Laskuharjoitus 1 palautus 21. 10. 2003 mennessä Juha-Matti Alakoskela, jmalakos@cc.helsinki.fi Yleistä Kurssin maksimipistemäärä on 44. Kaikista mahdollisista pisteistä 36 on jaossa kurssin tentissä, 4 laskuharjoituksista ja 4 laboratoriotöiden työselostuksista Toisin sanoen nämä saatavat pisteet eivät ole ylimääräisiä lisäpisteitä, vaan osa kurssin pisteytystä siinä kuin tenttikin. Kurssin hyväksyttyyn suorittamiseen vaaditaan 24 pistettä, minkä jälkeen arvosana kasvaa neljän pisteeen välein. Laskuharjoitusten ja tentin tehtävät tullevat myös olemaan luonteeltaan erilaisia eli laskuharjoitustehtäviä eivät ole tarkoitettu tenttitehtävien malleiksi, vaan pikemminkin erillisiksi oppimista tukeviksi harjoituksiksi. Lisäksi ehkä parempi olisi puhua vain harjoituksista, sillä laskemista ei läheskään kaikkiin tehtäviin liity. Laskuharjoituksista jaetaan raakapisteitä, joiden kokonaissumman perusteella jaetaan lopulliset neljä laskuharjoituspistettä lineaarisen asteikon mukaan. Esim. näistä laskuharjoituksista enimmillään saatavat 36 raakapistettä vastaavat 1,0 lopullista pistettä ja 18 pistettä vastaa 0,5 lopullista pistettä. Vastauksia ei tarvitse laskea/kirjoittaa käsin, vaan kaikkien tekstinkäsittely- ja laskentaohjelmien käyttö on sallittua. Käsinkin toki saa vastauksensa kirjoittaa. Vastaukset voi joko lähettää sähköpostina osoitteeseen jmalakos@cc.helsinki.fi (jos tiedosto kooltaan alle 500 kb) tai toimittaa TKK:lla laatikkoon, jonka sijainti ilmoitetaan (toivon mukaan) 15.10. 2003 sähköpostitse. Tehtävä 1: Termodynamiikan perusteista 0 9 p. Tarkoituksena ei ole nyt perusteellisesti opettaa termodynamiikkaa, vaan pikemminkin antaa sen verran puolivillaisesti puolusteltuja muistisääntöjä, että olisi helpompi hahmottaa Gibbsin vapaaenergian merkitys ja oppikirjan sisältöä. Varsinainen termodynamiikan opetus jääköön fysiikan ja kemian kursseille. Lehningerissä esitetään kaava G= H-T S eli Gibbsin vapaaenergian muutos jollekin tapahtumalle on tapahtumaan liittyvän entalpian muutos miinus lämpötila kertaa tapahtumaan liittyvä entropian muutos. Entalpia H sinänsä lienee tuttu jo lukion kemiastakin. H=U+PV, missä U on lukion fysiikasta tuttu sisäenergia. Muistutukseksi huomautettakoon, että sisäenergian muutos U=Q+W, missä Q on siirtynyt lämpömäärä ja W on systeemiin tehty tai systeemin tekemä työ. Vastaavasti on entalpian muutos H= U+P V+V P. Useimmissa biologisissa systeemeissä paine on likimain vakio, jolloin H= U+P V (koska siis P=0). Jos systeemi tekee ainoastaan laajentumistyötä, on W=-P V ja H= Q. Entropia puolestaan kuvaa tilan todennäköisyyttä. Mitä todennäköisemmin tila saataisiin sattumalta sitä suurempi on tilan entropia. S=k B lnw, missä W on mahdolliset tavat toteuttaa kyseiset tilat. A. Kaasuista ja lipideistä Sinulla kaksi samankokoista kaasupulloa, jotka liittää toisiinsa ohut ja lyhyt kannas. Systeemissäsi sinulla on yhteensä 10 identtistä kaasumolekyyliä. Mitkä ovat systeemin mahdolliset tilat kaasumolekyylien jakautumiselle kahden pullon välillä ja mikä on kuhunkin kaasumolekyylien jakaumaan liittyvä entropia yllä esitetyn perusteella? Miten tämäntapaiset asiat mahdollisesti liittyvät vesimolekyyleihin lipidien ympärillä? B. Entropian muutos -tehtävä Useimmiten on kuitenkin käytännössä mahdotonta laskea entropiaa tuolla tavalla. Tiedetään, että johonkin muutokseen liittyvä maailmankaikkeuden entropian muutos S M = S+ S Y, missä S on systeemin itsensä entropian muutos ja S Y ympäristön entropian muutos. Toisaalta mille tahansa systeemille entropia on 1 S = S + dq T 0,
