II UR IMI ii II F I 0001 09029B (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI 109029 B SUOMI - FINLAND (FI) (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 15.05.2002 (51) Kv.lk.7 - Int.k1.7 CO7K 14/00, C12N 15/31, 15/62, A61K 39/102 // C12Q 1/04, 1/68 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 925460 PATENTTI- JA REKISTERIHALL1TUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 30.11.1992 (24) Alkupäivä - Löpdag 21.02.1991 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 30.11.1992 (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/SE91/00129 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 31.05.1990 SE 9001949 P (73) Haltija - Innehavare 1 Forsgren,Arne, Sothönsvägen 4 B, 230 11 Falsterbo, SVERIGE, (SE) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Forsgren,Arne, Sothönsvägen 4 B, 230 11 Falsterbo, SVERIGE, (SE) (74) Asiamies - Ombud: Forssen & Salomaa Oy Eerikinkatu 2, 00100 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä Haemophilus influenzaen tai siihen liittyvissä Haemophiluslajien kannoissa esiintyvän pintaproteiinin valmistamiseksi Förfarande för framställning av ett ytprotein, som finns i stammar av Haemophilus influenzae eller till denna relaterade Haemophilus arter (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer (57) Tiivistelmä - Sammandrag Uusi Haemophilus influenzaen tai siihen liityvien Haemophilus lajien pintaproteiini kuvataan. Proteiini, jota kutsutaan proteiiniksi D, on ihmisen IgD:n 1g reseptori ja sen keskimolekyylipaino on 42000. Proteiinia D voidaan havaita kaikissa tutkituissa H. influenzaen kapseloiduissa ja kapseloimattornissa eristeissä, joita on 116. Kaikista kannoista johdetulla proteiinilla on paitsi sama keskimolekyylipaino, samankaltaiset immunogeeniset ominaisuudet, koska kaikista kannoista peräisin oleva proteiini D vuorovaikuttaa kolmen eri hiiren monokloonisen vasta-aineen kanssa ja monokloonisen ihmisen IgD:n kanssa. Menetelmä proteiinin D puhdistamiseksi kuvataan. Proteiinin D geenin kloonaus H. influenzaesta E. colissa kuvataan, kuten myös nukleotidisekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi,
Ett nytt ytprotein av Haemophilus influenzae eller till denna relaterade I laemophilus arter beskrivs. Proteinet som kallas protein D är en IgD receptor för mänskligt IgD och har en medelmolekyivikt på 42000. Protein D kan detekteras i alla 116 studerade kapsylerade eller icke-kapsylerade isolat av 1-1. influenzae. Proteinet från alla stammar har utom samma medehnolekylvikt immunogena likheter då protein D från alla dessa stammar växelverkar med tre olika monoklonala mus-antikroppar och monoklonalt mänskligt IgD. Ett förfarande för rening av protein D beskrivs. Kloning av protein D genen från H. influenzae i E. coli beskrivs såväl som nukleotidsekvensen och den härledda aminosyrasekvensen.
5 Menetelmä Haemophilus influenzaen tai siihen liittyvissä Haemophiluslajien kannoissa esiintyvän pintaproteiinin valmistamiseksi Förfarande för framställning av ett ytprotein, som finns i stammar av Haemophilus influenzae eller till denna relaterade Haemophilus arter Esillä oleva keksintö liittyy pintaproteiiniin, jota kutsutaan proteiiniksi D, jota on monessa Haemophilus influenzae (Pfeifferin influenssabasillin) kannassa tai siihen liittyvissä hemofilus bakteerin lajeissa. Proteiini D on ihmisen IgD:n Ig 10 -reseptori. Useita immunoglobuliinia (Ig) sitovia bakteerisoluseinämän proteiineja on eristetty ja/tai kloonattu viimeisten kanden vuosikymmenen aikana. Näistä parhaimmin tutkittu on kultastafylokokin (Staphylococcus aureus) proteiini Aja ryhmän G beta-hemolyyt- 15 tisen (punasoluja