Kuinka geenin emäsjärjestys muunnetaan proteiinin avaruusrakenteeksi ribosomaalisen proteiinisynteesin vaiheet Yliopistonlehtori Tuomas Haltia Biotieteiden laitos Helsingin yliopisto Johdanto Ihmisellä on nykytiedon mukaan n. 23000 geeniä, joista valtaosa koodaa erilaisia proteiineja. Solun mikroskoopilla havaittavat rakenteet ovat pääosin proteiinien muodostamia. Kun lisäksi otetaan huomioon, että solun kemiaa hallitaan entsyymiproteiinien aktiivisuuksien kautta, proteiinien biosynteesiä voi perustellusti pitää biokemian ja laajemmin biologian ydinsisältöön kuuluvana asiana. Tarkastelen tässä artikkelissa sitä, miten tuman geenin informaatio käännetään ensin lähetti- RNA:n informaatioksi ja sitten edelleen proteiinin aminohappojärjestykseksi soluliman ribosomien avulla. Kunkin proteiinin biologinen aktiivisuus perustuu sen avaruusrakenteeseen, joka myöskin on koodattuna geenin emäsjärjestykseen, vaikka nykytiede ei pelkän aminohappojärjestyksen perusteella pystykään määrittämään proteiinin avaruusrakennetta. Kirjoitus perustuu BMOL:n talvipäivillä 16.11.2014 pitämääni esitykseen. Lähteinä olen käyttänyt Helsingin yliopiston biologian ja molekyylibiotieteiden koulutusohjelmien ensimmäisen vuoden oppikirjoja: Reece: Campbell Biology, 9. p, Pearson, 2011, Alberts ym.: Essential Cell Biology, 4. p., Garland, 2014 ja Alberts ym.: The Molecular Biology of the Cell, Garland, 2014. Aitotumallisen eliön geenit: TATA-laatikko, intronit ja eksonit Geeni on DNA-alue, joka koodaa proteiinia, ribosomaalisia RNA-molekyylejä (rrna), siirtäjä- RNA:ita (trna) tai muita RNA-molekyylejä, esim. geenien ilmentymistä sääteleleviä mikro- RNA:ita (mirna). Jatkossa käsittelen tarkemmin vain proteiineja koodaavia geenejä. Geenejä on DNA:n kummassakin juosteessa. Kunkin geenin kohdalla DNA:n toista juostetta sanotaan koodaavaksi juosteeksi, koska sen emäsjärjestys vastaa proteiinin aminohappojärjestystä. Toinen juoste on mallijuoste, jota RNA-polymeraasi II entsyymi (RNA-pol) käyttää mallinaan geenien luennassa eli transkriptiossa. Transkription tuote on lähetti-rna (mrna), joka ohjaa soluliman ribosomien proteiinisynteesiä. Aitotumallisen eliön geeni on tyypillisesti epäjatkuva: aminohapposekvenssiä koodaavien alueiden eli eksonien välissä voi olla pitkiä (usein paljon eksoneja pidempiä) introneiksi kutsuttuja eikoodaavia alueita. RNA-pol tuottaakin ensin esi-lähetti-rna-transkriptin, joka on paljon lopullista lähetti-rna:ta suurempi, koska se sisältää myös intronit. Transkriptiota seuraavan lähetti-rna:n valmistusprosessin aikana intronit pilkotaan eli silmukoidaan pois ja eksonit liitetään toisiinsa. Tämä tumassa tapahtuva silmukointi vaatii suurta täsmällisyyttä: yhdenkin emäksen siirtymä johtaa joko aivan erilaisen tai ei minkään proteiinin syntymiseen. Monien geenien silmukointi voi tapahtua vaihtoehtoisilla tavoilla; yhdestä geenistä voidaan siis lopulta saada tuotettua useita erilaisia