SPEKTROFOTOMETRISIÄ HARJOITUSTÖITÄ versio 2 Jaakko Lohenoja 2009
Alkusanat Tähän tekstiin on koottu viisi spektrofotometrisiä työtä, joita on suhteellisen helppo tehdä oppilasryhmän kanssa toiminnallisella opintokäynnillä. Työt on lueteltu lukion kursseittain, mutta niitä voi tehdä myös esimerkiksi yläasteen tai ammatillisen oppilaitoksen oppilasryhmien kanssa. Seuraavassa lyhyt kuvaus kustakin työstä: KE 1: Meijerin takahuoneessa. Tässä työssä mitataan maidon proteiinipitoisuus. Oppilas työskentelee meijerilaitoksella ja hänen tulisi päättää, onko paikallisen maanviljelijän erään sairastelleen lehmän maito tuotantoon sopivaa. KE 2: Ruostetta suonissa. Tässä työssä mitataan rautatabletin sisältämän rautaionin määrä. Oppilas työskentelee lääketehtaalla ja hänen tehtävänä on selvittää, onko rautatableteihin laitettu oikea määrä rautaa. KE 3: Lääketehtaan uumenissa. Tässä työssä mitataan aspiriinitabletin sisältämän asetyylisalisyylihapon määrä. Oppilas työskentelee lääketehtaan laadunvalvontalaboratoriossa ja hänen tehtävänä on päättää, voiko tuotantolinjalta valmistuneen erän päästää markkinoille. KE 4: Sumuinen aamu metallinkierrätyslaitoksella: Tässä työssä mitataan metallimateriaalin kuparipitoisuus. Oppilas työskentelee metallinkierrätyslaitoksella, jonne asiakas tuo suuren erän metallia kierrätettäväksi. Metallinkierrätyslaitos maksaa kierrätykseen tuotavasta kuparista 2 /kg ja oppilaan tehtävä on päättää, kuinka paljon asiakkaalle voidaan metallierästä maksaa. KE 5: Etanolitehtaan B-rakennus. Tässä työssä mitataan elintarvike-etikan etikkahappopitoisuus. Oppilas työskentelee elintarvike-etikkaa valmistavalla tehtaalla. Tuotantolinjalta on valmistunut erä elintarvike-etikkaa, jonka laatu tulee tarkistaa ennen sen markkinoille pääsyä. Mittausmenetelmä perustuu ph-indikaattorin värinmuutokseen. Harjoitustöihin on olemassa Excel-taulukot tulosten automaattista käsittelyä varten sekä powerpoint-esitys spektrofotometrin toiminnan opettamiseen. Niitä voi tiedustella sähköpostitse Jaakko Lohenojalta osoitteesta jaakko.lohenoja(a)helsinki.fi. Seuraavalla sivulla on töissä tarvittavien liuosten valmistusohjeet. Töissä käytettävät tuotteet on lueteltu viimeisellä sivulla. Ohje tämän tekstin tulostamiseen: Tulosta etusivu erikseen (yksipuolisena) ja seuraavat sivut (s. 2 14) kaksipuolisina. Tällöin yksi työohje on yhdellä paperilla. Viimeinen sivu tulee olemaan yksipuolinen.
