1111111111 111111111 1 1111101111)31 111111j1!1 11 1111111111 11111 (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 28.11.97 (51) Kv.lk.6 - Int.k1.6 SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen A 61K 39/12, 39/42, C 12N 7/00 G 01N 33/577, A 61K 39/15 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 910497 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 01.02.91 (24) Alkupäivå - Löpdag 02.08.89 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 01.02.91 (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/US89/03286 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 02.08.88 US 227311 P (73) Haltija - Innehavare 1. The University Of Maryland, College Park Campus, 2114 Lee Building, College Park, MD 20742, USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Snyder, David B., 9525 Franklin Avenue, Seabrook, MD 20706, USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab, Jaakonkatu 3 A, 00100 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benåmning Menetelmä ja testipakkaus siipikarjan bursaalitautia indusoivan viruksen havaitsemiseksi Förfarande och testpackning för att upptåcka ett virus som förmår inducera en bursalsjukdom i en fjåderfåpopulation (83) Mikro-organismitalletus - Deposition av mikroorganism: HB 9437 ATCC HB 9438 ATCC HB 9490 ATCC HB 9746 ATCC 1-792 CNCM 1-793 CNCM (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer US A 4530831 (A 61K 39/12), WO A 85/02545 (A 61K 39/12), WO A 86/07060 (C 07H 21/04), Cho, B.R., Snyder, D.B., Lana, D.P. ja/och Marquardt, W.W., "An immunoperoxidase monodonal antibody stain for rapid diagnosis of infectious bursal disease", Biological Abstracts vol. 84 ref 120283, Fahey, K.J., O'Donnel, I.J. ja/och Bagust, T.J., "Antibody to the 32K Structural Protein of Infectious Bursal Disease Virus Neutralizes Viral Infectivity in vitro and Confers Protection on Young Chickens", Journal of General Virology, vol. 66 (1985) p. 2693-2702 Azad, A.A., Fahey, K.J., Barrett, S.A., Erny, K.M. ja/och Hudson, P.J., "Expression in Escherichia coli of c DNA Fragments Encoding the Gene for the Host-Protective Antigen of Infectious Bursal Disease Virus", Virology, vol. 149 (1986) p. 190-198 (57) Tiivistelmä - Sammandrag On tunnistettu uusi virus, jota eivät mo- Ett nytt virus som inte neutraliseras av noklonaaliset vasta-aineet, jotka sitou- eller binds av monoklonala antikroppar, tuvat ja neutraloivat kaikki nykyisen ta- vilka binder eller neutraliserar alla nu son IBD-rokotteet, neutraloi, ja joka ky- kända IBD vaccin, och kapabelt att indukenee indusoimaan tarttuvan bursaalitau - cera smittosam bursal sjukdom hos fjäderdin siipikarjassa, olennaisesti puhtaassa fä identificeras, i väsentligen ren forr. muodossa. Esitetään testi-pakkaus ja nää- En testförpackning och analys för närvarc ritys viruksen läsnäololle yhdessä roko- av viruset visas, tillsammans med vacci - tetta sisältävän viruksen kanssa. net som innehåller viruset.
