Molekyyli- ja solubiologia ELEC-2210 Proteiinit Vuento & Heino: Biokemian ja solubiologian perusteet, ss. 51-66 Alberts et al. Essential Cell Biology, 4. p, luku 4 Dos. Tuomas Haltia, HY, Biotieteiden laitos, biokemia ja biotekniikka
Luennoitsijan CV Luennoitsija: dos. Tuomas Haltia, biokemian yliopistonlehtori Biotieteiden laitoksella Hgin yliopistossa 2005- Työssä HY:n lääk. tdk:ssa 1986-2004 tutkijana ja opettajana Tutkimusaiheita: kalvo- ja metalloproteiinit: sytokromioksidaasi, NO-reduktaasi, N 2 O-reduktaasi, sinkki-atpaasi (P-tyypin ATPaasi) Kuparin biokemia:kuparinpyydystysmolekyyli?
Ilokaasureduktaasin ja sen aktiivisen CuZ-keskuksen rakenne (Haltia et al., 2003) Katalysoi reaktiota: N 2 O + 2e - + 2H + N 2 + H 2 O Geenit koodaavat kemiaa!
Luennon sisältö ja tavoitteet Ymmärtää kuinka proteiinit (ja entsyymit) rakentuvat aminohapoista Peptidisidos Proteiinien rakennetasot Proteiinien laskostuminen
Proteiinin biologinen aktiivisuus liittyy tähän rakenteeseen! Aminohapot ja proteiinit Solujen kuiva-aineesta suurin osa on erilaisia proteiineja, solun toiminta perustuu paljolti proteiinien käyttöön Proteiinit muodostuvat 20 (22) aminohaposta Aminohappo: esim. Gly: H 2 N-CH 2 -COOH Pieni molekyyli, jolla paljon konformaatioita Proteiini, koostuu tyypillisesti > 100 aminohaposta; suuri molekyyli, joka laskostuu uniikiksi 3- ulotteiseksi rakenteeksi
Proteiinit muodostuvat aminohapoista YMPÄRISTÖ: VETTÄ! Kymotrypsiini (proteolyyttinen entsyymi) ja glysiini
AMINOHAPOT: Kiraalisia (paitsi Gly) eli a-hiilessä neljä erilaista ryhmää. Seuraus: myös proteiinit ovat kiraalisia ja kykenevät usein erottamaan vasen- ja oikeakätiset molekyylit toisistaan. Proteiineissa vain L- aminohappoja (syy epäselvä)
AMINOHAPOT:Aminoryhmä, karboksyyliryhmä, a-hiili ja sivuketju R (joita 20 erilaista) Proteiinilla on aminopää (N-terminus) ja karboksipää (C-terminus) Pääketju muodostuu N-C a -C carb yksiköistä R = sivuketju (20 erilaista)
Pääketju ja sivuketjut Proteiinin pääketju muodostuu, kun aminoryhmät ja karboksylaattiryhmät reagoivat muodostaen haarautumattoman polypeptidin a-hiileen kiinnittyneet amino- ja karboksylaattiryhmät kuluvat peptidisidoksen muodostamisreaktioon (jossa lohkeaa vettä) peptidisidoksen ominaisuudet tärkeitä proteiinin laskostumiselle Sivuketjujen (R) ominaisuudet ovat myös ratkaisevan tärkeitä proteiineissa
COOH ja NH 2 reagoivat, vettä lohkeaa Reaktio ei ole spontaani, vaan vaatii energiaa! PEPTIDISIDOS Peptidisidos on silti kineettisesti stabiili, proteiinimme eivät noin vain hajoa! Peptidisidos on varautumaton vaikkakin polaarinen (seuraava kuva) H-sidosten muodostusmahdollisuus
Aminohappojen luokittelu Vesihakuiset eli hydrofiiliset: polaarinen (poolinen) tai varattu sivuketju Vesipakoiset eli hydrofobiset: epäpolaarinen (pooliton, polaariton) sivuketju Tärkeää koska proteiinit laskostuvat vedessä!
Aminohapot, joilla ei-polaariset eli poolittomat sivuketjut -Hakeutuvat pois vedestä (proteiinien ydin); oikeammin: vesi työntää ne yhteen Glysivuketju on pieni!