Liuosten valmistuohjeet Meijerin takahuoneessa: Biuret-reagenssi: Liuota 6 g K-Na-tartraattia ja 1,5 g CuSO 4. 5 H 2 O n. 100 millilitraan vettä. Liuota (vetokaapissa muodostuvan pölyn takia) 11 g NaOH:ia n. 100 millilitraan vettä. Yhdistä liuokset ja laimenna mitapullossa 250 ml tilavuuteen. Säilytä liuos pimeässä. Proteiiniliuos (8 g/l): Pipetoi 25 ml rasvatonta maitoa (proteiinia 3,3 g / 100 ml) 100 millilitran mittapulloon ja täytä mittapullo merkkiin asti vedellä. Tehdään joka kerta uudestaan, eli ei jätetä pilaantumaan. Kevytmaitoa ei saa käyttää, koska siinä tulee samentumaa. Ruostetta suonissa: Rauta(II)liuos (50 mg/l): pipetoi 25 ml työohjeen mukaista tablettiliuosta 100 ml mittapulloon. 1,10-fenantroliiniliuos (0,5 %): Punnitse 1 g 1,10-fenantroliinia, liuota 50 ml etanolia ja laimenna 200 millilitraksi. Lääketehtaan uumenissa: Hapan rauta(iii)-liuos: 12 g Fe 2 (SO 4 ) 3 ja 64 ml 1 M HCl kuumennetaan levyllä ja laimennetaan 200 ml:ksi rautasuolan liuettua. Laimea vertailuliuos, salisyylihappoa 100 µmol/l: 0,138 g salisyylihappoa liuotetaan 10 ml 5 M NaOH:ia ja laimennetaan 500 ml:ksi. Tätä liuosta pipetoidaan 5 ml 100 ml:n mittapulloon, jossa on 10 ml hapanta rautaliuosta ja mittapullo täytetään merkkiin vedellä. Väkevä vertailuliuos, salisyylihappoa 500 µmol/l: 0,690 g salisyylihappoa liuotetaan 10 ml 5 M NaOH:ia ja laimennetaan 500 ml:ksi. Tätä liuosta pipetoidaan 5 ml 100 ml:n mittapulloon, jossa on 10 ml hapanta rautaliuosta ja mittapullo täytetään merkkiin vedellä. Sumuinen aamu metallinkierrätyslaitoksella: 5 % NH 3 : 100 ml 25 % NH 3 laimennetaan 500 ml:ksi. Kuparin perusliuos (kuparia 4 g/l): 3,143 g CuSO 4. 5 H 2 O laimennetaan vedellä 200 ml:ksi liuosta. Laimea vertailuliuos, kuparia 200 mg/l: Pipetoi 2 ml väkevää typpihappoa 100 ml mitapulloon, jossa on 25 ml 5 % ammoniakkia. Pipetoi perään 5 ml kuparin perusliuosta (Cu 2+ 4 g/l) ja täytä merkkiin asti vedellä. Väkevä vertailuliuos, kuparia 1000 mg/l: Pipetoi 2 ml väkevää typpihappoa 100 ml mitapulloon, jossa on 25 ml 5 % ammoniakkia. Pipetoi perään 25 ml kuparin perusliuosta (Cu 2+ 4 g/l) ja täytä merkkiin asti vedellä. Etanolitehtaan B-rakennus: Vahva metyylipunaliuos: 54 mg metyylipunaa liuotetaan n. 50 ml etanolia (pitää sekoitella paljon). Tämä liuos siirretään 500 ml mittapulloon, johon laitetaan lisäksi 5,670 g CH 3 COONa. 3 H 2 O ja laimennetaan 500 ml:ksi. Metyylipunan perusliuos (= natriumasetaattia ja metyylipunaa sisältävä liuos ): Vahvaa metyylipunaliuosta pipetoidaan 100 ml 200 ml:n mittapulloon, lisätään 5,670 g CH 3 COONa. 3 H 2 O ja mittapullo täytetään merkkin asti vedellä. Emäksinen metyylipunaliuos: pipetoi metyylipunan perusliuosta 10 ml 100 ml:n mittapulloon ja täytä merkkiin asti vedellä. Hapan metyylipunaliuos: pipetoi metyylipunan perusliuosta 10 ml 100 ml:n mittapulloon, pipetoi perään vielä 10 ml 1 M HCl ja täytä merkkiin asti vedellä. Etikkahappoliuos, 10 %: Kaada kaupasta ostettua väkiviinaetikkaa laboratoriopulloon ja kirjoita kylkeen, että 10 % etikkahappo.
