2 3 Pipetointi, sentrifugointi ja spektrofotometria 740151P Biokemian menetelmät I BMTK / Juha Kerätär Luennon aiheet ja tavoitteet Pipetit ja pipetointi Sentrifugit ja sentrifugointi Spektrofotometria ja sen perussovellukset Opiskelija tietää ja osaa kertoa, mihin ja miten käytetään pipettiä, sentrifugia ja spektrofotometriä. Opiskelija osaa turvallisesti käyttää sentrifugia. Opiskelija osaa laskea spektrofotometrilla määritettyjen näytteiden pitoisuuksia. Biokemian laboratorion laitteet Keskustele parisi kanssa tai pienessä ryhmässä: Olet hankkinut kotiisi uuden kodinkoneen. Miten toimit ottaessasi sen käyttöön? Biokemian laboratorion laitteet ovat tyypillisesti kalliita erikoislaitteita. Miten käytät niitä turvallisesti, ja niiden käyttötarkoituksen mukaisesti? 1
4 5 6 Laitteiden käyttö Tutustu käyttöohjeisiin! Jos olet epävarma, kysy neuvoa. Kursseilla kurssiassistenteilta tai teknikoilta, muussa laboratoriotyössä laitteen vastuuhenkilöltä tai sitä aiemmin käyttäneeltä. Varaa laite käyttöösi, jos sille on varausjärjestelmä. Täytä käyttöpäiväkirja, jos sellainen on. Ilmoita laitteessa ilmenneestä viasta heti! Sulje laitteet käytön jälkeen. Käyttöikä (esim. UV-lampun kuluminen) Tapaturmat ja tulipalot (esim. kuumenevat osat) Pipetointi Nesteen mittaamista ja siirtämistä. Valitse pipetti käyttötarkoituksen mukaan (Pasteur-pipetti, lasinen tai muovinen mittapipetti, automaattipipetti). Tarkkuus Tilavuus Näytteen pitää olla sula ja homogeeninen. Sekoita näyte ennen pipetointia, ja putki johon pipetoit sen jälkeen. Älä pipetoi suoraan varastopullosta. Automaattipipetti Biokemistin tärkeimpiä työkaluja. Käytetään kertakäyttöisiä kärkiä vaihda kärki joka pipetoinnin jälkeen! Usein sarja erikokoisia pipettejä, joilla voidaan pipetoida tietty tilavuusalue (esim. 0,5 µl 5 ml). Pipetointi automaattipipetillä Säädä pipettiin pipetoitava tilavuus. Pipettiin merkittyä säätöaluetta ei saa alittaa tai ylittää! Kiinnitä puhdas (steriili?) kärki. Pipetointi: Paina pipetin painike ensimmäiseen vasteeseen (0 1). Vie kärki juuri ja juuri nestepinnan alle. Jos upotat kärjen syvälle nesteeseen, pipetoituva tilavuus voi olla epätarkka etenkin viskooseilla nesteillä. Vapauta painike rauhallisesti (1 0), jolloin neste siirtyy kärkeen. Kärjen ulkopinnalle mahdollisesti jääneen nesteen voi poistaa koskettamalla kärjellä putken reunaa. Tyhjennä pipetti painamalla ensin painike ensin ensimmäiseen vasteeseen (0 1), sitten pohjaan (1 2). Poista kärki nesteestä ja vapauta painike. 2
7 8 9 Pipetin säilytys ja huolto Säilytä pipetti aina pystyasennossa pipetille tarkoitetussa telineessä. Poista aina käytetty kärki kärkiroskikseen käytön jälkeen! Älä jätä käytettyä kärkeä kiinni pipettiin. Jos pipetin kärkiosaan menee pipetoitavaa nestettä: Poista kärjen suojana oleva filtteri (jos on). Puhdista kärkiosa imupaperilla tai ohuella pumpulipuikolla. Myös 70% etanolia voi käyttää, anna kuivua. Jos pipetissä käytetään filtteriä, vaihda lopuksi puhdas filtteri. Pipetin säännöllinen kalibrointi! Mieti työergonomiaa: esimerkiksi tue käsi pöytään pipetoidessasi. (Sartoriuksen video ergonomiasta pipetoidessa: https://youtu.be/puqtrtyjhrg) Sentrifugointi Sentrifugointi perustuu näytepartikkelien (hiukkasten) liikkuvuuteen nesteessä. Tämä riippuu: Käytetystä voimasta (esimerkiksi: maan