( B ) (ii) KUUTUSJUL I SU U U TLA L GGN I NGSSK KA R I FT 86377 C (51) Kv.lk.5 - Int.cl.5 A 61K 39/40, C 12N 5/00 SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (21) Patenttihakemus - Patentansökning 865027 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 10.12.86 (24) Alkupäivä - Löpdag 10.12.86 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 11.06.87 (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 15.05.92 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 10.12.85 US 807394 P 24.11.86 US 931179 P (71) Hakija - Sökande 1. Genetic Systems Corporation, 3005 First Avenue, Seattle, Wash. 98121, USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Siadak, Anthony W., 6210 lst Avenue, N W, Seattle, Wash. 98107, USA, (US) 2. Rosok, Mae J., 11337a 17th N E, Seattle, Wash. 98125, USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Oy Kolster Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden tai niiden sitoutuvien fragmenttien valmistamiseksi Förfarande för framställning av terapeutiskt aktiva humana monoklonala antikroppar eller deras bindande fragment (83) Mikro-organismitalletus - Deposition av mikroorganism: CRL 8941 ATCC CRL 9171 ATCC CRL 9258 ATCC (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer FI A 852029 (C 12N 5/00), FI A 870482 (A 61K 39/40), EP A 101039 (A 61K 39/395) (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksintö koskee solulinjoja, jotka erittävät monoklonaalisia vastaaineita, joilla on kyky sitoutua valittujen Pseudomonas aeruginosakantojen IATS-serotyyppien lipopolysakkaridimolekyyleihin. Keksintö koskee myös farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät näitä vasta-aineita mandollisesti yhdistettyinä muihin monoklonaalisiin vastaaineisiin, veriplasman fraktioihin ja mikrobien vastaisiin aineisiin, sekä tällaisten koostumusten profylaktista ja terapeuttista käyttöä infektioiden hoidossa. Ennen tämän patenttihakemuksen jättämistä jatkuvat transformoidut ihmissolulinjat 1C1, 6D6 ja 8H7, joita tässä kuvataan, talletettiin the Ameridan Type Culture Collectioniin, ja niille annettiin merkinnät CRL 8941, 9171 ja vastaavasti 9258.
86377 Uppfinningen avser cellinjer, vilka som sekret avsöndrar mänskliga, monoklonala antikroppar, vilka förmår binda sig vid lipopolysackaridmolekylerna av valda Pseudomonas aeruginosa-stammars IATS-serotyper. Uppfinningen avser även farmaceutiska kompositioner, vilka innehåller dessa antikroppar, eventuellt i kombination med andra monoklonala antikroppar, blodplasmafraktioner och antimikrobiella medel, och profylaktisk och terapeutisk användning av dylika kompositioner vid bekämpningen av infektioner. Före inlämnandet av denna patentansökning deponerades de kontinuerligt transformerade och här beskrivna mänskliga cellinjerna 1C1, 6D6 och 8H7 hos The American Type Culture Collection och de gavs respektive beteckningar CRL 8941, 9171 och 9258.
1 86377 Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden tai niiden sitoutuvien fragmenttien valmistamiseksi............. 5 Ristiviittaus aiheeseen liittyvään hakemukseen: Tämä hakemus on osittain jatkoa US-patenttihakemukseen 807 394, joka on jätetty 10. joulukuuta 1985,ja joka mainitaan tässä viitteenä. Tämä keksintö koskee immunologisten menetelmien 10 käyttöä uusien materiaalien aikaansaamiseksi, jotka ovat käyttökelpoisia bakteeri-infektioiden oidossa, tarkemmin ilmaistuna ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden, joilla on kyky tunnistaa lukuisia Pseudomonas aeruginosa serotyyppejä, tuotantoa ja käyttöä. 15 Gram-negatiivisten bakteerien aiheuttama sairaus ja sen vakavimmat komplikaatiot, esimerkiksi bakteremia ja endotoksemia, aiheuttavat merkittävää sairastumista ja kuolleisuutta ihmispotilaissa. Tämä pätee erityisesti gram-negatiiviseen organismiin, Pseudomonas aeruginosaan, 20 joka on enenevässä määrin liittynyt bakteeri-infektioihin, erityisesti sairaalainfektioihin, viimeisten viidenkymmenen vuoden aikana. Muutaman viimeisen vuosikymmenen aikana on gramnegatiivisten bakteerien aiheuttaman sairauden hoitoon 25 käytetty antibiootteja. Gram-negatiivisten bakteerien aiheuttamaan sairauteen liittyvä jatkuva suuri sairastuvuus ja kuolleisuus osoittaa kuitenkin antibioottihoidon rajoitukset erityisesti P. aeruginosan ollessa kyseessä. [Katso esimerkiksi Andriole, V.G., "Pseudomonas Bacteremia: Can 30 Antibiotic Therapy Improve Survival", J. Lab. Clin. Med. 94 (1978) ss. 196-199]. Tämä on ollut kimmokkeena vaihtoehtoisten ehkäisy- ja hoitomenetelmien etsimiselle. Eräs harkinnan kohteena ollut menetelmä on isännän immuunijärjestelmän voimistaminen aktiivisella tai passii- 35 visella immunisoinnilla. On esimerkiksi havaittu, että
2 86377.-._ ihmisten tai koe-eläinten aktiivinen immunisointi P. aeruginosasta valmistetuilla kokosolubakteerirokotteilla tai puhdistetuilla bakteeriendotoksiineilla johtaa spesifisten opsonivasta-aineiden kehittymiseen, jotka suuntautuvat 5 pääasiassa P. aeruginosan uloimmalla solukalvolla sijaitsevien lipopolysakkaridimolekyylien (LPS) toistuvien oligosakkaridiyksiköiden pinnalla olevia determinantteja vastaan (katso Pollack, M., Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations, toim. Alving, B.M. 10 ja Finlayson, J.S., U.S. Department of Health and Human Services 1979, ss. 73-79). Tällaisten vasta-aineiden, olivatpa ne sitten aktiivisesti synnytettyjä tai passiivisesti siirrettyjä, on osoitettu suojaavan P. aeruginosa - infektion tappavilta vaikutuksilta joukossa eläinmalleja 15 (Pollack, supra) ja joissain ihmisillä tehdyissä esitutkimuksissa (katso Young, L.S. ja Pollack, M., Pseudomonas aeruginosa, toim. Sabath, L., Hans Huber, 1980, ss. 119-132). Erityisen tärkeä näiden vasta-aineiden merkitykselle ihmisissä on lisäksi ollut se havainto, että P. ae- 20 ruginosa -bakteremiapotilaissa vallitsee yhteys eloonjäämisen ja infektoivan kannan LPS-molekyylien vastaisten vasta-aineiden korkean lyhytaikaisen seerumipitoisuuden välillä [katso Pollack, M. ja Young, L.S., J. Clin. Invest. 63 (1979) ss. 276-286]. 25 Edellä mainitut raportit viittaavat siihen, että immunoterapeuttisia lähestymistapoja voitaisiin käyttää P. aeruginosan aiheuttaman bakteerisairauden hoitoon, kuten antamalla yhdistettyjä ihmisen immunoglobuliineja, jotka sisältävät vasta-aineita yhtä tai useampaa infektoi- 30 vaa kantaa vastaan. Ihmisen immunoglobuliinit määritellään tässä yhteydessä siksi fraktioidun ihmisplasman osaksi, joka on rikastunut vasta-aineiden suhteen, joiden joukossa on spesifisiä vasta-aineita P. aeruginosa -kannoille. Ih- misen immunoglobuliinikomponenttien käyttöön liittyvien.---. 35 tiettyjen luontaisten rajoitusten vuoksi on tämä lähesty-