Aminohapot, joilla aromaattiset sivuketjut Myös vesipakoisia A 280, tryptofaanifluoresenssi
Polaariset, varautumattomat Viihtyvät proteiinin pinnalla Cys: S-S sillat, kysteiinien kemiallinen modifiointi koeputkessa Pro rikkoo a-kierteen
Positiivisesti varautuneet Viihtyvät proteiinin pinnalla His-tag, histidiinisivuketjun pka = 6
Negatiivisesti varautuneet Viihtyvät proteiinin pinnalla
Sivuketjujen ominaisuudet proteiineissa Voivat poiketa selvästi vapaiden aminohappojen tai proteiinin pinnalla olevien sivuketjujen ominaisuuksista Polaarinen ympäristö (esim. vesi) suosii sivuketjujen varautuneita muotoja, esim. Asp- COO - ja Lys-NH + 3 Esim. proteiinin aktiivisessa keskuksessa hydrofobinen ympäristö voi muuttaa joidenkin aminohappojen happo-emäs ominaisuuksia (pk a - arvoja) merkittävästi katalyyttisten ryhmien erikoisominaisuudet
Mitä aminohapoista pitäisi osata? Mikä on a-aminohappo Kolmikirjainlyhenteet Onko sivuketju hapan/emäksinen/aromaattinen jne. Onko sivuketju hydrofobinen/hydrofiilinen Miten aminohappo muodostaa peptidisidoksen
COOH ja NH 2 reagoivat, vettä lohkeaa Reaktio ei ole spontaani, vaan vaatii energiaa! PEPTIDISIDOS Peptidisidos on silti kineettisesti stabiili, proteiinimme eivät noin vain hajoa! Peptidisidos on varautumaton vaikkakin polaarinen (seuraava kuva) H-sidosten muodostusmahdollisuus
PEPTIDISIDOS ON TASOMAINEN, koska sillä on 2-sidosluonnetta! 2-sidosluonteesta seuraa tasomaisuus, ts. karbonyyliryhmä C=O ja amidiryhmä NH ovat samassa tasossa. Polypeptidiketju ei voi kiertyä peptidisidoksen ympäri!
Peptidi- eli amidisidoksin liittyneet aminohapot muodostavat polypeptidin; proteiinin primäärirakenne on sen sekvenssi Kiertymiskulmat fii (N- C a ) ja psii (C a -C C=O ) Taso Taso Tietyt kiertymiskulmien arvot ovat parempia kuin toiset
Proteiinien muut rakennetasot Sekundäärirakenteet, esim. a-kierre, b-laskos Tertiäärirakenne, kullekin polypeptidiketjulle ominainen 3D-rakenne (jolla biologinen aktiivisuus) Kvaternäärirakenne, laskostuneiden (enemmän tai vähemmän) polypeptidiketjujen assosioituminen dimeereiksi, trimeereiksi, tetrameereiksi jne. (vain osalla proteiineista)
Primääri- ja sekundäärirakenteella ei ole biologista aktiivisutta. Aktiivisuus liittyy proteiinin tertiäärirakenteeseen eli polypeptidiketjun spesifiseen ja (fysiologisissa oloissa) stabiiliin 3-ulotteiseen rakenteeseen. Miten tämä rakenne syntyy? Koeputkessa sopivissa oloissa laskostumaton polypeptidi laskostuu biologisesti aktiiviseksi proteiiniksi. Informaatio 3D-rakenteesta on koodattuna ah-sekvenssiin (ja siis geenin emäsjärjestykseen).
Miksi sekundäärirakenne syntyy? Polypeptidin peräkkäiset peptidisidostasot rajoittavat merkittävästi mahdollisten konformaatioiden lukumäärää! Tietyt konformaatiot eli tietyt fiin ja psiin arvot ovat epäsuotuisia molekulaaristen kolarien takia Ramachandrankuvaaja!
Ramachandran: vain tietyt F:n ja y:n arvot ovat steerisesti sallittuja säännöllinen sekundäärirakenne kun peräkkäisillä aminohapoilla nämä kiertymäkulmien arvot
Proteiinien sekundäärirakenteet: a- kierre ja b-laskos Suotuisat fiin ja psiin arvot Ei steerisiä esteitä Hyvä vetysidosgeometria Tilaa sivuketjuille Muodostuvat sekvenssissä peräkkäin olevista (3-30 ah) aminohappotähteistä, joilla samanlaiset fiin ja psiin arvot Eivät vielä selitä tertiäärirakenteiden syntyä mutta ovat osa selitystä, koska sekundäärirakenteiden muodostus on osa tertiäärirakenteen syntyä
Peräkkäiset aminohapot muodostavat Oikeakätinen a-kierre Tietty geometria (3,6 ah/kierros; 5,4 Å nousu/kierros) Peptidisidoksen karbonyylihapet ja amidivedyt muodostavat hyviä vetysidoksia heliksiä koossapitävä voima! Sivuketjut osoittavat ulospäin; kierre voi olla esim. amfipaattinen (toinen puoli hydrofobinen ja toinen hydrofiilinen
a-kierteen päätykuva R = sivuketju Joka 3. tai 4. ah on aina samalla puolella Ei ole oikeasti tyhjä tila!