Menetelmä ja testipakkaus siipikarjan bursaalitautia indusoivan viruksen havaitsemiseksi Tämä keksintö koskee siipikarjateollisuutta ja erityisesti tarttuvaa bursaalitautia, 5 joka on tämän teollisuudenalan tunnettu vitsaus. Tarkemmin sanottuna on tunnistettu uusi virus, ja tässä esitetään menetelmiä käyttää tätä virusta ja siihen liittyvää tietoa. Tarttuva bursaalitauti (IBD) on aikaisemmin tunnistettu merkittävänä taloudellisena rasituksena siipikarjateollisuudessa. Tämän sairauden, joka koskee pääasiassa 10 kananpoikateollisuutta, aiheuttavat virulentit kenttävirukset, jotka aiheuttavat erittäin tarttuvan, immunosuppressiivisen tautitilan. Tämä olotila pahentaa tietenkin muita tartuntoja kananpoikapopulaatiossa. Tämä tauti on havaittu sen vaikutuksesta nuoriin kananpoikiin ja sitä kuvataan leesioilla Fabriciuksen bursan (suolen kateenkorvarauhanen) imukeräsissä. 15 US-patenttihakemuksessa sarjanumero 07/061 083, jätetty 12. kesäkuuta 1987, tämän keksinnön keksijä ja muut, ilmoittivat kanden monoklonaalisen vasta-aineen kehittymisestä, jotka olivat herkkiä ja kykenivät neutraloimaan kaikki tunnetut virukset, joiden oli osoitettu indusoivan IBD:tä. Tuon hakemuksen täydellinen esitys on liitetty tähän viitteeksi. Tässä US-hakemuksessa esitetään monoklonaaliset vasta- 20 aineet, erityisesti ne, jotka on tunnistettu R63:ksi ja B69:ksi, joita hybridoomasolulinjat, jotka on talletettu ATCC-9437:nä ja HB-9490:na, jotka ovat edelleen arvokkaita neutralisoivina monoklonaalisina vasta-aineina, muodostaen passiivisen rokotteen tunnettuja viruskantoja, jotka indusoivat IBD:tä, vastaan. Siitä huolimatta siipikarjateollisuuden lähihistoriassa, erityisesti Yhdysvaltojen itä- :.. 25 rannikolla, on annettu yhä suurempia määriä ilmoituksia tarttuvan bursaalitaudin puhkeamisista, joita ei voida täysin estää millään tunnetuilla rokotteilla, mukaan luettuina ne, jotka on valmistettu edellä puhutuista monoklonaalisista vasta-aineista. : Johtuen siitä vakavasta taloudellisesta paineesta, jonka nämä kontrolloimattomat puhkeamiset asettavat siipikarjateollisuudelle, on suoritettu merkittävän asteista 30 tutkimusta puhkeamisen leviämisistä ja syistä, miksi tunnetut rokotteet eivät onnistu estämään puhkeamisia. Rokotevalmisteissa tai niiden antotavassa ei ole havaittu mitään syytä. Siitä huolimatta kontrolloimattomia puhkeamisia tapahtuu jatkuvasti.
2 Siispä tekniikan tason toistuvaksi ongelmaksi jää määrittää tämän tarttuvan bursaalitaudin puhkeamiset, jotka ovat resistenttejä kaikille tunnetuille rokotteille, ja määrittää menetelmä, jolla estetään sellaiset puhkeamiset. Nyt on havaittu, että pääasiallinen virus, joka on vastuussa tarttuvasta bursaalitau- 5 dista siipikarjassa pitkin USA:n itärannikkoa, on uudestaan tunnistettu varianttikanta, jolla on muuttuneet tunnistuskohdat, sellaiset, ettei aikaisemmin kehitetyt monoklonaaliset vasta-aineet kykene neutraloimaan tai sitomaan virusta. Nämä monoklonaaliset vasta-aineet kuitenkin neutraloivat ja reagoivat kaikkien nykyisten tunnettujen IBD-rokotteiden lajin kanssa. Virus on eristetty olennaisesti puhtaassa 10 muodossa ja voidaan tunnistaa sillä, etteivät monoklonaaliset vasta-aineet R63 ja B69 kykene sitoutumaan siihen, kun taas toinen tavallinen ei-neutraloiva vasta-aine, samoin kuin standardi polyklonaaliset antiseerumit, joita saadaan USDA:lta, sitoutuvat siihen positiivisella tavalla. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa. 15 Kuten edellä huomattiin, uutta virusta, jota on saatu ainakin 116 uudesta eristyksestä, jotka on otettu Yhdysvaltojen itä- ja kaakkoisosista, ei mikään aikaisemmin kehitetty ja kuvattu monoklonaalinen vasta-aine neutraloi. Täten uuden viruksen läsnäoloa ei voida tunnistaa millään normaaleilla menetelmillä. Yhdistämällä negatiivinen ja positiivinen testaus voidaan kuitenkin viruksen läsnäolo ja eristys saada 20 aikaiseksi. Erityisesti monoklonaalinen vasta-aine, jota merkitään R63, joka neutralisoi kaikki aikaisemmin tunnistetut serotyyppi yksi -viruskannat ja ainakin yhden serotyyppi kanden, antoi negatiiviset vastaukset antigeenin sieppaus-elisa:ssa, kun annettiin reagoida homogenisoitujen bursien kanssa, jotka oli saatu kananpojista, joista saatiin 25 23 eristystä. Samat tulokset havaittiin MCA-B69:llä, joka on selektiivinen D78- viruskannalle ja tietyille aikaisemman lajin klassisille kannoille, jonka kerran. ajateltiin olevan Yhdysvaltojen vallitseva kanta. Samaan aikaan toinen MCA, jota ' : merkitään B29, joka ekspressoituu hybridoomasolulinjassa, joka on talletettu : ATCC:hen talletusnumerolla MB 9746, Budapestin sopimuksen mukaisesti, ja joka ' ' 30 ei neutraloi virusta, sitoutuu siihen siitä huolimatta, samoin kuin kaikkiin tunnettuihin olemassa oleviin virusrokotteisiin. Lisäksi polyklonaaliset IBDV-antiseerumit, joita käytetään standardeina ja joita saadaan USDA:n kansallisesta eläinlääkärin palvelulaboratoriosta Amesissa, Iowassa ADU8701-merkinnällä, sitoutuu uuteen rokotteeseen antigeenin sieppaus-elisa:ssa. Muita ei-neutraloivia vasta-aineita, jotka 35 sitoutuvat virukseen, voidaan tunnistaa, ja niitä voidaan tuottaa kuten tavanomaisia
3 monoklonaalisia vasta-aineita. Keksintö ei rajoitu mihinkään positiiviseen testitekijään. Koska viruksen kokonaiskoko on melko suuri verrattuna mihin tahansa saatavilla olevaan neutraloivaan kohtaan, on olemassa laaja potentiaalinen kenttä sellaisia positiivisia testitekijöitä ja polyklonaalisia antiseerumeja. 5 Täten viruksen läsnäolo voidaan nykyään parhaiten määrittää negatiivisella testauksella antigeenin sieppaus-elisa:ssa, joka on R63:a ja B69:ää varten ja positiivisella testauksella joko B29:llä tai polyklonaalisilla antiseerumeilla. Pitäisi kuitenkin huomata, että IBD-viruksen läsnäolon morfologinen tai oireenmukainen vahvistaminen liittyneenä siihen, ettei R63 MCA kykene sitoutumaan antigeeninäytteeseen, on 10 selvä todiste viruksen läsnäolosta. Jotta alunperin tunnistettaisiin uuden viruksen läsnäolo, kerättiin 116 kanapojan populaatio, bursat saatiin 116 erillään olevasta parvesta Delmarvan niemimaan ja Kaakkois-Yhdysvaltojen siipikarjan kasvatusalueilta. 116 kananpoikapopulaation bursat homogenisoitiin asettamalla yksi bursa 1 ml:aan SGPA-EDTA-puskuria ja 15 hiertämällä seosta huhmareella ja survimella kunnes saatiin nesteen kaltainen koostumus. Tämä materiaali kirkastettiin sentrifugoimalla alhaisella nopeudella ja supernatantit analysoitiin AC-ELISA:lla. Tässä määrityksessä 96 kuopan Immulon-maljat (saatu Dynatechiltä, Virginia) peitettiin 0,1 ml:lla 2 gg/m1 Staphylococcus aureuksen proteiini A:ta peitinpuskurissa. 20 18 h 4 C:ssa jälkeen maljat tyhjennettiin. Lisättiin 1/10 laimennukset happosupernatanttia, joka oli kerätty hybridoomaviljelmistä, jotka erittivät R63- ja B69 IBDvirusspesifistä MCA:ta, fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, jossa oli TWEEN 20 ja 2 % rasvatonta kuivattua maitojauhetta vuorottain. 