3 86377 mistapa P. aeruginosan aiheuttaman sairauden hoitamiseksi edelleen tutkimuksen alaisena [katso esimerkiksi Collins, M.S. ja Roby, R.E., Am. J. Med. 76(3A) (1984) ss. 168-174], eikä vielä ole saatavana kaupallisia tuotteita, 5 joissa käytettäisiin näitä komponentteja. Eräs tällainen immunoglobuliinikoostumuksiin liittyvä rajoitus on se, että ne koostuvat yhdistetyistä näytteistä, jotka on saatu tuhannesta tai useammasta luovuttajasta ja jotka on esivalikoitu tiettyjen anti-pseudomonas- 10 vasta-aineiden läsnäolon perusteella. Tämä yhdistäminen johtaa yksittäisten vasta-aineiden pitoisuuksien keskiarvoistumiseen, joka parhaimmillaankin antaa tulokseksi vaatimattomia nousuja tuloksena olevassa haluttujen vastaaineiden pitoisuudessa. 15 Toinen rajoitus on se, että itse esivalikointipro- sessi vaatii kallista, jatkuvaa luovuttajayhdistelmän tutkimista tuotteen yhtenäisyyden varmistamiseksi. Näistä toimenpiteistä huolimatta immunoglobuliinituotteet saattavat edelleen vaihdella huomattavasti erästä toiseen ja eri 20 maantieteellisiltä alueilta tulevien tuotteiden kesken. Vielä eräs tällainen immunoglobuliinikoostumuksille luontainen rajoitus on se, että niiden käyttö johtaa ulkopuolisten proteiiniaineiden samanaikaiseen antamiseen suurina määrinä (joihin aineisiin voi kuulua viruksia, kuten 25 sellaisia, joiden on vähän aikaa sitten osoitettu liittyvän immuunikatoon, AIDS:iin), jotka aineet saattavat aiheuttaa biologisia haittavaikutuksia. Haluttujen vastaaineiden pienet pitoisuudet ja ulkopuolisten aineiden suuri pitoisuus voivat yhdessä rajoittaa potilaalle annetta- 30 vissa olevien yhden tai useamman spesifisen ja siten hyödyllisen immunoglobuliinin pitoisuuden usein optimaalista pienemmäksi. Kirjallisuudessa esitetään joukko serotyypin määritysohjelmia, joita voitaisiin käyttää anti-pseudomonas- - 35 vasta-aineiden läsnäolon tutkimiseen solusupernatanteis-
4 86377 ta. Ohjelmat perustuvat pääasiassa tämän organismin lämpöstabiileihin somaattisiin pääantigeeneihin (katso Zierdt, C.H. teoksessa Glucose Nonfermenting Gram-Negative Bacteria in Clinical Microbiology, toim. Gilardi, 5 G.L., CRC Press 1978, ss. 213-238). Serotyypitysohjelmien lisääntyminen on tehnyt P. aeruginosan serologisten tutkimusten vertaamisen melko vaikeaksi ja siten tietyn järjestelmän valinta supernatanttien tutkimista varten näyttää jossain määrin sattumanvaraiselta. Tyypitysjärjes- 10 telmien välistä sekavuutta on jokin aika sitten vähentänyt IATS-järjestelmä (the International Antigenic Typing Scheme), jota on ehdottanut the Subcommittee on Pseudomonadaceae of the International Commitee on Systematic Bacteriology rungoksi P. aeruginosan tarkempia serologisia 15 tutkimuksia varten. Tämä järjestelmä, joka sisältää 17 erilaista serotyyppiä, jotka merkitään IATS-tyyppi 1, IATS -tyyppi 2 jne., kattaa kaikki aiemmissa järjestelmissä identifioidut lämpöstabiilit somaattiset pääantigeenit. Katso Liu, P.V., Int. J. Syst. Bacteriol. 33 (1983) ss. 20 256-264, joka mainitaan tässä viitteenä. Kehitettäessä suojaavia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat ristiin P. aeruginosa -kantojen kanssa, on edullista ottaa mukaan myös tyypitysohjelma, joka perustuu P. aeruginosan suojaaviin antigeeneihin. 25 Tällainen ohjelma on suunniteltu pyrittäessä kehittämään rokote kliiniseen käyttöön ja sitä kuvataan yksityiskohtaisesti julkaisussa Fisher, M.V. et al., J. Bacteriol. 98 (1969) ss. 835-836. Tämä järjestelmä, jota yleensä kutsutaan Fisher-tyypitysjärjestelmäksi, luokittelee pääosan 30 tunnetuista P. aeruginosa -kannoista seitsemään tyyppiin, joista käytetään merkintöjä Fisher-immunotyyppi 1, Fisherimmunotyyppi 2 jne. IATS- ja Fisher-tyypitysjärjestelmien välistä korrelaatiota on selvitetty kirjallisuudessa (kat-.:. so Liu, P.V. et al., supra) ja se esitetään taulukossa I....: 35 Kuten taulukosta I käy ilmi, ei ole olemassa vastaavia
5 86377 Fisher-immunotyyppejä tietyille IATS-serotyypeille, vaikka kukin Fisher-immunotyyppi vastaa tiettyä IATS-serotyyppiä. IATS- ja Fisher-tyypitysjärjestelmien ollessa kyseessä kummallekin serotyypin määritysjärjestelmälle tärkeiden 5 antigeenideterminanttien uskotaan sijaitsevan P. aeruginosan pinta-lps-molekyyleillä[liu, P.V. et al., supra; Hanessien, F. et al., Nature 229 (1979) ss. 209-210). 10 Taulukko I Pseudomonas aeruginosan IATS- ja Fisher-tyypitysohjelmien vertailu ja korrelointi IATS Fisher 1 4 15 2 3 3 4 5 7 6 1 20 7 8 6 9 10 5 11 2 25 12 13 14 15 16 30 17 Vuonna 1975 Kohler ja Milstein julkaisivat kehityskelpoisen havaintonsa, jonka mukaan tiettyjä hiirisolulinjoja voitiin fuusioida hiiren pernasoluihin, jolloin - 35 syntyy hybridoomia, joista kukin erittää yhdelle aineelle
6 86377 spesifistä vasta-ainetta, ts. monoklonaalisia vasta-aineita [Kohler, G. ja Milstein, C., Nature 256 (1975) ss. 495-497]. Tämän tekniikan keksimisen myötä tuli mandolliseksi tuottaa joissakin tapauksissa suuria määriä täysin spe- 5 sifisiä hiiren vasta-aineita antigeeneilla oleville yhdelle tai useammalle determinantille. Tällaisilla hiiren monoklonaalisilla vasta-aineilla tai tällaisten vasta-aineiden koostumuksilla saattaa kuitenkin olla suuria haittapuolia ajateltaessa käyttöä ihmisissä, erityisesti otet- 10 taessa huomioon se havainto, että käytettäessä hiiren monoklonaalisia vasta-aineita kokeilututkimuksissa ihmisen tietyn sairauden hoitoon niiden on usein havaittu herättävän imuunivasteen, joka tekee niistä tehottomia [Levy, R.L. ja Miller, R.A., Ann. Rev. Med. 34 (1983) ss. 107-15 116]. Käyttämällä hybridoomatekniikkaa Sadoff et al. ovat raporttinsa mukaan tuottaneet hiiren monoklonaalista IgM-ryhmän vasta-ainetta P. aeruginosan tietyn serotyypin LPS-molekyylien O-ketjudeterminanttia vastaan (Abstracts 20 of the 1982 Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, nro 253). He ilmoittavat lisäksi, että tämä hiiren vasta-aine suojasi hiiret P. aeruginosan, joka oli samaa serotyyppiä kuin se, jota vastaan vasta-aineet suuntautuivat (ts. homologista serotyyppiä), 25 tappavalta hyökkäykseltä. Muutamissa myöhemmissä artikkeleissa on esitetty yksityiskohtaisesti spesifisyydeltään erilaisten hiiren ja ihmisen monoklonaalisten anti- P. aeruginosa-lps-vasta-aineiden kehittämistä; esimerkiksi Sawada, S. et al., J. Inf. Dis. 150 (1984) ss. 570-30 576; Sadoff, J. et al., Antibiot. Chemother. 36 (1985) ss. 134-146; Hancock, R. et al., Infect. Immun. 37 (1982) ss. 166-171; Siadak, A.W. ja Lostrom, M.E. teoksessa Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, toim. Engleman, E.G. et al., Plenum Publishing Corp., 1985, ss. 167-35 185; ja Sawada, S. et al., J. Inf. Dis. 152 (1985) ss.