missä dq on systeemiin tuotu pienen pieni lämpömäärä, jonka yli integroidaan. Ts. S= Q/T. Systeemi puolestaan tietysti ottaa tai luovuttaa vastaavan määrän lämpöä ympäristöstään, joten ympäristölle muutos on S Y =- Q/T. Lämmön tuominen systeemiin lisää entropiaa. Vaikkei yhteyden täsmällinen muoto olekaan ilmeinen, niin sinänsä lienee ymmärrettävää, että systeemin energian lisääntyessä entropiakin kasvaa. Osoita edellä annettujen tietojen perusteella, että vakiopaineessa ja -lämpötilassa pelkästään laajentumistyötä tekevän systeemin johonkin tapahtumaan liittyvä G<0 vastaa sitä, S M >0 eli sitä, että maailmankaikkeuden kokonaisentropia lisääntyy. C. Tiettyyn reaktioon A?B liittyvät systeemin entropian ja entalpian muutokset ovat seuraavanlaiset: a) H>0, S>0 b) H>0, S<0 c) H<0, S>0 d) H<0, S<0 Miten on reaktion spontaanisuuden laita lämpötilan funktiona tilanteissa a d? Kuvitellaan nyt, että eri tapauksissa olisi kyseessä jonkin molekyylin ei-kovalentti assosiaatio (sitoutuminen) esim. proteiiniin ja että pysyttäisiin lämpötilavälillä, jolla itse proteiinissa ei tapahdu merkittäviä muutoksia, esim. denaturaatiota. Mitä lämpötilakäyttäytyminen tuossa tilanteessa kertoisi sitovista voimista? Luettele, millaiset voimat tai vuorovaikutukset saattaisivat ylipäätään tällaisessa tilanteessa merkittävästi vaikuttaa (esim. gravitaation vaikutus lienee vähäinen). Tehtävä 2: Reaktioista ja Gibbsin vapaaenergiasta 0 9 p. A. Reaktiotasapaino Kyseessä on yksinkertainen reaktio, jossa A B ja toisaalta vastakkaiseen suuntaan B A. Nopeusvakiot reaktioille ovat k 1 ja k -1 (oheinen kuva). Millainen lauseke tulee tasapainovakiolle K nopeusvakioiden ja toisaalta tasapainossa saavutettujen pitoisuuksien perusteella annettuna? B. Gibbsin vapaaenergia A-kohdan mallin mukaiseen reaktioon liittyväksi Gibbsin vapaaenergian muutokseksi annetaan Lehningerissä G= G 0 # +RTln([B]/[A]), missä G on vapaaenergian muutos reaktiolle tämänhetkisillä A:n ja B:n pitoisuuksilla ja tämänhetkisissä oloissa, G 0 # on standardivapaaenergian muutos, R on yleinen kaasuvakio, T on lämpötila absoluuttisella asteikolla ja [B] ja [A] ovat tietenkin reaktanttien konsentraatiot. Jos G 0 # =-10 kj/mol ja T=27 C, niin mikä on reaktion tasapainovakio? Mitä voit sanoa erisuuntaisten osareaktioiden suhteellisista nopeuksista alussa, jos sekä A:ta että B:tä on alussa sama pitoisuus? C. ATP:n energia Miten ATP:sta reaktiossa ATP+H 2 O ADP+P i enimmillään saatava vapaaenergia riippuu ATP:n, ADP:n ja P i :n pitoisuuksista? Tapahtukoon reaktiomme koeputkessa, joten veden pitoisuudesta voi tehdä karkean oletuksen, että se on likimain sama kuin vedessä (mikä tosin ei päde solun sisällä). G '=-30,5 kj/mol ko. reaktiolle ja adenosiinifosfaattien yhteiskonsentraatio [ATP]+[ADP] on vakio = 5 mm ja [P i ]=[ADP].