MEIJERIN TAKAHUONEESSA Työskentelet lehmänmaitoa vastaanottavassa meijerissä. Paikallisen maitoa toimittavan maanviljelijän yksi lehmistä on juuri sairastellut proteiiniaineenvaihduntaan liittyvää sairautta ja maanviljelijä epäilee, että se lypsää heikkolaatuista maitoa. Tämän vuoksi maanviljelijä ei uskalla yhdistää sairastelleen lehmän maitoa muuhun maitoon. Mitä teet: a) kehotat maanviljelijää sekoittamaan heikkolaatuisen maidon suureen määrään muuta maitoa ja myymään sen kilpailevalle meijeriyhtiölle b) selvität kemiallisin mittauksin, onko sairastelleen lehmän maito heikkolaatuista? Työn suoritus Laimean vertaliliuoksen valmistus (proteiinia 200 mg/l): pipetoi 5 millilitraa proteiiniliuosta (proteiinia 8 g/l) 200 millilitran mittapulloon, jossa on 25 millilitraa biuret-reagenssia. Täytä mittapullo merkkiin asti vedellä. Väkevän vertaliliuoksen valmistus (proteiinia 1000 mg/l): pipetoi 25 millilitraa proteiiniliuosta (proteiinia 8 g/l) 200 millilitran mittapulloon, jossa on 25 millilitraa biuret-reagenssia. Täytä mittapullo merkkiin asti vedellä. Näyteliuoksen valmistus: pipetoi tutkittavaa maitoa 5 millilitraa 200 millilitran mittapulloon, jossa on 25 millilitraa biuret-reagenssia. Täytä mittapullo merkkiin asti vedellä. Mittaa spektrofotometrillä liuosten absorbanssit 15 minuutin kuluttua liuosten valmistuksesta. Käytä mittauksessa aallonpituutta 545 nm. Kirjaa liuosten absorbanssit seuraavalla sivulla olevaan taulukkoon. Tutkittavan maidon proteiinipitoisuuden voi laskea taulukkolaskentaohjelman avulla.
Teoria Biuret-reagenssi sisältää kupari-ioneja. Proteiini molekyylissä on kaksi päätyä: ns. karboksyylipääty ja amiinipääty. Kupari-ioni muodostaa proteiinimolekyylin amiinipäädyn kanssa violetin yhdisteen. Mitä enemmän proteiinia on, sitä voimakkaampi on liuoksen väri. Liuoksen värin voimakkuus mitataan spektrofotometrillä. Näyteliuoksen värin voimakkuutta verrataan sellaisiin liuoksiin, joiden proteiinipitoisuudet tunnetaan. Tulokset Kirjaa mittaustulokset alla olevaan taulukkoon. Laimean vertailuliuoksen absorbanssi (proteiinia 200 mg/l) Väkevän vertailuliuoksen absorbanssi (proteiinia 1000 mg/l) Näyteliuoksen absorbanssi Selvitä (esim. maitopurkin kyljestä) kuinka suuri on maidon proteiinipitoisuus normaalisti ja vertaa analyysin tulosta siihen. Onko sairastelleen lehmän maito laadultaan hyväksyttävää? Analyysin tarkkuus on 20 %.
RUOSTETTA SUONISSA Työskentelet lääketehtaan hivenaineosastolla. Tuotantolinjalta on juuri valmistunut erä rautatabletteja, joiden laatu pitäisi tarkistaa ennen niiden markkinoille pääsyä. Mitä teet: a) syöt kaksi viikkoa pelkkää riisipuuroa, luovutat verta ja kokeilet, selviätkö terveenä rautatablettien avulla b) selvität kemiallisin mittauksin tabletin rautapitoisuuden? Työn suoritus Tabletin liuottaminen (tablettiliuoksen valmistus): Laita tutkittava rautatabletti koeputkeen, jossa on 10 millilitraan 1 M suolahappoa. Kuumenna koeputkea vesihauteella ja murskaa tabletti lasisauvan avulla. Siirrä koeputken sisältö huuhdellen 500 millilitran mittapulloon. Täytä mittapullo merkkiin asti vedellä. Näyteliuoksen valmistus: Pipetoi 5 millilitraa tablettiliuosta 250 millilitran mittapulloon, jossa on 25 millilitraa 0,5 % 1,10-fenantroliinia. Täytä mittapullo merkkiin asti vedellä. Laimean vertailuliuoksen valmistus (Fe 2+ 1 mg/l): Pipetoi 5 millilitraa rautaliuosta (Fe 2+ 50 mg/l) 250 millilitran mittapulloon, jossa on 25 millilitraa 0,5 % 1,10-fenantroliinia. Täytä mittapullo merkkiin asti vedellä. Väkevän vertailuliuoksen valmistus (Fe 2+ 5 mg/l): Pipetoi 25 millilitraa rautaliuosta (Fe 2+ 50 mg/l) 250 millilitran mittapulloon, jossa on 25 millilitraa 0,5 % 1,10-fenantroliinia. Täytä mittapullo merkkiin asti vedellä. Mittaa liuosten absorbanssit aallonpituudella 510 nm. Kirjaa liuosten absorbanssit seuraavalla sivulla olevaan taulukkoon.
