TUHKALLA TEHOSTETUN KOMPOSTIN KYPSYYDEN JA LAADUN ARVIOINTI JENNI OJALA

TUHKALLA TEHOSTETUN KOMPOSTIN KYPSYYDEN JA LAADUN ARVIOINTI JENNI OJALA HELSINGIN YLIOPISTO YMPÄRISTÖEKOLOGIAN LAITOS PRO GRADU TUTKIELMA 20.10.2008 0

HELSINGIN YLIOPISTO HELSINGFORS UNIVERSITET Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion Laitos Institution Biotieteellinen tiedekunta Ympäristöekologian laitos Tekijä Författare Jenni Arja Emilia Ojala Työn nimi Arbetets titel Tuhkalla tehostetun kompostin laadun ja kypsyyden arviointi Oppiaine Läroämne Ympäristöekologia Työn laji Arbetets art Pro gradu Tiivistelmä Referat Aika Datum 20.10.2008 Sivumäärä Sidoantal 62 Kompostoitumisessa biojätteestä syntyy mikrobien toiminnan avulla maanparannusainetta ja sivutuotteena vettä, hiilidioksidia, haihtuvia yhdisteitä sekä lämpöä. Kompostointiprosessi jaetaan yleensä kolmeen osaan; mesofiilinen alkuvaihe, termofiilinen aktiivivaihe sekä jäähtymis- eli kypsymisvaihe. Kompostoitumisen alkuunlähtöä voi hidastaa ns. happokuoppa. On havaittu, että tuhkalisäyksellä ph saadaan alussa nousemaan, mikä edistää aktiivivaiheeseen siirtymistä ja tehostaa kompostoitumista. Kompostoitumisen etenemistä voidaan seurata mittaamalla esimerkiksi hapenkulutusta sekä ph:ta. Luotettavan tuloksen kompostin tilasta saa useamman testin avulla. On tärkeää, että kasvien kasvualustaksi tarkoitettu komposti on kypsää sillä raaka komposti voi olla myrkyllistä esimerkiksi kasveille. Ihmiselle haitalliseksi kompostin voi tehdä patogeeniset mikrobit kuten Yersinia ja Salmonella. Näitä mikrobeja voi esiintyä mikäli aktiivinen vaihe ei ole ollut kyllin tehokas ja massa on sisältänyt eläinperäisiä jätteitä. Lämpötilan pitää pysyä useita päivä + 55 C, jotta patogeenit kuolevat. Suomen ja EU:n lainsäädännössä on asetuksia, jotka ohjaavat maanparannusaineiden laatua ja omavalvontaa. Tässä Pro Gradu- työssä tutkittiin tuhkakäsitellyn kompostimassan kypsyyttä ja laatua yleisesti käytössä olevilla menetelmillä. Kompostista määritettiin tilavuuspaino, ph, kuiva-aine, orgaaninen aine, hapenkulutus, lämmönkehitys rottegrad-testillä, hiilen ja typen suhde, ammonium-ja nitraattiytpen suhde, ravinteet ja raskasmetallit. Aihetta tarkasteltiin myös työsuojelumielessä maljauksilla sekä reaali aika PCR-menetelmällä riskiluokkabakteerien osalta. Vertailukohteena käytettiin kompostia, jossa ei ollut tuhkakäsittelyä. Tavoitteena oli saada tietoa kompostointilaitosten toimivuudesta ja prosessin tehostamisesta sekä tuhkan vaikutuksista kompostoinnissa. Hypoteeseina työssä oli: 1. Tuhka nopeuttaa kompostin kypsymistä, 2. Tuhkakomposti on hygieenistä ja laadultaan hyvää ja 3. Tuhka ei estä kompostin käyttöä maanparanteena. Näytteet haettiin Kiertokapula oy:n ja YTV:n kompostilaitoksista. YTV aloitti tuhkalisäykset syksyllä 2007. Kiertokapula oy on käyttänyt tuhkaa jo muutaman vuoden ajan. Tuhkalla oli positiivinen vaikutus kompostin kypsymiseen sekä laatuun, eikä se estä kompostin käyttöä maanparanteena.tuhka tasasi ph:n vaihteluita kompostoitumisen aikana ja nopeutti aktiiviseen vaiheeseen siirtymistä. Tuhkalla oli alentava vaikutus Yersinian ja Streptomykeettien määriin. Salmonellan kohdalla ero tuhkallisen ja tuhkattoman kompsotin välillä ei ollut huomattavan suuri. Kampylobakteereita ei PCRmenetelmällä löydetty. Bacillus cereus-baktreereista ei saatu tulosta liiallisen IPC:n vuoksi. Maljauksilla saaduissa tuloksissa mikrobistossa tuhka oli vähentänyt hiukan mikrobien määrää. Kaikki Kiertokapula oy:n näytteet täyttivät asetuksen (EY) N:o 1774/2002 vaatimukset. YTV:n komposteista vain muutama näyte täytti asetuksen vaatimukset ja yksi näyte sisälsi Salmonellaa. Tuhkakompostissa havaittiin suuremmat ravinnepitoisuudet, mikä kertoo nopeammasta ja tehokkaammasta orgaanisen aineksen hajoamisesta. Raskasmetallien osalta myös tuhkalliset kompostit täyttivät asetetut laatuvaatimukset MMM 46/1994. Kiertokapula oy:n komposteista jo puolenvuoden ikäinen komposti täytti useimmat kypsyyttä mittaavat testit. Jälkikypsyminen jatkuu kuitenkin vielä pidempään. YTV:n kompostit olivat kaikki vielä kypsymisvaiheessa, vanhin komposti oli vasta 4,5 kk ikäistä. Käyttökelpoisiksi analyyseiksi kompostin kypsyyttä määritettäessä osoittautuivat C/N-suhde, nitraatti-ja ammoniumtypen suhde sekä hapenkulutus. Kun nämä analyysit tehdään huolellisesti saadaan hyvä ja luotettava kuva kompostin kypsyysasteesta. Mikrobiologisten määritysten osalta PCR-analyysi antaa tarkan ja kattavan kuvan mikrobiologisesta laadusta. PCR-työskentelyssä kokemus tuo tarkemmat tulokset. Asetetut hypoteesit toteutuivat. Avainsanat - Nyckelord komposti, kypsyys, stabiilisuus, hygieenisyys Säilytyspaikka - Förvaringställe Helsingin yliopisto, Ympäristöekologian laitoksen käsikirjasto Muita tietoja Ohjaajat: Yliopiston professori Martin Romantschuk, yliopiston lehtori Merja Kontro ja jatkoopiskelija Aija Rainisalo 1

HELSINGIN YLIOPISTO HELSINGFORS UNIVERSITET Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion Faculty of Biosciences Laitos Institution Department of Ecological and Environmental Sciences Tekijä Författare Jenni Arja Emilia Ojala Työn nimi Arbetets titel Evaluation of compost maturity and quality with ash amendment Oppiaine Läroämne Environmental ecology Työn laji Arbetets art Pro gradu Tiivistelmä Referat Aika Datum 20.10.2008 Sivumäärä Sidoantal 62 Composting is a microbiological event, which produces soil improvement from organic waste. Water, heat, carbon dioxide and volatile compounds are produced as side product. Composting is usually divided in three phases: mesophilic- thermophilic (active)- and cooling-/stabilation phase. In the beginning of composting process mass often becomes very acidic and it can take a while before active phase starts. It has been found that ash amendment raises ph and accelerates the shift to the active phase. Maturity of the compost can be followed with different kind of analysis, for example ph and oxygen consumption. Results are more reliable by doing several tests. It is very important that compost is mature, especially when used for plants. Immature compost can contain toxic compounds, which prevent plants to grow. Compost can be unhealthy also for humans. Compost may contain pathogens like Yersinia or Salmonella if active phase hasn t been effective enough. There are laws and rules settled by MMM and EU that controls selfmonitoring and the quality of soil improvement. In this pro-gradu thesis was studied compost quality and maturity with ash amendment with commonly used tests. Made tests were: volume weight, ph, dry weight, organic matter, oxygen consumption, self heating capacity with rottegrad-test, carbon-nitrogen relation, ammonia- nitrate-relation, nutrients and heavy metals. Subject was also viewed from working healthy aspect. Harmful pathogens were detected with plating and RT- PCR. There were composts with and without ash amendment. The aim in this study was to get information about compost facilities and how ash affects to compost process. Hypotheses were: 1. Composting is faster with ash and 2. Compost with ash is hygienic and has good quality and 3. Ash doesn t prevent to use compost as soil improvement. Samples were from Kiertokapula oy and YTV. YTV started ash amendments in autumn 2007, Kiertokapula oy has already been used ash for few years. Ash had positive effect on compost maturity and quality and it can be used as soil improvement. Ash stabilized ph during composting and accelerated shifting to active phase. Ash decreased amount of Yersinia and Streptomyces but hadn t so notable effect on Salmonella. Any Campylobacter were not found. For Bacillus cereus were not able to get results. There was small differences between ash and no ash compost were found with plating. All Kiertoakpula oy:s samples fitted in rules settled by European parliament (EY) N:o 1774/2002. YTV:s samples contained quite much bacteria, only few samples fitted in (EY) N:o 1774/2002. One sample contained Salmonella.Nutrient content were higher in ash composts, it tells that decomposing has been faster and more effective than in no ash compost. Heavy metal contents were fitted in MMM 46/1994 and ash didn t rose contents. Kiertokapula oy.s compost samples were mature in 6 months age, but stabilization takes another 6 months. All YTV:s samples were raw, oldest samples were only 4,5 months old. Good analyses for studying compost maturity were carbon-nitrogen-ratio, ammonia-nitrate-ratio and oxygen consumption. When these analyses are made carefully, it gives good results about maturity of compost. PCR gives precise results amount of compost microbes. Experience in PCR gives more reliable results than plating. Avainsanat - Nyckelord compost, maturity, stability, hygiene Säilytyspaikka - Förvaringställe University of Helsinki, Department of Ecological and Environmental Sciences, library Muita tietoja Instructors: professor Martin Romantschuk, lecturermerja Kontro and PhD student Aija Rainisalo 2