liuottavan) streptokokin proteiini G. Proteiinin A klassiseen Fcsitovaan kykyyn sisältyy ihmisen ja useiden nisäkäslajien IgD mutta sitominen rajoittuu ihmisen IgG:n aliluokkiin 1, 2 ja 4. Myös muiden Ig:n ihmisluokkien (G,A,M,E) on osoitettu sitovan proteiinia A, jota reaktivisuutta on kutsuttu vaihtoehtoiseksi Ig -sitomiseksi, jonka Fab rakenteet välittävät ja joita esiintyy vaihtelevasti 20 erilaisissa Ig luokissa. Ryhmän G streptokokin proteiini G sitoo kaikkia ihmisen IgG:n aliluokkia ja se sitoo myös useampia eläimen IgG:n aliluokkia kuin proteiini A. Fc -osa on pääasiallisesti vastuussa vuorovaikutuksesta proteiini G:n kanssa, vaikkakin hieman vuorovaikutusta 25 myös todettiin Fab fragmenttien kanssa. Kun kyseessä on IgM, IgA ja IgD, ei kuitenkaan esiinny mitään sidontaa proteiiniin G. Sekä proteiinilla A että proteiinilla G on saavutettu monia käyttösovellutuksia immuglobuliinin erotukseen ja toteamiseen liittyen. (EP 0 200 909, EP 0 131 142, WO 87/05631, US 3,800,798, US 3,995, 018.) 30 Ryhmän A streptokokin tiettyjen kantojen tiedetään myös tuottavan IgG:tä sitovaa proteiinia, jota on puhdistettu tai kloonattu. Ig:tä sitova proteiini ryhmän A streptokokista on suhteellisen spesifinen ihmisen IgG:11e. Tietoja bakteerimolekyyleistä, jotka selektiivisesti sitovat IgA:ta ja IgM:ää, on rajoitetummin. IgA:ta sitovia proteiineja on
kuitenkin eristetty sekä ryhmän A että ryhmän B streptokokista, kaksi tavallista ihmisen tautia aiheuttavaa mikro-organismia. Ryhmän A streptokokin IgA -reseptori on nimitetty proteiiniksi Arp. Anaerobisen läpäisevän klostridi -bakteerin tietyt kannat sitovat ensisijaisesti IgM:ää mutta myös IgA:ta ja IgG:tä. Tämä sitominen riippuu 5 solun pintaproteiinista (proteiini P). Äskettäin suuresta Peptokokista eristettiin bakteeriproteiini, proteiini L, jolla on ainutlaatuiset L -ketjujen sidontaominaisuudet. Proteiinin L on osoitettu sitovan ihmisen ja useiden nisäkäslajien IgG:tä, IgA:ta ja IgM:ää. Gram-negatiivisten bakteerien joukossa Ig reseptoreita on esitetty eläinlääketieteen yhteydessä tautia aiheuttavien bakteereiden joukossa. Brusella abortus (luoma- 10 tautibasilli) sitoo härän IgM:ää ja Taylorella equigenitalis, joka aiheuttaa veneerisiä tauteja hevosessa, sitoo hevosen IgG:tä. Äskettäin ilmoitettiin, että Haemophilus somnus (Hemofilus-unibakteeri) sitoo IgG:tä. Vuosikymmen sitten osoitettiin, että Haemophilus influenzae (Pfeifferin influenssa- 15 basilli) ja Moxarella (Branhamella) catarrhalis omaa hyvän sidontakyyvyn ihmisen IgD:hen (Forsgren A. and Grubb A, J. Immunol. 122:1468, 1979). Esillä oleva keksintö kuvaa H. influenzae pintaproteiinin solubilisoinnin ja puhdistuksen, joka proteiini on vastuussa IgD:n vuorovaikutuksesta. Se kuvaa myös H. 20 influenzaen IgD:tä sitovan proteiinigeenin kloonauksen, ilmentämisen ja nukleotidisekvenssin Escherichia colissa. Sen lisäksi se kuvaa tämän proteiiniksi D kutsutun molekyylin Ig:tä sitovia ominaisuuksia, joiden havaittiin olevan erilaisia verrattuna aikaisemmin eristettyihin Ig:tä sitoviin proteiineihin. Proteiinin D havaittiin ainoastaan vuorovaikuttavan IgD:n kanssa eikä muiden ihmisen immunoglobuliiniluokkien 25 kanssa. Siten proteiini D saattaisi olla tärkeä IgD:n tutkimiseen, erottamiseen ja määrittämiseen samalla tavalla kuin proteiinia A ja proteiinia G aikaisemmin on käytetty IgG:tä varten. Proteiini D saattaisi myös yksinomaan olla arvokas väline ja yhdessä muiden molekyylien kanssa (esimerkiksi proteiinien ja polysakkaridien) immuunisysteemin stimuloinnissa sen takia, että se vuorovaikuttaa B-lymfosyyttien 30 kanssa. Proteiini D ei ole identtinen minkään aikaisemmin kuvatun H. Influenzaen proteiinin kanssa.