Tehtävä 3: Vedestä ja osmoosista 0 9 p. A. Osmoosista ja soluväliaineesta Nivelruston soluväliaineessa on nivelruston solujen tuottamia proteoglykaaneja, negatiivisesti varautuneita kondroitiini- ja keratiinisulfaatteja, joiden voidaan katsoa olevan kiinni ympäristössään. Varauksien neutraloimiseksi nivelrusto sisältää runsaasti myös Na + -ioneja. Enimmäkseen näiden aiheuttama osmoottinen paine puolestaan imee vettä nivelrustoon kunnes tasapaino on saavutettu, mikä aiheuttaa nivelruston turpoamisen. a) Mitä tapahtuu jalan nivelten nivelrustoissa, kun makuulla ollut henkilö nousee seisomaan ja kohdistaa painonsa nivelrustojen varaan? Mikä paineita koskeva ehto siis toteutuu uudessa tasapainotilassa? (Nivelväliaineen makromolekyylien välinen repulsio ei ole vielä pystyssäkään merkittävä.) Nivelen rakenteista tarvitset ainoastaan oheisen kaavakuvan. b) Nivelrusto pystyy ajan mittaan jossakin määrin sopeutumaan pitkään jatkuneeseen rasitukseen, esimerkiksi lisääntyneeseen liikunnan harrastamiseen. Mikä mekanismi on tehtävässä annettujen ja omien tietojesi perusteella ilmeinen? c) Millaisista osista proteoglykaanit muodostuvat? B. Vesi ja biomolekyylit a) Hemoglobiinilla on kaksi konformaatiota, joista toinen (R) sitoo happea hyvin ja toinen (T) huonosti. Happea hyvin sitovalla R- eli relaxed-muodolla on suurempi pinta-ala kuin T- eli tensemuodolla. R-muodon pinnalle on näin ollen ymmärrettävästi sitoutunut enemmän vettä kuin T-muodon pinnalle. Veden aktiivisuutta (jota voit pitää vapaan veden vaikuttavana tai tehollisena konsentraationa) voidaan alentaa lisäämällä liuokseen vettä sitovaa, melko inerttiä polyetyleeniglykolia. Mihin suuntaan ja miksi muuttuu hemoglobiiniin sitoutuneen hapen määrä, jos hemoglobiiniliuoksen polyetyleeniglykolipitoisuutta lisätään? b) Amfifiiliset lipidit voivat muodostaa vesiliuoksessa erilaisia rakenteita, esimerkiksi kaksoiskalvoja tai misellejä. Jos lipidimolekyylimme on muodoltaan sellainen, että molekyylit puhtaassa vesiliuoksessa muodostavat vielä juuri ja juuri (lieriömäisen) misellin eivätkä kaksoiskalvoa, niin mitä olisi syytä olettaa kenties muodostuvan ja miksi, jos laitammekin lipidimme väkevään polyteleeniglykoliliuokseen (katso a-kohtaa). c) Miten selittyy se, että pieni Na + -ioni ei pääse läpi kanavaproteiinista, josta suurempi K + -ioni pääsee läpi? C. Veden anomaalinen käyttäytyminen Vedellä on tunnetusti anomaalista käyttäytymistä, esimerkiksi normaalipaineessa tiheyden maksimi lämpötilassa 4 C. Veden käyttäytyminen poikkeaa muutenkin yksinkertaisesta ideaalinesteestä. Tee jollakin hakukoneella haku veden anomaalisesta käyttäytymisestä ja luettele ainakin osa mielestäsi mielenkiintoisista anomalioista.
Tehtävä 4: DNA:sta 0 9 p. Coxin ja Nelsonin teoksen Lehninger Principles of Biochemistry luvuista 10, 24, 25 ja 29 pitäisi olla apua tehtävien ratkaisussa, mikäli se ei kylmiltään suju. A. DNA:n replikaatio Oheinen huonosti piirretty kuva esittää tyypillistä eukaryootin replikaatiokuplaa auki levitettynä. a) Merkitse kuvaan replikaation alkamiskohta. b) Merkitse kuvaan kaikki leading strand ja lagging strand -juosteet. c) Merkitse nuolilla replikaation suunta. d) Merkitse nuolilla replikaatiohaarukan etenemissuunta. e) Merkitse paikat, joissa tapahtuu DNA-synteesiä. f) Merkitse Okazakin fragmenttien synteesijärjestys. g) Merkitse kohdat, jossa DNA-ligaasi toimii