7 86377 965-970. Serotyyppispesifisten ihmisen monoklonaalisten anti-p. aeruginosa-lps-vasta-aineiden tuotantoa ja immunoterapeuttista käyttöä kuvataan avoinna olevissa US-patent- 5 tihakemuksissa 734 642 ja 828 005, jotka mainitaan tässä viitteenä. Vaikka joissakin tilanteissa, kuten silloin kun infektio voidaan jäljittää yhden tietyn serotyypin aiheuttamaksi, voi olla tiettyjä etuja yhdelle P. aeruginosa- 10 serotyypille spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden käytöstä, eivät ne olisi edullisia monissa muissa tilanteissa. Esimerkiksi ihmisten mandollisten infektioiden ehkäisevissä hoidoissa olisi edullisempaa antaa yhtä tai useampaa ihmisen vasta-ainetta, joka antaa suojan useita 15 serotyyppejä vastaan. Vastaavasti terpauttisissa käyttötarkoituksissa, joissa infektoivan (infektoivien) kannan (kantojen) serotyyppiä (serotyyppejä) ei tunneta, olisi edullista antaa yhtä tai useampaa ihmisen vasta-ainetta, joka on tehokas useimpia ellei kaikkia, kliinisesti tär- 20 keitä P. aeruginosa -serotyyppejä vastaan. Vaikka teoriassa voitaisiin formuloida yhdistelmää ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, joista kukin on spesifinen yhdelle P. aeruginosa -serotyypille, suojan antamiseksi erilaisia serotyyppejä vastaan, olisi tällainen koostumus vaikea... 25 kehittää ja tuotannon kannalta katsottuna epätaloudelli- nen valmistaa. Siten on olemassa merkittävä tarve saada aikaan ihmisen monoklonaalisia anti-p. aeruginosa -vasta-aineita, joilla on kyky tunnistaa useita P. aeruginosa -serotyyppe- 30 jä ja antaa suoja niitä vastaan. Näiden vasta-aineiden tulisi lisäksi soveltua käytettäviksi P. aeruginosa -infektioiden ehkäisevään ja terapeuttiseen hoitoon. Tämä keksintö tyydyttää nämä tarpeet. Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti aktii-..:. 35 visten ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden tai niiden...:
8 86377 sitoutuvien fragmenttien valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että viljellään ihmisen B-lymfosyyteistä transformoimalla saatua jatkuvasti viljeltävissä olevaa solulinjaa ja otetaan talteen sen tuottamat mono- 5 klonaaliset vasta-aineet, jotka reagoivat spesifisesti vähemmän kuin kaikkien mutta vähintään kanden Pseudomonas aeruginosan IATS-serotyypin kanssa, ja haluttaessa eristetään niiden sitoutuvat fragmentit. Keksintö koskee myös uusia, jatkuvasti viljeltävis- 10 sä olevia solulinjoja, jotka pystyvät tuottamaan ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on kyky reagoida spesifisesti P. aeruginosan useiden, muttei kaikkien, IATS-serotyyppien kanssa. Vasta-aineet reagoivat monella tavalla Fisher-immunotyyppien kanssa ja sitoutuvat nol- 15 laan, yhteen tai useampaan immunotyyppiin. Keksinnön mukaisesti valmistettuja ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää hoidettaessa ihmistä, joka on alttiina P. aeruginosa -infektiolle tai jo saanut sen, antamalla profylaktinen tai terapeuttinen määrä koostumusta, 20 joka sisältää ainakin yhtä tällaista ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta tai sen sitoutuvaa fragmenttia, jolla on kyky ristireagoida P. aeruginosa -serotyyppien kanssa, ja joka koostumus sisältää edullisesti myös fysiologisesti hyväksyttävää kantoainetta. Koostumus voi sisältää myös 25 yhtä tai useampaa seuraavista aineista: muita ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on kyky reagoida P. aeruginosan LPS:n muiden serotyyppi- tai immunotyyppideterminanttien kanssa tai eksotoksiini r:n flagellojen kanssa; ihmisen veriplasman gammaglobuliinifraktiota ihmi- 30 sen veriplasmasta, joka saadaan ihmiseltä, jolla P. aeruginosan kanssa reagoivien immunoglobuliinien taso on kohonnut; ja yhtä tai useampaa mikrobien vastaista ainetta. Tämä keksintö tarjoaa käytettäväksi uusia soluja, jolla on kyky tuottaa ihmisen monoklonaalisia vasta-ainei-.:. 35 ta, joilla on kyky selektiivisesti tunnistaa useita
9 86377 P. aeruginosa -kantoja, jolloin yksittäiset vasta-aineet tyypillisesti tunnistavat P. aeruginosan useita IATS-serotyyppejä ja ei yhtään tai yhden tai useampia Fisher-immunotyyppejä. Kyseessä olevissa soluissa on identifioitavis- 5 sa olevia kromosomeja, joissa niiden tai esiastesolun solulinja-dna on järjestäytynyt koodaamaan vasta-ainetta, jolla on sitoutumiskohta tietyille P. aeruginosa -serotyypeille yhteiselle epitoopille. Näitä ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää monin tavoin diagnosoin- 10 ti ja terapia mukaan luettuina (so. in vivo-suoja). Tämän keksinnön mukaiset solut ovat tyypillisesti transformoituja ihmisen lymfosyyttejä, jotka tuottavat suojaavia ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita P. aeruginosan saavutettavissa olevia LPS-molekyylejä vastaan. 15 "Saavutettavissa olevalla" tarkoitetaan sitä, että LPSmolekyylit ovat fysikaalisesti saatavilla käyttöympäristössä suoraan vuorovaikutukseen monoklonaalisten vastaaineiden kanssa. Siten aikaansaadut monoklonaaliset vastaaineet ovat käyttökelpoisia P. aeruginosan aiheuttaman 20 vakavan sairauden hoitoon tai ehkäisyyn. P. aeruginosan ulomman kalvon LPS-molekyylit ovat käytettävissä suoraan kosketukseen vasta-ainemolekyylien kanssa ja mandollistavat siten organismin komplementtivälitteisen hajoamisen ja/tai fagosytoosin. Lisäksi ne LPS-molekyylit, joita le- 25 viää ulommasta kalvosta ympäristöön, ovat myös vapaita olemaan suorassa vuorovaikutuksessa vasta-ainemolekyylien kanssa ja eliminoituvat retikuloendoteliaalisen järjestelmän kautta. Yksityiskohtaisemmin kuvattuna monoklonaalisten 30 vasta-aineiden valmistus voidaan toteuttaa keksinnön mukaisesti tekemällä pysyväksi P. aeruginosan useiden serotyyppien LPS-molekyyleillä olevalle epitoopille spesifisiä vasta-aineita koodaavien nukleiinihapposekvenssien ilmentyminen. Monoklonaalisia vasta-aineita tuotetaan tyypilli-. 35 sesti transformoimalla soluohjatusti Epstein-Barr-viruk-...-