vetovoima) Hiukkasen ja nesteen tiheyserosta Hiukkasen koosta ja muodosta (kitka) Nesteen viskositeetista (kitka) Solujen tai soluorganellien sedimentaatio liuoksessa pelkän painovoiman avulla on liian hidasta sentrifugin käyttö. Tyypillisiä sentrifugoinnin sovelluksia: Saostetun molekyylin (esim. DNA, RNA, proteiinit) erottaminen liuoksesta. Saostuman poistaminen. Bakteerien tai solujen kerääminen kasvatusliuoksesta. Soluorganellien erottelu hajotetuista soluista. Spinnaus, liuoksen kerääminen putken pohjalle nopealla sentrifugoinnilla. Sentrifugoinnin jälkeen: Sakka putken pohjalla = pelletti Liuosfaasi = supernatantti Sentrifugointi Harjoituslasku: Pesukoneen rummun säde on 25 cm. Kun sen linkousohjelmilla pyörimisnopeudet ovat 800, 1000 ja 1200 rpm, mitkä ovat syntyvät g-voimat? RCF = 1, 118 250 ( 800 1000 ) 2 = 178, 88 g 179 g Voimat ovat 179 x g, 280 x g ja 402 x g. Mitä huomaat? Sedimentaatio sentrifugissa saadaan aikaan pyörittämällä näytettä suurella nopeudella. Syntyvä voima riippuu sentrifugin roottorin säteestä r (mm) ja pyörimisnopeudesta rpm (revolutionsper minute). Voima (RCF, relative centrifugalforce, garvo ) voidaan laskea yhtälöstä: RCF = 1, 118r( rpm 1000 )2 Jos tiedossa on haluttu g-arvo ja roottorin säde, voidaan laskea myös tarvittava pyörimisnopeus: rpm = 945, 7 RCF r 3
10 11 12 Sentrifugointi Työohjeissa sentrifugointi-työvaiheen kohdalla ilmoitetaan aina g-arvo. Moderneissa sentrifugeissa laite laskee automaattisesti tarvittavan kierrosnopeuden, kun siihen syöttää halutun g-arvon (kiinteäroottoriset sentrifugit). Irtoroottorisissa sentrifugeissa laitteeseen voi joutua syöttämään käytetyn roottorin koodin tai tyypin, jolloin laite laskee tarvittavan kierrosnopeuden. Vanhoissa sentrifugeissa ei välttämättä ole kuin rpm-säätö tarvittavan g-arvon voi joutua laskemaan käytetyn roottorin tietojen perusteella kuten edellä. Käytännössä tarjolla on tällöin lähes aina taulukko tai nomogrammi tarvittavan kierrosnopeuden arvioimiseen. Sentrifugoinnin sovelluksia Sedimentaatiosentrifugointi Yleisin laboratoriossa tehtävä sentrifugointi. Suspensiossa olevan kiinteän faasin erottaminen liuosfaasista, tai kahden tiheydeltään erilaisen liuosfaasin erottaminen toisistaan. Esimerkkejä: Bakteerien kerääminen kasvatusliuoksesta. DNA-, RNA- tai proteiinisakan kerääminen liuoksesta. Fenoli-kloroformi- ja vesifaasien erottaminen DNA:n puhdistuksessa. Differentiaalisentrifugointi Sarja sentrifugaalivoimaltaan tai kestoltaan poikkeavia sentrifugointivaiheita, joista kussakin suspensiosta erotetaan joku tai jotkin sen osista. Esimerkki: soluorganellien eristäminen kudoksesta. (Wikipedia 2009) 4
13 14 15 Sentrifugoinnin sovelluksia (Sigma-Aldrich) Gradienttisentrifugointi eli tiheyserottelusentrifugointi Putken pohjaa kohti kasvava, jatkuva- tai epäjatkuva tiheys- tai konsentraatiogradientti inertistä, vesiliukoisesta aineesta (cesiumkloridi, sakkaroosi, ficoll- tai percollgradientti). Erottelee seoksen partikkelit niiden tiheyden perusteella. Esimerkkejä: Erittäin puhtaiden mitokondrioiden tai peroksisomien eristäminen. Voidaan jakaa edelleen isopykniseen ja vyöhykesentrifugointiin: Isopykninen sentrifugointi: Eroteltavissa molekyyleissä erilainen tiheys, mutta samanlainen molekyylipaino. Korkea ajonopeus, pitkä ajoaika. Vyöhykesentrifugointi (rate-zonal centrifugation): Eroteltavissa molekyyleissä samanlainen tiheys, mutta erilainen molekyylipaino. Matalampi ajonopeus, lyhyempi ajoaika. Sentrifugointi ja roottorit Roottorien materiaali vaihtelee käyttötarkoituksen mukaan: Matala nopeus: alumiini tai teräs Keskinopeus: alumiini, titaani tai hiilikuitu Suuret nopeudet: titaani Materiaalin ominaisuudet vaihtelevat: Alumiini: altis metallin väsymiselle suurissa g-voimissa, sekä kemialliselle korroosiolle (pintanaarmut!). Titaani: kestää paremmin suuria g-voimia. Raskas ja kallis. Hiilikuitu: kevyt, nopeuttaa roottorin kiihdyttämistä ja jarruttamista ja siten lyhentää ajoaikaa. Kestää korroosiota. Roottorilla aina maksimi-ajonopeus. Voi muuttua roottorin käytön ja kulumisen seurauksena! Kulmaroottori (fixed angle rotor) (Beckman JA-10 alumiiniroottori) sakka Putket roottorissa vinossa kulmassa. Sedimentoitumisaika lyhyt. Sakka kerääntyy putken uloimpaan kohtaan helppo kerätä talteen. Suurien tilavuuksien sentrifugointi nopeaa. Hyvin yleinen roottorityyppi biokemian laboratoriossa: kiinteäroottoriset spinnerit, pienet pöytäfuugit, sekä suuremmat irtoroottoriset sentrifugit. Yleisiä roottorityyppejä BMTK:n kursseilla: SS-34 (r = 107 mm, 8 x 50 ml putkia tai 8 x 15 ml + adapterit); SLA-1500 (r = 145 mm, 6 x 250 ml) Huomatkaa: roottorin r erilainen eri kohdissa putkea! Esimerkiksi kuvassa: r min = 38 mm, r av = 98 mm, r max = 159 mm näytteeseen kohdistuva voima muuttuu! 5
16 17 18 Pysäytetyssä roottorissa putkikotelot pystysuorassa, pyörivässä putket kääntyvät vaakasuoraan. Sedimentaatiomatkana koko putken pituus maksimaalinen erottelukyky, mutta pitkä ajoaika. Sakka kerääntyy näyteputken pohjalle. Yleinen sovellus: bakteeriviljelmien kerääminen kasvatuksen jälkeen kasvatusliuoksesta. Putkikotelot usein irrallisia kaikkien koteloiden tai korien oltava ajon aikana kuitenkin paikallaan! Roottori rasittuu ajon aikana tyhjien paikkojen vuoksi. Tarkista aina, että putkikotelo pystyy kääntymään kokonaan, eikä esimerkiksi näyteputki ota kiinni roottoriin! Kääntyväputkiroottori (swingbucket) Vertikaaliputkiroottori Putket pystysuorassa roottorissa. Näytemolekyyleillä lyhin mahdollinen kulkeutumismatka silti nopein ajoaika ja paras resoluutio. Ei kuitenkaan sovellu näytteiden keräämiseen, pelletti leviää koko seinämän mitalle. Tyypillinen sovellus: gradienttisentrifugointi ultrasentrifugissa. Sentrifugi ja roottori Mini low speed spinneri Sentrifugityyppejä Max x Max Näytetilavuus g rpm 2000 6000 6 x 1,5 ml 6 x 2,0 ml Mihin käytetään? Liuoksen kerääminen näyteputken pohjalle, spinnaus Kiinteä kulmaroottori Nopea käyttää Mikro high speed Kiinteä kulmaroottori Joissain malleissa jäähdytys Laboratorion peruslaite 16873 14000 18 x 1,5 ml Sedimentaatio 18 x 2,0 ml Näytteen konsentrointi spinnaus Nopea käyttää, saavuttaa maksiminopeuden noin kymmenessä sekunnissa. Laboratorion peruslaite 6