proteiineja. Yhden eksonin koodaama alue vastaa lopputuoteproteiinissa usein yhtä itsenäistä rakenteellista kokonaisuutta eli domeenia. Intronien lisäksi geeniin kuuluu myös muita tärkeitä eikoodaavia alueita: geenin alussa eli 5 -päässä on promoottorialue, jossa olevaan TATA-laatikkoon transkription aloitustekijä-proteiinit sitoutuvat ennen kuin RNA-pol voi sitoutua promoottorialueeseen ja aloittaa geenin luennan. Syntyvän esi-lähetti-rna:n 5 -päähän, koodaavan alueen ulkopuolelle lisätään 5 -tulppa (engl. 5 cap), jolla tarkoitaan lähetti-rna:n 5 -pään tiettyä
kemiallista modifikaatiota. Geenin lopun 3 -päässä ei-koodaavalla alueella on kohta, josta esilähetti-rna katkaistaan. Tähän 3 -päähän lisätään noin 200 emäksen mittainen polyadeniinitoistojakso eli polya-häntä. 5 - ja 3 -pään modifikaatiot stabiloivat syntyvää lähetti-rna:ta ja edesauttavat sen kuljetusta tumahuokosten kautta tumasta solulimaan. 5 -tulppa ja 3 -polya-häntä tekevät RNA-molekyylistä nimenomaan lähetti-rna:n, jonka ribosomin pieni alayksikkö tunnistaa solulimassa. Jo tumassa lähettiin sitoutuu kolmen tyyppisiä proteiineja (Kuva 1): 5 -tulpan tunnistava proteiini, eksoniliitosproteiinikomplekseja ja 3 -polya:han sitoutuva proteiini. Näiden proteiinien sitouduttua lähetti-rna on valmis kuljettettavaksi tumakalvon läpi solulimaan. Lähettiin sitoutuneet proteiinit vuorovaikuttavat tuman uloskuljetusreseptorin ja tumahuokosen proteiinien kanssa. Solulimassa 5 -tulppaan sitoutunut proteiini vaihtuu toiseen ennen kuin lähetti- RNA ja ribosomin pieni alayksikkö sitoutuvat toisiinsa translaation aloitusvaiheessa (Kuva 1). Ribosomin rakenne: ribosomi onkin ribotsyymi Kaikkien eliöiden ribosomien yleisrakenne on samankaltainen (Taulukko), muttei identtinen: prokaryoottien ja eukaryoottien ribosomit eroavat yksityiskohdiltaan; näillä eroilla on tärkeä merkitys antibioottien sitoutumiselle. Käsittelen tässä vain eukaryoottiribosomia. Aitotumallisen ribosomin molekyylipaino on 4,2 megadaltonia ja se koostuu pienestä (1,4 MDa) ja suuresta (2,8 MDa) alayksiköstä. Kumpikin alayksikkö koostuu sekä ribosomaalisesta RNA:sta että proteiinista. rrna-molekyylien geenit sijaitsevat tumajyväsessä, ja niiden transkriptiota katalysoivat RNApolymeraasit I ja III (kun taas RNA-polymeraasi II tuottaa esi-lähetti-rna:t). Tumajyväsen havaittavuus johtuu sen suuresta RNA-pitoisuudesta. Ribosomaaliset proteiinit, joita on yli 80, tehdään soluliman vapailla ribosomeilla. Tämän jälkeen ne kuljetetaan tumahuokosten kautta tumaan ja tumajyväseen, jossa ne kootaan rrna:n kanssa pieneksi ja suureksi ribosomin alayksiköksi. Nämä kuljetetaan taas tumahuokosten kautta solulimaan. Kokonainen ribosomi muodostuu vasta translaation aloitusvaiheessa (kuva). Ribosomin karkea rakenne ja mm. kuvan A, P ja E-paikkojen olemassaolo on tunnettu jo vuosikymmeniä, mutta proteiinisynteesikoneen atomitason rakenne on selvinnyt vasta 2000-luvulle tultaessa. Vuoden 