10 86377 sella (EBV:llä) B-lymfosyyttisolut, joita saadaan ihmisluovuttajista, jotka ovat tai ovat olleet alttiina yhdelle tai useammalle asianmukaiselle P. aeruginosa -serotyypille. Siten tuotettuja vasta-aineita erittäviä solulinjoja 5 luonnehditaan jatkuvasti kasvaviksi lymfoblastoidisoluiksi, joilla on diploidinen karyotyyppi, jotka ovat Epstein- Barr-tuma-antigeenipositiivisia ja jotka erittävät monoklonaalista vasta-ainetta, joka on IgG-, IgM-, IgA- tai IgD-isotyyppiä, mukaan luettuina erilaiset alatyypit, ku- 10 ten IgGl, IgG2, IgG3 ja IgG4. Itse soluohjattua transformointiprosessia kuvataan yksityiskohtaisesti US-patenttijulkaisussa 4 464 465, joka mainitaan tässä viitteenä. Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää kokonaisina tai fragmentteina, kuten Fv-, Fab- ja F(ag') 2 -fragment- 15 teina, tavallisesti kuitenkin kokonaisina. Vasta-aineina tuottavia solulinjoja voitaisiin vaihtoehtoisesti tuottaa tekemällä solufuusio sopivalla lääkkeellä merkittyjen ihmisen myelooma-, hiiren myelooma-, ihmis-hiiri-heteromyelooma- tai ihmisen lymfoblastoi- 20 disolujen ja ihmisen B-lymfosyyttien kesken, jolloin saadaan ihmishybridisolulinjoja. Tämän keksinnön mukaisilla solulinjoilla saattaa olla muutakin käyttöä kuin ihmisen monoklonaalisten vastaaineiden suora tuotanto. Solulinjoja voidaan fuusioida 25 muihin soluihin (kuten sopivalla lääkeaineella leimattuihin ihmisen myelooma-, hiiren myelooma-, ihmis-hiiri-heteromyelooma- tai ihmisen lymfoblastoidisoluihin), jolloin saadaan hybridoomia ja sitä kautta mandollisuus siirtää monoklonaalisia vasta-aineita koodaavia geenejä. Solulin- - 30 joja voidaan vaihtoehtoisesti käyttää lähteinä immunoglobuliineja koodaaville geeneille, jotka voidaan eristää ja siirtää soluihin muilla menetelmillä kuin fuusioimalla. Monoklonaalisia vasta-aineita koodaavia geenejä voidaan lisäksi eristää ja käyttää yhdistelmä-dna-menetelmien mu-..:. 35 kaisesti spesifisen immunoglobuliinin tuotantoon erilai-
11 86377 sissa isännissä. Erityisesti valmistamalla cdna-kirjastoja lähetti-rna:sta voidaan eristää yksittäinen cdna-klooni, joka koodaa immunoglobuliinia eikä sisällä introneja, ja sijoittaa tämä soveltuvaan prokaryoottiseen tai eukaryoot- 5 tiseen ilmentymisvektoriin, jolla sitten transformoidaan isäntä lopullista massatuotantoa varten. Lymfoblastoidi- tai hybridisolulinjoja voidaan kloonata ja tutkia tavanomaisin menetelmin vasta-aineilla, joilla on kyky sitoutua solusupernatanteissa havait- 10 tujen erilaisten P. aeruginosa -serotyyppien epitooppeihin.käyttämällä keksinnön mukaisesti valmistettuja vastaaineita suoja-vasta-aineina seulonnassa alan ammattimiehen hyvin tuntemien menetelmien mukaan voidaan helposti eristää lisää monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat 15 samat antigeenideterminantit tai epitoopit. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää monella tavalla myös in vitro. Esimerkkeinä mainittakoon, että monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisiin 20 tarkoituksiin, tyypitykseen, tiettyjen P. aeruginosa -kantojen eristämiseen, heterogeenisessa soluseoksessa olevien P. aeruginosa -solujen selektiiviseen poistamiseen tai vastaaviin tarkoituksiin. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja monoklo-... 25 naalisia vasta-aineita voidaan myös sisällyttää komponenteiksi farmaseuttisiin koostumuksiin, jotka sisältävät terapeuttisen tai profylaktisen määrän ainakin yhtä tämän keksinnön mukaisesti valmistettua monoklonaalista vastaainetta yhdessä farmaseuttisesti tehokkaan kantajan kans- -- 30 sa. Farmaseuttisen kantajan tulisi olla yhteensopiva, myrkytön aine, joka soveltuu monoklonaalisten vasta-aineiden viemiseen potilaaseen. Kantajana voidaan käyttää steriiliä vettä, alkoholia, rasvoja, vahoja ja inerttejä kiinteitä aineita. Farmaseuttiseen koostumukseen voidaan sisällyttää 35 myös farmaseuttisesti hyväksyttäviä apuaineita (puskuriai- :
12 86377. neita, dispergointiaineita). Tällaiset koostumukset voivat sisältää yhtä monoklonaalista vasta-ainetta, jolloin niiden on tarkoitus olla spesifisiä kandelle tai useammalle, muttei kaikille P. aeruginosa-serotyypeille. Farmaseutti- 5 nen koostumus voi vaihtoehtoisesti sisältää kahta tai useampaa monoklonaalista vasta-ainetta, jolloin muodostuu "cocktail". Esimerkiksi cocktail, joka sisältää erilaisten P. aeruginosa -serotyyppien muodostamien ryhmien vastaisia ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, olisi yleistuote, 10 joka on aktiivinen suurimman osan suhteen kliinisesti eristettyjä näytteitä, jotka sisältävät tätä nimenomaista bakteeria. Kiintoisia ovat profylaktiset ja/tai terapeuttiset monoklonaalisia vasta-aineita sisältävät koostumukset, 15 joilla on kyky reagoida ainakin kolmen, tavallisesti ainakin neljän ja tavallisimmin ainakin viiden IATS-serotyypin kanssa. Erityisen kiintoisia ovat monoklonaalisia vasta-aineita sisältävät koostumukset, jotka reagoivat vähintään noin seitsemän, edullisesti vähintään noin 20 10-14 ja jopa kaikkien 17 IATS-serotyypin kanssa. IATSserotyyppien yhteydessä koostumukset reagoivat toivotusti vähintään kanden, tavallisesti vähintään kolmen ja tavallisimmin vähintään neljän ja jopa kaikkien seitsemän Fisher -immuunityypitysjärjestelmän immunotyypin kanssa. 25 Kukin koostumus sisältää vähintään yhtä, tavallisesti vähintään kahta ja tavallisimmin vähintään kolmea vasta-ainetta, jolloin kukin vasta-aine reagoi vähintään kanden, kolmen, neljän tai useamman, muttei kaikkien IATSserotyyppien kanssa. On toivottavaa, että läsnä on aina- 3 0 kin yksi monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu vähintään kahteen IATS-serotyyppiin ja yhteen tai useampaan, edullisesti vähintään kahteen, Fisher-immunotyyppiin. On toivottavaa, että koostumuksessa olevien erilaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kokonaislukumäärä 35 on vähintään yksi ja korkeintaan noin puolet, usein 1/3
13 86377 IATS-serotyyppien, joiden kanssa koostumus reagoi, kokonaismäärästä. Eri monoklonaalinen vasta-aine-komponenttien moolisuhteiden ero on tavallisesti korkeintaan kymmenkertainen, 5 tavallisemmin korkeintaan viisinkertainen, ja kunkin vasta-ainekomponentin moolisuhde kuhunkin muuhun on yleensä noin 1:1-1:2. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavia ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää myös yhdis- 10 tettyinä muihin monoklonaalisiin vasta-ainekoostumuksiin tai jo olemassa oleviin veriplasmatuotteisiin, kuten myynnissä oleviin gammaglobuliini- ja immunoglobuliinituotteisiin, joita käytetään ihmisten P. aeruginosa -sairauden profylaktiseen tai terapeuttiseen hoitoon. Immunoglobulii- 15 nien ollessa kyseessä plasma otetaan edullisesti ihmisluovuttajista, joilla P. aeruginosan kanssa reagoivien immunoglobuliinien taso on koholla. Katso yleisesitys Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host, Amer. J. Med. 76(3a) (30.3.1984) 1-231, joka mainitaan tässä 20 viitteenä. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää erikseen annettavina koostumuksina antibioottien tai mikrobien vastaisten aineiden annon yhteydessä. Mikrobien vastaisiin aineisiin 25 voi tyypillisesti kuulua anti-pseudomonaalinen penisilliini (esimerkiksi karbenisilliini) yhdistettynä aminoglykosidiin (esimerkiksi gentamysiiniin, tobramysiiniin jne.), mutta lukuisia muitakin alan ammattimiesten tuntemia aineita (esimerkiksi kefalosporiineja) voidaan käyttää.. 30 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut ihmisen monoklonaaliset vasta-aineet ja niitä sisältävät farmaseuttiset koostumukset ovat erityisen käyttökelpoisia oraaliseen tai parenteraaliseen antoon. Farmaseuttisia koostumuksia voidaan edullisesti antaa parenteraalisesti, ts. 35 ihon alle, lihaksensisäisesti tai laskimonsisäisesti.