24 h reaktion jälkeen 4 C:ssa maljat kopautettiin kuiviksi ja suljettiin 30 minuutiksi huoneenlämpötilaan. Sulke-... 25 misen jälkeen maljat tyhjennettiin ja koputeltiin kuiviksi. Lisättiin 0,1 ml laimennus-. sarjaa jokaisesta homogenisoidusta bursaalisuspensionäytteestä peitetyille maljoille ja inkubaation jälkeen maljat tyhjennettiin, koputeltiin kuiviksi ja pestiin 3 kertaa 3 ' min PBS-T:llä. Sitten jokaiseen kuoppaan laitettiin 0,1 ml biotiinilla leimattua R63 : MCA-konjugaattia, joka oli laimennettu PBS-T + NFDM:ään. 1 h inkubaation jäl- "". 30 keen maljat tyhjennettiin jälleen ja pestiin. Sen jälkeen lisättiin jokaiseen kuoppaan 0,1 ml streptavidiini-piparjuuriperoksidaasikonjugaattia. 1 h inkubaation jälkeen maljat tyhjennettiin jälleen ja pestiin. Tämän jälkeen lisättiin TMB-subsh -aattia. Lyhyen inkubaatiojakson jälkeen testit luettiin 650 nm:ssä automaattisen spektrofotometrin avulla. Siten bionyloitua R63 MCA:ta käytettiin signaalina positiivisille reak- 35 tioille viruksen ja R63- ja B69-kaivojen välillä, kun taas samanlainen AC-ELISA suoritettiin polyklonaali anti-ibdv-seerumeilla antamaan signaali B29-vangitsemi-
4 sista. Vaihtoehtoisesti bionyloitua B29:ää voitiin käyttää samaan tarkoitukseen. Lisäksi mitä tahansa R63:n, B69:n, B29:n polykloonin leimaamisen muotoa voidaan käyttää. Kaikki 116 kantaa osoittivat negatiivista reaktiivisuutta R63:n ja B69:n kanssa, mut- 5 ta olivat erittäin positiivisia B29 MCA:lle, joka yhdistyy ei-neutraloivalla tavalla. Koska R63 on neutraloiva vasta-aine kaikille aiemmin tunnistetuille IBD-viruksille, määritys, jossa käytetään vain R63:a positiivisena ei-neutraloivana määrityksenä, on riittävä. Tähän yhdistetty B69:n käyttö antaa suuremman varmuustason ja voidaan käyttää lisämäärittelemään ja erottamaan tekniikan tason IBDV-kantoja. 10 Viidestä tunnistetusta eristetystä viruskannasta otetut näytteet, jota virusta ekspressoi Pasteur-instituutissa Budapestin sopimuksen mukaisesti talletusnumeroilla i.-792 ja i.-793 talletetut talletukset, kerättiin ja annettiin reagoida R63 MCA:n kanssa ja ympättiin SPF-kananpoikiin. 5 päivää ymppäyksen jälkeen näille kananpojille ja eiympätyille kananpojille tehtiin ruumiinavaus. Ne linnut, jotka oli ympätty kerätyillä 15 näytteillä ja jotka merkattiin NegaVac (NV), osoittivat leesioita, jotka olivat yhdenmukaisia vain tarttuvan bursaalitaudin kanssa. Varmuuden vuoksi linnuista otettiin antiseerumit 11 päivää ymppäyksen jälkeen ja testattiin epäsuoralla ELISA:11a ja osoitettiin serologinen muunnos IBDV:ksi, mutta ei muuksi vastaavaksi siipikarjataudiksi. Näiden lintujen bursaalinäytteet homogeni- 20 soitiin ja tehtiin toinen kierros R63:n ja B69:n läsnäollessa samanlaisin tuloksin. Molemmilla kierroksilla, skaalana 0-9, reaktiivisuus B29 MCA:n kanssa oli tasolla 9 ja reaktiivisuus B69:n ja R63:n kanssa oli tasolla 0. Täten tunnistettiin puhdas valmiste aikaisemmin tunnistamattomasta viruksesta, joka ei muistuta mitään tunnettua rokotetta R63- ja B69-neutralointikohdissa, joka on valmistettu viruksesta tai muulla 25 tavoin. Tekeillä on lisää monoklonaalisia vasta-aineita, proteiini-informaatiota ja RNA-analyysi. Keksinnön mukaisesti saadaan aikaan menetelmiä, joilla voidaan viruksen läsnäolo tunnistaa annetussa siipikarjapopulaatiossa suhteellisen nopealla ja tehokkaalla ELISA-määrityksellä, jossa jos reaktio R63:een yksinään tai R63:een ja B69:ään 30 yhdessä on negatiivinen, mutta reaktio polyklonaaliseen rokotteeseen tai B2-9:ään on positiivinen, niin viruksen läsnäolo on vahvistettu. Hybridoomasolulinja, joka on talletettu Budapestin sopimuksen mukaisesti ATCC:hen, talletusnumerolla HB 9746, ekspressoi B29:ää. Tämän hakemuksen hakemiseksi ainakin 333 parvea on testattu. Näistä 116 olivat testissä negatiivisia R63 monoklonaalista vasta-ainetta