2009 kemian Nobel-palkinto annettiin kolmelle rakennebiologille, jotka selvittivät ribosomin rakenteen. Eräs rakennetyön yllätyksistä oli, että ribosomin ydin on RNA:ta ja että ribosomaaliset proteiinit sijaitsevat enimmäkseen rrna-ytimen ulkopinnoilla. Erityisen merkittävää on, että peptidisidoksen syntyä näyttää katalysoivan yksinomaan RNA (suurin rrna-molekyyli eli 23S rrna). Ribosomin A-, P- ja E-paikat ovat myös paljolti rrna:n muodostamia. Näiden havaintojen ajatellaan viittaavan siihen, että nykyisiä proteiinikatalyyttejä eli entsyymejä edelsivät muinaisessa RNA-maailmassa RNA-katalyytit. On mahdollista, että RNA-maailman eliöiden geneettinen materiaalikin oli RNA:ta eli niillä oli RNA-genomi. Siirtäjä-RNA:t, geneettinen koodi ja aminohappojen aktivointi peptidisidoksen muodostamista varten Siirtäjä-RNA:t ovat pienehköjä (n. 80 emäksen pituisia, molekyylipaino n. 25 kda) RNAmolekyylejä, joiden avulla ribosomi kytkee tietyn aminohapon toiseen geneettisen koodin määräämässä järjestyksessä. Aminohappo-tRNA:t sitoutuvat ribosomin A-paikkaan (paitsi proteiinisynteesin aloitusvaiheen aloitusmetioniini-trna, joka sitoutuu P-paikkaan; kuva 3). Jokaista aminohappoa varten on olemassa vähintään yksi siirtäjä-rna, jonka (a) toiseen päähän voidaan liittää aktivoitu (eli karboksylaattiryhmästään ATP:n energian avulla reaktiiviseksi tehty) aminohappo ja joka (b) toisen päänsä antikodonilla voi tunnistaa lähetti-rna:n kodonin. Myös
siirtäjä-rna:t saattavat olla jäänteitä muinaisesta, proteiinien valtakautta edeltäneestä RNAmaailmasta. Kullekin aminohapolle on olemassa oma aminoasyyli-trna-syntetaasi, entsyymi, joka ATP:n energian avulla liittää tiettyyn trna:han sen antikodonia vastaavan aminohapon. Syntetaasi pystyy siis sekä lukemaan trna:n antikodonin että liittämään antikodonia vastaavan aminohapon trna:n toiseen päähän (Kuva 2). Voidaan sanoa, että aminoasyyli-trna syntetaasit lukevat geneettistä koodia; jos trna:n antikodoni ja siihen liitetty aminohappo eivät vastaa toisiaan, proteiinisynteesin tuloksena on mutatoitunut proteiini. Translaatio: lähetti-rna:n informaation kääntäminen aminohapposekvenssiksi Solulimaan kuljetettu lähetti-rna siihen kiinnittyneine proteiineineen on valmis ohjaamaan ribosomaalista proteiinisynteesiä eli translaatiota. Aitotumallisella 100-aminohappoisen proteiinin synteesi kestää 50 sekuntia; bakteerien translaatio on kymmenen kertaa nopeampaa eli 100 aminohapon polypeptidi syntyy viidessä sekunnissa. Tämä prosessi voidaan jakaa aloitus-, pidennys- ja lopetusvaiheeseen. Aloitusvaiheessa ribosomin pienen alayksikön P-paikkaan kiinnittyy aloitusmetioniini-trna. Seuraavaksi tähän kompleksiin liittyy mrna, ja joukko aloitustekijäproteiineja (Kuva 3A). Nämä sitoutuvat mrna:n 5 -tulppaan ja vuorovaikuttavat myös 3 -polya:n kanssa; siten vain kypsä ja ehjä mrna kelpaa ohjaamaan translaatiota. Aloituskompleksissa ribosomin pieni alayksikkö liikkuu suuntaan 