Viljely ja DNA pohjaiset menetelmät polttoöljyllä saastuneen maan ritsoremediaatioprosessin tutkimisessa Pro gradu Kaisa Lappi Huhtikuu 2007 Helsingin Yliopisto Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitos Mikrobiologian osasto
Alkusanat Pro gradu työni oli osa Helsingin Yliopiston Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitoksella vuonna 2005 toteutettua tutkimusta, jossa seurattiin polttoöljyn hajoamisprosessia rehuvuohenherneen (Galega orientalis) juuristossa. Vuoden 2005 keväällä perustettiin Viikin kasvihuoneille koe, jossa prosessia seurattiin 21 viikon ajan sekä mikrobiologisin että kemiallisin menetelmin. Tutkimuksen suunnitteluun ja toteutukseen osallistuivat ohjaajina Leena Suominen ja Kaisa Wallenius sekä pro gradu työntekijöinä itseni lisäksi Elina Kondo ja Anu Mikkonen. Omassa pro gradu työssäni arvioin erilaisten mikrobiologisten menetelmien soveltuvuutta öljynhajotusprosessin seurantaan. Elina Kondo vastasi projektin kemiallisista analyyseistä ja seurasi pro gradu työssään muun muassa öljyhiilivetyjen kokonaismäärien muutoksia kokeen kuluessa sekä suoritti käytetyn koemaan maa analyysit (Kondo 2006). Anu Mikkonen seurasi pro gradu työssään hajoamisprosessin aikana tapahtuvia mikrobiekologisia muutoksia (Mikkonen 2007). Haluan kiittää kaikkia tähän projektiin osallistuneita tuesta, jota olen saanut gradutyöni eri vaiheissa. Erityisesti haluan välittää kiitokseni ohjaajalleni Kaisa Walleniukselle, joka on ollut korvaamaton tuki kaikissa gradutyöni vaiheissa. Anu Mikkosta ja Elina Kondoa halua kiittää kaikesta siitä vertaistuesta, jota he ovat tarjonneet koko gradutyöni ajan. Dosentti Kristina Lindströmiä haluan kiittää mahdollisuudesta työskennellä hänen tutkimusryhmässään sekä hänen tarjoamistaan mahdollisuuksista osallistua useisiin alan kansainvälisiin tapaamisiin. Leena Suomista haluan kiittää ohjauksesta ja arvokkaista kommenteista gradun kirjoitusvaiheessa. Haluan lisäksi kiittää Ekokemin stipendirahastoa sekä Neste Oy:n tutkimussäätiötä, joiden rahoitus mahdollisti tämän tutkimusprojektin toteuttamisen. 3
Sisällysluettelo Alkusanat... 3 Kuvaluettelo... 6 Taulukkoluettelo... 8 Johdanto... 10 Kirjallisuuskatsaus... 12 1. Biologinen öljynhajotus... 12 1.1 Öljyn muodostuminen ja rakenne...13 1.2 Aerobinen öljynhajotus...14 1.2.1 Alifaattisten öljyhiilivetyjen aerobinen hajotus...15 1.2.2 Aromaattisten hiilivetyjen aerobinen hajotus...17 1.3 Anaerobinen öljynhajotus...20 1.3.1 Aromaattisten hiilivetyjen anaerobinen hajotus...20 1.3.2 Alifaattisten hiilivetyjen anaerobinen hajotus...22 2. Öljyllä saastuneiden maiden puhdistus... 23 2.1 Bioremediaatio...23 2.1.1 Luontainen bioremediaatio...24 2.1.2 Biostimulaatio...25 2.1.3 Bioaugmentaatio...25 2.1.4 Ex situ menetelmät...26 2.2 Fytoremediaatio...27 2.2.1 Ritsoremediaatio...28 3. Bioremediaation tutkimusmenetelmät öljyllä saastuneilla maaalueilla... 30 3.1 Viljelyyn perustuvat menetelmät...33 3.1.1 MPN...33 3.2 DNA pohjaiset menetelmät...37 3.2.1 DNA:n eristys maanäytteistä...40 3.2.2 DNA:n pitoisuuden mittaus...41 3.2.3 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR...43 Kokeellinen osuus... 46 4. Tutkimuksen tavoitteet... 46 5. Materiaalit ja menetelmät... 47 5.1 Kasvihuonekoe...47 5.1.1 Koeasetelma...47 5.1.2 Kasvihuonekokeen hoito...51 5.1.3 Näytteenotto...54 5.2 MPN menetelmä polttoöljynhajottajille...54 5.2.1 MPN levyjen valmistus ja inkubointi...55 5.2.2 MPN lukumäärän määritys...56 5.2.3 MPN kasvatusten toteutus...57 5.3 DNA:n eristys maanäytteistä...59 4
5.4 DNA:n pitoisuuden määritys...60 5.4.1 NanoDrop ND1000 UV Vis spektrofotometrimittaus...60 5.4.2 PicoGreen mittaus...61 5.5 NahAc geenin monistaminen Q RTm PCR:llä...62 5.5.1 PCR alukkeet...62 5.5.2 Standardin valmistaminen PCR tuotteesta...62 5.5.3 Näytelevyjen valmistus ja ajo ABI 7300 laitteella...64 5.5.4 Standardiplasmidin valmistus...65 5.6 Kasvihuonekokeesta saatu muu aineisto...68 6. Tulokset... 72 6.1 Menetelmien testauksen ja optimoinnin tulokset...72 6.1.1 MPN menetelmän optimointitulokset...72 6.1.2 NanoDrop ja PicoGreen menetelmien arviointi...79 6.1.3 NahAc geenin monistuminen kasvihuonekokeen näytteistä...81 6.1.4 NahAc fragmentin siirtyminen plasmidiin...84 6.2 Ritsoremediaatioprosessin seuranta...87 6.2.1 Kasvien kasvu...87 6.2.2 Polttoöljynhajottajien MPN lukumäärien vaihtelu kokeen aikana...90 6.2.3 DNA pitoisuuden vaihtelu kasvihuonekokeen aikana...91 7. Tulosten tarkastelu ja johtopäätökset... 93 7.1 Kasvihuonekokeen ritsoremediaatioprosessin tarkastelu eri menetelmillä...93 7.1.1 Kasvien kasvu...93 7.1.2 Polttoöljynhajottajien MPN lukumäärien vaihtelu...94 7.1.3 Bakteeribiomassan muutokset DNA:n pitoisuuden perusteella...96 7.1.4 NahAc geenin monistuminen...98 7.2 Käytettyjen menetelmien arviointi...98 7.2.1 MPN menetelmä...98 7.2.2 DNA pitoisuuden mittaus NanoDrop :illa...100 7.2.3 PicoGreen mittaus...100 7.2.4 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR...101 8. Loppupäätelmät... 103 9. Lähdeluettelo... 104 Liitteet... 112 5
Kuvaluettelo 1. Pseudomonas putida Gpo1 kannan OCT plasmidin koodaama alkaanien hajotusreitti. s. 16 2. Prokaryoottien ja eukaryoottien aromaattisten hiilivetyjen aerobisen hajotuksen reittejä. s. 18 3. Pseudomonas stutzeri AN10 kannan kromosomaalisesti koodattu ylempi naftaleenin hajotusreitti. s. 19 4. Aromaattisten öljyhiilivetyjen anaerobisia hajoamisreittejä. s. 21 5. Tetratsoliumsuolojen rakenne ja elektronien siirtyminen dehydrogenaasilta tetratsoliumsuoloille. s. 35 6. Kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR:n standardisuoran fluoresessin muutokset PCR:n aikana. s. 45 7. Näyteruukkujen kosteuden säätäminen vaa an avulla. s. 52 8. Kokeen kolmen eri kerranteen sijainnit kasvihuoneessa. s. 53 9. Koeviikon 12 näytteenottoruukut. s. 54 10. MPN levyjen inkuboinnin aikana käytetyt rasiat. s. 56 11. NanoDrop ND1000 UV Vis spektrofotometri. s. 60 12. Näyte NanoDrop ND1000 UV Vis spektrofotometrissä. s. 61 13. Polttoöljyn pitoisuuden (mg/kg) muutokset kasvillisessa (ÖKR), kasvittomassa (Ö) ja steriilissä (ÖS) öljymaassa 21 viikoisen kasvihuonekokeen aikana. s. 69 14. Kasvibiomassan tuotto puhtaassa (PKR) ja polttoöljyllä saastutetussa (ÖKR) maassa. s. 70 15. Koemaan typpipitoisuus (% maan kuivapainosta) kasvillisessa (ÖKR), kasvittomassa (Ö) ja steriilissä (ÖS) öljymaassa viikolta 6 viikolle 21. s. 71 16. INT soluhengitysindikaattorin avulla saatujen positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon 0 MPN näyte ja kontrollilevyillä. s. 73 17. Positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon 0 MPN näyte ja kontrollilevyillä 1, 2 ja 3 vuorokautta WST 1 lisäyksen jälkeen. s. 73 18. Näytelevy kahden vuorokauden jälkeen WST 1 ja INT reagenssien lisäämisestä (vasemmalla) ja sama levy viikon päästä WST 1 ja INTreagenssien lisäämisestä (oikealla). s. 74 6