Sisällysluettelo: TIIVISTELMÄ...1 ABSTRACT...2 1. JOHDANTO... 4 1.1. Yleistä kompostoinnista...4 1.2. Lisäaineena tuhka... 5 1.3. Hygieenisyys...6 1.4. RT-PCR...7 1.5. Kypsyyden määritys...8 1.6. Työn tarkoitus...13 2. AINEISTO JA MENETELMÄT...13 2.1. Näytteenotto...13 2.2. Näytteiden käsittely ja varastointi...15 2.3. Tilavuuspaino...16 2.4. ph...16 2.5. Kuiva-aine...16 2.6. Orgaaninen aine...16 2.7. Hapenkulutus...17 2.8. Rottegrad...19 2.9. C/N-suhd...19 2.10. Ammonium- ja nitraattitypen suhde...20 2.11. Maljaukset...20 2.12. Reaaliaika PCR...21 2.13. Ravinteet... 34 2.14. Raskasmetallit...34 3. TULOKSET...34 3.1. Näytteiden ominaisuudet...34 3.2. Tilavuuspaino...36 3.3. ph...37 3.4. Kuiva-aine...39 3.5. Orgaaninen aine...40 3.6. Hapenkulutus...42 3.7. Rottegrad...43 3.8. C/N-suhde...45 3.9. Ammonium- ja nitraattitypen suhde...46 3.10. Maljaukset...47 3.11. Reaaliaika PCR...48 3.12. Ravinteet...52 3.13. Raskasmetallit...53 4. TARKASTELU......54 4.1. Kompostin kypsyys...54 4.2. Kompsotin laatu...56 4.3. Tuhkan käyttö kompostissa...57 5. KIITOKSET........ 59 6. KIRJALLISUUS...... 60 3

1. Johdanto 1.1. Yleistä kompostoinnista Kompostoituminen on prosessi, jonka saavat aikaan aerobisissa olosuhteissa toimivat mikrobit hajottaessaan biojätettä.. Reaktiossa syntyy vettä, hiilidioksidia, haihtuvia yhdisteitä, lämpöä sekä maanparannusainetta; kompostia (Haug, 1993). Suomessa kompostointilaitokset käsittelevät suuria määriä biojätettä, esimerkiksi jätevesilietteitä sekä yhdyskuntien biojätteitä. Suuret rumpu- sekä tunnelikompostorit ovat jatkuvatoimisia ja tarkoin prosessoituja systeemejä joiden lopputuote viedään aumaan kypsymään. Kompostin käyttöä lannoitevalmisteena säätelevät lannoitevalmisteita ja maanparanteita koskevat kansalliset ja EU-säädökset, kuten MMM 45/1994, 46/1994 ja 47/1994 (Itävaara ym 2006). Kompostoitumisen alussa massa on viileää, ph on alhainen ja valtalajeina hajottajamikrobeissa ovat mesofiiliset eli viileässä viihtyvät lajit. Massa voi sisältää patogeenisia mikrobeja sekä sisältää kasveille liiallisia määriä kasvua estäviä, jopa myrkyllisiä aineita. Mesofiilistä alkuvaihetta seuraa termofiilinen aktiivivaihe, jonka aikana hajotustoiminta kiihtyy ja mikrobisto muuttuu. ph alkaa nousta ja hapen kulutus kasvaa, käynnissä on kompostoinnin kiivain vaihe. Tässä vaiheessa lämpötila voi nousta yli +70 C: een. Kun helposti hajotettava materiaali alkaa olla lopussa, termofiilisten mikrobien osuus vähenee ja alkaa jäähtymis- eli kypsymisvaihe (Haug, 1993). Kypsyminen jatkuu vielä pitkään, vaihetta kutsutaan jälkikypsymiseksi eli stabiloitumiseksi. (Kuva 1). 4

Kuva 1. Kompostoitumisprosessin eri vaiheet. (Itävaara ym, 2006). 1.2. Lisäaineena tuhka Kompostoitumisen tehostamista on tutkittu ja yhtenä lisäaineena on käytetty tuhkaa. Kiertokapula oy oli mukana Bioteho II- hankkeessa, jossa kompostin sekaan lisättiin tuhkaa tehoaineeksi. Tulokset olivat lupaavia, tuhka alensi prosessin alussa ns. happamuuskuoppaa ja nopeutti aktiivivaiheeseen siirtymistä. Happamuuskuoppa syntyy mm. maitohappobakteerien happamista aineenvaihduntatuotteista. Tuloksia saatiin kun tuhkaa lisättiin 4-8 % kompostoitavan massan painosta. Mikrobisukkessio eteni samankaltaisesti kuin tuhkattomassa kompostissa, mutta esimerkiksi happamuutta aiheuttavien maitohappobakteerien määrä oli alhaisempi (Romantcshuk ym. 2005b). Toisessa suomalaisessa tutkimuksessa tuhkaa oli lisätty 10-20 % kompostoitavan massan painosta. Tuhkan todettiin lisäävän typen määrää lopputuotteesa. Jopa kahden vuoden jälkeen tuhkallisessa kompostissa typen määrä oli kontrollia suurempi. Tutkimuksessa huomattiin myös orgaanisen aineen hajoamisen olevan nopeampaa, kun tuhkaa oli lisätty (Koivula ym. 2003). Molemmissa kokeissa huomattiin, että tuhka vähensi hajuhaittoja (Koivula ym. 2003, 5

Romantcshuk ym. 2005b) Liian kosteissa olosuhteissa tuhka voi aiheuttaa liettymistä (ymparisto.fi) tämä taas huonontaa happitilannetta kompostissa. 1.3. Hygieenisyys Koska kompostiin laitetaan kasvijätteen lisäksi eläinperäisiä jätteitä voi kompostissa ilmetä hyödyllisten lajien lisäksi terveydelle haitallisia mikrobeja (Epstein, 1997). Kompostilaitoksessa työskentelevät altistuvat kompostin mikrobeille hengityksen sekä ihokosketuksen kautta. Hengitettynä mikrobit takertuvat ylempiin hengitysteihin josta ne voivat nieltynä kulkeutua ruuansulatuskanavaan ja aiheuttaa sairauden. (Pillai, 2002). Osa mikrobeista voi olla itiöiviä kuten Streptomykeetit. Niiden on havaittu aiheuttavan hengityselinten sairauksia (KTL). Maanparannusaineena käytettävän kompostin tulisi olla turvallista kasveille, ihmisille ja ympäristölle, siinä ei saa esiintyä haitallisia määriä mikro-organismeja (MMM 46/1994, Kapanen ja Itävaara, 1998). 2006 voimaan tulleen sivutuoteasetuksen mukaan komposti täyttää laatukriteerit kun entrokokkien ja E.colin määrä on alle 1000/g/ka. Näyte on huono jos yksi viidestä sisältää soluja 5000 tai enemmän (N:o 208/2006). Kompostissa ei saisi esiintyä salmonellaa /25 g eikä lämpökestävien mikrobien itiöitä lainkaan (N:o 1774/2002, N:o 208/2006). Aiemmin on havaittu, että Salmonella serovar Enteritidis voi jopa lisääntyä, jos aktiivivaihe ei ole ollut tarpeeksi tehokas (Lemunier ym. 2005). Bacillus cereus on yleinen mikrobi luonnossa, joten sitä esiintyy myös komposteissa. Tutkimuksissa kompostista on löydetty Bacillus suvun soluja 10 9 ja 10 10 kpl/g ka (Sundh ym 2002). Maaperässä esiintyvien mikrobien kokonaismääräksi on saatu 10 10 kpl/g ka (Mälkönen, 2003). Aktiivisen vaiheen aikana kompostin lämpötila nousee korkeaksi, jolloin suuri osa haitallisista mikrobeista kuolee. Myös olosuhteiden muutokset sekä toisten mikrobien erittämät aineet kuten antibiootit estävät patogeenien kasvua (Epstein, 1997). Tarvittaessa suoritetaan massan hygienisointi nostamalla lämpötila 70 C tunnin ajaksi (Euroopan komissio 2001). 6