19 20 21 Sentrifugi ja roottori Max x Max g rpm Näytetilavuus Mihin käytetään? Pöytä low speed Kiinteä kääntyväputkinen roottori Usein myös mahdollisuus jäähdyttää 3234 4200 4 x 4 x 50 ml 4 x 8 x 15 ml 4 x 250 ml Suspensiona kasvatettujen solujen, hiivojen ja bakteerien erottaminen kasvatusliuoksesta. Konsentrointi Nopea käyttää Tiedekunnassa useita eri malleja Lattia high speed Erikokoisia kulmaroottoreita Aina jäähdyttävä Laitehuoneessa! Roottorin mukaan, esim: SS-34 48200 20000 8 x 50 ml 31916 14500 SLA-1500 6 x 250 ml Bakteerisolujen erottaminen Saostuman erottaminen DNApuhdistuksesta Soluorganellien fraktiointi Solujäänteiden erotus homogenaatista Sentrifugi ja Max x Max roottori g rpm Ultrasentrifugi high speed Roottorikammiossa tyhjiö 235000 45000 Kiihdytys ja jarrutus tarkkaan säädeltävissä 504000 70000 Erilaisia vaihdettavia roottoreita Näytetilavuus Roottorin mukaan, esim: Ti 45 6 x 94 ml Ti 70 8 x 39 ml Mihin käytetään? Soluorganellien fraktiointi (kalvorakenteet, mitokondriot, peroksisomit, jne.) Lipoproteiinien eristys Proteiinin molekyylipainon määritys Monia preparatiiviisia ja analyyttisia käyttötarkoituksia! Sentrifugointiputket Laboratorion mini- ja mikrosentrifugeihin käyvät 1,5 2 ml mikroputket, epparit. Isompiin pöytäsentrifugeihin mahtuvat myös 15 ml ja 50 ml falcon-putket, joihinkin myös esimerkiksi erikokoiset pullot. Lattiasentrifugin SS-34 roottoriin tarvitsee SS-34 putket, tai muoviadaptereihin laitetut corexlasiputket. SLA-1500 roottoriin 250 ml sentrifugipullot. Tavallinen lasiputki ei kestä sentrifugointia. Aina sentrifugoinnin kestävä lasimateriaali (esim. corex). Ultrasentrifugiin on omat putkensa erilaisiin käyttötarkoituksiin. 7
22 23 24 Sentrifugointi käytännössä DNA-sakan erotus: korkean nopeuden pöytäsentrifuugi, (suurella volyymillä lattiasentrifugi irtoroottorilla). Työohjeessa ilmoitetaan sentrifugoinnista: sentrifugaalivoima (RCF, g-arvo) sentrifugointiaika lämpötila (tyypillisesti RT tai +4 C) Sentrifugi, näyteputki (ja roottori) valitaan näytetilavuuden ja vaadittavan sentrifugaalivoiman mukaan. Millaista sentrifugia käyttäisit seuraavien näytteiden kohdalla? DNA-sakan erotus 1 ml:sta nestettä, 10000 x g Bakteerien erotus 1000 ml:sta kasvatusmediaa, 3000 x g Sentrifugin turvallinen käyttö Keskustelu parin kanssa tai pienessä ryhmässä: Mitä tapahtuu, jos pesukone on epätasapainossa? Mitä luulet tapahtuvan, jos roottori, jossa sentrifugaalivoima on 10000 x g, on epätasapainossa ajon aikana? Kun ultrasentrifugiin laitetaan roottori, jota valmistaja ei ole hyväksynyt käytettäväksi tässä ultrasentrifugissa: http://www.ehrs.upenn.edu/programs/labsafe ty/alerts/ultra_explosion.html Bakteerien erotus: matalan nopeuden pöytä- tai lattiasentrifugi. https://www.fishersci.co.uk/gb/en/scientificproducts/centrifuge-guide/centrifuge-safetyguide.html Sentrifugointi käytännössä Varmista että käytetyt näyteputket kestävät käytetyt g-arvot. Jokaisella sentrifugiputkella on aina oltava roottorissa samanpainoinen vastinputki. Pienissä pöytäsentrifugeissa: vastinputki toinen näyteputki tai vastapainoputki, jossa nestettä noin saman verran. Irtoroottoreita käyttävissa isoissa high speed sentrifugeissa, esimerkiksi SS-34- ja SLA-1500-roottorit: putki ja sen vastinputki tasapainotettava vaa alla! Muista tehdä tasapainotus mahdollisen korkin tai adapterin kanssa. Vastinputken nesteen tulee olla tiheydeltään samanlaista näyteputken kanssa. Älä ylitäytä etenkään kulmaroottoreissa käytettävia avoimia putkia! Väärin tasapainotettu putki voi rikkoa roottorin tai sentrifugin ja aiheuttaa henkilövahinkoja! 8