19. MPN tulokset näytteenottoviikoilta 0 ja 3. s. 76 20. MPN tulokset näytteenottoviikoilta 6 ja 8. s. 77 21. Positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon 8 kasvillisen öljykäsittelyn (ÖKR) MPN näytelevyllä ja negatiivisella kontrollilevyllä. s. 78 22. MPN tulokset viikoilta 12, 16 ja 21. s. 79 23. NanoDrop laitteen antamat spektrit Q RTm PCR:ssä käytetylle PCR tuotteelle (vasemmalla) ja näytteenottoviikon 0 kasvillisen öljykäsittelyn (ÖKR) maa DNA uutteelle (oikealla). s. 81 24. Näytteenottoviikon 0 saastutetun kasvikäsittelyn (ÖKR) DNA uutelaimennusten monistuminen Q RTm PCR:llä. s. 82 25. Näyte DNA:n 10 3 laimennuksen, negatiivisen kontrollin sekä standardi PCR tuotteen reaktiotuotteiden sulamiskäyrät. s. 83 26. Näytteenottoviikkojen 0, 3, 8 ja 21 maa DNA uutteiden monistuminen Q RTm PCR:llä. s. 84 27. P. putida G7 kannasta nah_pitkä alukkeilla monistetut PCR tuotteet. s. 85 28. Kloonauksen onnistumisen tarkistus. s. 85 29. Klooneista nah_pitkä alukkeille saadut PCR tuotteet. s. 86 30. Kahdesta kloonatusta plasmidista sekä P. putida G7 kannasta nah_pitkäalukkeilla monistetut PCR tuotteet ajettuna 2 %:lla agaroosigeelillä. s. 87 31. Rehuvuohenherneet viikolla 5. s. 89 32. Näytteenottoviikolla 6 ÖKR ruukusta harvennettu kasvi. s. 89 33. Rehuvuohenherneet viikolla 10. s. 89 34. Kasvihuonekokeen jäljellä olevat ruukut viikolla 13. s. 89 35. Rehuvuohenherneet viikolla 14. s. 89 36. Viikon 21 näytteenottoruukut. s. 89 37. Kasvihuonekokeen MPN tulokset. s. 90 38. PicoGreen mittauksella saadut keskimääräiset DNA pitoisuudet kasvihuonekokeen eri käsittelyille kokeen kuluessa. s. 92 7
Taulukkoluettelo 1. Raakaöljyn ensimmäisessä jalostusvaiheessa eli jakotislauksessa saatavat jakeet. s. 14 2. Öljyllä saastuneiden maiden bioremediaation tutkimusmenetelmiä. s. 32 3. Kasvihuonekokeen koeasetelma. s. 48 4. Näyteruukkujen koostumus. s.49 5. Kasvihuonekokeessa käytetyn maasekoituksen kivennäisaineksen lajitekoostumus. s. 50 6. Kasvihuonekokeessa käytetyn maasekoituksen perusominaisuuksia. s. 50 7. Q RTm PCR:ssä käytetyt NAH alukkeet. s. 62 8. PCR reaktioliuoksen koostumus monistettaessa nahac geenifragmenttia P. putida G7 kannasta pesäke PCR:llä. s. 63 9. NahAc geenifragmentin monistamisessa P. putida G7 kannasta käytetty pesäke PCR ohjelma. s. 63 10. Maa DNA uutteiden sopivan laimennustason määrittämiseen käytetty Q RTm PCR ohjelma. s. 65 11. Kloonattavan nahac fragmentin monistamiseen suunnitellut alukkeet. s. 66 12. Ligaatioseoksen koostumus. s. 67 13. Q RTm PCR:n standardina käytetyn PCR tuotteen NanoDrop mittaustulokset. s. 80 14. Maa DNA uutteiden NanoDrop ja PicoGreen mittaustulokset sekä NanoDrop laitteen antamat puhtausarvot maa DNA uutteille. s. 80 8
Lyhenneluettelo bp Emäspari (Basepair) BTEX Bentseeni, tolueeni, etyylibentseeni, ksyleenit DGGE Denaturoiva gradienttigeelieletroforeesi FISH Fluoresenssi in situ hybridisaatio GC MS Kaasukromatografia massaspektrometria HAMBI Helsingin yliopiston Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitoksen mikrobikantakokoelma HUM Hiivauute mannitoli INT 2 (p iodofenyyli) 3(p nitrofenyyli) 5 fenyylitetratsoliumkloridi LH PCR Pituusheterogenia polymeraasiketjureaktio MPN Todennäköisin lukumäärä (Most probable number) nt Nukleotidi PAH Polyaromaattinen hiilivety (Polyaromatic hydrocarbon) PCR Polymeraasiketjureaktio (Polymerase chain reaction) PLFA Fosfolipidirasvahappo (Phospholipid fatty acid) Q RTm PCR Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (Quantitative real time polymerase chain reaction) SIP (Stable isotope probing) T RFLP Terminaalisen restriktiofragmentin pituuspolymorfia WST 1 4 [3 (4 iodofenyyli) 2 (4 nitrofenyyli) 2H 5 tetratsolio] 1,3 bentseenidisulfonaatti X Gal 5 bromo 4 kloro 3 indolyyli D galaktopyranosidi 9
Johdanto Viimeisen vuosisadan aikana öljyn teollinen tuotanto, kuljetus ja jakelu ovat aiheuttaneet öljyhiilivetyjen leviämisen ympäristöön ja muodostumisen merkittäväksi ympäristöongelmaksi. Ympäristöministeriön vuonna 1994 julkaiseman SAMASEkartoituksen loppuraportin mukaan Suomessa on yli 20 000 aluetta, joita epäillään saastuneiksi. Näistä 33 % eli noin 6 000 aluetta on erilaisten polttoaineiden saastuttamia. Yleisimmiksi maaperän saastuttajiksi todettiin erilaiset korjaamot, romuttamot ja huoltoasemat (Puolanne ym. 1994). Koska näiden toimialojen valvonta on Suomessa viimeaikoina huomattavasti tiukentunut, syntyy uusia pilaantuneita maa alueita Suomessa nykyään pääasiassa erilaisten onnettomuuksien seurauksena (Salo 2003). Yleisimpänä onnettomuustyyppinä Salo (2003) pitää öljylämmitteisen omakotitalon öljysäiliötä täytettäessä sattuneita vahinkoja ja laiterikkoja. Koska maaperän saastuneisuus heikentää maa alueiden käyttökelpoisuutta, pilaa pohjavesiä sekä voi aiheuttaa vaaraa ihmisten ja eläinten terveydelle, korostavat Puolanne ym. (1994) SAMASE projektin loppuraportissaan saastuneiden maa alueiden kunnostustoimien tärkeyttä. Saastuneita maa alueita voidaan kunnostaa erilaisilla fysikaalisilla tai kemiallisilla menetelmillä, kuten lämpökäsittelyllä tai pesulla, tai erilaisilla biologisilla menetelmillä eli bioremediaatiolla. Bioremediaatiomenetelmät perustuvat pääasiassa maaperän mikrobien kykyyn hajottaa erilaisia haitta aineita. Koska bioremediaatio perustuu biologisiin prosesseihin, joihin vaikuttavat maaperässä monet ympäristötekijät yhtäaikaisesti, on bioremediaation etenemisen ennustaminen usein hankalaa. Näin ollen tarvitaan tarkkoja, monipuolisia ja luotettavia menetelmiä, joiden avulla voidaan seurata bioremediaation etenemistä maaperässä. Tässä tutkimuksessa asiaa lähestyttiin tutkimalla rehuvuohenherneen (Galega orientalis) juuristossa tapahtuvaa ritsomediaatiota yhdistämällä monia erilaisia mikrobiologisia ja kemiallisia tutkimusmenetelmiä. Kirjallisuuskatsaukseni koostuu kolmesta erillisestä aihealueesta. Ensimmäisessä osiossa käsittelen öljyn biologista hajoamista sekä hapellisissa että hapettomissa oloissa. Lisäksi tarkastelen muutamia yleisimpien öljyn yhdisteiden hajotusreittejä, koska erityisesti käytettäessä DNA pohjaisia menetelmiä, on tärkeää tuntea erilaiset öljynhajotusreitit ja niiden avainentsyymit. Toisessa osiossa käsittelen erilaisia bioremediaatiometelmiä, joita on hyödynnetty öljyllä saastuneiden maiden puhdistuksessa. Viimeisessä osuudessa 10