14 86377 Voidaan käyttää monia erilaisia vesipohjaisia kantajia, esimerkiksi vettä, puskuroitua vettä, 0,4-%i:sta suolaliuosta, 0,3-%:ista glysiiniliuosta tms. Nämä liuokset ovat steriilejä eivätkä sisällä hiukkasmaista ainesta. 5 Nämä koostumukset voidaan steriloida tavanomaisin, hyvin tunnetuin sterilointimenetelmin. Koostumukset voivat sisältää farmaseuttisesti hyväksyttäviä apuaineita, joita tarvitaan fysiologisten olosuhteiden approksimointiin, kuten ph:n säätä- ja puskuriaineita, tonisuudensäätöaineita 10 tms. kuten natriumasetaattia, natriumkloridia, kaliumklo- ridia, kalsiumkloridia, natriumlaktaattia jne. Vasta-aineen pitoisuus näissä formuloissa voi vaihdella suuresti, ts. alle noin 0,5 %:sta, tavallisesti vähintään noin 1 %:sta, jopa 15 tai 20 %:iin, ja se valitaan pääasiassa 15 valitulle antomuodolle edullisten nestetilavuuksien, vis- kositeettien jne. perusteella. Niinpä tyypillinen lihaksensisäisesti annettava farmaseuttinen koostumus voisi sisältää 1 ml steriiliä puskuroitua vettä ja 50 mg monoklonaalista vasta-ainetta. 20 Tyypillinen laskimoon tiputettava koostumus voisi sisäl- tää 250 ml steriiliä Ringerin liuosta ja 150 mg monoklonaalista vasta-ainetta. Parenteraalisesti annettavien koostumusten varsinaiset valmistusmenetelmät ovat alan ammattimiesten tuntemia tai ilmeisiä heille ja niitä kuva- 25 taan yksityiskohtaisemmin esimerkiksi teoksessa Reming- ton's Pharmaceutical Science, 15. p., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980, joka mainitaan tässä viitteenä. Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut monoklonaa- - 30 liset vasta-aineet voidaan kylmäkuivata varastointia varten ja sekoittaa takaisin sopivaan kantajaan ennen käyttöä. Tämä menetelmä on osoittautunut tehokkaaksi tavan-.. omaisten immunoglobuliinien yhteydessä ja voidaan käyttää alalla tunnettuja kylmäkuivaus- ja käyttöliuoksen sekoi-... - - 35 tusmenetelmiä. Alan ammattimiehet tietävät, että kylmäkui-......:
15 86377 vaus ja sekoitus uudelleen käyttöliuokseksi voivat johtaa vaihtelevanasteiseen vasta-aineen aktiivisuushäviöön (esimerkiksi tavanomaisten immunoglobuliinien yhteydessä IgMvasta-aineilla on taipumus kärsiä suuremmista aktiivisuus- 5 häviöistä kuin IgG-vasta-aineilla) ja että käyttömäärät saatetaan joutua säätämään tämän häviön kompensoivalla tavalla. Koostumuksia, jotka sisältävät tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja ihmisen monoklonaalisia vasta-ai- 10 neita tai niiden seoksen, voidaan antaa P. aeruginosa -infektioiden profylaktiseen ja/tai terapeuttiseen hoitoon. Terapeuttisessa käytössä potilaalle, joka on jo infektoitunut yhdellä tai useammalla P. aeruginosa -serotyypillä, annetaan riittävä määrä koostumuksia infektion 15 ja sen komplikaatioiden hoitamiseksi tai lievittämiseksi ainakin osittain. Tämän tuloksen aikaansaamiseksi riittävä määrä määritellään "terapeuttisesti tehokkaaksi annokseksi". Tähän käyttötarkoitukseen tehokkaat määrät riippuvat infektion vakavuudesta ja potilaan oman immuunijärjestel- 20 män yleistilasta, mutta ne ovat yleensä alueella noin 1-200 mg vasta-ainetta/painokilo ja yleisemmin käytetään annoksia 5-25 mg/kg. Tulee pitää mielessä, että tämän keksinnön mukaisesti valmistettavia aineita voidaan yleensä käyttää vakavissa sairaustiloissa, ts. hengenvaa- 25 rallisissa tai mandollisesti hengenvaarallisissa tilan- _ teissa, erityisesti P. aeruginosan aiheuttamissa bakteremioissa ja endotoksemioissa. Kun otetaan huomioon tämän keksinnön mukaisesti valmistetuilla ihmisen monoklonaalisilla vasta-aineilla saavutettava ulkopuolisten aineiden. 30 poissaolo ja "vieraan aineen" hylkimisten poissaolo, on : : 35 tällaisissa tapauksissa mandollista ja hoitavan lääkärin mielestä toivottavaa antaa merkittävä ylimäärä näitä vasta-aineita. Profylaktisessa käytössä keksinnön mukaisesti val- mistettua vasta-ainetta tai niiden seosta sisältäviä
16 86377 -.' 35 koostumuksia annetaan potilaalle, joka ei vielä ole P. aeruginosan infektoima, jotta parannetaan potilaan vastustuskykyä tällaisen mandollisen infektion suhteen. Tällainen määrä määritellään "profylaktisesti tehokkaaksi 5 annokseksi". Tässäkin käyttötarkoituksessa tarkka määrä riippuu potilaan terveydentilasta ja yleisestä immuunisuustilasta, mutta se on yleensä 0,1-25 mg/kg, erityisesti 0,5-2,5 mg/kg. Koostumuksia voidaan antaa hoitavan lääkärin valit- 10 semina annoksina ja hänen valitsemansa ohjelman mukaisesti. Farmaseuttisten formuloiden tulisi joka tapauksessa antaa riittävä määrä tämän keksinnön mukaisesti valmistettua yhtä tai useampaa vasta-ainetta potilaan hoitamiseksi tehokkaasti. 15 Esimerkki I Esimerkki I valaisee menetelmiä IATS-serotyyppien 2, 5 ja 16 ja Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 kanssa reagoivien ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden (IgM-isotyyppi) tuottamiseksi. 20 Ihmisen B-solujen lähteenä toimi ääreisverinäyte, joka oli saatu kystistä fibroosia sairastavalta potilaalta, jolla tiedettiin olevan krooninen P. aeruginosa -infektio. Yksitumaiset solut erotettiin verestä tavanomaisin sentrifugointimenetelmin Ficoll-Paquella [Boyum, A; Scand. 25 J. Clin. Lab. Invest. 21, Suppl. 97 (1968) 77-89) ja pestiin kandesti kalsiumista/magnesiumista vapaassa fosfaattipuskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (PBS). Yksisoluiset solut puhdistettiin T-soluista käyttämällä muunnettua E-rosettimenettelyä. Lyhyesti kuvattuna 30 solut suspendoitiin ensin pitoisuudeksi 1 x 10 7 solua/ml PBS:ään, joka sisälsi 20 % naudan sikiöseerumia (FCS), lämpötilassa 4 C. 1 ml tätä suspensiota laitettiin sitten pyöreäpohjaiseen polystyreeniputkeen, jonka mitat olivat 17 x 100 mm ja johon lisättiin 1 x 10 9 2-aminoisotiouro- niumbromidilla (AET) käsiteltyjä lampaan punasoluja, jot-