Teoria Rauta(II)-ioni muodostaa 1,10-fenantroliinin kanssa punaisen yhdisteen. Mitä enemmän rauta(ii)- ioneja on, sitä voimakkaampi on liuoksen punainen väri. Liuoksen värin voimakkuus mitataan spektrofotometrillä. Näyteliuoksen värin voimakkuutta verrataan sellaisiin liuoksiin, joiden rautapitoisuudet tunnetaan. Tulokset Kirjaa mittaustulokset alla olevaan taulukkoon. Laimean vertailuliuoksen absorbanssi (rautaa 1 mg/l) Väkevän vertailuliuoksen absorbanssi (rautaa 5 mg/l) Näyteliuoksen absorbanssi Tulokset voi käsitellä laskentataulukon avulla.
LÄÄKETEHTAAN UUMENISSA Työskentelet lääketehtaan laadunvalvontalaboratoriossa. Tuotantolinjalta on juuri valmistunut erä aspiriinivalmistetta. Tehtäväsi on selvittää, onko tableteissa oikea määrä aspiriinia. Mitä teet: a) tarjoat päänsärystä kärsivälle työkaverillesi aspiriinitabletin ja tiedustelet varttitunnin kuluttua, poistuiko hänen päänsärkynsä b) selvität kemiallisin mittauksin, kuinka paljon aspiriinia yksi tabletti sisältää? Työn suoritus Näyteliuoksen valmistus: Laita tutkittava aspiriinitabletti kiehuvassa vedessä olevaan koeputkeen, jossa on 10 millilitraa 5 M natriumhydroksidiliuosta. Odota 20 minuuttia. Kaada koeputken sisältö 500 millilitran mittapulloon. Täytä koeputki vielä vedellä ja kaada vesi mittapulloon. Täytä mittapullo merkkiin asti vedellä ja sekoita. Pipetoi edellä valmistettua liuosta 5 millilitraa mittapulloon, jossa on 10 millilitraa hapanta rauta(iii)-liuosta. Täytä mittapullo lopuksi merkkiin asti vedellä ja sekoita. Mittauksen suoritus: Laita näyteliuosta ja vertailuliuoksia pipetin avulla spektrofotometrin mittausastioihin. Valitse spektrofotometristä aallonpituudeksi 525 nm ja mittaa kunkin liuoksen absorbanssi. Kirjaa liuosten absorbanssit seuraavalla sivulla olevaan taulukkoon.
Teoria Aspiriinin vaikuttavana aineena oleva asetyylisalisyylihappo on esteri, joka hydrolysoituu emäksisissä olosuhteissa salisyylihapoksi ja etikkahapoksi. Salisyylihapon sisältämä fenolinen hydroksyyliryhmä on ionimuodossa, kun ph on yli 1. Tällöin salisyylihappo kiinnittyy rauta(iii)ioniin muodostaen punaisen yhdisteen. Tabletissa olevan asetyylisalisyylihapon määrä saadaan selville hydrolysoimalla se salisyylihapoksi ja antamalla sen reagoida rauta(iii)ionin kanssa. Mitä enemmän yhdistettä on, sitä voimakkaampi on liuoksen punainen väri. Liuoksen värin voimakkuus mitataan spektrofotometrillä. Näyteliuoksen värin voimakkuutta verrataan sellaisiin liuoksiin, joiden salisyylihappomäärät tunnetaan. Tulokset Kirjaa mittaustulokset alla olevaan taulukkoon. Laimean vertailuliuoksen absorbanssi (100 µmol/l) Väkevän vertailuliuoksen absorbanssi (500 µmol/l) Näyteliuoksen absorbanssi
SUMUINEN AAMU METALLINKIERRÄTYSLAITOKSELLA Työskentelet metallinkierrätyslaitoksella. Asiakas tuo kierrätyslaitokselle 1200 kilogramman erän kellertävää metallimateriaalia, joka on löytynyt purettavasta varastorakennuksesta. Kierrätykseen tuotavasta kuparista maksetaan 2 /kg. Asiakkaan arvion mukaan metallimateriaalin kuparipitoisuus on ainakin 50 %. Mitä teet: a) tarjoat asiakkaalle metallierästä 1000 ja kokeilet, hyväksyykö hän tarjouksen b) selvität kemiallisin mittauksin metallimateriaalin kuparipitoisuuden? Työn suoritus Näyteliuoksen valmistus: Punnitse tutkittavaa metallia n. 0,1 grammaa ja laita