tarkastelen erilaisia bioremediaation tutkimusmenetelmiä keskittyen pääasiassa mikrobiologisiin menetelmiin. Kokeellisen osuuteni alussa on esitetty 2005 vuoden alussa perustettu kasvihuonekoe, jonka perustamiseen sekä ylläpitoon osallistuivat itseni lisäksi Elina Kondo, Anu Mikkonen, Kaisa Wallenius ja Leena Suominen. Tämän jälkeen kokeellinen osuuteni keskittyy MPN menetelmän, DNA pitoisuusmittausten sekä reaaliaikaisen kvantitatiivisen PCR:n optimointiin ja soveltamiseen kasvihuonekokeen ritsoremediaatioprosessin tutkimisessa. Koska pro gradu työni oli osa laajempaa kokonaisuutta, on tulosteni tarkastelun kannalta välttämätöntä esittää myös Elina Kondon saamia tuloksia (Kondo 2006). Elina Kondon tulokset on esitetty tämän pro gradu tutkielman materiaalit ja menetelmät osion lopussa kappaleessa 5.6. 11
Kirjallisuuskatsaus 1. Biologinen öljynhajotus Biologista öljynhajoamista tapahtuu sekä hapellisissa että hapettomissa oloissa. Maaperän mikrobeista useiden bakteeri ja sienisukujen edustajat kykenevät hyödyntämään öljyhiilivetyjä energian ja hiilenlähteenään. Myös muutamien mikrolevien on todettu pystyvän öljyhiilivetyjen hajotukseen (van Hamme ym. 2003). Atlas ja Cernilian (1995) mukaan hapellisissa oloissa merkittävin maaperän öljyhiilivetyjen hajotukseen osallistuva bakteerisuku on proteobakteereihin kuuluva Pseudomonas. Tämän lisäksi öljyhiilivetyjen hajotukseen kykeneviä bakteereita löytyy muun muassa Burkholderia, Sphingomonas, Achromobacter, Nocardia, Mycobacterium, Vibrio ja Bacillus suvuista (Atlas ja Cernilia 1995). Myös sienet ovat hapellisissa oloissa merkittäviä öljyhiilivetyjen hajottajia ja niiden on arveltu olevan maaperässä joissain tapauksissa jopa bakteereita merkittävämpiä hajottajia. Muiden muassa sienisuvuista Candida, Rhodotorula, Aureobasidium, Penicillium, Aspergillus ja Fusarium löytyy öljyhiilivetyjen hajotukseen kykeneviä lajeja (Riser Roberts 1998). Öljyhiilivetyjen hajotustehokkuus on suuresti riippuvainen maaperän luontaisten mikrobien geneettisestä sopeutumisesta öljyhiilivetyjen hajotukseen. Lisäksi öljyhiilivetyjen hajotustehokkuuteen vaikuttavat monet ympäristötekijät, kuten maan rakenne, orgaanisen aineksen määrä, hapen ja ravinteiden saatavuus, lämpötila, ph, suolapitoisuus ja vedenaktiivisuus. Nämä tekijät vaikuttavat sekä maan mikrobistoon että öljyhiilivetyjen sitoutumiseen maapartikkeleihin. Huonosti veteen liukenevien yhdisteiden, kuten öljyhiilivetyjen, hajotusta rajoittaa merkittävästi myös niiden biosaatavuus. Jotta mikrobit pystyvät olemaan metabolisesti aktiivisia, ne vaativat korkean vedenaktiivisuuden. Tällöin öljyhiilivetyjä hajottavat mikrobit ja heikosti vesiliukoiset öljyhiilivedyt eivät usein kohtaa toisiaan maaperässä. (Maier 2000) 12
1.1 Öljyn muodostuminen ja rakenne Öljy on muodostunut meressä eläneiden eläinten ja kasvien jäänteistä noin 50 200 miljoonaa vuotta sitten. Kovassa paineessa ja kuumuudessa pitkien aikojen kuluessa monimutkaiset fysikaaliset ja kemialliset reaktiot muuttivat kuolleen eläin ja kasvikudoksen raakaöljyksi ja maakaasuksi. Sopivat olosuhteet merien pohjiin syntyivät, kun uudemmat sedimenttikerrostumat painoivat alempia kerrostumia aiheuttaen valtavan paineen. Raakaöljy koostuu pääasiassa erilaisista hiilivedyistä, jotka voidaan jakaa molekyylirakenteen perusteella toisaalta suoriin, haaroittuneisiin ja rengasmaisiin yhdisteisiin, toisaalta tyydyttyneisiin, tyydyttämättömiin ja aromaattisiin yhdisteisiin. Raakaöljyn koostumus vaihtelee huomattavasti eri esiintymisalueiden välillä, mutta keskimäärin raakaöljyssä on 50 % rengasmaisia tyydyttyneitä hiilivetyjä ja 25 % avoketjuisia hiilivetyjä. Aromaattisten osuus on raakaöljyssä yleensä korkeintaan 15 %. Aromaattiset hiilivedyt jaetaan mono, di ja polyaromaatteihin (PAH), joista monoaromaattisissa yhdisteissä on yksi aromaattinen rengas, di aromaateissa kaksi ja polyaromaateissa kolme tai enemmän. Vedyn ja hiilen lisäksi raakaöljy sisältää pieniä määriä rikkiä, typpeä ja happea sitoutuneena orgaanisiin yhdisteisiin. Raakaöljyssä on myös pieniä määriä metalleja, joista merkittävimmät ovat vanadiini ja nikkeli. (Aatelo 1995a) Öljytuotteet valmistetaan raakaöljystä tislaamalla raakaöljy jakotislauskolonnissa (Aatelo 1995b). Jakotilauskolonni on jopa 80 metriä korkea uuni, jossa yhdisteet erottuvat kiehumispisteensä mukaisesti. Uunin yläpäässä lämpötila on 30 40 ºC ja pohjalla noin 400 ºC. Jakotislauksessa raakaöljystä erotetaan seitsemän eri jaetta. Eri jakeet kerätään uunista niin, että kevyin raakaöljyn jae, polttokaasu, kerätään putkiuunin yläpäästä ja öljyn raskain jae, josta valmistetaan raskaat polttoöljyt ja bitumituotteet, jää putkiuunin pohjalle. Taulukossa 1 on esitetty jakotislauksessa saatavat jakeet ja lämpötilaväli, jolta kyseinen jae on kerätty. Jakotislauksen jälkeen jakeita usein jatkokäsitellään muun muassa pilkkomalla suurimpia öljyhiilivetyjä pienemmiksi molekyyleiksi ja tislaamalla jakeita uudelleen, jotta saadaan haluttuja lopputuotteita. 13
Polttoöljy, jota käytetään muun muassa talojen lämmityksessä, kuuluu kaasuöljyihin ja sen tislausalue on laajimmillaan 170 ºC:sta 390 ºC:een. Kaasuöljyn raskaampia jakeita käytetään polttoöljyn talvilaadussa ja kevyempiä jakeita kesälaadussa. (Hästbacka 1992) Taulukko 1. Raakaöljyn ensimmäisessä jalostusvaiheessa eli jakotislauksessa saatavat jakeet. Muokattu Aatelon (1995b) julkaisemasta taulukosta. Jae Polttokaasut Tislauksen alkupiste ºC Tislauksen loppupiste ºC Bensiinit 10 150 180 Petrolit 150 180 200 220 Kevyt kaasuöljy 200 220 280 320 Kaasuöljy 280 320 360 400 Raskas kaasuöljy 330 420 470 500 Pohjaöljy 390 420 Öljyn sisältämien yhdisteiden rakenteet vaikuttavan monin tavoin öljyn biologiseen hajoavuuteen. Öljyhiilivedyistä suoraketjuiset n alkaanit ovat helpoiten mikrobien hajotettavissa (van Hamme ym. 2003). Tämän jälkeen järjestyksessä helpoiten hajotettavia ovat haaroittuneet alkaanit ja alkeenit, alle neljärenkaiset n alkyyliaromaatit, monoaromaatit, sykliset alkaanit ja polyaromaatit. Vaikeimmin hajotettavia ovat kompleksiset rengasrakenteiset asfalteenit. Lisäksi monet öljyhiilivedyt voivat olla myrkyllisiä mikrobeille, mikä hidastaa näiden öljyhiilivetyjen hajoamista (Maier 2000). Maierin (2000) mukaan öljyhiilivetyjen myrkyllisyys perustuu yleensä niiden lipofiiliseen luonteeseen. Myrkylliset öljyhiilivedyt sitoutuvat mikrobien solukalvoon, jolloin solukalvon rakenne häiriintyy. 1.2 Aerobinen öljynhajotus Aerobinen hajotus vaatii tapahtuakseen molekulaarista happea ja voi tapahtua näin ollen ainoastaan hapellisissa oloissa. Aerobinen hajotus on yleensä aina hapettomissa oloissa tapahtuvaa anaerobista hajotusta tehokkaampaa. Aerobinen hajotus käynnistyy, kun oksygenaasientsyymi liittää öljyhiilivetyyn yhden tai kaksi happiatomia (Riser Robets 1998). Sekä alifaattisia että aromaattisia yhdisteitä voidaan hajottaa aerobisissa oloissa. 14