Kompostin mikrobiologiaa voidaan tutkia perinteisellä maljausementelmällä. Reaaliaika PCR tarjoaa mahdollisuuden monistaa ja määrittää haluttujen mikrobien määrää maljauksia tarkemmin ja monipuolisemmin. 1.4. RT-PCR (Real time polymerase chaing reaktion, reaaliaika polymeraasiketjureaktio) Reaaliaika PCR tarjoaa mahdollisuuden monistaa ja määrittää haluttujen mikrobien lukumäärää esimerkiksi ympäristönäytteistä, menetelmä on kvantitatiivinen. Monistumista voidaan seurata asetetuissa mittauskohdissa läpi koko ajon (University of Gothenburg). DNA:n monistus ja kvantitointi voidaan tehdä esimerkiski Opticon monitor-laitteella. Laite muuttaa lämpötilaa kullekin mikrobille säädetyn ohjelman mukaisesti ja mittaa näytteeseen lisätyn SybrGreen-reagenssin fluoresenssin vahvuutta. SybrGreen sitoutuu kaksijuosteiseen DNA:han (Pitkänen, 2004). Jotta tuloksista saataisiin luotettavia tarvitaan taustalle IPC (inner positive control), eli sisäinen standardi, jonka avulla nähdään, että olosuhteen ovat sopivat joka ajossa ja että reaktiokomponentit, kuten alukkeet ja entsyymit toimivat moitteettomasti. IPC:n määrä ja koko täytyy suunnitella hyvin, ettei se inhiboi näytteen monistumista sillä se monistuu samoilla alukkeilla kuin tutkittava näyte (Hoofar ym. 2004). Jotta IPC ei monistuisi tuotetta helpommin on sen oltava ainakin 100 emäsparia (bp) pidempi kuin kohde DNA (Jensen ym. 2002). Erikokoisina tuotteen ja IPC:n sulamispisteet eroavat ja niiden sulamiskäyrät voidaan erottaa näyteajossa toisistaan (Hoorfar ym. 2004). Lisäksi tarvitaan standardisuora solumäärälle, sen avulla lasketaan näytteissä mahdollisesti olevien mikrobien määrä. Standardisuora valmistetaan monistamalla ja kvantitoimalla halutun mikrobisolukasvuston eri laimennoksia samoissa olosuhteissa ja samoilla alukkeilla kuin näyteajossa. Näyteajotilanteessa standardin ja sisäisen standardin lisäksi tehdään vesikontrolli, jonka avulla nähdään reaktiotuotteiden puhtaus ja mahdolliset kontaminaatiot (A.Rainisalo, julkaisematon). 7

Monistettuja tuotteita voidaan tarkastella tekemällä geeliajo agaroosigeelille ja ajamalla juosteita sähkövirrassa. DNA on negatiivisesti varautunutta, joten monistetut pätkät lähtevät liikkeelle positiivista napaa kohden, lyhyet nopeammin kuin pitkät. Agaroosigeeliajossa tutkittavia näytteitä, sekä tietyn vahvuista molekyylimarkkeria pipetoidaan geelin kaivoihin. Näytekuoppiin lisätään myös bromofenolin sinistä, jotta liikettä on helpompi seurata. Geeliin lisätty etidiumbromidi sitoutuu DNA:han, se myös fluoresoi UV-valossa. Juovat saadaan näkyviksi, kun geeli kuvataan UV-valolla. Juovien avulla saadaan tietoon onko PCR ajo onnistunut ja tuotetta syntynyt. Molekyylimarkkerin avulla juovista voidaan erottaa oikeat, koska halutun tuotteen emäsparien määrä on tunnettu (Jones. ym. 2003). 1.5. Kypsyyden määritys Kompostin kypsymistä voidaan seurata ja arvioida erilaisilla analyyseillä. Arviointia ei voida jättää yhden analyysin varaan, koska luotettavaa yhden testin menetelmää ei ole olemassa (Itävaara ym. 2006). Tuloksia täytyy tarkastella hyvin, ettei virheellisiä arvioita kypsyysasteesta tulisi. Vaikka muutama testi antaisi tuloksesksi kypsän kompostin voi esimerkiksi lämpötila olla vielä korkea, mikä kertoo mikrobiologisesta aktiivisuudesta (Tognetti ym. 2007). On tärkeää, että kasvien kasvualustaksi tarkoitettu komposti on kypsää. Epästabiilin kompostin käyttö ei pysty tarjoamaan kasveille riittävästi ravinteita, koska mikrobit käyttävät niitä kompostin hajottamiseen (Itävaara ym 2006). Seuraavaksi on lueteltu tässä työssä tehtävien analyysien teoriaa kypsyyden määrityksessä. 8

Tilavuuspaino Kompostin ollessa aktiivivaiheessa massa voi osin jopa kuivua, kypsymisen edetessä se tiivistyy jolloin tilavuuspaino kasvaa. Tilavuuspainoa voidaan pitää kypsyyden parametrinä, mutta yksin sen avulla ei voida luotettavasti sanoa mitään kompostin kypsyydestä (Itävaara 2006). Kompostilaitosten omavalvonta edellyttää tilavuuspainon seuraamista. MMM lannoitevalmiste asetuksessa on säädetty sallittu poikkeama maanparanteiden tilvauuspainolle (Itävaara 2006, MMM 656/01/2007). ph Kompostoitava materiaali sekä tukiaineet vaikuttavat suuresti kompostin ph-arvoon. Kompostoitumisen alussa esiintyy usein ns. happokuoppa, jonka maitohappobakteerit ja muut happoja tuottavat mikrobit saavat aikaan (de Bertoldi, 1993, Romantshuk ym. 2005a ja 2005b). Kompostoitumisen edetessä ph muutuu aktiivivaiheessa hiukan emäksiseksi kun mm. proteiinien hajotessa vapautuu ammoniakkia (Halinen ja Tontti, 2004). Kypsässä kompostissa ph laskee lähelle neutraalia. ph voi pysyä suhteellisen alhaisena esimerkiksi happamia tuotteita kompostoitaessa tai hapenpuutteen vuoksi (Epstein 1997). Kompsotin ph-arvoon voidaan vaikuttaa esimerkiksi lisäämällä tuhkaa. Tuhka on emäksistä ainetta, mikä edesauttaa happokuopan ohituksessa. Tuhkan emäksinen vaikutus voi jatkua vielä kypsässäkin kompostissa (Romantshuk ym. 2005b). Tukiaineita vertailtaessa havaittiin puuhakkeen laskevan ph:ta verrattuna hakkeettomaan kompostiin (Tognetti ym. 2007). ph:n avulla voidaan seurata kompostoitumisen edistymistä (Haug, 1993), mutta se ei ole yksin luotettava parametri kypsyyden määrittämiseksi (Epstein, 1997). 9