17 86377 ka olivat 10-%:isena (tilavuusprosenttia) liuoksena Iscoven muunnetussa Dulbeccon väliaineessa (Iscoven väliaineessa) [Madsen, M. ja Johnson, H.E., J. Immun. Methods 27 (1979) 61-74]. Suspensiota sekoitettiin hyvin varovasti 5 5-10 min lämpötilassa 4 C ja sitten E-rosettisolut poistettiin sentrifugoimalla 8 min Ficoll-Paquella kiihtyvyydellä 2 500 x g lämpötilassa 4 C. E-rosettinegatiiviset yksitumaiset ääreisverisolut (E -PBMC), jotka muodostivat vyöhykkeen rajapinnalle, kerättiin, pestiin kerran 10 Iscoven väliaineella ja suspendoitiin takaisin samaan väliaineeseen, joka sisälsi 15 tilavuus-% FCS:ää, L-glutamiinia (2 mmo1/1), penisilliiniä (100 µg/ml), streptomysiiniä (100/gg/m1), hypoksantiinia (1 x 10-4 mo1/1), aminopteriiniä (4 x 10-7 mo1/1) ja tymidiiniä (1,6 x 10-5 15 mo1/1). Tätä väliainetta kutsutaan tästedes HAT-väliaineeksi. E- PBMC:n soluohjattu transformointi tehtiin viljelemällä näitä soluja yhdessä transformoivan solulinjan kanssa. Transformoiva solulinja oli Epstein-Barr-tuma-an- 20 tigeenipositiivinen (EBNA-positiivinen) ihmisen lymfoblastoidisolulinja, joka oli saatettu GM 1500 -lymfoblastoidisolulinjan etyylimetaanisulfonaatti (EMS) -mutageneesilla ja sitä seuraavalla valikoinnilla 6 -tioguaniinin (30 gg/ml) läsnäollessa, jolloin soluista tuli hypoksantiini-guanii- 25 nifosforibosyylitransferaasin (HGPRT) suhteen vajauksellisia ja siten HAT:lle herkkiä. Tämä solulinja on nimetty 1A2-solulinjaksi ja talletettu the American Type Culture Collection -talletuslaitokseen (ATCC) 29. maaliskuuta 1983 ATCC-numerolla CRL 8119. Logaritmisen kasvun vaiheessa 30 olevat 1A2-solut suspendoitiin HAT-väliaineeseen ja yhdistettiin sitten E - PBMC-soluihin suhteessa kandeksan 1A2- solua/yksie -PBMC-solu. Soluseos siirrostettiin kandeksalle pyöreäpohjaiselle, 96-kuoppaiselle miktotiitterilevylle (Costar 3799) pitoisuudeksi 72 000 solua/kuoppa tilavuuden 35 ollessa 200 gl/kuoppa ja inkuboitiin lämpötilassa 37 C
18 86377 kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % CO 2 :ta. Viljelmille annettiin lisäravintoa 5. ja 8. päivänä siirrostuksen jälkeen korvaamalla puolet supernatantista tuoreella HAT-väliaineella. Soluja tarkkailtiin joka toinen päivä 5 käänteismikroskoopilla merkkien havaitsemiseksi solujen proliferaatiosta. 12 päivän kuluttua siirrostuksesta havaittiin, että 100 % kuopista sisälsi lisääntyviä soluja ja että useimmissa kuopissa soluja oli riittävän tiheässä, supernatanttien poistamiseksi ja tutkimiseksi anti-p. ae- 10 ruginosa -vasta-aineen suhteen. Supernatanteista tutkittiin anti-p. aeruginosavasta-aineiden läsnäolo käyttämällä ELISA-menetelmää [enzyme linked immunosorbent assay, Engvall, E., _55 (1977) 193-200]. Antigeenilevyt olivat tasapohjaisia, 15 96-kuoppaisia mikrotiitterilevyjä (Immulon II, Dynatech), joiden kuopat sisälsivät erilaisia kuopan pohjalle adsorboituja eläviä bakteereja. Bakteerien adsorboimiseksi muoviin inkuboitiin 50 ml/kuoppa poly-l-lysiiniä (PLL) (1 µg/ml PBS:ssä, ph 7,2) 30 min huoneen lämpötilassa. 20 Sitten adsorboitumaton PLL poistettiin, levyt pestiin kerran PBS:llä, kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 pl pestyä bakteerisuspensiota (0D 660 = 0,2) PBS:ssä ja levyjä inkuboitiin yksi tunti lämpötilassa 37 C. Adsorboitumattomat bakteerit poistettiin pesemällä levyt kolmesti Tweeniä si- 25 sältävällä fysiologisella suolaliuoksella (0,9 % NaC1, 0,05 tilavuus-% Tween-20). Tutkimuksessa käytetyt erilaiset antigeenilevyt olivat: (1) P. aeruginosa-fisher-immunotyyppien 1, 2 ja 4 seos (ATCC-nrot 27312, 27313 ja 27315); (2) P. aeruginosa-fisher-immunotyyppien 3, 5, 6 ja -. 30 7 seos (ATCC-nrot 27314, 27316, 27317 ja vastaavasti 27318); ja (3) mikrotiitterilevy ilman bakteereja. ELISA aloitettiin suojaamalla ensin levyt suojauspuskurilla [200 gl/kuoppa, PBS, ph 7,2, joka sisälsi 5 % (paino/tilavuus) rasvatonta kuivamaitoa, 0,01 tilavuus-% 35 Antifoam Aita (Sigma) ja 0,01 % (paino/tilavuus) timerosa-
19 86377 lia), käsittelyaika 60 min huoneen lämpötilassa. Suojauksen jälkeen levyt pestiin kolmesti Tweeniä sisältävällä fysiologisella suolaliuoksella. Kaikkiin kuoppiin laitettiin sitten 50 gl PBS:ää, ph 7,2, joka sisälsi 0,1 % 5 Tween-20:tä ja 0,2 % (paino/tilavuus) naudan seerumialbumiinia (BSA). Viljelylevyjen kuoppien supernatantit repiikasiirrostettiin vastaaviin antigeenilevyjen kuoppiin (50 gl/kuoppa) ja levyjä inkuboitiin 30 min huoneen lämpötilassa. Sitten supernatantit poistettiin, kuopat pestiin 10 kolmesti Tweeniä sisältävällä fysiologisella suolaliuoksella ja kuoppiin lisättiin 50 gl asianmukaisella tavalla laimennettua piparjuuriperoksidaasiin (HRP) liitettyä vuohen anti-ihmis-(igg + IgM)-vasta-ainetta (American Qualex International nro A1114 + nro A1124). Tässä esimerkissä 15 HRP-(vuohen anti-igg):n ja RP-(vuohen anti-igm):n lopullinen laimennussuhde oli 1:5 000 ja vastaavasti 1:3 000 PBS:ssä, ph 7,2, joka sisälsi 0,05 % Tween-20:tä ja 0,1 % BSA:ta. Kun oli inkuboitu 30 min huoneen lämpötilassa, ylimääräiset entsyymiin liitetyt vuohen vasta-aineet pois- 20 tettiin ja kuopat pestiin kolmesti Tweeniä sisältävällä fysiologisella suolaliuoksella. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 gl substraattia (0,8 mg/ml o-fenyleenidiamiinidihydrokloridia 100 mm sitraattipuskurissa, ph 0,5 ja 0,03 % H2 0 2 :a deionisoidussa vedessä, sekoitetaan yhtä 25 suuret tilavuudet juuri ennen levylle siirtämistä). Kun oli inkuboitu pimeässä 30 min, kaikkiin kuoppiin lisättiin 50 gl 3 N H 2 SO 4 :a reaktioiden pysäyttämiseksi. Viljelysupernatantit, jotka sisälsivät levyllä olevan antigeenin kanssa reagoivia vasta -aineita, detektoitiin vastaavissa 30 kuopissa tapahtuvan värinkehityksen avulla ja reaktion voimakkuus määritettiin kvantitatiivisesti mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 490 nm Bio-Tek EL-310-mikro- ELISA-lukulaitteella. Viljelysupernatanttien analysointi edellä kuvatulla 35 menetelmällä johti kanden kuopan (1C1 ja 2H12) identi-