5 vastaan yksinään tai R63 ja B69 yhdessä ja olivat positiivisia B29 MCA:lle. Täten uusi virus näyttää olevan vallitseva ja kasvava tekijä aiheuttamassa tarttuvaa bursaalitautia kananpojissa. Tämän hakemuksen jättöpäivänä on epävarmaa, onko uudelleen tunnistettu virus 5 alatyyppi vai muodostaako se uuden IBDV-serotyypin, vaikka on olemassa huomattava todiste siitä, että se on serotyyppi yksi -alatyyppi. Joka tapauksessa on saavutettu viruksen läsnäolon tunnistaminen samalla tavalla riippumatta siitä, onko se kanta vai serotyyppi ja sen mukaisesti keksintö ei rajoitu siihen. Tämän keksinnön lukuisat muunnelmat ja vaihtelut ovat mandollisia edellä olevien 10 tekniikkojen valossa. Sen vuoksi on ymmärrettävää, että oheisten patenttivaatimusten puitteissa keksintöä voidaan kuvata vaihtoehtoisesti tai toteuttaa käytännössä muutoin kuin tässä on erityisesti kuvattu.
6 Patenttivaatimukset 1. Testipakkaus, jolla havaitaan viruksen, joka kykenee indusoimaan tarttuvan bursaalitaudin siipikarjapopulaatiossa, läsnäolo, tunnettu siitä, että se koostuu hybridoomasolulinjan ATCC HB-9437 tuottamasta monoklonaalisesta vasta-aine 5 R63 -valmisteesta, ei-neutraloivasta testitekijävalmisteesta sisältäen vasta-aineita tarttuvaan bursaalitautiin ja keinoista ylläpitää mainitut valmisteet kosketuksessa bursaalinäytteen kanssa, joka on saatu mainitusta populaatiosta. 10 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että siinä on lisäksi hybridoomasolulinjan ATCC HB-9490 tuottama monoklonaalinen vasta-aine B69 -valmiste. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että mainittu testitekijä sisältää vasta-aineita, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu hybridooma- 15 solulinjan ATCC MB-9746 tuottamasta monoklonaalisesta vasta-aineesta B29 ja vasta-aineista, joita on polyklonaalisissa antiseerumeissa USDA ADV 8701. 4. Menetelmä, jolla havaitaan virus, joka kykenee indusoimaan tarttuvan bursaalitaudin siipikarjapopulaatiossa ja jota hybridoomasolulinjan ATCC HB-9437 tuottama monoklonaalinen vasta-aine R63 ei neutraloi, menetelmän käsittäessä vaiheet, 20 joissa annetaan bursaalikudoksen olla kosketuksissa erikseen monoklonaalisen vastaaineen R63 kanssa ja positiivisen ei-neutraloivan tekijän kanssa, joka kykenee sitoutumaan mainittuun virukseen, ja verrataan sitoutumisen astetta, joka havaitaan mainittujen näytteiden ja mainitun 25 monoklonaalisen vasta-aineen ja testitekijän välillä, tunnettu siitä, että suuri sitoutumisen aste mainitun näytteen ja mainitun testitekijän välillä yhdessä alhaisen sitoutumisasteen kanssa R63:n ja mainitun näytteen välillä on osoitus mainitusta viruksesta..: 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu testi- 30 tekijä sisältää hybridoomasolulinjan ATCC MB-9746 tuottamaa monoklonaalista vasta-ainetta B29 tai vasta-aineita, joita on polyklonaalisissa antiseerumeissa USDA ADV 8701. 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, johon lisäksi kuuluu, että annetaan mainittujen näytteiden olla kosketuksissa hybridoomasolulinjan ATCC HB-