25 26 27 (https://www.beckman.com/resources/discover/fundament als/principles-of-centrifugation/balancing-your-rotor) Sentrifugointi käytännössä Varaa sentrifugi käyttöösi. Jos sentrifugoit tietyssä lämpötilassa (esimerkiksi +4 C), laita se ajoissa päälle ja säädä jäähtymään. Varmista, että roottori on tarkoitettu käyttämääsi sentrifugiin. Aseta roottori kammioon istukan päälle varovasti. Laita tasapainotetut näyteputket tai näyteputki ja vastinputki roottoriin. Sulje roottorin kansi alemmasta ruuvista, ja kiristä vielä kiinni yläruuvilla. Säädä sentrifugiin ajoaika, kierrosnopeus tai tarvittava g-arvo, roottorin tyyppi jos se tarvitaan, lämpötila. Käynnistä sentrifugi. Seuraa sentrifugia niin pitkään että ajonopeus on saavutettu! Ajon jälkeen: Sentrifugin kantta ei saa avata ennen kuin sentrifugi roottori on täysin pysähtynyt. Avaa roottorin kansi ja poista putket varovasti. Huomioi, missä on putken uloin kohta eli mihin kohtaan sakan pitäisi olla kerääntynyt. Jos sentrifugille ei ole varauksia, sammuta virta ja jätä kansi auki. Huolla roottori! Sentrifugointi: roottorin huolto Roottorit ovat kalliita (5000-10000 ) ja niistä on pidettävä hyvää huolta. Kosteus ja suola voivat aiheuttaa roottorin korroosiota ja lyhentää käyttöikää Pese roiskeet heti miedolla pesuaineella, huuhtele ja kuivaa. Säilytä roottori ylösalaisin kylmässä, jolloin kondenssivesi poistuu. Älä poista putkia roottorista käyttäen teräviä esineitä. Naarmuuntuminen korroosio. Jos roottori ei lähde istukasta, irrota varovasti t- avaimella jottei istukka vaurioidu. Ultrasentrifugien käyttömääristä pidetään aina päiväkirjaa metalliväsymisen seuraamiseksi. Maahantuoja ja valmistaja seuraavat säännöllisesti roottorien kuntoa. Huonokuntoisen roottorin maksimikäyttönopeutta voidaan laskea, tai sen käyttö kieltää. Älä missään olosuhteissa ylitä valmistajan ilmoittamaa maksimiajonopeutta! Roottorin huoltoa: https://youtu.be/e0kt79n9sm4 9
28 29 30 Spektrofotometria UV IR Spektroskoopiset menetelmät tutkivat aineiden ja sähkömagneettisen säteilyn vuorovaikutuksia. Spektrofotometriassa tutkitaan näitä vuorovaikutuksia näkyvän valon aallonpituuksilla (noin 350 nm 800 nm), sekä ultravioletti- ja infrapunaaallonpituuksien lähialueilla. Biologiset molekyylit absorboivat UV-valoa, tai voivat reagoida kemiallisten yhdisteiden kanssa, muodostaen värillisen tuotteen, joka absorboi näkyvää valoa. UV/näkyvän alueen spektrofotometria (UVvis) on biokemian laboratorion perusmenetelmä. Puhtaalle molekyylille voidaan määrittää UVvis spektri mittaamalla absorboitunut säteily aallonpituuden funktiona. Spektriä voidaan käyttää molekyylin tunnistamiseen (kvalitatiivinen spektrofotometria). Spektrofotometria Spektrofotometriaa käytetään yleisimmin mittaamaan liuoksessa olevan aineen pitoisuutta (= kvantitatiivinen spektrofotometria). proteiinit nukleiinihapot Pitoisuuden määritys perustuu Beerin ja Lambertin lakiin. Sen mukaan valon absorption A määrä näytteessä on suoraan verrannollinen näytteen konsentraatioon. Tämä esitetään usein yhtälöllä: A = εlc ɛ = molaarinen absorptiokerroin (l*mol -1 *cm -1 ) l = valon kulkema matka näytteessä (cm) c = näytteen konsentraatio (mol/l) Kun tiedetään molaarinen absorptiokerroin (ɛ) voidaan absorbanssin perusteella laskea molekyylin pitoisuus liuoksessa. Spektrofotometri Spektrofotometri ( spekkari ) mittaa aineiden sähkömagneettisen säteilyn absorptiota eri aallonpituuksilla. Valonlähde UV-valo: vety- tai deuteriumlamppu