5 à 3 kunnes ensimmäinen AUG-kodoni tulee P-paikan kohdalle. Prosessi vaatii energiaa GTP:n muodossa. P-paikka on miehittynyt aloitusmetioniini-trna:lla. Kun aloituskodoni on löytynyt ja pariutunut aloitusmetioniini-trna:n antikodonin kanssa, ribosomin suuri alayksikkö liittyy kompleksiin ja varsinainen proteiinisynteesi voi alkaa. Translaation pidennysvaihe (Kuva 3B) on toistuva prosessi, jossa kukin aminohappo-trna sitoutuu ensin ribosomin A-paikkaan siten, että trna:n antikodoni ja mrna:n kodoni pariutuvat vetysidosten avulla. Tämän jälkeen P-paikassa oleva aminohappo-trna (tarkemmin: aminohapon reaktiiviseksi tehty karboksylaatti) reagoi A-paikan aminohappo-trna:n aminopään kanssa. 23S rrna:n peptidyylitransferaasiaktiivisuus aikaansaa uuden peptidisidoksen syntymisen. Syntyvä proteiini syntyy siis aminopää edellä. Lopuksi ribosomin alalyksiköt siirtyvät kahdessa askelessa yhden kodonin verran kohden mrna:n 3 -päätä. P-paikassa ollut, aminohapponsa menettänyt trna joutuu nyt E-paikkaan ja peptidyyli-trna siirtyy P-paikkaan. Seuraava mrna:n kodoni on nyt A-paikassa odottamassa seuraavaa aminohappo-trna:ta. Myös pidennysvaihe (ribosomin siirtyminen kodonin verran 5 à3 suuntaan) vaatii GTP:n energiaa ja pidennystekijä-nimisiä proteiineja. E-paikan kautta tyhjä trna vapautuu solulimaan uudelleen käyttöä varten. Translaatio päättyy, kun lähetti-rna:ssa oleva stop-kodoni ilmaantuu A-paikkaan (Kuva 3C). Stop-kodoneita on kolme erilaista. Niitä varten ei ole omaa trna:ta, vaan ribosomin A-paikassa olevan stop-kodonin tunnistaa lopetustekijäproteiini. Tämän sitoutuminen muuttaa ribosomin P- paikan rakennetta siten, että siellä oleva peptidi hydrolysoituu irti trna:sta ja vapautuu ribosomissa olevan kanavan kautta solulimaan. Jos syntyvän proteiinin N-päässä on solulimakalvostopesifinen signaalisekvenssi (n. 30 aminohapon pituinen keskeisiltä osiltaan hydrofobinen sekvenssi), tällaista proteiinia tuottava ribosomi tarttuu signaalisekvenssin tunnistavien proteiinien välityksellä solulimakalvostossa olevaan proteiinien kuljetuskanavaan, jonka kautta syntetisoituva proteiini siirtyy joko kalvoston sisätilaan tai solulimakalvon proteiiniksi. Solulimakalvostossa proteiinia voidaan muokata esimerkiksi liittämällä tiettyihin asparagiinisivuketjuihin sokeriosia. Tämän
jälkeen muokattu proteiini usein jatkaa matkaansa kuljetusvesikkelin sisällä tai sen kalvon osana Golgin laitteeseen. Täällä sokerointia voidaan jatkaa toisenlaisilla sokereilla. Lopulta tämä glykoproteiini kuljetetaan vesikkeliliikenteen avulla edelleen, joko solukalvon proteiiniksi siten, että sen sokeriosa on solun ulkopinnalla, tai kokonaan solusta ulos. Kolmas mahdollinen osoite Golgin laitteessa kypsyvälle sokeroidulle proteiinille on soluorganelli lysosomi. Riippumatta syntyvän proteiinin osoitelapusta kukin ribosomin vapauttama polypeptidi laskostuu omaan, sekvenssinsä määräämään avaruusrakenteeseen. Vesiliukoisten