Kuiva- ja orgaaninen aine Kuiva-ainepitoisuus vähenee kompostin kypsyessä. Optimaalinen kosteuspitoisuus aktiiviselle vaiheelle on 50-60 %. Tällöin olosuhteet ovat otolliset tehokkaalle mikrobitoiminnalle (Epstein, 1997). Syötteen laadulla on suuri vaikutus kuivaainepitoisuuteen. Tulokset voivat vaihdella suuresti eri kompostierien välillä, mikäli syöte on ollut laadultaan erilaista. Kypsyyttä ei voida määritää kuiva-ainepitoisuuden avulla, mutta se on hyvä apuväline seurattaessa kompostoitumista (Haug, 1993). Maa- ja metsätalousministeriön asetus lannoitevalmisteista sisältää vaihteluvälin kuiva-aineen määrälle, joten sitä on seurattava jos kompostia on tarkoitus käyttää maanparanteena (MMM 656/01/2007). Kompostoitumisen edetessä orgaanisen aineksen määrä vähenee, kun pieneliöt hajottavat sitä vapauttaen aineet kiertoon. Syötteen laatu vaikuttaa myös orgaanisen aineen määrään (Haug, 1993). Eräässä tutkimuksessa havaittiin, että syötteen murskaaminen ja puuhakkeen lisääminen massaan nosti orgaanisen aineen määrää lopputuotteessa (Tognetti ym. 2007). Koivula ym. (2003) havaitsivat tuhkan lisäävän orgaanisen aineen määrää kompostissa. Hapen kulutus Hapenkulutus antaa parhaimillaan tarkasti tietoa kompostin kypsyydestä. Jotta tulokset olisivat luotettavia, täytyy mittaukseen otettavan kompostin olla sopivan kosteaa mikrobitoiminalle. Hapen kulutus on kiivainta aktiivisessa vaiheessa. Kypsässä kompostissa mikrobitoiminta on jo hidasta, koska orgaaninen materiaali on jo hajotettu eikä helposti saatavaa ravintoa enää ole (Haug, 1993). Vaikka hapenkulutus antaa hyvän kuvan kompostin kypsyyden tilasta on rinnalle hyvä ottaa muita analyysejä tueksi, jolloin saadaan varmempi tulos. Arvoja voidaan verrata esimerkiksi humusaineiden määrään, jolloin hapenkulutuksen lasku vastaa humusaineiden määrän nousua (Tiquia, 2005). Oxitop-analyysin avulla voidaan 10

määrittää helposti erilaisten maanäytteiden hapenkulutusta. Menetelmää on käytetty esimerkiksi pilaantuneiden maa-aluiden tutkimisessa (Suni ym. 2006). Miyatake (2006) havaitsi, että mikrobiologinen aktiivisuus eli stabiilisuus on paremmin mitattavissa entsyymiaktiivisuuden ja haihtuvien yhdisteiden (aineenvaihduntatuotteet) kuin hapenkulutuksen avulla. Rottegrad Rottegrad-testillä voidaan arvioida kompostin kypsyyttä ja stabiilisuutta seuraamalla lämpötilan kehitystä 10 päivän ajan. Raa an kompostin lämpötila voi nousta yli 60ºC kun taas kypsä komposti pysyy samoissa lukemissa koko testauksen ajan, lähellä ympäröivää lämpötilaa (Haug, 1993, Itävaara, 2006). Kompostin hajoaminen ja mikrobiaktiivisuus voi ns. aaltoilla jokaisessa vaiheessa, joten lämpötila voi nousta myös kypsässä kompostissa ja jäädä alhaiseksi raa assa kompostissa. Koska mittausaika on suhteellisen lyhyt, näytteen ottoajankohta sekä näytteen edustavuus vaikuttavat tuloksen luotettavuuteen (M.Talves, C. Gareis, suullinen tiedonanto). C/N-suhde Kompostista mitattua C/N-suhdetta on pidetty hyvänä kypsyyden parametrina. Kun suhde on alle 20 on komposti kypsää. Kuitenkin C/N-suhteeseen vaikuttaa suuresti syötteen laatu, joten pelkästään C/N-suhdetta ei voida käyttää yleispätevänä kypsyyden parametrina (Epstein, 1997). C/N-suhde yhdistettynä muihin menetelmiin, kuten humusaineiden määrään tai hiidioksidintuotantoon tuottaa luotettavampia tuloksia kompostin kypsyydestä (Goyal ym, 2005). C/N-suhde ei ole hyvä kypsyyden mittari kompostimassalle, jos syötteen C/N-suhde on ollut alhainen (Yona, 1993). Esimerkiksi hevosenlannassa C/N-suhde on 25, lehmän lannassa 18 kun taas kasviperäisellä jätteellä esimerkiksi ruohoilla C/N-suhde voi olla 11-12 11

(Haug, 1993). Vaikka lähtö- ja lopputilanteet vaihtelevat suuresti, vähenee hiili suhteessa typpeen kompostoinnin aikana (Goyal ym. 2005). Ensimmäisten kuukausien aikan C/N-sude laskee nopeasti ja hidastuu loppua kohden, koska nopeasti saatava hiili on käytetty (Yona, 1993). Liian matala C/N-suhde hidastaa kompostoitumista ja vähentää typen määrää lopputuotteessa, jolloin se ei ole yhtä ravitseva alusta kasveille (de Bertoldi, 1993). Nitraatti-ammoniumtypp ( NO 3 -N /NH 4 -N) Typen eri esiintymismuotojen (nitriitti, nitraatti, ammoniakki) määrän perusteella, voidaan arvioida kompostin kypsyyttä. Ammoniakin läsnäolo indikoi raakaa kompostia kun taas lisääntynyt nitraatin määrä kypsää kompostia (Epstein, 1997). Ammoniakki haihtuu kompostoinnin edetessä, osa muuttuu oksidaation kautta nitraattimuotoon (Haug, 1993). Kun NO 3 -N /NH 4 -N suhde on >1 on komposti kypsää (Romantshuk ym. 2005b, Itävaara 2006). Raskasmetallit ja ravinteet Raskasmetallien määrälle on säädetty rajat maa- ja metsätalousministeriön päätöksessä eräille lannoitevamisteille (MMM 46/1994). Raskasmetallien määrä on laadullinen kriteeri, eikä niiden määrä muutu kompostin kypsymisen aikana, koska ne eivät tarjoa mikrobeille ravintoa. Ravinteiden määrä lisääntyy kompostissa kypsymisen edetessä ja määrät vaihtelevat paljon kompostoidun raaka-aineiden mukaan. Myös ravinteiden määrä on laadullinen. Mitä parempi ravinnekoostumus maanparannusaineena käytettävässä kompostissa on sitä vähemmän tarvitaan lannotteita. Ravinteille on säädetty vaadittu vähimmäisraja päätöksessä MMM 46/1994. 12

1.6. Työn tarkoitus Tässä Pro Gradu- työssä oli tarkoituksena tutkia tuhkakäsitellyn kompostimassan kypsyyttä ja laatua yleisesti käytössä olevilla menetelmillä. Tavoitteena oli saada tietoa kompostointilaitosten toimivuudesta, prosessin tehostamisesta ja tuhkan vaikutuksista kompostoinnissa sekä erilaisista analyysimenetelmistä. Aihetta katsottiin myös työsuojelumielessä tarkastelemalla hygieenisyyttä sekä maljauksella, että reaaliaika PCR-menetelmällä riskiluokkabakteerien osalta. Analyysien perustana käytettiin Merja Itävaaran kirjoittamaa julkaisua; Kompostin kypsyyden määritys. Vertailukohteena oli tuhkatonta kompostia. Asetetut hypoteesit olivat: 1. Tuhka nopeuttaa kompostin kypsymistä alentamatta kompostin laatua, 2. Komposti on hygieenistä ja laadultaan hyvää ja 3. Tuhka ei estä kompostin käyttöä maanparanteena. Näytteet haettiin Kiertokapula oy:n ja YTV:n kompostilaitoksista. YTV on aloittanut tuhkalisäykset syksyllä 2007. Kiertokapula oy on käyttänyt tuhkaa jo parin vuoden ajan. 2. Aineisto ja menetelmät 2.1. Näytteenotto Kiertokapula oy:n kompostointilaitos on käyttänyt lisäaineena tuhkaa jo muutaman vuoden ajan. Kompostointi tapahtuu kolmessa vaiheessa. Biojäte siirretään aluksi rumpukompostoriin, josta se siirtyy noin 3-5 vrk kuluttua tunneliin. Tunnelissa komposti viipyy 5-10 vrk, jonka jälkeen kompostimassa siirretään ulos aumoihin, joissa jälkipyksyminen kestää noin vuoden. Tuhkan lisäksi kompostimassaan sekoitetaan tukiaineeksi puuhaketta. Kiertokapula oy:n kompostointilaitokselta näytteitä kerättiin seitsemästä eri ikäisestä kompostista noin 40 cm syvyydestä. Näytteenotto suoritettiin siten, että näytettä tuli 13

