Iiimilivil!10001p,603!

Transkriptio

1 Iiimilivil!10001p,603! (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSICRIFT (10) FI B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (51) Kv.lk.6 - Int.k1.6 A 61K 39/12, 39/42 C 12N 7/00, A 61K 39/15 (21) Patenttihakemus - Patentansökning (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/US89/03286 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet US P (73) Haltija - Innehavare 1. The University of Maryland, College Park Campus, 2114 Lee Building, Collage Park, MD 20742, USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Snyder, David B., 9525 Franklin avenue, Seabrook, MD 20706, USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab, Jaakonkatu 3 A, Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä rokotteen valmistamiseksi siipikarjan tarttuvaa bursaalitautia vastaan Förfarande för framstållning av vaccin mot den smittsamma bursalsjukdomen hos fjäderfå (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta - Avdelad från ansökan: (patentti - patent ) (83) Mikro-organismitalletus - Deposition av mikroorganism: 792 CMCM 793 CMCM 9437 ATCC 9438 ATCC 9490 ATCC 9746 ATCC (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer (57) Tiivistelmå - Sammandrag On tunnistettu uusi virus, jota eivät monoklonaaliset vastaaineet, jotka sitoutuvat ja neutraloivat kaikki nykyisen tason IBD-rokotteet, neutraloi, ja joka kykenee indusoimaan tarttuvan bursaalitaudin siipikarjassa, olennaisesti puhtaassa muodossa. Esitetään menetelmä rokotteen valmistamiseksi tätä virusta vastaan. Ett nytt virus som inte neutraliseras av eller binds av monoklonala antikroppar, vilka binder eller neutraliserar alla nu kända IBD-vaccin, och kapabelt att inducera smittosam bursal sjukdom hos fjäderfå identificeras, i väsentligen ren form. Presenteras ett förfarande för framställning av ett vaccin mot detta virus.

2 Menetelmä rokotteen valmistamiseksi siipikarjan tarttuvaa bursaalitautia vastaan 5 Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta Tämä keksintö koskee siipikarjateollisuutta ja erityisesti tarttuvaa bursaalitautia, joka on tämän teollisuuden alan tunnettu vitsaus. Erityisesti on tunnistettu uusi virus, ja tässä esitetään menetelmiä käyttää tätä virusta ja siihen liittyvää tietoa rokot- 10 teen valmistamiseksi. Tarttuva bursaalitauti (IBD) on aikaisemmin tunnistettu merkittävänä taloudellisena rasituksena siipikarjateollisuudessa. Tämän taudin, joka koskee pääasiassa kananpoikateollisuutta, aiheuttavat virulentit kenttävirukset, jotka aiheuttavat erittäin tart- 15 tuvan, immunosuppressiivisen taudintilan. Tämä olotila pahentaa tietenkin muita tartuntoja kananpoikapopulaatiossa. Tämä tauti on havaittu sen vaikutuksesta nuoriin kananpoikasiin ja sitä kuvataan leesioilla Fabriciuksen bursan (suolen kateenkorvarauhanen) imukeräsissä. 20 US-patenttihakemuksessa 07/ , jätetty 12. kesäkuuta 1987, tämän keksinnön keksijä ja muut ilmoittivat kanden monoklonaalisen vasta-aineen kehittymisestä, jotka olivat herkkiä ja kykenivät neutraloimaan kaikki tunnetut virukset, joiden oli osoitettu indusoivan IBD:tä. Tuon hakemuksen täydellinen esitys on liitetty tähän viitteeksi. Tässä US-hakemuksessa esitetään monoklonaaliset vasta-aineet, erityises- 25 ti ne, jotka on tunnistettu R63:ksi ja B69:ksi, joita hybridoomasolulinjat, jotka on tallennettu ATCC-9437:nä ja HB-9490:na, jotka ovat edelleen arvokkaita neutralisoivina monoklonaalisina vasta-aineina, muodostaen passiivisen rokotteen tunnettuja viruskantoja, jotka indusoivat IBD:tä, vastaan. 30 Siitä huolimatta siipikarjateollisuuden lähihistoriassa, erityisesti USA:n itä-rannikolla, on annettu yhä suurempia määriä ilmoituksia tarttuvan bursaalitaudin puhkeamisista, joita ei voida täysin estää millään tunnetuilla rokotteilla, mukaan luettuina ne, jotka on valmistettu edellä mainituista monoklonaalisista vasta-aineista. Johtuen siitä vakavasta taloudellisesta paineesta, jonka nämä kontrolloimattomat puhkea- 35 miset asettavat siipikarjateollisuudelle, on suoritettu merkittävän asteista tutkimusta puhkeamisen leviämisistä ja syystä, miksi tunnetut rokotteet eivät onnistu estämään puhkeamisia. Rokotevalmisteissa tai niiden antotavassa ei ole havaittu mitään syytä. Siitä huolimatta kontrolloimattomia puhkeamisia tapahtuu jatkuvasti.