Näkyvä valo: volframi-halogeenilamppu Monokromaattori (prisma tai taivehila) Hajottaa valon eri aallonpituuksille, niin että mittaus voidaan tehdä halutulla aallonpituudella. Peilit, linssit ja filtterit Puhdistavat edelleen valon halutulle aallonpituudelle. Kohdistavat valon näytekammioon. Näytekammio Säde johdetaan näytteen läpi. Näytetilavuus 50 µl 3 ml. Näyte tyypillisesti kvartsi- tai muovikyvetissä UV-alueella, muovi- tai lasikyvetissä näkyvän valon alueella. Detektori Havaitsee näytteeseen absorboituneen valon määrän ja muuttaa sen luettavaan muotoon. 10
31 32 33 Spektrofotometrin käyttö Mitattavan liuoksen täytyy olla homogeeninen ja kirkas, ei sakkainen tai samea. Myös ilmakuplat kyvetissä mittauskohdassa haittaavat mittausta. Ennen jokaista mittaussarjaa ja vaihdettaessa aallonpituutta spektrofotometri on nollatava (blank, nollanäyte, blankki ). Esimerkki: Nollanäytteessä sama värireagenssi ja sama liuotin kuin mitattavassa näytteessä. Nollataan spektrofotometri käyttäen tätä nollanäytteenä, jolloin mitattavan näytteen absorbanssista on vähennetty värireagenssin ja liuottimen mahdollinen absorbanssi nähdään vain mitattavan aineen absorbanssi. Konsentraation kasvaessa absorbanssi ei välttämättä enää muutu lineaarisesti! Näytteitä voi joutua laimentamaan ja tekemään uuden mittauksen. Lineaarinen mittausalue on useissa menetelmissä kapea, joten voidaan joutua valmistamaan useita näytelaimennoksia, jotta jokin niistä osuu oikealle mittausalueelle. Kun sopiva laimennos on löydetty ja mitattu, pitoisuus saadaan kertomalla tulos laimennoskertoimella. Onko mitatun näytteen A > 1? Laimenna ja mittaa uudestaan, jos et tiedä paremmin. NanoDropspektrofotometri Moderni mikrotilavuus-spektrofotometri. Kyvettiä ei käytetä: näytepisara (1-2 µl) pipetoidaan kahden valokuidun väliin. Käytetään DNA:n, RNA:n ja proteiinien konsentraation mittaamiseen älä käytä kursseilla värireaktioiden tai bakteerikasvustojen absorbanssin mittaamiseen. Konsentraation mittaamisessa mikrotilavuus-spektrofotometrin lineaarinen alue on perinteistä spektrofotometriä laajempi voidaan mitata laimentamatta jopa 50-kertaisesti vahvempia pitoisuuksia. Spektrofotometrian sovelluksia Laskuharjoitus: Olet eristänyt kaksijuosteista plasmidi- DNA:ta. Mittaat eristetyn DNA:n absorbanssit: A 260 = 0,544; A 280 = 0,291. Mikä on eristämäsi DNA:n konsentraatio? Mitä voit sanoa sen puhtaudesta? c = 0,544 * 50 µg/ml = 27,2 µg/ml A 260 /A 280 1,86 (DNA on suhdeluvun perusteella melko puhdasta) Nukleiinihappojen pitoisuuden ja puhtauden määritys liuoksesta (λ = 260 nm): Perustuu etenkin nukleiinihappojen emästen rengasrakenteiden absorptioon Kaksijuosteisella DNA:lla kun A 260 = 1, c = 50 µg / ml Yksijuosteisella DNA:lla kun A 260 = 1, c = 33 µg / ml Yksijuosteisella RNA:lla kun A 260 = 1, c = 40 µg / ml Proteiinit absorboivat voimakkaasti aallonpituudella 280 nm. A 260 /A 280 - suhdelukua on käytetty arvioimaan eristetyn DNA:n puhtautta: Puhtaalla DNA:lla A 260/A 280 = 1,8 Puhtaalla RNA:lla A 260/A 280 = 2,0 Matala suhdeluku voi kertoa näytteen kontaminoituneen suurella määrällä proteiinia, tai jollain puhdistukseen käytetyllä reagenssilla. Korkea suhdeluku voi kertoa RNA-kontaminaatiosta. 11