proteiinien yleinen rakenneperiaate on, että proteiinin ydin koostuu vesipakoisista aminohappotähteistä ja että proteiinin pinnalla on enimmäkseen vesihakuisia aminohapposivuketjuja. Laskostunut rakenne syntyy spontaanisti eli sen vapaa energia on alempi kuin laskostumattoman proteiinin. Solussa on kuitenkin koko joukko kaitsijaproteiineja, joiden tehtävä on edistää polypeptidien laskostumista ja estää esimerkiksi aggregoituminen eli laskostuvien proteiinien epäspesifinen tarttuminen toisiinsa. Translaatio vaatii energian lähteen Translaatiossa yhden aminohapon karboksylaattiryhmä reagoi toisen aminohapon aminoryhmän kanssa siten että syntyy peptidisidos (jota kutsutaan myös amidisidokseksi). Kysymyksessä on kondensaatioreaktio, jossa lohkeaa vettä. Peptidisidoksen syntyminen ei vesiliuoksessa ole spontaani reaktio eli sen vapaan energian muutos on positiivinen, ts. reaktio vaatii tapahtuakseen energian lähteen. Translaatiossa peptidisidos saadaankin syntymään investoimalla prosessiin energiaa ATP:n ja GTP:n muodossa. ATP:n energian avulla aminoasyyli-trna syntetaasi liittää toisiinsa aminohapon ja sille spesifisen trna:n (Kuva 2). Investoidun energian avulla aminohapon karboksylaatti muuttuu korkeaenergiseksi, minkä vuoksi se voi translaation pidennysvaiheessa reagoida toisen aminohappo-trna:n aminoryhmän kanssa. Koska aminohappo-trna:n synteesissa ATP:stä tulee AMP:tä ja kaksi epäorgaanista fosfaattia, reaktion voidaan katsoa vaativan kahden ATP:n verran energiaa. Energiaa tarvitaan myös translaation jokaisessa vaiheessa: aloituksessa yhden GTP:n ja ATP:n verran per polypeptidi, pidennysvaiheessa kaksi GTP:tä per peptidisidos. Lopetusvaihe kuluttaa kaksi GTP:tä per polypeptidi. Siten yhden peptidisidoksen tuottaminen vaatii enemmän kuin neljän ATP:n hydrolyysin ADP:ksi ja fosfaatiksi (ATP:n ja GTP:n energiasisällöt ovat yhtä suuret). Aktiivinen proteiinisynteesi on merkittävä energian kuluttaja. Translaation ja ribosomin rakenteen yksityiskohtien käytännön merkitys Vaikka translaatio toimii samalla periaatteella koko eliökunnassa ja ribosomit ovat kaikkialla samankaltaisia, prosessit ja rakenteet eroavat toisistaan monissa yksityiskohdissa. Erot ovat biologisesti tärkeitä: monet aitotumalliset sienet ja homeet kilpailevat resursseista naapuruston bakteerien kanssa. Pärjätäkseen kilpailussa nämä eukaryootit ovat kehittäneet molekyylejä, jotka estävät prokaryoottien proteiinisynteesiä sitoutumalla näiden ribosomeihin. Esimerkkejä antibiooteista, joiden vaikutus perustuu proteiinisynteesin estämiseen, ovat tetrasykliini (estää aminoasyyli-trna:n sitoutumisen ribosomin A-paikkaan), streptomysiini (estää translaation etenemisen aloitusvaiheesta pidennysvaiheeseen) ja kloramfenikoli (estää pidennysvaiheen peptidyylitransferaasia). Eräs motivaatio ribosomien rakennetutkimukselle onkin juuri mahdollisuus kehittää rakennetiedon avulla entistäkin tehokkaampia antibiootteja.