auman eri kohdista, jotta saataisiin käsitys koko auman tilasta. Rummusta otetut näytteet otettiin luukusta rummun pyöriessä. Tunnelinäytteet otettiin kasasta, johon massa kerääntyi tunnelin päästä. Ikäryhmiä oli yhteensä seitsemän: rumpu 3-5 päivää, tunneli kaksi viikkoa ja muut näytteet aumasta (Taulukko 1.). Kahden kuukauden sekä 5-6 kuukauden ikäiset aumat oli käännetty kaksi viikkoa ennen näytteen ottoa, joten näistä aumoista otetut näytteet edustavat hyvin koko komposti massaa. Näytteen ottajana toimi Martin Romantschuk. Näytteenottohetkellä mitattiin kompostien lämpötilat jokaisen näytteenottokohdan vierestä, noin 40 cm syvyydestä. Rummusta otetuista näytteistä lämpötila mitattiin ämpäristä heti näytteen oton jälkeen, koska pyörivästä rummusta mittaus on vaikea tehdä luotettavasti. Myös tunnelista otettujen näytteiden lämpötila mitattiin ämpärissä olevasta näytteestä. Taulukko 1. Kiertokapula oy:n näytteet. 1 2 3 4 5 6 7 A 3-5 pvä 2 vko 2 kk 5-6 kk 12 kk 18 kk 19 kk B 3-5 pvä 2 vko 2 kk 5-6 kk 12 kk 18 kk 19 kk C 3-5 pvä 2 vko 2 kk 5-6 kk 12 kk 18 kk 19 kk YTV:n kompostointilaitos aloitti tuhkakokeilut vuoden 2007 syksyllä. Kompostointilaitokselle rakennettiin uusi kompostointipuoli, mutta vanhapuoli on edelleen käytössä jälkikypsytyslaitoksena. Kompostimassa siiretään aluksi tunneliin, jossa se saa kypsyä kolme viikkoa. Sen jälkeen massa siirretään jälkikypsymään kahdeksi viikoksi vanhaan laitokseen. Komposti stabiloituu aumoissa ja on käyttökelpoista vuodenikäisenä. Tuhkan lisäksi kompostimassaan sekoitetaan kalkkia sekä tukiaineeksi haketta. YTV:ltä toimitettiin näytteitä kolmessa erässä, näytteen ottajana toimi Annika Viljakainen. Näytteet otettiin ämpäreihin tunnelin hihnalta tai kompostin uloskannosta sekä varastoaumasta. Näytteenotolla seurattiin kolmea panosta 14

(Taulukko 2.). Panoksista 111 sisälsi tuhkaa, kaksi muuta panosta olivat tuhkattomia vertailukomposteja. Panos U210 oli kompostoitu sekä uudessa että vanhassa laitoksessa. Massa oli viety varastoaumaan sen ollessa noin kuukauden vanhaa. Panos 108 oli kompostoitu vain jälkikompostointilaitoksessa, varastoaumaan se oli viety 20 päivän ikäisenä. Panos 111 oli kompostoitu sekä uudessa että vanhassa laitoksessa ja siihen oli lisätty tuhkaa. Massa oli viety varastoaumaan 26 päivän jälkeen kompostoinnin aloittamisesta. Massojen lämpötiloja oli seurattu kompostoitumisen edetessä säännöllisesti laitoksen omavalvonnan edellyttämällä tavalla. Taulukko 2. YTV:n näytteet ja rinnakkasiten näytteiden määrä. 10.10.2007 1 30.11.2007 2 7.2.2008 3 U210 A - 2 *11 pvä 3 * 80 pvä 108 B 1 * 20 pvä 3 * 71 pvä 3 * 140 pvä 111 C 1 * 26 pvä 3* 71 pvä 3 * 146 pvä 2.2. Näytteiden käsittely ja varastointi Näytteet tuotiin esikäsittelyyn ja kylmäsäilytykseen Lahteen ympäristöekologian laitokselle kolmen tunnin sisällä näytteenotosta. Jokaisesta näytteestä otettiin noin 0,5 l kompostia mikrobiologisia määrityksiä varten puhtaalla hanskalla. Loppuosa näytteistä seulottiin 20 mm seulalla, jotta tukimateriaali sekä maatumattomat jätteet saatiin eroteltua massasta. Seula huuhdottiin vedellä jokaisen näytteen jälkeen. Seulonnan jälkeen jokaisesta näytteestä otettiin näytettä pakkasseen ( 20 ºC). Loppuosa näytteistä säilytettiin jääkaapissa ämpäreissä, joista analyysit suoritettiin viikon sisällä. 15

2.3. Tilavuuspaino Ennen näytteiden seulomista ja mikrobiologisten näytteiden ottamista näyteämpärit punnittiin ja laskettiin tilavuuspaino (Itävaara, 2006). 2.4. ph Jääkaapissa säilytetyistä, seulotuista näytteistä mitatiin noin 50 ml kompostia näyteastiaan. Kompostimassa sekoitettiin hyvin ennen näytteen ottoa. Näytteiden annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan, jonka jälkeen joukkoon lisättiin 200 ml tislattua, huoneenlämpöistä vettä, sekoitussuhteeksi tuli tällöin 1:5, kuten Kiertokapula oy:n omissa mittauksissa (J. Pyttynen, suullinen tiedonanto). Näytteet sekoitettiin ja annettiin liettyä tunnin ajan. ph- mittari kalibroitiin ph 7 ja ph 10 asteikolle pakkauksessa olevan ohjeen mukaisesti. Mittaus suoritettiin jokaisesta näyteastiasta kaksi kertaa 2.5. Kuiva-aine Hyvin sekoitettua komopstinäytettä punnittiin n.20 g näyteastiaan. Näytteitä pidettiin lämpökaapissa 24h 105 ºC, (Tiquia, 2005), jonka jälkeen ne laitettiin jäähtymään eksikaattoriin. Jäähtyneet näytteet punnitiin. 2.6. Orgaaninen aine Orgaanisenaineen mittausta varten merkattuja upokkaita hehkutettiin muhveliuunissa 30 min, +550 º C. Upokkaat laitettiin jäähtymään eksikaattoriin. Kuiva-aine analyysistä säästetyt näytteet jauhettiin huhmarella hienojakoiseksi, ja punnitiin 16

jäähtyneisiin upokkaisiin. Näytteitä poltettiin muhveliuunissa 4 h, +550 º C, (ohjelma maanäytteille), jonka jälkeen näytteet jäähtyivät eksikaattorissa ennen punnitusta. 2.7. Hapenkulutus Analyysia varten hyvin sekoitettua kompostinäytettä punnitiin 30-50 g Oxitoppulloihin. Jokaiseen pulloon laitettiin teline, sekä 50 ml 1M kaliumhydroksidi liuosta muovisessa dekantterilasissa. Koeastiat tiivistettiin ja suljettiin ohjeiden mukaisesti. Mittapäät ohjelmoitiin mittamaan paineen muutosta (pressure-ohjelma) viiden päivän ajan. Pullot laitettiin inkubaattoriin, jonka lämpötila oli säädetty 23 º C. Mittausajan loputtua mittapäiden tulokset siirrettiin säätimen kautta tietokoneelle. Tulokset käsiteltiin Achat-ohjelman avulla. Käsitelty tieto siirrettiin ecxeliin. Tuloksien avulla piirrettiin alipainekäyrät. Jokaisen näytteen alipainekäyrää tarkasteltiin ja tuloksista valittiin jakso, jonka aikana paine oli alentunut. Jos paineen muutos tasaantui esimerkiksi kahden vuorokauden kuluttua otettiin näytteen tuloksista mukaan vain tämä muutosjakso, jolloin alkutilanne on aloitushetki ja lopputilanne se hetki, jolloin paineen muutos oli tasaantunut. Tilanteet, joissa paine oli aluksi laskenut ja lähtenyt sitten nousuun, otettiin laskuihin mukaan se ajanjakso, jossa alipainetta oli muodostunut. Näytteet, joissa paine laski analyysiajan loppuun saakka, otettiin mukaan koko jakso. Näytteiden ollessa kuivia, massaa kasteltiin hanavedellä. Liian kostean massan joukkoon lisättiin sahanpurua. Sopiva kosteus määritettiin nyrkkitestillä (Itävaara ym., 2006). Käsitellyn massan tilavuuspaino laskettiin erikseen, koska tilavuuspainoa tarvittiin hapenkulutuksen laskemisessa. (Kaavat 1, 2 ja 3). 17