se koeputkeen, jossa on 2 millilitraa väkevää typpihappoa. Kirjaa punnitun näytteen massa seuraavalla sivulla olevaan taulukkoon. Kun metalli on liuennut, kaada koeputken sisältö suppilon avulla 100 millilitran mittapulloon, jossa on 25 millilitraa 5 % ammoniakkiliuosta. Täytä koeputki vielä vedellä ja kaada vesi mittapulloon. Täytä mittapullo lopuksi merkkiin asti vedellä ja sekoita. Mittauksen suoritus: Laita näyteliuosta ja vertailuliuoksia pipetin avulla spektrofotometrin mittausastioihin. Valitse spektrofotometristä aallonpituudeksi 600 nm ja mittaa kunkin liuoksen absorbanssi. Kirjaa liuosten absorbanssit seuraavalla sivulla olevaan taulukkoon. Tulosten tulkinta: Kirjoita mitatut liuosten absorbanssit taulukkolaskentaohjelmaan. Nyt ohjelma ilmoittaa näyteliuoksen kuparipitoisuuden (mg/l). Tämän jälkeen kirjoita ohjelmaan näytteen massa, jolloin ohjelma laskee metallinäytteen kuparipitoisuuden (m-%) ja metallierästä maksettavan hinnan.
Teoria Väkevä typpihappo hapettaa metallisen kuparin reaktioyhtälön Cu + 4 HNO 3 Cu(NO 3 ) 2 + 2 NO 2 + 2 H 2 O mukaisesti. Kupari-ioni muodostaa ammoniakin kanssa sinisen yhdisteen, tetra-ammiinikupari(ii)- ionin: Cu 2+ + 4 NH 3 [Cu(NH 3 ) 4 ] 2+ Metallimateriaalin kuparipitoisuus saadaan selville liuottamalla metallia ensin typpihappoon, ja sekoittamalla typpihappoliuos ammoniakkiliuokseen. Mitä enemmän kuparia on, sitä voimakkaampi on liuoksen sininen väri. Liuoksen värin voimakkuus mitataan spektrofotometrillä. Näyteliuoksen värin voimakkuutta verrataan sellaisiin liuoksiin, joiden kuparipitoisuudet tunnetaan. Tulokset Kirjaa mittaustulokset alla oleviin taulukoihin. Näytteen massa (grammoina) Laimean vertailuliuoksen absorbanssi (200 mg/l) Väkevän vertailuliuoksen absorbanssi (1000 mg/l) Näyteliuoksen absorbanssi
ETANOLITEHTAAN B-RAKENNUS Työskentelet Rajamäen tehtailla laadunvalvontalaboratoriossa. Tuotantolinjalta on juuri valmistunut erä elintarvike-etikkaa. Tehtäväsi on selvittää, onko erän etikkahappopitoisuus kohdallaan. Mitä teet: a) syötät etikkaa työkaverillesi ja päättelet etikan laadun hänen ilmeestään b) selvität kemiallisin mittauksin etikkaerän etikkahappopitoisuuden? Työn suoritus Näyteliuoksen valmistus: Punnitse tutkittavaa etikkaa n. 1 gramma 100 millilitran mittapulloon, jossa on 10 millilitraa natriumasetaattia ja metyylipunaa sisältävää liuosta. Kirjaa punnitun näytteen massa seuraavalla sivulla olevaan taulukkoon. Täytä mittapullo merkkiin asti vedellä ja sekoita. Testiliuoksen valmistus: Valmista testiliuos samalla tavalla kuin näyteliuos, mutta käytä tutkittavan etikkaliuoksen sijaan etikkahappoliuosta, jossa etikkahappoa on 10 %. Mittauksen suoritus: Laita näyteliuosta, testiliuosta ja vertailuliuoksia pipetin avulla spektrofotometrin mittausastioihin. Valitse spektrofotometristä aallonpituudeksi 520 nm ja mittaa kunkin liuoksen absorbanssi. Kirjaa liuosten absorbanssit seuraavalla sivulla olevaan taulukkoon. Vertailuliuoksia on kaksi: emäksinen ja hapan metyylipunaliuos. Molemmissa vertailuliuoksissa metyylipunan kokonaiskonsentraatio on 20 µmol/l. Emäksisen vertailuliuoksen ph ~ 9 ja happaman vertailuliuoksen ph ~ 1. Testiliuoksen avulla selvitetään metyylipunan happovakion arvo. Kaikissa mitattavissa liuoksissa natriumasetaatin konsentraatio on 0,025 mol/l.