3 2 Siispä tekniikan tason toistuvaksi ongelmaksi jää määrittää tämän tarttuvan bursaalitaudin puhkeamiset, jotka ovat resistenttejä kaikille tunnetuille rokotteille ja määrittää menetelmä, jolla estetään sellaiset puhkeamiset. 5 Nyt on havaittu, että pääasiallinen virus, joka on vastuussa tarttuvasta bursaalitaudista siipikarjassa pitkin USA:n itärannikkoa, on uudestaan tunnistettu varianttikanta, jolla on muuttuneet tunnistuskohdat, sellaiset ettei aikaisemmin kehitetyt monoklonaaliset vasta-aineet kykene neutraloimaan tai sitomaan virusta. Nämä monoklonaaliset vasta-aineet kuitenkin neutraloivat ja reagoivat kaikkien nykyisten tunnettu- 10 jen IBD-rokotteiden lajin kanssa. Virus on eristetty olennaisesti puhtaassa muodossa ja voidaan tunnistaa sillä, etteivät monoklonaaliset vasta-aineet R63 ja B69 kykene sitoutumaan siihen, kun taas toinen tavallinen ei-neutraloiva vasta-aine, samoin kuin standardi polyklonaaliset antiseerumit, joita saadaan USDA:lta, sitoutuvat siihen positiivisella tavalla. 15 Uutta virusta voidaan käyttää tapetussa muodossa tapettuina rokotteina indusoimaan vasta-aineita, jotka ovat resistenttejä uudelle virukselle ja voidaan käyttää heikennetyssä muodossa tai muuten geneettisesti muunnettuna valmistamaan joko elävää tai tapettua virusrokotetta. 20 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa. Kuten edellä huomattiin, uutta virusta, jota on saatu ainakin 116 uudesta eristyksestä, jotka on otettu USA:n itä- ja kaakkoisosista, ei mikään aikaisemmin kehitetty ja 25 kuvattu monoklonaalinen vasta-aine neutraloi. Täten uuden viruksen läsnäoloa ei voida tunnistaa millään normaaleilla menetelmillä. Yhdistämällä negatiivinen ja positiivinen testaus voidaan kuitenkin viruksen läsnäolo ja eristys saada aikaiseksi. Erityisesti monoklonaalinen vasta-aine, jota merkitään R63, joka neutralisoi kaikki 30 aikaisemmin tunnistetut serotyyppi yksi -viruskannat ja ainakin yhden serotyyppi kanden, antoi negatiiviset vastaukset antigeenin sieppaus-elisa:ssa, kun annettiin reagoida homogenisoitujen bursien kanssa, jotka oli saatu kananpojista, joista saatiin 23 eristystä. Samat tulokset havaittiin MCA-B69:11ä, joka on selektiivinen D78 viruskannalle ja tietyille aikaisemman lajin klassisille kansoille, jonka kerran ajatel- 35 tiin olevan Yhdysvaltojen vallitseva kanta. Samaan aikaan toinen MCA, jota merkitään B29, joka ekspressoituu hybridoomasolulinjassa, joka on tallennettu ATCC:ssä talletusnumerolla MB 9746, Budapestin sopimuksen mukaisesti, joka ei neutraloi virusta, sitoutuu siihen siitä huolimatta, samoin kuin kaikkiin tunnettuihin