34 35 36 Spektrofotometrian sovelluksia Bakteerisolujen kasvun seuraaminen: Bakteerikasvuston absorbanssin mittaaminen aallonpituudella 600 nm kertoo kasvuston solumäärästä. Perustuu enemmänkin valon siroamiseen poispäin detektorista kiinteiden partikkelien (bakteerisolujen) vuoksi, kuin absorptioon. Esimerkiksi: halutaan aloittaa proteiinin tuotto bakteerien ollessa lineaarisessa kasvuvaiheessaan (A 600 0,6). Laimenna ja mittaa uudestaan, jos A > 0,8! Biokemiallisen reaktion nopeuden mittaaminen: Voidaan tutkia reaktiossa syntyvän tai kuluvan aineen määrän muutosta, joko suoraan jollain aallonpituudella absorboivan substraatin tai tuotteen kautta, tai välillisesti. Absorbanssin muutos ajan funktiona kertoo biokemiallisen reaktion kulusta. Spektrofotometrian sovelluksia Proteiinin pitoisuuden mittaaminen: Proteiinin pitoisuus voidaan selvittää suoraan mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 280 nm: Kun A 280 = 1, proteiinipitoisuus on noin 1 mg/ml. Soveltuu puhdistettujen proteiinien pitoisuuksien määrittämiseen absorbanssi riippuu etenkin proteiinin tyrosiini- ja tryptofaani-aminohappojen määrästä. DNA ja RNA häiritsevät mittausta. Proteiiniseosten pitoisuus määritetään useimmiten erilaisilla kolorimetrisillä, värireaktioihin perustuvilla menetelmillä. Lowryn menetelmä: Alkaalinen kupari reagoi proteiinin peptidisidosten kanssa. Folin-Ciocalteu-reagenssi sitoutuu tyrosiini- ja tryptofaani aminohappoihin. Herkkyys noin 20 µg/ml - monet orgaaniset molekyylit häiritsevät mittausta. Bradfordin menetelmä; Coomassie Brilliant Blue väriaine sitoutuu proteiinien hydrofobisiin osiin. Herkkyys noin 5 µg/ml lyhyt lineaarinen alue! Proteiinipitoisuuden määritys standardikuvaajan avulla spektrofotometrisesti Proteiiniliuoksesta valmistetaan standardinäytesarja, ja tuntemattomasta näytteestä laimennokset ja niistä mitattavat näytteet. Kaikki näytteet tehdään rinnakkaisina (duplicate)! Värin muodostuttua nollataan spektrofotometri ja mitataan näytteiden absorbanssit. Saadut absorbanssit taulukoidaan, ja piirretään niiden perusteella standardikuvaaja (proteiinimäärä vs absorbanssi). Kuvaajalta luetaan tai kuvaajan yhtälöstä lasketaan tuntemattoman näytteen absorbanssia vastaava proteiinimäärä Lasketaan näytteen pitoisuus, huomioiden mahdollinen laimennoskerroin. 12
37 38 39 Proteiinipitoisuuden määritys Esimerkki: Tehtävänä on selvittää soluhomogenaatin proteiinipitoisuus, käyttäen Bradfordin testin microassaysovellusta. Käytetty Bradfordin microassay on lineaarinen konsentraatioalueella 1,2-10 µg/ml, kun standardiproteiinina käytetään lehmän seerumin albumiinia (BSA). Tunnetun konsentraation BSA-liuoksesta valmistetaan laimennokset, joiden konsentraatiot ovat 2, 5 ja 10 µg/ml. Soluhomogenaatista tehdään 1:100, 1:200 ja 1:400 laimennokset. Bradfordin microassay lyhyesti: Eppendorf-putkessa sekoitetaan: 800 µl proteiiniliuosta (standardi- tai näytelaimennos) 200 µl Bradford-reagenssia Sekoitetaan, annetaan seisoa 5 minuuttia RT Kaikki näytteet rinnakkaisina (kaksi näytettä / laimennos)! Tehdään samalla myös nollanäyte (800 µl dh 2O + 200 µl Bradford-reagenssia). Nollataan spektrofotometri nollanäytteellä, mitataan ja taulukoidaan standardien ja näytteiden A aallonpituudella 595 nm. A 595 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 2 4 6 8 10 12 proteiinin konsentraatio (ug/ml) Näyte A 595 standardi 2 µg/ml 0,130 standardi 2 