3 H. influenzae (Pfeifferin influenssabasilli) on tavallinen parasiitti ihmisessä ja se on tautia aiheuttava bakteeri, joka muodostaa kasvupesäkkeitä ylempien hengityselimien limakalvoihin ja aiheuttaa sairautta leviämällä paikallisesti tai tunkeutumalla. Tärkeä tekijä, joka erottaa H. influenzaen eristeet toisistaan on, että toiset koteloituvat ja toiset 5 ei. Koteloitunut H. influenzae tyyppi b on ensisijainen syy bakteerista johtuvaan aivokalvon tulehdukseen ja muihin tunkeutumistartuntoihin alle 4 vuotisissa lapsissa Euroopassa ja Yhdysvalloissa. Ei-koteloitunut (ei-tyypillinen) H. influenzae aiheuttaa harvoin tunkeutumistartunnan terveissä lapsissa ja aikuisissa, mutta on tavallinen syy lasten korvatulehduksiin ja sen on oletettu aiheuttavan sivuontelotulehduksia sekä 10 aikuisissa että lapsissa. H. influenzae -basillia on myös usein eristetty niiden potilaiden märkivistä eritteistä, joilla on rakkomainen sidekudostuminen ja krooninen keuhkoputkentulehdus ja sen on äskettäin tunnistettu olevan tärkeä syy keuhkokuumeeseen. : : 15 Rokote, joka koostuu puhtaasta tyypin B kotelomaisesta polysakkaridista, on osoittautunut olevan tehokas H. influenzae tyypin B sairautta vastaan 2-5 ikäisissä lapsissa. Koska alle kanden vuoden ikäisillä lapsilla kuitenkin on heikko vastaus tälle rokotteelle, on kehitetty yhdistelmärokotteita, joilla on parempi vastustuskykyä aikaansaava vaikutus sitomalla kotelomainen polysakkaridi kovalenttisesti tiettyihin proteiineihin 20 Konjugoimattomilla ja konjugoituneilla polysakkaridirokotteilla ei ole kuitenkaan mitään arvoa, kun ei-tyyppinen H. influenzae sairaus on kyseessä. Siksi muita solun pintakomponentteja ja varsinkin ulomman kalvon proteiineja (OMPs) on etsitty mandollisina rokote-ehdokkaina sekä tyypin b että ei-tyyppistä H. influenzae -basillia vastaan. (EP 0 281 673, EP 0 320 289.) 25 H. influenzaen ulompi kalvo on tyypillinen gram-negatiivisille bakteereille ja koostuu fosfolipideistä, lipopolysakkaridista (LPS) ja noin 24:stä proteiinista. Neljän erilaisen Haemophilus OMPs proteiinin on osoitettu olevan sellaisten vasta-aineiden kohteita, jotka suojaavat kokeellista Haemophilus -sairautta vastaan. Tähän sisältyy lämmöllä 30 modifioitavissa oleva pääasiallinen ulompi P1 kalvoproteiini, P2 poriiniproteiini, P6 lipoproteiini ja pintaproteiini, jonka näkyvä molekyylipaino on 98000 (98 K proteiini).
4 On osoitettu, että näistä ainakin vasta-aineet P2:ta vastaan suojaavat haasteilta, jotka liittyvät poikkeaviin Haemophilus kantoihin. (Loeb, M.R., Infect. Immun. 55:2612, 1987; Munson Jr, R.S. et al J. Clin. Invest. 72:677, 1983; Munson Jr, R.S. and Granoff, D.M. Infect. Immun. 49:544, 1985 and Kimura, A. et al, Infect. Immun. 5 194:495, 1985). Ei-tyyppisen H. influenzaen analyysi on osoittanut, että on merkittäviä eroja OMP:n koostumuksessa kantojen välillä (Katso esim. Murphy et al, "A subtyping system for nontypable Haemophilus influenzae based on outer membrane proteins" J Infect Dis 10 147:838, 1983; Barenkamp et al. "Outer membrane protein and biotype analysis of pathogenic nontypable Haemophilus influenzae" Infect Immun 30:709, 1983).. Jos pinta-antigeeni (immunogeeni), jota on kaikissa H. influenzaen kannoissa, voitaisiin löytää, se olisi tärkeä väline kehittäessä menetelmää tunnistaa H. influenzae 15 kliinisissä yksilöissä, kuten myös rokotteen kehittämisessä H. influenzaeta vastaan. Esillä oleva keksintö näyttää, että proteiini D, jolla on identtinen näkyvä molekyylipaino (42000), ja reagoi kolmen eri monokloonisen vasta-aineen ja ihmisen IgD:n kanssa, löydettiin kaikista tutkituista 116:sta H. influenzae kannoista (koteloituneet ja koteloimattomat), kuten myös kandesta muusta siihen liittyvästä Haemophilus lajista, 20 nimittäin H. haemolyticus ja H. aegypticus. Keksinnön mukaisen menetelmän tunnusomaiset piirteet pintaproteiinin valmistamiseksi sekä keksinnön mukaisen plasmidin tai faagin, isäntäsolun, DNAsegmentin, rekombinantti-dna-molekyylin, menetelmän fuusioproteiinin tai 25 -polypeptidin valmistamiseksi, menetelmän fuusiotuotteen valmistamiseksi, menetelmän rokotteen valmistamiseksi, hybridoomasolun, menetelmän puhdistetun vasta-aineen valmistamiseksi, menetelmän Haemophilus influenzaen tai siihen liittyvien Haemophilus-lajien havaitsemiseksi näytteestä, menetelmän Haemophilus influenzaen tai siihen liittyvän Haemophilus-lajien määrittämiseksi näytteestä, 30 menetelmän IgD:n määrittämiseksi ja menetelmän IgD:n erottamiseksi tunnusomaiset piirteet on esitetty patenttivaatimuksissa.