4 3 olemassa oleviin virusrokotteisiin. Lisäksi polyklonaaliset IBDV-antiseerumit, joita käytetään standardeina ja joita saadaan USDA:n kansallisesta eläinlääkärin palvelulaboratoriosta Amesissa, Iowassa ADU8701 merkinnällä, sitoutuu uuteen rokotteeseen antigeenin sieppaus-elisa:ssa. Muita ei-neutraloivia vasta-aineita, jotka sitou- 5 tavat virukseen, voidaan tunnistaa, ja niitä voidaan tuottaa kuten tavanomaisia monoklonaalisia vasta-aineita. Keksintö ei rajoitu mihinkään positiiviseen testitekijään. Koska viruksen kokonaiskoko on melko suuri verrattuna mihin tahansa saatavilla olevaan neutraloivaan kohtaan, on olemassa laaja potentiaalinen kenttä sellaisia positiivisia testitekijöitä ja polyklonaalisia antiseerumeja. 10 Täten viruksen läsnäolo voidaan nykyään parhaiten määrittää negatiivisella testauksella antigeenin sieppaus-elisa:ssa, joka on R63:a ja B69:ää varten ja positiivisella testauksella joko B29:llä tai polyklonaalisilla antiseerumeilla. Pitäisi kuitenkin huomata, että IBD-viruksen läsnäolon morfologinen tai oireenmukainen vahvistaminen 15 liittyneenä siihen, ettei R63 MCA kykene sitoutumaan antigeeninäytteeseen, on selvä todiste viruksen läsnäolosta. Jotta alunperin tumfistettaisiin uuden viruksen läsnäolo, kerättiin 116 kanapojan populaatio, bursat saatiin 116 erillään olevasta parvesta Delmarvan niemimaan ja 20 Kaakkois-Yhdysvaltojen siipikarjan kasvatusalueilta. 116 kananpoikapopulaation bursat homogenisoitiin asettamalla yksi bursa 1 ml:aan SGPA-EDTA-puskuria ja hiertämällä seosta huhmareella ja survimella kunnes saatiin nesteen kaltainen koostumus. Tämä materiaali kirkastettiin sentrifugoimalla alhaisella nopeudella ja supernatantit analysoitiin AC-ELISA:lla. 25 Tässä määrityksessä 96 kuopan Immulon-maljat (saatu Dynatechiltä, Virginia) peitettiin 0,1 m1:11a 2 µg/m1 Staphlycoccus aureuksen proteiini A:ta peitinpuskurissa. 18 h 4 C:ssa jälkeen maljat tyhjennettiin. Lisättiin 1/10 laimennukset happosupernatanttia, joka oli kerätty hybridoomaviljelmistä, jotka erittivät R63- ja B69 IBD- 30 virusspesifistä MCA:ta, fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, jossa oli TWEEN 20 ja 2 % rasvatonta kuivattua maitojauhetta vuorottain. 24 h reaktion jälkeen 4 C:ssa maljat kopautettiin kuiviksi ja suljettiin 30 minuutiksi huoneenlämpötilaan. Sulkemisen jälkeen maljat tyhjennettiin ja koputeltiin kuiviksi. Lisättiin 0,1 ml laimennussarjaa jokaisesta homogenisoidusta bursaalisuspensionäytteestä peitetyille maljoille 35 ja inkubaation jälkeen maljat tyhjennettiin, koputeltiin kuiviksi ja pestiin 3 kertaa 3 min PBS-T:llä. Sitten jokaiseen kuoppaan laitettiin 0,1 ml biotiinilla leimattua R63 MCA-konjugaattia, joka oli laimennettu PBS-T + NFDM:ään. 1 h inkubaation jälkeen maljat tyhjennettiin jälleen ja pestiin. Sen jälkeen lisättiin jokaiseen kuoppaan

5 4 0,1 ml streptavidiini-piparjuuriperoksidaasikonjugaattia. 1 h inkubaation jälkeen maljat tyhjennettiin jälleen ja pestiin. Tämän jälkeen lisättiin TMB-substraattia. Lyhyen inkubaatiojakson jälkeen testit luettiin 650 nm:ssä automaattisen spektrofotometrin avulla. Siten bionyloitua R63 MCA:ta käytettiin signaalina positiivisille reak- 5 tioille viruksen ja R63- ja B69-kaivojen välillä, kun taas samanlainen AC-ELISA suoritettiin polyklonaali anti-ibdv-seerumeilla antamaan signaali B29-vangitsemisista. Vaihtoehtoisesti bionyloitua B29:ää voitiin käyttää samaan tarkoitukseen. Lisäksi mitä tahansa B63:n, B69:n, B29:n, polykloonin leimaamisen muotoa voidaan käyttää. 