tai tulee toimimaan. h) Merkitse kohdat, jossa primaasi toimii. B. DNA:n rakenteesta ja topologiasta DNA:n topologian säätely on keskeinen osa solujen toimintaa. Replikaatiossa ja transkriptiossa DNA:n kierteisyyttä täytyy superkierteisyyden aiheuttamia jännitteitä purkaa. Lisäksi on viitteitä siitä, että bakteerit osittain myös edesauttavat transkription aktiivisuutta tekemällä negatiivisesti superkierteisiä jaksoja runsaasti transkriboitavien geenien alueelle. Toisaalta joillakin arkkibakteereilla on ns. käänteisgyraaseja, jotka synnyttävät DNA:han positiivista superkierteisyyttä. Tarkoituksena on mahdollisesti suojella DNA:ta denaturoitumiselta. Ohessa T. Devlinin kirjan Biochemistry taulukko: entsyymi tyyppi 1 DLk toiminnot E. colin topoisomeraasi I I +1 relaksoi negatiivisesti superkierteistä DNA:ta hiivan topoisomeraasi I I ±1 relaksoi positiivisesti tai negativiivisesti superkierteistä DNA:ta E. colin topoisomeraasi II (DNA-gyraasi) II ±2 synnyttää negatiivista superkierteisyyttä DNA:han; relaksoi sekä positiivisesti että negatiivisesti superkierteistä DNA:ta E. colin topoisomeraasi IV II ±2 relaksoi positiivisesti tai negatiivisesti superkierteistä DNA:ta, ei voi synnyttää superkierteistä DNA:ta hiivan topoisomeraasi II II ±2 relaksoi positiivisesti tai negatiivisesti superkierteistä DNA:ta, ei voi synnyttää superkierteistä DNA:ta E. colin topoisomeraasi III I +1 relaksoi negatiivisesti superkierteistä DNA:ta, selvittelee limittäisten DNA-silmukoiden takertumia (=decatenation activity, catanae=ketjun renkaiden lailla toisiinsa lukittuneet renkaat) hiivan topoisomeraasi III I +1 spesifisenä substraattina heterodupleksien yksijuosteinen DNA 1 tyypin I topoisomeraasit eivät käytä ATP:ia, tyypin II topoisomeraasit käyttävät.
a) Mikä olennainen ero gyraaseilla on muihin topoisomeraaseihin verrattuna? Mitä hyötyä transkriptiossa voisi olla siitä, jos DNA on negatiivisesti superkierteistä? b) Miten tavallisen (B-DNA:n) kierteisyyden vähentäminen (underwinding) vaikuttaa Z-DNA:n esiintymistodennäköisyyteen ko. molekyylissä? c) Miksi DNA:n kaksoiskierre ylipäätään kiertyy silmukoille, jos sitä kiertää tiukemmalle? Tähän jokin kierteinen johto kuten perinteinen puhelimenjohto on omiaan kokeellista testausta varten. C. PCR Sinulla on koeputkissasi potilaalta otettu DNA-näyte, josta haluat monistaa tiettyä sekvenssiä tutkiaksesi myöhemmin restriktioentsyymien avulla sitä, onko sekvenssissä tietty tuntemasi pistemutaatio. Luonnollisesti sinulla on myös kaksi vertailunäytettä: toinen, jossa DNA:ssa on mutaatio, ja toinen, jossa DNA:ssa ei ole mutaatiota. Ohessa DNA-näytteen oletettu sekvenssi. aagctgctgc caccaaatgg cggcacgttc ctgctggttt gctaatgggc caggcctctg tgtacaggta ccatctggtc ctggtggttg agcgcaggtc gacctatccc agcacaagtg aaccaaagct ttatataact gcccgtggct tttttttttt cccccgtcat ttggctgtca aaaatcataa cttgggaaat gggccattgg gtgatgtgcg cacgcatcca cgggtggcag cccagcatca gcttggaagt aagactctct gaaccttcca tccccaggag ctctggccac cactgagtac ctgtccttat agagttcaag gatttctaat cggggagcgt atttgtcaag gaatctggac gttgaaaaaa atgagagaac gtgagaagaa tacaaatcac agccagtcca gtgctccaac ccagaaaata cattgttctt aagttatgtg acgccagttt gcctccggag tgtccgttac tacacacctg cacacctgtc caggcctgtt tggccctcag ctatgttttc ctgggttcct atcctcaagt cagccggggc tctcattcag agcctaggaa agaaggaaag gaaggcagga aagtgtctag tgccacctgt acaggcacag cagaaaacta gccagagaat ccatcaggag