Seuraavien kaavojen avulla laskettiin näytteiden hapen ja hiilidioksidintuotto: Hapenkulutus: (Kaava 1.) mg O2/kg dw = (Mr(O2)*Vfr*deltap)/(R*T*mbt*duration) Hiilidioksidin tuotto: (Kaava 2.) mg CO2/h/g dw = mg O2/kg dw*45/32 Vapaa kaasutilavuus: (Kaava 3.) Vfr = Vges-Vag-Vam-Vbf Mr (O2) = hapen moolimassa 32 000 mg/mol Vfr = vapaa kaasutilavuus (l) Vges = astian tilavuus (0,96 l) Vag = KOH -astia telineen tilavuus (0,01 l) Vam = KOH liuoksen tilavuus (0,05 l) Vbf = näytteen tilavuus R = kaasuvakio (83,14 l mbar/mol/k) T = inkubointilämpötila ( 296 K) mbt = näytteen kuivapaino (g) Deltap = paineenmuutos Duration = kokeen kesto (h) Esim. Hapen kulutus näytteelle A1 32000 mg/mol*(0.96 l 0,01 l 0,05 l - 0,0856 l) * 190)/ [(83,14 l mbar/mol/k) * 196 * 15,977 g * 67,6 h] = 0,186288 mg O2/kg dw Esim. hiilidioksidin tuotto näytteelle A1 0,186288 mg O2/kg dw * 45/32 = 0,261967 mg CO2/h/g dw 18

2.8. Rottegrad Rottegrad-stabiilisuustestillä seurattiin kompostimassan lämmönkehitystä n.11 päivän ajan. Sopiva kosteus kokeiltiin nyrkkitestillä (Itävaara ym., 2006). Jokaista näytettä laitettiin lämpöeristeiseen devar-astiaan tai termospulloon astia lähes täyteen. Jokaisessa rinnakkaisnäyteryhmässä oli yksi devar-astia ja kaksi termospulloa, näyteastiat jaettiin satunnaisesti rinnakkaisten kesken. Jokaiseen devarastiaan sijoitettiin digitaalinen lämpömittari alimpaan kolmannekseen. Termospulloihin laitettiin lasiset lämpömittarit. Kaikki näytteet olivat lähtötilanteessa samanlämpöisiä, koska näytteitä säilytettiin jääkaapissa. Lämpötilankehitystä seurattiin päivittäin, jolloin otettiin ylös mittaushetken lämpötila sekä maksimi lämpötila (digitaalimittarit). Seurantajaksolla mitattin myös huoneen lämpötila. Mittasujaksoille tuli katkos pyhäpäivien aikaan sekä viikonloppuisin. Kompostinäytteet jaettiin kypsyysluokkiin maksimilämpötilan mukaan (taulukko 3), (Itävaara ym. 2006). Taulukko 3. Rottegrad-luokat: Luokka Lämpötila C I syöte yli 60 II 50-60 III 40-50 IV 30-40 V kypsä 20-30 2.9. C/N-suhde Analyysiä varten pakastettuja näytteitä otettiin sulamaan foliokuppeihin. Näytteitä kuivatettiin lämpökaapissa + 60 C kolme vuorokautta jonka jälkeen ne huhmaroitiin mahdollisimman tasalaatuisiksi. Näyteitä punnittiin noin 100 mg keraamisiin näyteastioihin, jokaisesta näytteestä tuli kaksi rinnakkasinäytettä. Ajoa varten 19

punnittiin myös jauhettua riisiä sekä EDTA: ta, jotka olivat kontrollinäytteinä ajossa. Näytteiden väliin jätettiin myös tyhjiä aukkoja, jotka olivat nollanäytteitä, niiden avulla nähtii paljonko mittauksissa tulee virhettä antavaa taustapitoisuutta tutkittaville aieneille. Jos ajon aikana nollanäytteestä analysoitiin esimerkiksi typpeä, tehtiin tuloksiin korjaus vähentämällä taustapitoisuus saadusta tuloksesta Analysointi tapahtui Leco-laitteella, joka kuumentaa näytteen ja mittaa jännitemuutosta kaasuuntuneesta näytteestä. (A.M. Nykänen ja E. Heikkinen, suullinen tiedonanto). 2.10. Nitraatti- ja ammoniumtypen suhde, (NO 3 -N /NH 4 -N) Koetta varten pakastettuja näytteitä otettiin sulamaan tarvittava määrä ja sulaneita näytteitä punnittiin n. 5g lasiseen pulloon. Pulloon lisättiin 50 ml 1M kaliumkloridi (KCL) liuosta. Näytteet olivat ravistelijassa neljä tuntia, mukana kolme nollanäytettä, joissa oli 50 ml pelkkää KCL-liuosta. Ravistelun jälkeen sakan annettin laskeutua ja liuos suodatettiin paperisen suodatinpaperin (Whatman GF/C) läpi muoviseen näytepulloon. Suodokset vietiin jääkaappiin ja analysointi Lachat-laitteella suoritettiin seuraavana päivänä. Näytteiden ajon teki Niko Savolainen. 2.11. Maljaukset Kompostimassan hygieenisyyttä tutkittiin maljausten avulla. Maljaukset suoritti Lahti Science and Business Park (nyk. Ramboll analytics) standardien mukaisesti. Maljauksilla tutkittiin enterokokkien, lämpökestoisten koliformien sekä Salmonellan esiintyvyyttä kompostinäytteissä. YTV:n näytteistä edellisten lisäksi viljeltiin Clostridium perfringens sekä Bacillus cereus. Laboratorioon toimitettiin kompostinäytteistä noin litran otos mahdollisimman nopeasti näytteenottopäivänä. 20

2.12. Reaaliaika PCR 2.12.1. Näytteiden eristys DNA:n eristäminen kompostinäytteistä tehtiin FastDNA SPIN Kit for Soil kitillä (Obiogene, Irvine, CA) ohjeen mukaisesti. Pakastettua (-20 C) näytettä punnittiin eristysputkeen noin 100 mg, mikä oli havaittu hyväksi (Fracchia ym. 2005) ja lisättiin reagenssit. Näytteitä ravisteltiin FastPrep laitteella. Laitteen ravistelu ja putkessa olevat kuulat rikkoivat solut jolloin DNA saatiin ulos. Ravistelun jälkeen näytteitä sentrifugoitiin minuutin ajan 13 000 xg ja neste pipetoitiin puhtaaseen eppendorf putkeen, jonne oli lisätty valmiiksi proteiineja saostava reagenssi. Proteiinisakka poistettiin sentifugoimalla näytettä. DNA:ta sisältävä neste pipetoitiin putkeen, jossa oli DNA:ta sitovaa materiaalia. Sentrifugoimalla näytteitä sihtiputkessa saatiin erotettua neste sitojamateriaalista. Sihdin päälle jäänyt sitojamatreriaali puhdistettiin huuhtelemalla näytettä etanolipohjaisella puhdistusaineella ja näytteen annettiin kuivua 30-60 minuuttia. Kuivumisen jälkeen näytteen päälle lisättiin 50 l eluaattia, joka siirsi DNA:n sitojaaineesta sihdin läpi nesteeseen. Eristettyä DNA-liuosta pipetoitiin 10 l eppendorfputkeen, jossa oli 90 l vettä. Näyte sekoitettiin ja pipetoitiin viiteen ependorfputkeen 20 l näytettä. Laimennetut näytteet sekä alkuperäiset eristykset pakastettiin 20 C. 2.12.2. IPC Jokaiselle tutkittavalle mikrobille valmistettiin sisäinen standardi eli IPC (inner postive standard). Jokaiselle kohdemikrobille valittiin omat IPC-alukkeet (taulukko 5). Templaatiksi valiittiin bakteriofaagin plasmidi, lambda DNA, ( -DNA, Fermentas), johon alukkeet kiinnittyivät ja muodostivat PCR-ajossa tuotteen. 21