10 Kaikki 116 kantaa osoittivat negatiivista reaktiivisyyttä R63:n ja B69:n kanssa, mutta olivat erittäin positiivisia B29 MCA:lle, joka yhdistyy ei-neutraloivalla tavalla. Koska R63 on neutraloiva vasta-aine kaikille aiemmin tunnistetuille IBD-viruksille, 15 määritys, jossa käytetään vain R63:a positiivisena ei-neutraloivana määrityksenä, on riittävä. Tähän yhdistetty B69:n käyttö antaa suuremman varmuustason ja voidaan käyttää lisämäärittelemään ja erottamaan tekniikan tason IBDV-kantoja. Viidestä tunnistetusta eristetystä viruskannasta otetut näytteet, jota virusta ekspres- 20 soi Pasteur-instituutissa Budapestin sopimuksen mukaisesti talletusnumeroilla i.-792 ja i.-793 talletetut talletukset, kerättiin ja annettiin reagoida R63 MCA:n kanssa ja ympättiin SPF-kananpoikiin. 5 päivää ymppäyksen jälkeen näille kananpojille ja eiympätyille kananpojille tehtiin ruumiinavaus. Ne linnut, jotka oli ympätty kerätyillä näytteillä ja jotka merkattiin NegaVac (NV), osoittivat leesioita, jotka olivat yhden- 25 mukaisia vain tarttuvan bursaalitaudin kanssa. Varmuuden vuoksi linnuista otettiin antiseerumit 11 päivää ymppäyksen jälkeen ja testattiin epäsuoralla ELISA:lla ja osoitettiin serologinen muunnos IBDV:ksi, mutta ei muuksi vastaavaksi siipikarjataudiksi. Näiden lintujen bursaalinäytteet homogeni- 30 soitin ja tehtiin toinen kierros R63:n ja B69:n läsnäollessa samanlaisin tuloksin. Molemmilla kierroksilla, skaalana 0-9, reaktiivisuus B29 MCA:n kanssa oli tasolla 9 ja reaktiivisuus B69:n ja R63:n kanssa oli tasolla 0. Täten tunnistettiin puhdas valmiste aikaisemmin tunnistamattomasta viruksesta, joka ei muistuta mitään tunnettua rokotetta R63- ja B69-neutralointikohdissa, joka on valmistettu viruksesta tai muulla 35 tavoin. Tekeillä on lisää monokionaalisia vasta-aineita, proteiini-informaatiota ja RNA-analyysi. Tästä informaatiosta saadaan tarpeellinen perusta sellaisten rokotteiden valmistamiseksi, jotka perustuvat neutraloiviin mutta ei-toksisiin, rekombinanttiviruksen kaltaisiin proteiineihin

6 5 Kunnes sellaiset "suunnitellut" rokotteet ovat saatavilla, voidaan mitä tahansa eristettyä virusvahnistetta, joista jokaista merkitään GLS n (n=1-116), käyttää, tapetussa muodossa, valmistettaessa tavanomaisia tapettuja rokotteita, jotka antavat immuniteetin uutta virusta vastaan. GLS-kannat voidaan valmistaa rokotteeksi tavanomaisin 5 menetelmin, mitkä sinänsä eivät ole osa tätä keksintöä, joista lupaavimpiin kuuluu lämpötappaminen ja kemiallinen tappaminen, mikä säilyttää rokotteen olennaisen muodon, joka antaa valmisteelle ympätyssä linnussa suojaavia NV-vasta-aineita samalla muuttaen sen ei-virulentiksi. Vaihtoehtoisesti, on olemassa tunnettuja menetelmiä virusten heikentämiseksi, sarjasiirrot, virusta deletoivien nukleiinihapposek- 10 venssien kloonaus ja kohdennettu mutageneesi mukaanluettuina, mikä sallii elävän ei-virulentin virusrokotteen valmistuksen. Rokotteita voidaan valmistaa liittämällä yksinkertaisesti valittu virusjohdannainen ja suspendoimalla tai sekoittamalla se kantajaan. Sopivat annosarvot voidaan määrittää rutiininomaisella yritys ja erehdystekniikalla ottamalla näytteitä vasta-ainetiitteristä. 