Usein öljyhiilivetyjen hajotukseen kykenevät mikrobit ovat kuitenkin erikoistuneet joko alifaattisten tai aromaattisten hiilivetyjen hajotukseen ja pystyvät hajottamaan vain tietyn kokoisia aromaattisia tai alifaattisia yhdisteistä. (Whyte ym. 1997) 1.2.1 Alifaattisten öljyhiilivetyjen aerobinen hajotus Monet mikrobit pystyvät aerobisissa oloissa käyttämään erikokoisia alkaaneja hiilen ja energianlähteenään. Alkaanien on todettu hajoavan aerobisissa oloissa useampaa erilaista reittiä. Jopa samalta mikrobikannalta on löydetty useita entsyymejä, jotka voivat toimia toisistaan riippumatta metaboliareitin samassa vaiheessa (van Hamme ym. 2003). Perusteellisimmin tyydyttyneiden öljyhiilivetyjen hajoamista on tutkittu Pseudomonas putida Gpo1 kannalla, jolla alkaanien hajotukseen vaadittavia entsyymejä koodaa OTCplasmidi (van Hamme ym. 2003). Alkaanien hajotukseen osallistuvat geenit ovat OTCplasmidissa kahdessa operonissa. Isompi operoneista (alkbfghjkl) koodaa suurinta osaa metaboliareitillä tarvittavista entsyymeistä (kuva 1). Toinen operoni koodaa geenejä alkt ja alks. Pienemmän operonin alkt geeni koodaa alkaanien hajotusreitillä tarvittavaa rubredoksiinireduktaasientsyymiä (kuva 1) kun taas AlkS osallistuu hajotusreitin säätelyyn. Operoneja luetaan plasmidissa toisiaan kohti ja niiden 3 päiden etäisyys toisistaan on 9,7 kiloemästä. Tällä 9,7 kiloemäksen välialueella on todettu olevan vielä yksi alkaanien hajotukseen osallistuva geeni, alkn. AlkN on siirtäjäproteiini (methyl accepting transducer), joka pystyy ottamaan vastaan metyyliryhmän. AlkN proteiinin tehtävää alkaanien hajotuksessa ei ole pystytty vielä täysin selvittämään, mutta van Bailen ym. (2001) mukaan sen uskotaan liittyvän alkaanikemotaksikseen. 15
Kuva 1. Pseudomonas putida Gpo1 kannan OCT plasmidin koodaama alkaanien hajotusreitti. Metaboliareitin entsyymit ovat mono oksygenaasi (AlkB), rubredoksiinit (AlkG ja AlkF), rubredoksiinireduktaasi (AlkT), alkoholidehydrogenaasi (AlkJ), aldehydidehydrogenaasi (AlkH) sekä asetyyli koentsyymi A syntetaasi (AlkK). AlkS on metaboliareitin positiivinen säätelijä. Proteiinien AlkL ja AlkN merkitystä ei ole pystytty vielä täysin selvittämään. Kuva on muokattu van Beilen ym. (2001) julkaisemasta kuvasta. Kuvassa 1 on esitetty OTC plasmidin koodaaman alkaanihajotusreitin entsyymien sijainti solussa. Proteiini AlkB on alkaanimono oksygenaasi, joka aloittaa n alkaanien hajotuksen liittämällä yhden happiatomin alkaanin hiilivetyketjun päähän, jolloin muodostuu primaarinen alkoholi (van Beilen ym. 1994). Molekylaarisen hapen toinen happiatomi muodostaa kahden protonin kanssa vesimolekyylin. Tarvittavat elektronit reaktioon saadaan nikotiiniamidinukleotidiltä (NADH). Elektronit siirtyvät NADH:ltä monooksygeenasille (AlkB) rubredoksiinireduktaasin (AlkT) ja rubredoksiinien (AlkF ja AlkG) kautta (van Beilen ym. 1994). Alkoholidehydrogenaasi (AlkJ) muuttaa primaarisen alkoholin aldehydiksi, jonka jälkeen proteiini AlkH muodostaa aldehydistä karboksyylihapon (van Beilen ym. 1994). Lopuksi AlkK liittää hiilivetyketjun karboksyylipäähän asetyylikoentsyymia:n, minkä jälkeen hiilivetyketju siirtyy oksidaatioon hajotettavaksi. oksidaatio ei vaadi enää happea tapahtuakseen ja voi näin ollen tapahtua myös hapettomissa oloissa. 16
Edellä esitetystä P. putida Gpo 1 kannan metaboliareitistä poikkeavilla alkaanien hajotusreitteillä mono oksygenaasi voi olla esimerkiksi korvautunut dioksygenaasilla. Tällöin metaboliareittiä kutsutaan Finnertyn reitiksi (Tani ym. 2001). Alkaanien hajotuksen aloittava mono oksygenaasi voi myös liittää happiatomin hiilivetyketjun pään sijasta keskelle hiilivetyketjua (Atlas ja Bartha 1998). Tällöin muodostuu sekundaarinen alkoholi, joka muutetaan ketoni ja asetyyliesterivälituotteiden kautta primaariseksi alkoholiksi ja edelleen asetaattihapoksi. 1.2.2 Aromaattisten hiilivetyjen aerobinen hajotus Aromaattisten hiilivetyjen hajoaminen maaperässä on yleensä alifaattisten öljyhiilivetyjen hajoamista huomattavasti hitaampaa. Aromaattisten yhdisteiden hajoamista hidastaa muun muassa niiden heikko vesiliukoisuus ja voimakas sitoutuminen maapartikkeleihin (Maier 2000). Monet mikro organismit (bakteerit, sienet ja levät) pystyvät kuitenkin hajottamaan aromaattisia yhdisteitä (van Hamme ym. 2003). Mitä vähemmän aromaattisessa yhdisteessä on renkaita, sitä helpommin se on yleensä mikrobien hajotettavissa. Raskain aromaattinen yhdiste, jota mikro organismit tämän hetkisen tiedon mukaan pystyvät hyödyntämään ainoana hiilen ja energianlähteenä on nelirenkainen. Tosin viisirenkainen bentso[a]pyreenin on todettu hajoavan myös hitaasti luonnossa, mutta sen täydellinen hajotus vaatii useiden mikrobilajien osallistumista hajotusprosessiin (van Hamme ym. 2003). Bakteereilla aromaattisten yhdisteiden hajotuksen aloittaa dioksygenaasi, joka liittää bentseenirenkaaseen kaksi happiatomia, jolloin muodostuu ensin epästabiili cis,cisdihydroksidioli, joka spontaanisti muuttuu katekoliksi (kuva 2). Tämän jälkeen hajotusreaktio etenee organismista riippuen meta tai orto reitti (Smith 1990). Meta reitillä katekoli 2,3 dioksygenaasi avaa katekolin aromaattisen renkaan renkaaseen liittyneiden hydroksyyliryhmien vierestä, jolloin muodostuu 2 hydroksimukonisemialdehydi (kuva 2). Orto reitillä katekoli 1,2 dioksygenaasi avaa katekolin aromaattisen renkaan hydroksyyliryhmien välistä, jolloin muodostuu cic,cis mukonihappo (kuva 2). Meta reitin lopputuotteina syntyy pyruvaatti ja asetaldehydi ja orto reitin lopputuotteina sukkinaatti ja asetyyli koentsyymia (Smith 1990). Nämä yhdisteet bakteeri pystyy hyödyntämään esimerkiksi sitruunahappokierrossaan. 17