µg/ml 0,111 standardi 5 µg/ml 0,334 standardi 5 µg/ml 0,325 standardi 10 µg/ml 0,650 standardi 10 µg/ml 0,621 Piiretään millimetripaperille (tai taulukkolaskentaohjelmalla, esim. Excel) koordinaatisto, jossa x-akselilla proteiinin konsentraatio ja y-akselilla mitattu absorbanssi. Merkitään kaikki mitatut standardi-näytepisteet koordinaatistoon (ei esimerkiksi pelkästään näytepisteistä laskettuja keskiarvoja) Jos käytät millimetripaperia: käytä tila hyödyksi, pyri tekemään akseleista suunnilleen yhtä pitkät. A 595 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Näyte A 595 standardi 2 µg/ml 0,130 standardi 2 µg/ml 0,111 standardi 5 µg/ml 0,334 standardi 5 µg/ml 0,325 standardi 10 µg/ml 0,650 standardi 10 µg/ml 0,621 y = 0,0641x - 0,0011 Piirretään standardikuvaaja joko käsin siten, että se sopii mahdollisimman hyvin näytepisteiden joukkoon, tai automaattisesti taulukkolaskentaohjelmaa käytettäessä. Esitä taulukkolaskentaohjelmaa käyttäessäsi myös kuvaajan yhtälö. 0 2 4 6 8 10 12 proteiinin konsentraatio (ug/ml) Huom! Standardikuvaaja ei pakoteta leikkaamaan origon kautta! Huom! Standardikuvaajaa ei ekstrapoloida kumpaankaan suuntaan! 13
40 41 42 A 595 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 0,0641x - 0,0011 0 2 4 6 8 10 12 proteiinin konsentraatio (ug/ml) Näyte A 595 c prot (µg/ml) standardi 2 µg/ml 0,130 standardi 2 µg/ml 0,111 standardi 5 µg/ml 0,334 standardi 5 µg/ml 0,325 standardi 10 µg/ml 0,650 standardi 10 µg/ml 0,621 näytelaimennos 1:100 0,731 - näytelaimennos 1:100 0,705 - näytelaimennos 1:200 0,350 5,48 näytelaimennos 1:200 0,371 5,80 näytelaimennos 1:400 0,166 2,61 näytelaimennos 1:400 0,170 2,67 Arvioidaan kuvaajasta tai lasketaan kuvaajan yhtälöstä näytelaimennosten proteiinikonsentraatiot. Huom! Standardien alueen ylittäviä näytelaimennoksia ei huomioida! Näyte A 595 c prot (µg/ml) (laimennos) standardi 2 µg/ml 0,130 standardi 2 µg/ml 0,111 standardi 5 µg/ml 0,334 standardi 5 µg/ml 0,325 standardi 10 µg/ml 0,650 standardi 10 µg/ml 0,621 näytelaimennos 1:100 0,731 - näytelaimennos 1:100 0,705 - näytelaimennos 1:200 0,350 5,48 1,096 näytelaimennos 1:200 0,371 5,80 1,160 näytelaimennos 1:400 0,166 2,61 1,044 näytelaimennos 1:400 0,170 2,67 1,068 c prot (mg/ml) c prot (mg/ml) dd keskiarvo 1,092 Rinnakkaisnäytteet määrityksissä Rinnakaisnäytteet, replikaatit (technical replicate) määrityksen tai kokeen sisällä tehdään, jotta voidaan kontrolloida kaikissa menetelmissä olevaa, ja pipetoinnin ja muun käsittelyn vaihtelusta johtuvaa hajontaa. Proteiinin määrityksessä vähintään kaksi rinnakkaisnäytettä. Joissain herkissä menetelmissä saatetaan tehdä kolme tai jopa neljä rinnakkaisnäytettä. Biokemiallisissa kokeissa puhutaan myös biologisista rinnakkaisnäytteistä (biological replicate). Tällä tarkoitetaan rinnakkaisnäytteitä, joilla kontrolloidaan biologisissa näytteissä ja järjestelmissä luonnostaan esiintyvää hajontaa. Varo sekoittamasta keskenään biologisia ja teknisiä replikaatteja. Esimerkki: Halutaan määrittää, miten poistogeenisen ja normaalin hiirilinjan maksan sappihapon määrä eroaa toisistaan. Molempien hiirilinjojen kohdalla kerätään kahdeksan eri hiiren maksasta näyte (= kahdeksan biologista replikaattia, n = 8). Mittauksessa tehdään jokaisesta maksapalasta sappihapon määritys kahdesta teknisestä replikaatista. 14