15 Hybridoomasolulinja, joka on tallennettu Budapestin sopimuksen mukaisesti AT- CC:hen, talletusnumerolla HB 9746, ekspressoi B29:ää. Tämän hakemuksen hakemiseksi ainakin 333 parvea on testattu. Näistä 116 testasi negatiivisesti R63 monoklonaalista vasta-ainetta vastaan yksinään, tai R63 ja B69 yhdessä, koska olivat 20 positiivisia B29 MCA:lle. Täten uusi virus näyttää olevan vallitseva ja kasvava tekijä aiheuttamassa tarttuvaa bursaalitautia kananpojissa. Tämän hakemuksen jättöpäivänä on epävarmaa, onko uudelleen tunnistettu virus alatyyppi vai muodostaako uuden IBDV-serotyypin, vaikka on olemassa melkoinen 25 todiste, että se on serotyyppi yksi -alatyyppi. Joka tapauksessa on saavutettu viruksen läsnäolon tunnistaminen ja rokotteen valmistaminen siitä samalla tavalla riippumatta, onko kanta vai serotyyppi, ja sen mukaisesti keksintö ei rajoitu siihen. Tämän keksinnön lukuisat muunnelmat ja vaihtelut ovat ilmeisesti mandollisia 30 edellä olevien tekniikkojen valossa. Sen vuoksi on ymmärrettävää, että liitettyjen patenttivaatimusten puitteissa keksintöä voidaan kuvata vaihtoehtoisesti tai toteuttaa käytännössä muutoin kuin tässä on erityisesti kuvattu.

7 6 Patenttivaatimukset 1. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi siipikarjan tarttuvaa bursaalitautia vastaan, tunnettu siitä, että 5 a) tehdään ei-virulentiksi tarttuva bursaalitautivirus, joka indusoi tarttuvan bursaalitaudin siipikarjassa ja johon hybridoomasolulinjan ATCC HB-9437 tuottama monoklonaalinen vasta-aine R63 ei sitoudu, samalla säilyttäen sen inununogeeniset ominaisuudet; b) yhdistetään mainittu ei-virulentti, inununogeeninen, tarttuva bursaalitautivirus, 10 johon monoklonaalinen vasta-aine R63 ei sitoudu, farmaseuttisesti hyväksytyn kantajan kanssa annokseksi, joka riittää saamaan aikaan suojan tarttuvaa bursaalitautivirustartuntaa vastaan. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virus tehdään 15 ei-virulentiksi tappamalla se antamalla kuumuuden vaikuttaa siihen tai heikentämällä se käyttämällä sarjasiirtoa. Patentkrav Förfarande för framställning av ett vaccin mot smittosam bwsalsjukdom hos fjäderfä, kännetecknat av att a) ett smittosamt bursalsjukdomsvirus som inducerar smittosam bursalsjukdom hos fjäderfä görs icke-virulent, och vid vilket en av hybridomcellinje ATCC HB alstrad monoklonal antikropp R63 inte binds, medan det samtidigt bibehåller 25 sina immunogena egenskaper; b) nämnda icke-virulenta, immunogena smittosamma bursalsjukdomsvirus, vid vilket den monoklonala antikroppen R63 inte binds, kombineras med en farmaceutiskt acceptabel bärare till en dos som räcker till att åstadkomma skydd mot smittosamt bursalsjukdomsvirus Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att viruset görs icke-virulent genom att förgöra det med hetta eller försvaga det med hjälp av serieöverföring.