Sienien on todettu olevan maaperässä merkittäviä erityisesti polyaromaattisten öljyhiilivetyjen hajottajina. Kuvassa 2 on esitetty myös sienten aromaattisten öljyhiilivetyjen hajotusreitti, joka eroaa prokaryoottien hajotusreitistä. Sienillä hajotuksen aloittaa sytokromi P450 mono oksygenaasi. Tämä seuraa entsymaattinen veden lisääminen, jossa syntyy trans dihydrodioleita ja fenoleita. Nämä yhdisteet hajoavat usein nopeasti aerobisissa oloissa joko bakteerien tai sienten toimesta. (Cernilia 1997) Kuva 2. Prokaryoottien ja eukaryoottien aromaattisten hiilivetyjen aerobisen hajotuksen reittejä. Kuva muokattu Scraggin (2005a) julkaisemasta kuvasta. Naftaleeni on niin kutsuttu diaromaatti, joka koostuu kahdesta fuusiotuneesta bentseenirenkaasta. Se on yksi myrkyllisimmistä öljyn vesiliukoisen fraktion yhdisteistä (Riser Roberts 1998) ja tästä syystä sen biologista hajoamista on tutkittu paljon. Muun muassa katabolisen plasmidin NAH7 koodaama naftaleenin hajotusreitti on jo pystytty selvittämään yksityiskohtaisesti. Hajotusreittiä koodaavat geenit ovat ryhmittyneet 18
plasmidiin kahdeksi operoniksi. Toinen operoneista koodaa niin sanottua ylempää reittiä (eng. upper pathway), ja toinen niin sanottua alempaa reittiä (eng. lower pathway). Ylempää reittiä koodaava operoni koostuu geeneistä nahaaabacadbfced. Ylemmällä reitillä naftaleeni muutetaan salisylaatiksi (kuva 3). Ylemmän reitin ja naftaleenin hajotuksen aloittava entsyymi on naftaleenidioksygenaasi. Se koostuu neljästä eri alayksiköstä: naftaleenidioksygenaasisreduktaasista (NahAa), naftaleenidioksygenaasiferredoksiinista (NahAb), naftaleenidioksygenaasin Fe S proteiinin isosta alayksiköstä (NahAc) ja naftaleenidioksygenaasin Fe S proteiinin pienestä alayksiköstä (NahAd) (Bosch ym. 1999). Ylemmän reitin jälkeen salisylaatin hajotus jatkuu alemmalla reitillä, jota koodaava operoni koostuu geeneistä nahgthinlomkj (van Hamme ym. 2003). Alemmalla reitillä salisylaatti muutetaan meta reittiä sitruunahappokierron välituotteiksi, pyruvaatiksi ja asetaldehydiksi. Kuva 3. Pseudomonas tutzeri AN10 kannan kromosomaalisesti koodattu ylempi naftaleenin hajotusreitti. Kuvan aineenvaihduntatuotteet ovat 1) naftaleeni, 2) cisnaftaleenidihydrodioli, 3) 1,2 dihydroksinafteleeni, 4) 2 hydroksikromene 2 karboksylaatti, 5) ciso hydroksibensaalipyruvaatti, 6) salisyylialdehydi ja 7) salisylaatti. Metaboliareitin ensyymit ovat naftaleenidioksygenaasi (NahA), naftaleeni cis dihydrodiolidehydrogenaasi (NahB), 1,2 dihydroksinaftaleenidioksygenaasi (NahC), 2 hydroksikromene 2 karboksylaattidehydrogenaasi (NahD), 1,2 dihydroksibentsyylipyruvaattialdolaasi (NahE) ja salisyylialdehydidihydrogenaasi (NahF). Kuva muokattu Bosch ym. (1999) julkaisemasta kuvasta. Naftaleenin hajotusreitin geenit sijaitsevat yleisesti katabolisessa plasmidissa, mutta on löydetty myös useita kantoja, joissa naftaleenin hajotusreittiä koodaavat geenit sijaitsevat bakteerin genomissa. Bosch ym. (1999) totesivat Pseudomonas stutzeri AN10 kannan kromosomissa sijaitsevan ylemmän naftaleenin hajotusreitin olevan hyvin samanlainen kuin plasmidin NAH7 koodaama hajotusreitti (kuva 3). Heidän mielestään on hyvin todennäköistä, että koko ylempi hajotusreitti on siirtynyt NAH7 kaltaisesta plasmidista osaksi P. stutzeri AN10 kannan genomia. Lisäksi Bosch ym. ovat havainneet viitteitä siitä, että P. stutzeri AN10 kannalla olisi mahdollisesti rinnakkain kaksi erillistä ylempää hajotusreittiä. Öljyhiilivetyjen hajotukseen tarvittavien geenien onkin todettu usein olevan osana niin kutsuttuja liikkuvia elementtejä (Tsuda ym. 1999). Tästä johtuen hyvin samanlaisia metabolisia reittejä voidaan löytää kaukaista sukua olevilta bakteereilta. 19
1.3 Anaerobinen öljynhajotus Anaerobista öljyhiilivetyjen hajoamista on tutkittu vasta muutamien vuosikymmenien ajan. Viimeisen kymmenen vuoden aikana on löydetty useita anaerobisia öljyhiilivetyjen hajotusreittejä monilta eri bakteerilajien edustajilta (Heider ym. 1999). Monia kantoja on onnistuttu myös eristämään puhdasviljelmiksi. Kaikissa tähän asti eristetyissä kannoissa anaerobinen öljyhiilivetyjen hajotus perustuu anaerobiseen soluhengitykseen eli vaatii ulkoisen elektronin vastaanottajan (Heider ym. 1999). Kaikki öljyhiilivetyjen anaerobinen hajoaminen maaperässä ei kuitenkaan perustu anaerobiseen soluhengitykseen. Meckenstock (1999) on onnistunut eristämään öljyhiilivetyjen hajotukseen kykenevän fermentatiivisen bakteerikonsortion. Lisäksi Heider ym. (1999) esittävät, että anoksygeeniset fotosynteettiset bakteerit kykenisivät hajottamaan öljyhiilivetyjä. Yleisimmin elektronien vastaanottajina anaerobisessa öljyhiilivetyjen pelkistyksessä toimivat nitraatti, ferri rauta, sulfaatti ja vetyioni (Heider ym. 1999). Vetyionin pelkistykseen perustuvalla anaerobisella soluhengityksellä voidaan tuottaa energiaa ainoastaan ympäristöissä, joissa reaktion tuottamaa vetyä poistetaan jatkuvasti. Sopivan ympäristön luovat metanogeenit, jotka kuluttavat vetyä tuottaessaan metaanikaasua (Heider ym. 1999). Eristettyjen bakteerikantojen on osoitettu pystyvän hajottamaan anaerobisissa oloissa aromaattisista yhdisteistä bentseeniä, alkyylibentseenejä, naftaleenia ja fenantreenia (van Hamme ym. 2003). Lisäksi alifaattisista alkaaneista ja alkeeneista 6 20 hiilisten yhdisteiden on osoitettu hajoavan anaerobisesti (van Hamme ym 2003). 1.3.1 Aromaattisten hiilivetyjen anaerobinen hajotus Aromaattisten öljyhiilivetyjen on todettu hajoavat anaerobisissa oloissa hyvin monenlaisia reittejä. Kuvassa 4 on esitetty BTEX (bentseeni, tolueeni, etyylibentseeni ja ksyleenit) yhdisteiden tällä hetkellä tunnettuja anaerobisia metaboliareittejä. Koska anaerobista öljyhiilivetyjen hajotusta tapahtuu monenlaisissa ympäristöissä erilaisten elektronien vastaanottajien läsnäollessa, ei ole yllättävää, että myös metaboliareitit poikkeavat toisistaan (Zhang ja Bennett 2005). BentsoyylikoentsyymiA on yleinen välituote BTEX yhdisteiden hajotuksessa (kuva 4). Seuraava reaktio on pelkistysreaktio, jossa aromaattisesta renkaasta muodostuu alisyklinen dienoyylikoentsyymia (Harwood ym. 1999). Reaktiossa toimiva entsyymi on 20