Taulukko A. Aitotumallisen eliön ribosomin koostumus rrna-molekyylit Proteiinit Suuri alayksikkö (60S) 3 kpl: 28S, 5,8S ja 5S rrna 49 kpl Pieni alayksikkö (40S) 1 kpl: 18S rrna 33 kpl Koko ribosomi (80S) 4 kpl 82 kpl (80S-ribosomi; noin puolet massasta on RNA:ta ja puolet proteiinia) B. Esitumallisen eliön ribosomin rakenne rrna-molekyylit Proteiinit Suuri alayksikkö (50S) 2 kpl: 23S ja 5S rrna:t 31 kpl Pieni alayksikkö (30S) 1 kpl: 16S rrna 21 kpl Koko ribosomi (70S) 3 kpl 52 kpl (70S-ribosomi; n. 2/3 massasta on RNA:ta ja 1/3 proteiinia) C. Nisäkkään mitokondrion ribosomin koostumus rrna-molekyylit Proteiinit Suuri alayksikkö (39S) 1 kpl: 16S rrna n. 52 kpl Pieni alayksikkö (28S) 1 kpl: 12S rrna n. 30 kpl Koko ribosomi (55S) 2 kpl yli 80 kpl (55S-ribosomi; n. 2/3 massasta on proteiinia ja 1/3 RNA:ta)
Kuvat: Kuva 1: Yleiskuva aitotumallisen solun geenistä, geenin luennasta eli transkriptiosta ja lähetti- RNA:n kypsymisestä sekä sen kuljetuksesta solulimaan translaatiota varten. Kuva 2: Aminoasyyli-tRNA-syntetaasi valmistaa aminoasyyli-trna:t. Kuvassa tryptofanyylitrna-syntetaasi. Entsyymi tarkistaa, että trna:n antikodoni vastaa tryptofaanin kodonia. Aminohapon liittäminen trna:han kuluttaa energiaa; trna:han liitetty aminohappo saadaan tämän energian avulla muodostamaan peptidisidos ribosomin katalysoimassa reaktiossa translaatiossa. Kuva 3. A. Translaation aloitusvaihe. Aloitusmetioniini-tRNA sitoutuu ribosomin pienen alayksikön P- paikkaan aloitustekijäproteiinien kanssa. Seuraavaksi tähän kompleksiin sitoutuu lähetti-rna, josta etsitään aloituskodoni AUG. Prosessi kuluttaa ATP:tä. AUG:n löydyttyä kompleksiin sitoutuu ribosomin suuri alayksikkö ja lähetin kodonia 2 vastaava aminohappo-trna sitoutuu ribosomin A- paikkaan. Ensimmäinen peptidisidos syntyy, kun P-paikan metioniinin aktivoitu karboksyyliryhmä reagoi A-paikan aminohapon aminoryhmän kanssa. Polypeptidi siis syntyy aminopää edellä. Ensimmäisenkin peptidisidoksen synty vaatii pidennystekijä-proteiineja ja GTP:n energiaa. B. Translaation pidennysvaihe. Jokainen uusi aminoasyyli-trna saapuu ribosomille A-paikan kautta, jossa trna:n antikodoni ja lähetin kodoni pariutuvat vetysidoksin. Aminosyyli-tRNA:n sitoutuminen vaatii pidennystekijäproteiineja ja GTP:n energiaa. Peptidisidos syntyy 23S rrna:n katalysoimassa reaktiossa; syntyvä peptidyyli-trna on ensin A-paikassa, kun taas P-paikkaan jää tyhjentynyt trna. Toisen pidennystekijäproteiinin ja GTP:n avulla ribosomi liikkuu niin, että tyhjä trna joutuu E-paikkaan ja irtoaa samalla kun peptidyyli-trna siirtyy P-paikkaan. Tyhjässä A- paikassa on nyt uusi kodoni ja se on valmis sitomaan kodonia vastaavan aminoasyyli-trna:n. C. Translaation lopetusvaihe. A-paikkaan ilmaantuneen lähetin stop-kodonin tunnistaa lopetustekijäproteiini. Tämän sitoutuminen muuttaa ribosomin rakennetta siten, että vesimolekyyli pääsee hydrolysoimaan P-paikan polypeptidin irti trna:sta. Syntynyt polypeptidi vapautuu solulimaan ja laskostuu. Jos polypeptidin aminopäässä on solulimakalvoston signaalisekvenssi, polypeptidi on jo translaation aikana ohjautunut solulimakalvostoon. Polypeptidin vapauduttua ribosomi hajoaa osikseen ja lähetti-rna vapautuu mahdollista uudelleen käyttöä varten. Tämäkin prosessi vaatii GTP:n energiaa.