20 86377 fiointiin, jotka sisälsivät anti-p. aeruginosa-vasta-aineita, jotka reagoivat Fisher-immunotyyppejä 3, 5, 6 ja 7 sisältävän levyn kanssa, mutta eivät Fisherimmunotyyppejä 1, 2 ja 4 sisältävän eivätkä bakteerittoman levyn kanssa. 5 Jotta saataisiin identifioiduksi tunnistetut yksi tai useampi nimenomainen Fisher-immunotyyppi, valmistettiin kustakin immunotyypistä antigeenilevyt, jotka sisälsivät vain yhtä Fisher-immunotyyppiä olevia PLL-kiinnitettyjä bakteereja. ELISA-kokeen tekeminen edellä kuvatulla taval- 10 la yksittäisiä immunotyyppejä sisältävillä levyillä kuopista 1C1 ja 2H12 saaduille viljelysupernatanteille osoitti, että nämä kaksi kuoppaa sisälsivät vasta-ainetta, joka oli spesifinen sekä Fisher-immunotyypille 3 että 7. Samanlainen ELISA, joka tehtiin sarjalla P. aeruginosa -IATS- 15 tyyppikantoja (saatiin ATCC:sta ja sisälsi nrot 33348-33364), osoitti, että kuopissa 1C1 ja 2H12 ollut vastaaine reagoi spesifisesti IATS-kantojen 2, 5 ja 16 kanssa. Kuopissa 1C1 ja 2H12 olleiden yhden tai useamman reagoivan vasta-aineen isotyyppi määritettiin muuten sa- 20 manlaisella ELISA-määrityksellä kuin spesifisyystesteissä, mutta HRP-(vuohen anti-ihmis-igg):tä ja HRP-(vuohen antiihmis-igm):tä käytettiin yksittäisinä toisen vaiheen reagensseina eikä yhdistettyinä. Kuoppien 1C1 ja 2H12 yhden tai useamman vasta-aineen positiivinen reaktio Fisher-im- 25 munotyyppien 3 ja 7 kanssa havaittiin vain anti-igm-rea- gensseilla, mikä osoittaa, että kunkin kuopan merkityksel- linen yksi tai useampi vasta-aine on IgM-isotyyppiä.... Sen määrittämiseksi, aiheuttiko anti-fisher-immuno- tyyppi 3 ja 7 reaktiomallin yksi vai useampi kuoppien 1C1 30 ja 2H12 vasta-aihe (ts. yksi vasta-aine, joka reagoi sekä Fishcr-immunotyypin 3 että 7 kanssa, vai kaksi vasta-ainetta, joista toinen reagoi Fisher-immunotyypin 3 ja toinen Fisher-immunotyypin 7 kanssa), viljeltiin kummankin kuopan soluja pienenä tiheytenä, ja tutkittiin lisääntyviä soluja.:. 35 sisältävistä kuopista vasta-aineaktiivisuus erillisillä._: Fisher-immunotyyppi 3 ja Fisher-immunotyyppi 7 -bakteeri-
21 86377 antigeenilevyillä. Alaviljely tehtiin 96-kuoppaisilla pyöreäpohjaisilla levyillä tiheytenä 5 solua/kuoppa kaikkiaan 100 gl:ssa HAT-väliainetta, josta puuttuu aminopteriinikomponentti (HT-väliaine). Transformoimattomia, HAT:lle 5 herkkiä lymfoblastoidisoluja lisättiin kaikkiin kuoppiin 500 solua/kuoppa syöttösoluiksi. Neljän päivän kuluttua siirrostuksesta kaikkiin kuoppiin lisättiin 100 gl HATväliainetta syöttösolujen tappamiseksi selektiivisesti. Kuoppiin lisättiin 9. päivänä siirrostuksen jälkeen lisä- 10 ravintoa korvaamalla puolet supernatantista HAT-väliaineella. Sen jälkeen kuoppiin lisättiin samalla tavalla 4-5 päivän välein HT-väliainetta, kunnes lymfoblastoidisolujen tiheys kuopissa oli riittävä supernatantin analysoimiseksi ELISA:lla. Tutkittaessa yksittäistä Fisher-im- 15 munotyypin 3 ja Fisher-immunotyypin 7 antigeenia sisältävillä levyillä kaikki supernatantit, jotka reagoivat Fisher-immunotyypin 3 kanssa, reagoivat myös Fisher-immunotyypin 7 kanssa, mikä osoittaa, että yksi vasta-aine aiheutti aktiivisuuden kummankin Fisher-immunotyypin suh- 20 teen. Tutkittaessa sattumanvaraisesti valittuja supernatantteja IATS-kantojen 2, 5 ja 16 kanssa niiden havaittiin reagoivan kaikkien kolmen kannan kanssa yksittäisten kantojen sijasta, mikä edelleen tukee sitä päätelmää, että yksi vasta-aine ristireagoi Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 -. 25 ja IATS-kantojen 2, 5 ja 16 kanssa. Kuoppien 1C1 ja 2H12 spesifistä vasta-ainetta tuottavien solujen kloonaus toteutettiin tekemällä kunkin kuopan soluille useita rajalaimennuskloonauksia, kunnes kaikki edellä mainitulla ELISA-ohjelmalla analysoidut klooni- -- 30 supernatantit antoivat tulokseksi positiivisten reaktion Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 ja IATS-kantojen 2, 5 ja 16 kanssa. Kloonauksessa käytettiin syöttösoluja edellä alaviljelyn yhteydessä kuvatulla tavalla. Tällä tavalla saatiin kaksi kloonattua, transformoitua ihmissolulinjaa (1C1.:. ' 35 ja 2H12), jotka ovat jatkuvia (kuolemattomia) ja jotka...: molemmat erittävät Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 ja IATS-
22 86377 kantojen 2, 5 ja 16 kanssa reagoivaa ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta. Tässä esimerkissä käytetään solulinjasta ja sen tuottamasta vasta-aineesta samaa merkintää. Esimerkki II 5 Esimerkki II valaisee menetelmiä IATS-serotyyppien 2, 5 ja 16 ja Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 kanssa reagoivan ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen (IgG-isotyyppi) tuottamiseksi. Tuotanto-ohjelmat ovat suurin piirtein samanlaiset kuin esimerkissä I. Lyhyesti ilmaistuna ihmisen 10 B-solujen lähteenä toimi ääreisverinäyte, joka saatiin kystistä fibroosia potevalta potilaalta, jolla oli ollut krooninen P. aeruginosa -infektio. Yksisoluiset solut erotettiin muuten esimerkissä I kuvatulla tavalla, mutta käytettiin 1,6 ml PBS-suspensiota 1,6 x 10 9 AET-käsitellyn 15 lampaan punasolun kanssa. Soluohjattu transformointi tehtiin myös samalla tavalla seuraavin poikkeuksin: 12- ja EPBMC-solujen suhde oli 7,5; käytettiin 15 levyä, joissa solutiheys oli 17 000/kuoppa; viljelmille annettiin lisäravintoa 6. ja 10. päivänä siirrostuksen jälkeen; ja 16 20 päivän kuluttua siirrostuksesta lähes kaikki kuopat sisäl- sivät lisääntyviä soluja. Spesifisten vasta-aineiden tutkiminen viljelysupernatanteista tehtiin kuvatulla tavalla ja se johti yhden kuopan (9D1) löytämiseen, joka sisälsi vasta-ainetta, joka. 25 reagoi Fisher-immunotyyppejä 3, 5, 6 ja 7 sisältävän levyn kanssa, muttei Fisher-immunotyyppejä 1, 2 ja 4 sisältävän eikä bakteerittoman levyn kanssa. Kuvatun ELISA-määrityksen tekeminen yksittäisen immunotyypin tai serotyypin bakteeriantigeeniä sisältävillä levyillä käyttämällä 9D1-vil- 30 jelmän supernatanttia osoitti vasta-aineen, joka oli spesifinen kummallekin Fisher-immunotyypille 3 ja 7 samoin kuin IATS-kannoille 2, 5 ja 16. Esimerkin I mukaisesti tehdyt jatkokokeet osoittivat, että kuopassa 9D1 havaittu vasta-ainespesifisyys liittyi yhteen klooniin, joka eritti - 35 IgG-isotyypin vasta-ainetta.