gaagaccttg gatcctgagg ctccagaaca agaaagagat ttaggagaga aagtagcttc tagacctgga gtccttgact tctgtttccc aagacctgtg cctccaggac caggggtgcc acctggcatc ggagcactgg ctctgtctgg tttatctaga gacttgcaga tatcaagcct tctgggtgag cccggaggaa ctgcgcttct ctgacgtggg caggctaagt gaatatcttg aattgcaggt agggtccctg gagcaagcca tgctggatgc cctagtcctg gacagagtgg attttgtgaa attactcata gaaaatggag taagcatgca ccgttttctc accatctcca gactagagga actgtacaat acggtagggc caagctaaga tgccttttca tttctctttc tcttctgttt gtttccctca tcctgcctgc ccataccccc atgcctgtga ttctcttcct gtctctcctg tgatgcatgc gtcattcctc acttgcattc ccttacacct ggatagacga cagacaccga gtcaccaaga actcacttgt tctaactgct cagttgtcag catcttaggc aaaaggtgtc gtgatcacca tagggcgttg ttctcagatt ctaactcaaa accacaagca ggtctctgtc aattggaaca cacgcactct gtaagcccag ggaggtgttg gtgacaaata gtgcaaggag ggttggttta gcaccaacca tcaaatgatg cttattaagt agcttgtatc accatgccat cctcggagct actaagttca cacacacacg tgcacacgca cacacataca cacatgcaca cacacatgca cacaaacaca tacacacatg cacacatact cacacacaca tacacacatg cacacacaca cacacatgca cacacacaca tgcacacaca cgcatgcaca cacaccctgc acccccacac catgatagaa agtataaaat accctggaat catccaaaaa catgtgtggt agtggctgtt ctttgcagtg gcattcacta aaaaagccaa gtgtgtttaa agaactgatg ttgttttttt taaccatttc acagatgaga aaactgtggc agtcttagtc tatttgtgcg gccacaacag aatgcctgag gctgagtaat ttataaagaa catgctttcc tttgtcacag ttctggaggc tggacgtcca agatcaaggt gccaggagct tcactatgta gtgagagtca ctttgtcttt ccagaatgtg tccactggaa ggggcaaacg ctgtcctctt aggacagaaa ggttggaagt acagaaatat gaacctactt ctgtctagcc ctcaattcca cttacaaaga aggtaccctt gtaaccaagt cacctatcac ctaacagcct catctccccc actgcatagg aaatgcagca tgaattttgt agtcacaaaa gtgtaaaaca tacacagagt aaaacataca cagagactaa gaagtagttg attaaaggtc ctagatctct gaataacaac aacggcagaa agaactcagt aacaaattta agcctctttt cagaggttgc tttttgattc actggccaca atgtctgtcc cagcaccctg agtgtgatgg gatagagcta tggaccggcc cggactaaag gcagacggta ggtaatagca gctagcttca tcttaatgcc actgcaggaa gtaagtcagc tggcagaata gatccagact tctgcttccc ctacaagctt gtcttgcctc aacacactga gacttacagt aatgaataat gggcatcatg acttagaaat cagttagaga gttatggcgg tacgaagggt cattccaaag cctgg a) Millaiset alukkeet tarvitset sekvenssiäsi varten PCR-monistukseen?
PCR-sykli koostuu seuraavista toistettavista lämpötiloista: 95 C 54 C 72 C ( takaisin alkuun) b) Tehdessäsi tavalliseen tapaan PCR:ää, huomaat kuitenkin sellaisen kiusallisen seikan, että jostakin syystä alukkeesi tuntuu sitoutuvan epäspesifisesti muuallekin DNA:han. Kyse ei ole siitä, että DNA:ssa olisi muualla alukkeesi täsmällisiä vastinsekvenssejä, vaan siitä, että aluke sitoutuu sekvensseihin, jotka ovat lähellä sitä. Neuvoksi sinua kehotetaan kohottamaan PCR:n yhden vaiheen lämpötilaa. Mistä vaiheesta on kyse ja miksi lämpötilan nostaminen voisi auttaa? c) Miksi synteesivaiheen lämpötila voi olla korkeampi kuin alukkeen sitoutumisvaiheen lämpötila? d) Miksi sinun tarvitsee lisätä PCR-putkeesi ainoastaan lämmönkestävää DNA-polymeraasia eikä mitään muita replikaatiossa tarvittavia entsyymejä? e) Pilkot tuottamasi DNA-pätkän restriktioentsyymillä ja teet saman käsittelyn myös molemmille kontrolleillesi. Ajat reaktiotuotteistasi agaroosigeelielektroforeesin ja saat seuraavanlaisen kaavakuvan mukaisen tuloksen: Mistä on kyse? Onko potilaalla tauti vai ei? Voitko ylipäätään ratkaista sitä näillä tiedoilla? Mistä on kyse, jos potilaalla on tauti, ja mistä on kyse, jos potilaalla ei ole tautia?