bentsoyylikoentsyymia reduktaasi, joka on aromaattisten yhdisteiden anaerobisen hajotuksen avainentsyymi (Harwood ym. 1999). BentsoyylikoentsyymiA reduktaasi ei vielä saa aikaan aromaattisen renkaan aukeamista, vaan aromaattisen renkaan pelkistystä seuraa sarja tavanomaisia hydraatio ja dehydrogenaatioreaktioita, jotka lopulta johtavat alisyklisen renkaan hydrolyyttiseen avaamiseen (Harwood ym. 1999). Yhdestä moolista BTEX yhdistettä syntyy täydellisen anaerobisen hajoamisen seurauksena kolme moolia asetyylikoentsyymia:ta ja yksi mooli hiilidioksidia (Zhang ja Bennett 2005). AsetyylikoentsyymiA:n myös anaerobiset bakteerit pystyvät hyödyntämään oksidaatiolla. Kuva 4. Aromaattisten öljyhiilivetyjen anaerobisia hajoamisreittejä. Reaktioissa toimivat entsyymit: E 1 ) bentsyylisukkinaattisyntaasi, E 2 ja E 4 ) etyylibentsyylisukkinaattisyntaasi, E 3 ) etyylibentseenidehydrogenaasi ja E 5 ) bentsoyyli CoA reduktaasi. Entsyymien E 1, E 2 ja E 4 reaktioihin merkitty A kirjain on fumaraatti (HOOCCH=CHCOOH). Kuva muokattu Zhangin ja Benettin (2005) julkaisemasta kuvasta. 21
1.3.2 Alifaattisten hiilivetyjen anaerobinen hajotus Alkaanien ja alkeenien anaerobista hajotusta on tutkittu aromaattisten yhdisteiden hajoamista huomattavasti vähemmän. Tämä johtuu todennäköisesti siitä, että aromaattisten yhdisteiden myrkyllisyyden vuoksi niistä ollaan yhteiskunnallisesti huomattavasti kiinnostuneempia (Zhang ja Bennett 2005). Ensimmäinen alkaanien anaerobiseen hajotukseen kykenevä bakteeri, sulfaatin pelkistäjä Hxd3, eristettiin vuonna 1991. Hdx3 pystyy kasvamaan anaerobisesti 16 hiilisellä heksadekaanilla ja muilla pitkäketjuisilla alkaaneilla sekä pystyy heksadekaanin täydelliseen mineralisaatioon anaerobisissa oloissa (Heider ym. 1999). Hxd3 kannan jälkeen useita anaerobiseen alkaanien hajotukseen kykeneviä sulfaatin pelkistäjiä sekä muutamia nitraatin pelkistäjiä on onnistuttu eristämään puhdasviljelmiksi (Wilkes ym. 2002). Lisäksi on todettu rautaa pelkistävien sekä metanogeenisten konsortioiden pystyvän anaerobiseen alkaanien hajotukseen (So ja Young 2001). Alkaanien hajotuksen biokemiallista taustaa ei vielä kovin hyvin tunneta. On kuitenkin selvää, että myös anaerobisen alkaanien hajotuksen käynnistäviä reaktioita on useita (Heider ym. 1999). Wilkes ym. (2001) esittävät nitraatin pelkistäjän, HxN1, käynnistävän anaerobisen n heksaanin hajotuksen liittämällä entsymaattisesti fumaraatin heksaanin toiseen hiileen muodostaen 1 metyylipentyylisukkinaatin. Reaktio on hyvin samanlainen kuin aromaattisten yhdisteiden hajotuksen yhteydessä tapahtuva fumaraatin liittäminen aromaattiseen renkaaseen (kuva 4). So ym. (2003) esittävät puolestaan sulfaatin pelkistäjien aloittavan anaerobisen alkaanien hajotuksen liittämällä hiilidioksidin n alkaanin kolmanteen hiileen. Tämän jälkeen hiilivetyketju katkaistaan toisen ja kolmannen hiilen välistä niin, että kaksi ensimmäistä hiiltä irtoavat ja jäljelle jää rasvahappo. Rasvahappo voidaan edelleen hajottaa oksidaatiolla. Tämänhetkinen tietämys alkaanien anaerobisesta hajoamisesta on kuitenkin vähäistä. 22
2. Öljyllä saastuneiden maiden puhdistus Perinteisesti saastuneita maita on käsitelty erilaisilla kemiallisilla ja fysikaalisilla puhdistusmenetelmillä. Menetelminä on käytetty muun muassa maa aineksen pesua, jossa saastunut maaperä joko huuhdellaan paikan päällä tai käsitellään pesulaitteistossa. Puhdistus perustuu saastuttavien aineiden siirtämiseen nestefaasiin ja poistoon pesuveden mukana. Haitta aineita voidaan myös poistaa polttamalla tai muilla termisillä käsittelyillä. Lisäksi voidaan käyttää haitta aineiden stabilointia, jossa haitta aineet sidotaan fysikaalisilla tai kemiallisilla käsittelyillä maaperän rakenteeseen siten, että niiden kulkeutuminen ympäristöön estyy. (Puolanne ym. 1994) Kaikki edellä mainitut perinteiset puhdistusmenetelmät vaikuttavat suuresti maan rakenteeseen ja sen luonnollisiin biologisiin prosesseihin. Tällä hetkellä ollaankin hyvin kiinnostuneita löytämään ympäristöystävällisempiä maaperän puhdistusmenetelmiä erilaisista biologisista menetelmistä. Biologiset menetelmät ovat perinteisiä menetelmiä halvempia ja niillä voidaan käsitellä tehokkaammin matalampia saastepitoisuuksia. (Scragg 2005a) 2.1 Bioremediaatio Bioremediaatiolla tarkoitetaan ympäristöön joutuneiden haitta aineiden poistamista biologisilla menetelmillä. Yleensä bioremediaatiolla tarkoitetaan mikrobien tai kasvien tuottamien entsyymien aikaansaamaa haitta aineiden hajoamista, mutta bioremediaationa pidetään myös haitta aineiden kertymistä kasveihin ja mikrobeihin. Bioremediaation avulla voidaan puhdistaa ympäristöstä ennen kaikkea luonnollisissa prosesseissa syntyneitä haitta aineita kuten öljyä, mutta myös raskasmetalleja ja erilaisia synteettisiä orgaanisia yhdisteitä, kuten liuottimia, hyönteis ja kasvimyrkkyjä sekä räjähdysaineita. (Scragg 2005a) Haitta aineita hajottavat organismit voivat joko hyödyntää yhdisteitä hiilen ja energianlähteinä tai hajotus voi tapahtua niin kutsutun kometabolian kautta. Kometaboliassa organismin tuottamat epäspesifiset entsyymit muokkaavat yhdistettä ilman että yhdistettä käytetään hiilen tai energianlähteenä. Haitta aineiden hajotus tapahtuu yleensä vaiheittain useiden entsyymien peräkkäisen toiminnan seurauksena. Maaperässä 23
tämä tapahtuu usein monien mikrobien yhteisvaikutuksen seurauksena. Haitta aineiden täydellisessä hajoamisessa eli mineralisaatiossa haitta aineet hajoavat täydellisesti tuottaen hiilioksidia, vettä ja muita epäorgaanisia yhdisteitä. Jos maaperän mikrobipopulaatiosta puuttuu jokin yhdisteen hajotukseen vaadittava entsyymi, yhdisteen hajotusprosessi pysähtyy. Tällä tavoin maaperään voi kertyä hajoamattomia yhdisteitä. (Maier 2000) Saastuneiden maiden biologista puhdistusta voidaan tehdä sekä paikan päällä ilman maan siirtämistä eli in situ tai siirretylle maa ainekselle eli ex situ. In situ menetelmien etuna on, ettei se edellytä kallista maamassojen siirtelyä. Lisäksi in situ menetelmät yleensä häiritsevät hyvin vähän maan luonnollista toimintaa. (Sylvia ym. 2005) 2.1.1 Luontainen bioremediaatio Yksinkertaisin in situ puhdistusmenetelmä on luontainen bioremediaatio, jossa saastuneen ympäristön luontaisten mikrobien annetaan hajottaa ympäristöön joutuneita haitta aineita ilman että prosessiin mitenkään vaikutetaan. Kun luontaista bioremediaatiota käytetään saastuneen alueen puhdistusmenetelmänä, on hajoamisen etenemistä seurattava sekä alueen mahdollisia riskejä kartoitettava. (Sylvia ym. 2005) Maan mikrobiyhteisöjen aineenvaihdunnan monipuolisuus ja kyky hajottaa erilaisia yhdisteitä on valtava. Monet mikrobiyhteisöt pystyvät myös hajottamaan monia niin kutsuttuja ksenobiootteja eli yhdisteitä joita ei luonnossa esiinny. Penet ym. (2006) sekä Solano Serena ym. (2000) ovat todenneet saastuneiden maiden mikrobiyhteisöjen olevan huomattavasti tehokkaampia hajottamaan kyseisiä haitta aineita kuin saastumattomien maiden mikrobiyhteisöt. Tästä he ovat päätelleet maan mikrobiyhteisöjen sopeutuvan erilaisten haitta aineiden hajotukseen. Sopeutuminen voi olla sekä hajottajien määrällistä lisääntymistä että mikrobien geneettistä muuntumista (Solano Serena ym. 2000). Vertaillessaan öljyhiilivedyillä saastuneen ja saastumattoman maan kykyä hajottaa bensiinin yleisimpiä yhdisteitä laboratoriossa Solano Serena ym. (2000) totesivat saastuneiden maiden mikrobiyhteisön pystyvän hajottamaan sellaisia öljyhiilivetyyhdisteitä, joita saastumattomien maiden mikrobiyhteisöt eivät pystyneet lainkaan hajottamaan. 24