23 86377 Esimerkki III Esimerkki III osoittaa joidenkin tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen vasta-aineiden antigeenispesifisyyden. 5 Sen määrittämiseksi, reagoivatko vasta-aineet 1C1, 2H12 ja 9D1 saman antigeenikohteen kanssa ja ovatko ne siten identtisiä, tehtiin lisäkokeita. Vasta-aineita verrattiin ensin ELISA:ssa käyttämällä sarjaa referenssikantoja ja kliinisesti eristettyjä P. aeruginosa -näytteitä. 10 ELISA-ohjelma oli edellä kuvatun kaltainen seuraavin muunnoksin: 1) PLL-päällystettyjen levyjen pinnoille adsorboitujen bakteerien sijasta levyn kuopat sisälsivät erilaisia kokonaisia bakteereja, jotka oli kiinnitetty etanolilla kuopan pohjaan. Levyt preparoitiin lisäämällä kuoppiin 15 50 gl pestyjen bakteerien suspensiota (0D 660 = 0,2) PBS:ssä, sentrifugoimalla levyjä 20 min kiihtyvyydellä 500 x g, imemällä pois PBS, lisäämällä 75 gl etanolia 10 min:n ajaksi, poistamalla etanoli ja ilmakuivaamalla sitten. Antigeenilevyillä olivat IATS-kannat 2, 5, 11 ja 20 16 (ATCC-nrot 33349, 33352, 33358 ja vastaavasti 33363) ja 16 kliinisesti eristettyä näytettä, jotka oli ennalta tyypitetty sekä agglutinoimalla Difcon (Detroit, Michigan) Bacto-Pseudomonas aeruginosa -antiseerumin kanssa valmistajan ohjeiden mukaisesti että ELISA:lla (tässä kuvatulla 25 tavalla) serotyypeiksi 2, 5, 16 tai näiden serotyyppien yhdistelmäksi; 2) kanin tyypitysantiseerumeja käytettiin laimennettuina suhteessa 1:500 PBS:llä lukuun ottamatta anti-iats 16-vasta-ainetta, joka laimennettiin suhteessa 1:250. Viljelysupernatantit, jotka sisälsivät 1C1-, 2H12-30 ja 9D1-vasta-aineita, käytettiin sellaisinaan; 3) toisen vaiheen reagensseina käytettiin biotinyloitua proteiini A:ta (B-2001, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) laimennettuna suhteessa 1:500 ja biotinyloitua vuohen anti-ihmis-ig:tä (4703, Tago, Inc., Burlingame, CA) laimen- 35 nettuna suhteessa 1:500 kanin ja vastaavasti ihmisen vasta-aineiden detektointiin. 50 µ1 reagenssia lisättiin
24 86377 asianmukaisiin kuoppiin, sitoutumaton reagenssi poistettiin, kun oli inkuboitu 30 min huoneen lämpötilassa, ja kuopat pestiin kolmesti. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 gl ennalta muodostettua avidiinin ja biotinyloidun 5 piparjuuriperoksidaasin kompleksia (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Kun oli inkuboitu 30 min huoneen lämpötilassa, ylimääräinen Vectastain ABC -reagenssi poistettiin ja kuopat pestiin uudelleen kolmesti ennen substraatin lisäämistä. 10 Kuten taulukossa II esitetään, kokeen tulokset osoittivat, että vaikka vasta-aineet 1C1 ja 9D1 reagoivat jokaisen kliinisesti eristetyn näytteen kanssa, joka oli tyypitetty IATS 2, 5 tai 16 -serotyypiksi, ei vasta-aine 2H12 reagoinut kolmen tällaisen näytteen kanssa. Tämä 15 viittaa siihen, että vasta-aine 2H12 tunnisti eri epitoopin kuin 1C1 ja 9D1 ja että nämä kaksi epitooppia esiintyvät ilmeisesti rinnakkaisina useimmissa muttei kaikissa kliinisesti eristetyissä näytteissä, jotka vastaavat IATSserotyyppejä 2, 5 tai 16. 20 Taulukko II Difcon Bacto-P. aeruginosa -antiseerumien ja ihmisen monokionaalisten vasta-aineiden 2H12, 1C1 jaa 9D1 25 reagointi tyyppikantojen ja kliinisesti eristettyjen P. aeruginosa -näytteiden kanssa Tyyppikanta tai Kaniini Ihminen kliinisesti eris- 30 tetty näyte IATS IATS IATS IATS MAb MAb MAb a2 a5 a16 ali 2H12 1C1 9D1 IATS 2 + - - - + + + IATS 5 (..0 a _i_ - - + + + IATS 16 (.0 a (+) a + - + + + 35 IATS 11 - - - +
25 86377 Taulukko II jatkuu Tyyppikanta tai Kaniini Ihminen kliinisesti eristetty näyte IATS IATS IATS IATS MAb MAb MAb 5 a2 a5 a16 all 2H12 1C1 9D1 A523 + + - - + + + B406 + + (+)a - + + + C27 + + - - + + + D26 + + - - + + + 10 F155 + + + - + + + F225 + (+)a + - + + + F250 + + - - + + + F253 - + - - + + + F255 + + - - - + + 15 F256 + - - - - + + F396 + + + - + + + H217 + + + - + + + H218 + + - - + + + H219 - + - - + + + 20 H220 + + - - + + + H221 + + - - - + + (+) a = ELISA-reaktio hyvin heikosti positiivinen. 25 Tulokset viittasivat lisäksi siihen, että vastaaineiden 1C1 ja 9D1 tunnistama molekyylikohde oli todennäköisesti läsnä kaikissa kliinisesti eristetyissä P. aeruginosa -näytteissä, jotka voitiin tyypittää kuuluviksi IATS-serotyyppiin 2, 5 tai 16, kun taas vasta-aineen 2H12 30 tunnistama kohde esiintyi tällaisten eristettyjen näytteiden alaryhmässä. Sen määrittämiseksi, reagoivatko 1C1-, 2H12- ja 9D1-vasta-aineet erilaisten antigeenien vai vaihtoehtoisesti saman antigeenin eri epitooppien kanssa, jolloin 35 nämä epitoopit esiintyisivät useammissa muttei kaikissa
26 86377 IATS 2, 5 ja 16-serotyypeissä, tehtiin immunobiottausanalyysi. Koska IATS-kantojen 2, 5 ja 16 yhteinen antigeenisyys on ilmeisesti lämpöstabiilien antigeenien aiheuttama (Liu, P.V. et al., supra) ja koska lämpöstabiilisuus on 5 aiemmin mainittu lipopolysakkaridimolekyylien luontainen ominaisuus, valittiin IATS-kannoista 2, 5 ja 16 tehdyt LPS-preparaatit analysoitaviksi antigeenipreparaateiksi. Raaka-LPS valmistettiin tyyppikannoista uuttamalla fysiologisella suolaliuoksella lämpötilassa 60 C [Orskov, F. 10 et al., Acta. Path. Microbiol. Scand. Section B 79 (1971) 142-152]. Kunkin serotyypin LPS:lle (10 11g, määritettynä 2-keto-3-deoksioktonaatti(KDO) -sisällön perusteella) [Karkhanis, Y.D. et al., Anal.Biochem. 85(1978) 595-601] tehtiin natriumdodekyylisulfaattipolyakyyliamidigeeli- 15 elektroforeesi (SDS-PAGE) [Hancock, R.E.W. ja Carey, A.M., J. Bacteriol. 149 (1977) 901-910] geeliltä, jossa vallitsi pitoisuusgradientti 10 --> 20 %. Erottuneet molekyylilajit siirrettiin geeliltä nitroselluloosakalvoon (NCM) kirjallisuudessa kuvatulla tavalla [Towbin, H. et al., 20 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4354] ja NCMkalvoa suojattiin pitämällä yksi tunti Tweeniä sisältävässä PBS:ssä [Batteiger, B. et al., J. Immunol. Meth. 55 (1982) 297-307]. Sitten kalvoja inkuboitiin yksi tunti huoneen lämpötilassa 20 ml:ssa käytettyä viljelysuperna- 25 tanttia, joka saatiin solulinjasta 1C1, 2H12 tai 9D1. Kutakin NCM-kalvoa huuhdottiin 5 min Tweeniä sisältävällä PBS:llä ja inkuboitiin sitten yksi tunti 25 C:ssa alkaliseen fosfataasiin liitetyn vuohen anti-ihmis-(igg + IgA + IgM):n (Zymed) kanssa, joka oli laimennettu suhteessa 30 1:1 000 tai 1:1 500 PBS-Tween-seokseila. Kalvoja pestiin sitten 5 min PBS-Tweenissä, minkä jälkeen antigeeni-vastaainevuorovaikutukset visualisoitiin inkuboimalla kalvoja 15-20 min lämpötilassa 25 C 30 ml:ssa nitrosininentet- ratsolium/5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatti(nbt-bcip)- 35 substraattia Leary et al.'n [Proc. Natl. Acad. Sci. USA