Aiemmissa tutkimuksissa IPC on valmistettu esimerkiksi kalan viruksen avulla, mutta tarkoitus oli sama, saada kvantitaatioajoon sisäinen standardi (Hoorfar ym. 2004). IPC:n tekoa varten valmistettiin PCR-seos puskuriliuoksesta, (Finnzymes, F-511), entsyymistä, (Finnzymes F-501L) ja nukleotideista, (Finnzymes F-560L), (Taulukko 4). Seokseen lisätyt alukkeet, (Oligomer), laimennettiin varastovahvuudesta 100 µm 1:10 suhteella vahvuuteen 10 µm. Templaatin varastovahvuus oli 300 ng. Kun haluttu vahvuus oli 150 ng / reaktio, saatiin se seuraavasti: 0,5 l lambda DNA + 4,5 l H 2 O. Jos lambda DNA:n haluttu vahvuus oli 100 ng/reaktio, saatiin se seuraavasti: 0,3 l lambda DNA + 4,7 l vettä. PCR-reaktiota varten pipetoitiin kuuteen reaktiokuoppaan 45 l PCR-seosta taulukon 4 mukaan. Neljään näytekuoppaan lisättiin 5 l lambda DNA:ta ja kahteen kuoppaan kontrolliksi 5 l vettä, lopputilavuus joka kuopassa oli 50 l. Näytteitä monistettin jokaiselle mikrobiryhmälle soveltuvalla ohjelmalla. (Taulukko 6), (A. Rainisalo, julkaisematon). Taulukko 4. Tarvittavat reagenssit IPC-ajoon yhtä reaktiota varten. Alukkeiden kohdalla on pipetoitu merkitty määrä 1:10 laimennosta, jolloin on saatu reagensisarakkeessa oleva vahvuus. (A. Rainisalo, julkaisematon) Reagenssi Salmonella Campylobacter spp. Streptomyces spp. Bacillus cereus Yersinia spp. Puskuriliuos 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl Entsyymi 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl Nukleotidit 0,5 µl 0,5 µl 1 µl 0,5 µl 1 µl Alukkeet 0,25 µmol 0.27 µmol 0,4 µmol 2 µl 2 µl 1,5 µl 1,25 µl 2 µl Vesi 34,5 µl 34,5 µl 35 µl 36,0 µl 34,0 µl Templaatti 150 ng 100 ng 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 22

Taulukko 5. IPC ajoissa käytetyt alukkeet (A. Rainisalo, julkaisematon) Kohde Sekvenssi (5-3 ) Lambdan sekvenssi tummennettu Tuotteen koko (bp) Salmonella spp. Yersinia spp. Bacillus cereus ryhmä Campylobacter spp. Streptomyces spp. F: GTG AAA TTA TCG CCACGT TCG GGC AAA AGA TAT GCA GAG TCT GGT R: TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC CAC CGC TCA GGC ATT TGC T F: GCG GCA GCG GGA AGT AGT TTA ACC CGG TAT GGA TGT GGC TTC G R: TAC AGC GTG GAC TAC CAG GGT ACC GCT CAG GCA TTT GCT F: GAGTTAGAGAACGGTATTTATGCTGCAGTATCAGCCGTA CCCATTCAGG R: CTACTGCCG CTCCATGAATCC ACCGCTCAGGCATTTGCT F: GGATGACACTTTTCGGAGC ACCCGGTATGGATGTGGCTTCG R: CATTGTAGCACGTGTGTC ACCGCTCAGGCATTTGCT F: ACAAGCCCTGGAAACGGGGT GCCAGCGTGGTGCTCTGGGA R: CACCAGGAATTCCGATCT ACCGCTCAGGCATTTGCT 404 978 517 973 617 Ensimmäisellä kierroksella alukkeet tarttuvat templaattiin, eli lamda-dna:han ja alukkeen lambda-osiot (tummat) ovat siipinä juosteen jatkeena. Toisella kierroksella monistuu myös alukkeen lambdan osuus. Saatu tuote monistuu näyteajossa samoilla alukkeilla, kuin tutkittava näyte, mutta sen koko on näytettä suurempi. TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC CAC CGC TCA GGC ATT Lambda DNA TGG TCT GAG ACG TAT AGA AAA CGG GCT TGC ACC GCT ATT AAA GTG 23

Taulukko 6. IPC:n valmistukseen käytetyt ajo-ohjelmat mikrobiryhmittäin. (Rainisalo A. julkaisematon). Vaihe Salmonella Campylobacter spp. Streptomyces spp. Bacillus cereus Yersinia spp. lämpötila/aika Alku denaturaatio 94/5 95/5 95/5 95/5 95/5 ºC/min Denaturaatio 94/10 94/60 94/60 94/60 94/60 ºC/sec Alukkeiden kiinnittyminen 55/30 55/60 52/40 55/60 62/60 ºC/sec Alukkeiden pidentyminen 72/30 72/60 72/120 72/60 72/120 ºC/sec Syklien määrä 22 20 20 24 24 Lopullinen pidentyminen 72/7 72/7 72/7 72/7 72/7 ºC/min Ajon loppu ºC 16 16 16 16 24

2.12.3. Tuotteen puhdistus Monistuksen jälkeen IPC tuote puhdistettiin, jotta nukleotidit, alukkeet ym. eivät inhiboisi geeliajon tai kvantitaatioajon tuloksia. Tuotteen puhdistus tehtiin QIAquick PCR Purification Kit Protocol ohjeen mukaisesti. PCR-tuote otettiin laitteesta jäille, jonka jälkeen puhdistus suoritettiin pöydällä. Eluaattia, joka irrottaa DNA:n näyteputken sihdistä, lisättiin 50 l. Puhdistetusta tuotteesta tehtiin kvantitaatioajo sekä agaroosigeeliajo. 2.12.4. Agaroosigeeliajo Agaroosigeeliajo tehtiin jokaisen mikrobiryhmän IPC tuotteelle sekä IPC-kvantitaatio tuotteelle, jotta voitiin laskea tarvittava IPC määrä näyteajoihin. Puskurina geeliajossa oli 1 x TAE. Geeliajoon lisätyn molekyylimarkkerin (Fermentas, GeneRuler ) perusteella ja monistettavan alueen koon avulla (lasketaan emäspareista) laskettiin paljonko näyte sisälsi kopioita. Näyteajossa tarvittavan IPC-laimennoksen vahvuus arvioitiin kopioiden määrän perusteella. Jokaiselle mikrobille on oma hyväksi havaittu IPC-vahvuus näyteajoon. (A. Rainisalo, julkaisematon). 1 % agaroosigeeliä valettiin 200 ml kelkkaan. Geeli valmistettiin seuraavasti: 2 g Agaroosi jauhe 200 ml 1 x TAE (50 x kantaliuos: 242 g Tris-emäs, 57,1 ml väkevää etikkahappoa, 100 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) ja H 2 O niin, että tilavuus 1000 ml) 20 µl etidiumbromidi (5 mg/ml) PCR-ajon jälkeen puhdistettuja näytteitä pietoitiin 5 µl/kaivo. Näytteisiin sekoitettiin ennen pieptointia 1 µl väriainetta (LB loadingbuffer). Vesikontrolleista pietoitiin 10 µl näyte sekä 2 µl väriainetta. Fermentas molekyylimarkkeria (100 bp DNA Ladder 25

Plus, 0,5µg/µl, 50 ng) pipetoitiin sarjan alkuun ja loppuun seuraavalla tavalla: 1 µl markkeria + 4 µl vettä+ 1 µl väriainetta. Geeliä ajettiin 100 V, 400 ma, 40 minuuttia. (A.Rainisalo, julkaisematon). Monistuneen tuotteen pitoisuus IPC:ssä saatiin selville kaavan 4. avulla. Ensiksi verrattiin geeliltä saadun tuotejuovan vahvuutta vastaavalla molekyylipainon kohdalla olevaan molekyylimarkkerin juovaan. Molekyylimarkkerikartasta katsotaan mitä pitoisuutta tämä juova vastaa ja kerrotaan pitoisuus luvulla, mikä arvioitiin tuotteen vahvuudeksi verrattuna molekyylimarkkeriin. (A. Rainisalo, julkaisematon). Yhden yksikön paino, esim Salmonella Salmonella 404 bp Lähin molekyylimarkkeri kartalla 500 bp pitoisuus 80ng Kuvan mukaan oma näyte on noin 10 kertaa vahvempi => 800 ng Yhdessä mikrolitrassa kopioita on m = n x 1,013 x10-21 g/bp (Kaava 4.) m= 404 bp x 1,013 x10-21 g/bp = 0,409252 x 10-18 800x10-9 /0,409252 x 10-18 = 1,95x10 12 /5 µl = 0,4x10 12 kpl/1 µl Lasketun pitoisuuden avulla tehtiin tarvittavan pitkä laimennossarja IPCkvantitaatiota varten. Ja valittiin sopivan kopiomäärän omaava IPC-laimennos näyteajoja varten. 2.12.5. IPC:n kvantitaatio Jokaiselle mikrobiryhmälle valmistettin laimennossarja puhdistetusta IPC-tuotteesta. Tuotetta pipetoitiin steriilin veden sekaan suhteella 1:10. Laimenossarjasta ajoon 26