2.1.2 Biostimulaatio Vaikka maaperän luontaiset mikrobit pystyvät hajottamaan valtavaa määrää erilaisia yhdisteitä, luontainen bioremediaatio etenee usein hyvin hitaasti ja sen tehostaminen on usein tarpeellista. Vaikuttamalla hajotusprosessia hidastaviin tekijöihin, kuten ravinteiden tai hapen puutteeseen, voidaan haitta aineiden hajotusta maaperässä tehostaa. Näitä maaperän luonnollisen mikrobiston aktiivisuuden lisäämiseen pyrkiviä menetelmiä kutsutaan biostimulaatioksi. (Scragg 2005a) Biostimulaation avulla on onnistuttu useissa tapauksissa tehostamaan luontaista bioremediaatiota. Biostimulaatiota hyödynnettiin laajamittaisesti vuonna 1989, kun Exxon Valdez öljytankkeri haaksirikkoutui Alaskan rannikolle (Scragg 2005b). Tällöin 1700 km rannikkoaluetta saastui raakaöljyllä. Biostimulaatio toteutettiin tällöin lisäämällä saastuneille maa alueille fosfori typpilannoitetta (Scragg 2005b). Öljyhiilivetyjen tiedetään muuttavan maaperän hiili typpi ja hiili fosforisuhteita mikrobeille epäedullisempaan suuntaan, jolloin parantamalla näitä suhteita voidaan usein lisätä maaperän mikrobien aktiivisuutta (Sylvia ym. 2005). Exxon Valdezin tapauksessa lannoituksen vaikutuksia seurattiin vertailemalla lannoitettuja alueita kontrollialueisiin, joita ei oltu lannoittettu (Lindstrom ym. 1991). Lannoituksen todettiin tehostavan öljyhiilivetyjen hajotusta silmin nähtävästi. Lisäksi lannoitetuilla alueilla mitattiin korkeampia öljy yhdisteiden mineralisaationopeuksia ja todettiin öljynhajottajien lukumäärien olevan selvästi korkeampia. (Lindstrom ym. 1991) Lannoituksen avulla saastuneiden maa alueiden öljyhiilivetypitoisuudet onnistuttiin Exxon Valdezin tapauksessa laskemaan öljyonnettomuutta edeltäneelle tasolle 3 4 vuodessa (Scragg 2005b). 2.1.3 Bioaugmentaatio Sen lisäksi, että saastuneen maa alueen luontaisten mikrobien hajotustehokkuutta voidaan parantaa biostimulaation avulla, voidaan hajotusta tehostaa myös lisäämällä haitta aineiden hajotukseen kykeneviä mikrobeja ympäristöön. Tätä lähestymistapaa kutsutaan bioaugmentaatioksi. Monissa tapauksissa lisättyjen bakteereiden on kuitenkin todettu häviävän nopeasti maaperästä (Thompson ym. 2005). Tämän nopean häviämisen on päätelty olevan seurausta laboratoriossa kasvatettujen mikrobien heikentyneestä kilpailukyvystä, jolloin ne maahan lisättäessä häviävät kilpailussa maaperän luontaiselle mikrobistolle. 25
Marquez Rocha ym. (2001) ovat keskittyneet tutkimaan puhdasviljelmien sijasta mikrobikonsortioiden hyödyntämistä bioaugmentaatiossa. Lisäksi sekä Barbeau ym. (1997) että Gentry ym. (2004) ovat tutkineet aktivoidun maa aineksen hyödyntämismahdollisuuksia bioaugmentaatiossa. Maa aineksen aktivointi tapahtuu bioreaktorissa, jossa maa ainekseen sekoitetaan tutkittavaa haitta ainetta. Tämän on todettu lisäävän kyseistä haitta ainetta hajottavien mikrobien määrää maa aineksessa. Aktivoitu maa aines hyödynnetään mikrobiymppinä saastuneella maa alueella. Koska haitta aineiden hajoamiseen luonnossa vaikuttavat aina monet ympäristötekijät, on hajotusta rajoittavat tekijät määritettävä jokaisessa tapauksessa erikseen. Jos alueella on hyvin vähän mikrobiaktiivisuutta tai hajotettavat yhdisteet ovat hyvin hankalasti hajoavia voi yhdisteiden hajotukseen kykenevien mikrobiymppien lisääminen eli bioaugmentaatio tehostaa hajotusta (Maier 2000). Suurimman osan haitta aineista on kuitenkin todettu hajoavan luontaisten mikrobien toimesta kaikissa ympäristöissä (Maier 2000). Hajotus voi tosin olla hidasta. Tällöin on tärkeää selvittää mitkä tekijät rajoittavat hajotusta ja yrittää vaikuttaa näihin tekijöihin biostimulaation avulla. 2.1.4 Ex situ menetelmät Kun saastuneen maa aineksen puhdistusta ei voida syystä tai toisesta tehdä paikan päällä, voidaan biologisia puhdistusmenetelmiä hyödyntää myös siirretylle maa ainekselle. Menetelmiä, joissa maa ainesta siirretään käsittelyä varten kutsutaan ex situ menetelmiksi. Ex situ menetelmissä maa aines puhdistetaan esimerkiksi bioreaktorissa, kompostoimalla tai ns. peltokäsittelyllä. Koska maan siirtäminen tuo kustannuksia, ovat ex situ menetelmät aina in situ menetelmiä kalliimpia. Tosin esimerkiksi bioreaktorissa maa aines voidaan puhdistaa paljon nopeammin kuin in situ menetelmillä. (Sylvia ym. 2005) Ex situ menetelmissä haitta aineiden hajotusta tehostetaan samoilla menetelmillä kuin in situ menetelmissä. Pellolle, bioreaktoriin ja kompostiin luodaan lannoittamalla optimaaliset ravinneolosuhteet. Bioreaktorissa taataan optimaaliset happiolosuhteet ilmastamalla; pellolla ja kompostissa sekoittamalla maa ainesta. Lisäksi voidaan säädellä ph:ta, hapetus pelkistys potentiaalia ja veden aktiivisuutta. Bioreaktorissa voidaan säädellä myös lämpötilaa. Olosuhteiden säätäminen optimaalisiksi on helpointa bioreaktorissa ja hajotustehokkuus saadaan bioreaktorissa korkeammaksi kuin muilla 26