7 9490 tuottaman monoklonaalisen vasta-aineen B69 kanssa, tunnettu siitä, että niiden välinen alhainen sitoutumisaste on lisäosoituksena mainitun viruksen läsnäolosta. 7. Menetelmä, jolla havaitaan virus, joka kykenee indusoimaan tarttuvan bursaa- 5 litaudin siipikarjapopulaatiossa ja jota hybridoomasolulinjan ATCC HB-9437 tuottama monoklonaalinen vasta-aine R63 ei neutraloi, menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa havaitaan tarttuvan bursaalitautiviruksen läsnäolo mainitussa populaatiosta morfologisella tai patologisella tarkastelulla ja 10 annetaan bursaalikudosnäytteiden, jotka on otettu mainitusta populaatiosta, olla kosketuksissa monoklonaalisen vasta-aineen R63 kanssa ja huomioidaan niiden välisen sitoutumisen aste, tunnettu siitä, että niiden välisen sitoutumisen alhainen aste indikoi mainitun viruksen läsnäoloa. 15 Patentkrav 1. Testförpackning för att upptäcka närvaro av ett virus som förmår inducera en smittosam bursalsjukdom i en fjäderfäpopulation, kännetecknad av att den består av ett monoklonalt antikroppspreparat R63 producerat av hybridomcellinje ATCC HB- 20 9437, ett icke-neutraliserande testfaktorpreparat som innehåller antikroppar mot smittosam bursalsjukdom och medel att hålla nämnda preparat i beröring med ett bursalprov erhållet från nämnda population.. : 25 2. Testförpackning enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den ytterligare inne-, håller ett monoklonalt antikroppspreparat B 69 producerat av hybridomcellinje I.... ATCC HB-9490. I 3. Testförpackning enligt patentkrav 1, kännetecknad av att nämnda testfaktor innehåller antikroppar valda i gruppen bestående av monoklonal antikropp B29 30 producerad av hybridomcellinje ATCC MB-9746 och antikroppar som förekommer i polyklonala antiserum USDA ADV 8701. 4. Förfarande för att upptäcka ett virus som förmår inducera en smittosam bursalsjukdom i en fjäderfäpopulation och som inte neutraliseras av monoklonal anti-
8 kropp R63 producerad av hybridomcellinje ATCC HB-9437, varvid förfarandet omfattar steg för att kontakta bursalvävnad skilt med monoklonal antikropp R63 och en positiv ickeneutraliserande faktor som förmår bindas till nämnda virus, och 5 jämföra den bindningsgrad som observeras mellan nämnda prov och nämnda monoklonala antikropp och testfaktorn, kännetecknat av att en hög bindningsgrad mellan nämnda prov och nämnda testfaktor tillsammans med en låg bindningsgrad mellan R63 och nämnda prov är en indikator på nämnda virus. 10 5. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att nämnda testfaktor innehåller monoklonal antikropp B29 producerad av hybridomcellinje ATCC MB-9746 eller antikroppar som finns i polyklonala antiserum USDA ADV 8701. 6. Förfarande enligt patentkrav 4, vilket vidare omfattar att nämnda prov kontaktas med monoklonal antikropp B69 producerad av hybridomcellinje ATCC-9490, 15 kännetecknat av att en låg bindningsgrad mellan dem är en ytterligare indikator på närvaro av nämnda virus. 7. Förfarande för att upptäcka ett virus som förmår inducera en smittosam bursalsjukdom i en fjäderfäpopulation ocn inte neutraliseras av monoklonal antikropp R63 producerad av hybridomcellinje ATCC HB-9437, varvid förfarandet omfattar 20 steg för att identifiera närvaro av smittosam bursalsjukdomsvirus i nämnda population med morfologisk eller patologisk undersökning och kontakta bursalvävnadsprov tagna från nämnda population med monoklonal antikropp R63 och beakta deras inbördes bindningsgrad, kännetecknat av att en låg 25 bindningsgrad mellan dem är en indikator på närvaro av nämnda virus.