Muodostuu kahden vierekkäisen (saman- tai erisuuntaisen) polypeptidiketjun välille b-laskos Vetysidokset C=O --- HN Sivuketjut vuorotellen laskoksen ala- ja yläpuolella Pääketju on venyneemmässä konformaatiossa kuin a- kierteessä
Proteiinien tertiäärirakenne = Koko polypeptidiketjun 3-ulotteinen rakenne Proteiinien biologisen aktiivisuuden perusta Proteiinin tertiäärirakenne on koodattuna primäärirakenteeseen (mutta emme tiedä tarkasti miten!) Vesiliukoisten proteiinien ydin koostuu hydrofobisista aminohapoista Kuinka laskostumaton proteiini löytää oikean rakenteensa millisekunneissa? Sivuketjujen väliset vuorovaikutukset pääosassa
Proteiinien 3D rakenteita... (tertiäärirakenteita)
Esimerkkejä tertiäärirakenteista (Domeeni = rakenteellinen, itsenäisesti laskostuva kokonaisuus jolla on oma funktio) Kupredoksiinidomeeni b-propelleri -domeeni Trioosifosfaattiisomeraasin kiderakenne Ilokaasureduktaasin kiderakenne
Kvaternäärirakenne Useiden laskostuneiden proteiinimolekyylien assosioituminen esim. dimeereiksi tai tetrameereiksi, esim. hemoglobiini Assosioituvat proteiinit samanlaisia tai erilaisia
Hemoglobiini ((ab) 2 -tetrameeri) Hemoglobiinin allosteerinen hapen sitominen riippuu olennaisesti sen tetrameerisestä kvaternäärirakenteesta
Proteiinien rakennetta ylläpitävät voimat Primäärirakenne: kovalenttinen peptidisidos Sekundäärirakenne: vetysidos Tertiäärirakenne: van der Waalsin sidokset, vetysidokset, kovalenttiset sidokset jos proteiinissa disulfideja (-S-S- kahden Cys:n välillä); hydrofobiset interaktiot Kvaternäärirakenne: samat kuin tertiäärirakennetta koossa pitävät voimat
Proteiinirakennetta koossapitävät voimat
Hydrofobinen ilmiö: Vesi preferoi vesinaapuria ja pakottaa epäpolaariset molekyylit pois kontaktista veden kanssa Hydrofobisella ilmiöllä tärkeä merkitys proteiinien laskostumisessa!
Hierarkinen laskostuminen säilyttämällä osittain oikea rakenne 1-2. Sekundäärirakenteet (heliksit muodostuvat) Hydrofobinen ydin muodostuu 3. Molten Globule 4. Natiivi rakenne syntyy Konformaatioparvi (polypeptidin maksimientropia) Karkea laskostumisreitti on koodattuna sekvenssiin. Ihmisen suunnittelema proteiini ei tod. näk. laskostu. Veden maksimientropia Yksi konformaatio, jolla alin vapaa energia
Laskostumiseen vaikuttavat mutaatiot voivat olla vaarallisia Koska ne voivat johtaa muutoksiin laskostumisvälituotteiden määrissä Koska ne voivat johtaa huonosti käyttäytyviin laskostumisintermediaatteihin Laskostuva proteiini alkaa aggregoitua, aggregaattia ei pystytä hajoittamaan Toksiset aggregaatit, solujen kuolema
Normaalin prioniproteiinin muuttuminen taudin aiheuttavaksi (Esimerkki laskostumisvirheen aiheuttamasta taudista) a-heliksien muuttuminen b-laskokseksi aiheuttaa intermolekulaarisen aggregaatiotaipumuksen solukuolema!
Proteiinien rakenne: yhteenveto Primäärirakenne: geenin määräämä aminohapposekvenssi Sekundäärirakenteet a- heliksi ja b-laskos juontuvat peptidiketjun stereokemiasta ja vetysidospotentiaalista (+sivuketjujen ominaisuuksista) Tertiäärirakenne = proteiinin 3-D rakenne; hydrofobinen vuorovaikutus, vetysidokset, vdwaalsin voimat pitävät koossa Kvaternäärirakenne = oligomeerien muodostuminen
Fig. 5-24 Proteiinin laskostuminen solussa: kaperoni avustaa (estää aggregoitumisen), muttei määrää 3D-rakennetta Cap Polypeptide Correctly folded protein Hollow cylinder Chaperonin (fully assembled) Steps of Chaperonin Action: 1 An unfolded polypeptide enters the cylinder from one end. 2 The cap attaches, causing the 3 cylinder to change shape in such a way that it creates a hydrophilic environment for the folding of the polypeptide. The cap comes off, and the properly folded protein is released.