Teoria Etikkahappo ja sen emäspari asetaatti-ioni muodostavat puskuriliuoksen, jonka ph-arvo määräytyy etikkahapon ja asetaatti-ionin konsentraatioiden suhteen perusteella. Liuoksen oksoniumionikonsentraatio voidaan laskea yhtälöllä [H 3 O + ] = K a, etikkahappo. c(ch 3 COOH) / c(ch 3 COO - ) Metyylipuna on ph-indikaattori, jonka happomuoto on punainen ja emäsmuoto keltainen. Kun pharvo on alhainen, metyylipuna esiintyy happomuodossaan ja liuos on väriltään punainen. Kun pharvo on korkea, metyylipuna esiintyy emäsmuodossaan ja liuos on väriltään keltainen. Metyylipunan molempia muotoja esiintyy ph-alueella 4 6. Tasapaino yhtälön [H 3 O + ] = K a, metyylipuna. [metyylipunan happomuoto] / [metyylipunan emäsmuoto] mukainen, jossa K a, metyylipuna on metyylipunan happovakio. Etikkahappopitoisuus saadaan selville sekoittamalla keskenään tutkittavaa etikkaliuosta sekä natriumasetaattia ja metyylipunaa sisältävää liuosta. Mitä alhaisempi ph-arvo on, sitä punaisempi on liuos. Värin punaisuus mitataan spektrofotometrillä. Värin punaisuutta verrataan sellaisiin liuoksiin, joissa on sama määrä metyylipunaa kuin näyteliuoksessa, mutta joissa metyylipuna on kokonaan joko emäksisessä muodossa tai happamassa muodossa. Testiliuoksen avulla selvitetään metyylipunan happovakion arvo. Tulokset Kirjaa mittaustulokset alla oleviin taulukoihin. Näytteen massa (grammoina) Testiliuokseen punnittu 10 m-% etikkahappoliuoksen massa (grammoina) Emäksisen metyylipunaliuoksen absorbanssi Happaman metyylipunaliuoksen absorbanssi Näyteliuoksen absorbanssi Testiliuoksen absorbanssi
Näytteinä käytettävät tuotteet Meijerin takahuoneessa: Näytteenä rasvaton maito (kevytmaito aiheuttaa häiritsevää sameutta). Ruostetta suonissa: Näytteenä Retafer 100 mg. Lääketehtaan uumenissa: Näytteenä toimii ainakin BAYERin vihreä Aspirin (500 mg). Sumuinen aamu metallinkierrätyslaitoksella: Näytteenä toimii messinkinaula, jonka tietoja seuraavassa: ostopaikkana Oulunkylän K-Rauta, tuotteen nimi on K PROF Messinkinaula, 15 x 10, 200 kpl, keltainen pahvi ja naulat läpinäkyvässä muovissa, kuparipitoisuus (81 + 1) %, yhden naulan massa n. 0,11 g. Etanolitehtaan B-rakennus: Näytteenä toimii kirkas Rajamäen Väkiviinaetikka, ilmoitettu etikkahappopitoisuus 10 %.