menetelmillä (Sylvia ym. 2005). Bioreaktorin käyttö on kuitenkin kallista eikä sillä voida käsitellä suuria maamassoja yhtäaikaisesti. Kontrolloiduissa oloissa, kuten bioreaktorissa, bioaugmentaatiota on hyödynnetty huomattavasti paremmin tuloksin kuin in situ menetelmissä (Sylvia ym. 2005). Bioaugmentaation tulevaisuuden sovellutukset voisivat näin ollen hyvin olla erilaisissa e x situ menetelmissä. Lisäksi laboratorio oloissa on tutkittu geneettisesti muunneltujen organismien hyödyntämistä öljyhiilivetyjen hajotuksen tehostamisessa (Dua ym. 2002). Näitä geneettisesti muunneltuja superhajottajia voitaisiin mahdollisesti tulevaisuudessa käyttää bioreaktorin kaltaisessa suljetussa ympäristössä tapahtuvassa puhdistuksessa (Scragg 2005a). 2.2 Fytoremediaatio Fytoremediaatio on bioremediaation osa alue, joka hyödyntää kasveja haitta aineiden poistamisessa. Kasveja voidaan hyödyntää monin eri tavoin ympäristönpuhdistuksessa. Newman ja Renolds (2004) ovat jaotelleet katsauksessaan fytoremediaatiomenetelmät neljään eri ryhmään, joita ovat fytodegradaatio, fytoakkumulaatio, fytostabilointi ja ritsoremediaatio. Fytodegradaatiossa kasvit ottavat sisäänsä ympäristömyrkkyjä ja hajottavat niitä solujensa sisällä. Fytoakkumulaatiossa kasvit ainoastaan keräävät ympäristömyrkkyjä biomassaansa, mutta eivät hajota niitä. Fytostabiloinnissa kasvien juuriston avulla estetään haitta aineita valumasta esimerkiksi vesistöihin tai pohjaveteen. Fytoremediaation osa aluetta, joka hyödyntää kasvin juuriston mikrobiaktiivisuutta nostavaa vaikutusta haitta aineiden hajotuksessa, kutsutaan ritsoremediaatioksi. Erityisesti ritsoremediaatiota pidetään lupaavana menetelmänä öljyhiilivetyjen poistamisessa maaperästä (Kuiper ym. 2004). Fytoremediaatio soveltuu pintamaiden matalien saastepitoisuuksien käsittelyyn alueilla, joilla ei ole kiireellistä kunnostuksen tarvetta. Alkorta ja Garbisu (2001) pitävät fytoremediaation hyvinä puolina sitä, että se häiritsee hyvin vähän maaperän luonnollista toimintaa ja on lisäksi edullinen ja esteettisesti miellyttävä menetelmä. Artikkelissaan he kuitenkin korostavat, että ennen fytoremediaation soveltamista saastuneille maa alueille on selvitettävä, etteivät haitta aineet haihdu kasvien kautta ilmakehään tai ettei kasveissa muodostu haitta aineista vielä myrkyllisempiä yhdisteitä kasvin metabolian seurauksena. 27
Jos kasveihin kertyy jotain myrkyllisiä yhdisteitä, on varmistettava, etteivät nämä myrkylliset yhdisteet siirry ravintoketjussa eteenpäin. 2.2.1 Ritsoremediaatio Ritsoremediaatiossa hyödynnetään kasvin juuriston edistävää vaikutusta haitta aineiden hajotuksessa. Juuristo vaikuttaa monin tavoin maan ominaisuuksiin. Juuristolla on vaikutusta muun muassa maan hiilidioksidi, happi ja vesipitoisuuteen, happamuuteen, osmoottiseen paineeseen sekä hapetus pelkistys potentiaaliin (Parrish ym. 2005). Lisäksi mikrobiaktiivisuus on huomattavasti korkeampaa kasvien juuristossa kuin sitä ympäröivässä maassa. Tämän havainnon teki Hiltner jo vuonna 1904. Samalla Hiltner esitti termin ritsosfääri, jonka hän määritteli alueeksi, jolle kasvin juuriston vaikutus maaperässä ylettyy. (Kuiper ym. 2004) Sen lisäksi, että ritsosfäärissä on ympäröivää maata korkeampi mikrobitiheys, on ritsosfäärin mikrobiyhteisön todettu poikkeavan huomattavasti ympäröivän maan mikrobiyhteisöistä. Mikrobiyhteisöjen koostumuksen on todettu myös olevan erilainen eri kasvilajien juuristossa. Mikrobiyhteisöjen rakenteeseen juuristossa vaikuttaa kasvilajin lisäksi kasvin juurieritteiden koostumus, juurten rakenne, kasvin ikä sekä maan ominaisuudet. Gram negatiivisten bakteerien, kuten Pseudomonas suvun edustajien on todettu olevan vallitsevia ritsosfäärissä. (Kuiper ym. 2004) Haitta aineiden tehostunut hajotus ritsosfäärissä perustuu pääasiassa mikrobien kohonneeseen lukumäärään sekä korkeampaan metaboliseen aktiivisuuteen (Kuiper ym. 2004). Tosin on esitetty ainakin joidenkin kasvien juurieritteiden edistävän erityisesti polyaromaattisten hiilivetyjen (PAH) hajotusta (Parrish ym. 2005, Spriggs ym. 2005). Parrish ym. (2005) tutkivat PAH yhdisteiden hajoamista rohtomesikän (Melilotus officinalis) ja ruokonatan (Festuca arundinacea) juuristossa. He totesivat kasvihuonekokeissaan erityisesti rohtomesikän juuriston tehostavan merkittävästi polyaromaattisten hiilivetyjen hajoamista. Parrish ym. uskovat PAH:ien tehostuneen hajotuksen johtuvan kasvin juurisolujen erittämistä rengasrakenteisista yhdisteistä, jotka aktivoivat epäspesifisiä, rengasrakenteisia yhdisteitä hajottavia entsyymejä. He esittävät näiden entsyymien osallistuvan myös PAH:ien hajotukseen. 28
Useiden haitta aineiden on todettu hajoavan tehokkaammin usean kasvilajin yhteisössä kuin monokulttuurissa (Maila ym. 2005, Palmroth ym. 2002). Maila ym. vertailivat Brachiaria serrata kasvin ja sormihirssin (Eleusine coracana) vaikutusta PAHyhdisteiden hajoamiseen kyseisten kasvien monokulttuureissa sekä niiden yhteisössä. Maila ym. totesivat Brachiarian ja sormihirssin yhteisön tehostavan PAH:ien hajotusta huomattavasti enemmän kuin kyseisten kasvien monokulttuurien. Monokulttuuriin verrattuna usean kasvilajin yhteisö ylläpitää maassa monimuotoisempaa mikrobistoa, ja tarjoaa siten paremmat edellytykset hajottaa hankalasti hajoavia yhdisteitä, kuten PAHyhdisteitä. Eri kasvilajien kyky edistää haitta aineiden hajotusta juuristonsa avulla poikkeaa huomattavasti toisistaan. Palmroth ym. (2002) vertailivat neljän erilaisen kasvipeitteen, männyn taimiston, poppelin taimiston, ruohokasviyhteisön ja palkokasviyhteisön, kykyä edistää dieselöljyn hajotusta. He totesivat tutkimuksessaan palkokasvien edistävän selvästi tehokkaimmin dieselöljyn hajotusta. Ruohokasviyhteisön ei puolestaan todettu merkittävästi edistävän diesel öljyn hajotusta. Lisäksi Palmroth ym. (2002) totesivat kaksivuotisen kokeensa aikana dieselöljyn häviävän selvästi nopeammin maasta kokeen toisena vuonna, jolloin dieselöljyä lisättiin samaan maahan toiseen kertaan kokeen toistamiseksi. Palmroth ym. päättelivät ritsosfäärin mikrobiston sopeutuneen öljynhajotukseen ja öljynhajottajien rikastuneen maassa kokeen ensimmäisen vuoden aikana. Joissain tapauksissa kasvien ei ole todettu edistävän lainkaan haitta aineiden hajotusta, vaan vaikutus on voinut olla jopa päinvastainen. Lalende ym. (2003) seurasivat kenttäkokeessaan kymmenen kuukauden ajan pyreenin hajoamista italianraiheinän (Lolium multiflorum) juuristossa ja vertasivat sitä kasvittomaan verrokkimaahan. He totesivat yllätyksekseen pyreenin hajoavan jopa nopeammin kasvittomassa verrokkimaassa kuin tutkimuksen kohteena olevassa kasvillisessa maassa. Syyksi tähän Lalende ym. esittävät kasvien juurten erittämiä orgaanisia yhdisteitä, joita osa pyreenin hajottajista mahdollisesti käyttää pyreenin sijasta energian ja hiilenlähteinään. Vaikeasti hajoavien yhdisteiden hajoaminen maaperässä voi näin ollen myös hidastua kasvien läsnäollessa niiden tuottaessa maaperään helpommin hyödynnettäviä energian ja hiilenlähteitä. 29