otettiin mukaan 10-6 -10-11. Kvantitaatioajoa varten valmistettiin jokaiselle mikrobiryhmälle alukeseos 1:10 laimennetuista patogeenialukkeista (Oligomer), (Taulukko 8). IPC- ajossa reaktioputken näytetilavuus oli 20 µl, joten yhtä reaktiota varten tarvittava alukemäärä laskettiin halutun pitoisuuden mukaan kaavalla 5. PCRreaktioseos oli valmis Fermentas:n seos SybrGreen HS Master Mix. Jokaiseen reakiokuoppaan pipetoitiin SybrGreen seosta 10 µl ja alukeseosta 5 µl. DNA:ta eli IPC-tuotetta lisättiin 5 µl tarvittavat laimennokset ja kolmeen reaktiokuoppaan lisätiin alukkeen ja reaktioseoksen lisäksi vettä kontrolliksi. (taulukko 7). Jokaiselle mikrobiryhmälle käytettiin omaa ajo-ohjelmaa (taulukko 9) (A. Rainisalo, julkaisematon). Alukkeiden määrän laskeminen, esim. Salmonella (Kaava 5.) 10 µm * x = 0,4 µm * 20 µl x = 0,8 µl / reakio 10 µm= laimennettu alukepitoisuus 0,4 µm= haluttu alukepitoisuus 20 µl = lopputilavuus Taulukko 7. Tarvittavat reagenssit IPC-kvantitaatioajoon yhtä reaktiota varten. Alukkeita on pipetoitu ilmoitettu määrä, 1:10 laimennoksesta tehdystä seoksesta. (A. Rainisalo, julkaisematon). Reagenssi Salmonella Campylobacter spp. Streptomyces spp. Bacillus cereus Yersinia spp. SybrGreen 10 10 10 10 10 Alukeseos 0.1 µmol 0.23 µmol 0,4 µmol 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl Templaatti 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 27

Taulukko 8. IPC kvantitaatiossa, standardi- ja näyteajoissa käytetyt alukkeet. (A. Rainisalo, julkaisematon). Kohde geeni Sekvenssi (5-3 ) Amplifioituva alue (bp) Referenssi Salmonella spp. inva Yersinia spp. Bacillus cereus ryhmä Campylobacter spp. Streptomyces spp. fp 139: GTG AAA TTA TCG CCA CGT TGG GCAA rp 141: TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C 16s-86f: GCG GCA GCG GGA AGT AGT TTA 16s-79r: TAC AGC GTG GAC TAC CAG GGT Pf:GAG TTA GAG AAC GGT ATT TAT GCT GC Pr: CTA CTG CCG CTC CAT GAA TCC C412f:GGA TGA CAC TTT TCG GAG C C1228r: CAT TGT AGC ACG TGT GTC F: ACA AGC CCT GGA AAC GGG GT R: CAC CAG GAA TTC CGA TCT 284 Rahn ym., 1992 749 Trebesius ym., 1998 411 Schraft ja Griffiths, 1995 816 Linton ym., 1996 519 Rintala ym., 2001 28

Taulukko 9. IPC kvantitaatiossa käytetyt lämpöilat. (A.Rainisalo, julkaisematon). Vaihe lämpötila/aika Salmonella Campylobacter spp. Streptomyces spp. Bacillus cereus Yersinia spp. Alku denaturaatio ºC/min Denaturaatio ºC/sec Alukkeiden kiinnittyminen ºC/sec Pidentyminen ºC/sec 95/15 95/15 95/15 95/15 95/15 94/10 94/60 94/60 94/30 94/60 65/20 55/60 52/40 55/60 62/60 72/30 72/60 72/120 72/60 72/120 Datapiste1) 81/1 80/1 81/1 75,5/1 81/1 Syklien määrä 36 40 36 36 36 Lopullinen pidentyminen ºC/min Sulamiskäyrä 72/7 72/7 72/7 72/7 72/7 65-95 ºC, mittaus luetaan sekunnin ajan jokaisella 0.2 ºC nousulla Juosteiden yhdistyminen ºC/min 72/5 72/5 72/5 72/5 72/5 Ajon loppu 16 16 16 16 16 1) Datapiste on se hetki ajossa, jolloin tuote on kaksijuosteisena ja laite mittaa tuloksen jokaiselle mikrobille soivassa lämpötilassa. 29

2.12.6. Standardit Jotta voitiin määrittää kompostista haluttujen mikrobien määrää täytyi valmistaa kyseisistä mikrobeista standardisuorat. Salmonellastandardia varten tehtiin Salmonella-rikastus, muita mikrobeja oli valmiskantoina ja niiden solukonstentraatiot olivat tiedossa. Pakastimessa -70 C ollutta Salmonella DS 88-kantaa siirrostettiin 150 l 10 ml:aan steriloitua LB-liuosta. LB-liuoksen aineet sekoitettiin keskenään ja autoklavoitiin. LB-liuos valmistettiin ohjeella: 2 g hiivauutetta 4 g tryptonia 4 g natriumkloridia 400 ml H 2 O Siirrostetta kasvatettiin yön yli ravistelijassa nopeudella 110 rpm +37 C. Aamulla liemestä tehtiin 1:100 laimennos ja ravisteltiin kolme tuntia nopeudella 110 rpm, lämpötilassa +37 C. Laimennoksista maljattiin 10-3 -10-9. Maljoja inkuboitiin lämpökaapissa vuorokausi +37 C ja pesäkkeet laskettiin. LB-agar valmistettiin samalla tavoin kuin LB-liuos, mutta joukkoon lisättiin vielä 6 g agarjauhetta. Jokaisen tutkittavan mikrobin puhdaskannasta valmistettiin laimennossarja, josta varmistettiin solumäärä PCR-ajon avulla. Varmistusajoa varten valmistettiin patogeenialukkeista (taulukko 8.) seos laskukaavan 5. avulla, halutut alukepitoisuudet on esitetty taulukossa 7. Alukkeista käytettiin 1:10 laimennosta. PCR-reaktioita varten pipetoitiin reaktioputkiin 10 µl Sybrgreen mastermix:a, 5 µl alukeseosta sekä 5 µl solulaimennosta ja kotrolleihin 5 µl vettä. Ajo suoritettiin jokaiselle mikrobille valituissa olosuhteissa (taulukko 9). Ajon jälkeen sopivat laimennokset valittiin siten, että pienin laimennos oli detektiorajalla ja suurin laimennos suhteutettu kompostissa olevien tutkittavien mikrobien määrään. Standardisuoraa varten eristettiin DNA hygienisoidusta 30

kompostista (Kujala auma 70 C) edellä esitetyn eristyksen mukaisesti. Streptomykeettien standardisuora valmistettiin kalkkunanjauhelihaan, koska kompostinäytteet sisältävät aina streptomykeettejä. Solunhajotusvaiheen jälkeen laskettiin pipetin avulla paljonko nestettä saatiin talteen. Saatuun määrään suhteutettiin lisättävän solulaimennoksen määrä, jokaiselle standardin pitoisuudelle (kaava 6). Jokaiselle mikrobille tehtiin oma standadisuora käyttämällä useampaa laimennosta, yleensä 10-3 - 10-6. (A. Rainisalo, julkaisematon). x = (V2/V1) * 50 l, jossa (kaava 6.) x= lisättävä solulaimennoksen määrä V1= eristyksessä olevien reagenssien tilavuus (1100 l) V2= soluhajotusvaiheen jälkeen pipetillä mitattu tilavuus l 50 l = reagenssitilavuutta vastaava määrä solulaimennosta esim.(800 l / 1100 l) * 50 l = 36,5 l 2.12.7. Näyteajo Näytteiden mikrobimäärien selvittämiseksi suoritettiin näyteajot eristetyistä näytteistä. käyttämällä laimmenosta 1:10, 1:20 tai 1:1000. Jokaisesta näytteestä tehtiin ajoon kolme rinnakkaisnäytettä. Ajoissa oli myös reaktio nolla (vesi), sisäinenstadradi eli IPC sekä soluista valmistettu standardi. Tällä tavalla voitiin poissulkea virhelähteitä, kuten alukkeiden toimimattomuus (Hoorfar ym. 2004). Jokaisesta tutkittavasta mikrobista suoritettiin vähintään kaksi ajoa. Taulukossa 10. on esitetty pipetoidut reagenssimäärät. Alukkeita lisättiin 5 l laskukaavan 5. mukaan, lopputilavuuden ollessa 30 l. Halutut alukekonsentraatiot on esitetty taulukossa 7. Jokaiselle mikrobille oli oma ajo-ohjelma (taulukko 11). Näyteajon jälkeen koneelle syötettiin standardien sisältämät solumäärät ja standardisuora säädettiin siten, että se antoi parhaan mahdollisen kulmakertoimen. 31