5 109029 Siten keksinnön mukaisesti saadaan pintaproteiini, jota on monissa Haemophilus influenzae kannoissa tai siihen liittyvissä Haemophilus lajeissa, joiden näennäinen molekyylipaino on 42000 ja joilla on kyky sitoa ihmisen IgD:tä. Keksintö käsittää 5 myös mainitun proteiinin luonnossa esiintyvät ja keinotekoisesti modifioidut muunnelmat ja myös mainitun proteiinin ja muunnelmien immunogeeniset (vastustuskykyä aiheuttavat) tai IgD:tä sitovat osat. Proteiinia kutsutaan proteiiniksi D ja sillä on aminohapposekvenssi, joka on esitetty kuviossa 9. 10 Saadaan myös aikaan plasmidi tai fagi, joka sisältää proteiinin D geneettisen koodin (perinnöllisyyskoodin) tai edellä määriteltyjen muunnelmien tai osien geneettisen koodin. Lisäksi saadaan aikaan ei-ihmisisäntä, joka sisältää edellä olevan plasmidin tai fagin 15 ja kykenee tuottamaan mainittua proteiinia tai sen muunnelmia tai sen osia. Isäntä valitaan joukosta bakteerit, hiivat tai kasvit. Tällä hetkellä edullinen isäntä on E. coli. 1. Eräs toinen keksinnön suoritusmuoto saa aikaan DNA -segmentin, joka käsittää DNA - sekvenssin, joka koodittaa proteiinia D tai sen muunnelmia tai sen osia. DNA - 20 sekvenssi on esitetty kuviossa 9... 7,I., * 25 Vielä erään suoritusmuodon mukaisesti keksinnöllä saadaan aikaan rekombinantti DNA -molekyyli, joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodittaa proteiinia D tai sen muunnelmia tai osia, joka nukleotidisekvenssi voidaan yhdistää toiseen geeniin. Plasmidi tai fagi, joka sisältää yhdistyneen nukleotidin, joka on määritelty edellä, voidaan myös rakentaa. Lisäksi sellainen plasmidi tai fagi voitaisiin sisällyttää ei-ihmisisäntään, kuten 30 bakteeriin, hiivoihin tai kasveihin. Tällä hetkellä E. coli on edullinen isäntä.
6 109029 Keksintö käsittää myös yhdstyneen proteiinin tai polypeptidin, jossa proteiini D tai sen muunnelma tai osa voidaan yhdistää toiseen proteiiniin käyttämällä rekombinantti DNA -molekyyliä, joka on määritelty edellä. 5 Lisäksi yhdistetty tuote, jossa proteiini D tai sen muunnelmat tai osat sidotaan kovalenttisesti tai muulla tavalla proteiiniin, hiilihydraattiin tai matriisiin (kuten kulta, Sephadex -hiukkaset, polymeeripinnat), voidaan rakentaa. Keksintö käsittää myös rokotteen, joka sisältää proteiinia D tai sen muunnelmia tai 10 osia. Toiset rokotemuodot käsittävät samaa proteiinia D tai sen muunnelmia tai osia yhdistettynä toiseen rokotteeseen tai yhdistettynä toisen molekyylin immunogeeniseen (vastustuskykyä aiheuttavaan) osaan. Saadaan myös aikaan risteytyssolu (Hybridoma), joka kykenee tuottamaan mono- 15 kloonista vasta-ainetta proteiinin D tai sen luonnollisesti esiintyvien tai keinotekoisesti modifioitujen muunnelmien vastustuskykyä aikaasaavalle osalle. Lisäksi saadaan aikaan puhdistettu vasta-aine, joka on spesifinen proteiinin D tai sen luonnossa esiintyvien tai keinotekoisesti modifioituj en muunnelmien immunogeeniselle 20 osalle (vastustuskykyä aiheuttavalle osalle). Tätä vasta-ainetta käytetään menetelmässä Haemophilus influenzaen tai siihen liittyvän Haemophilus lajin läsnäolon määrittämiseksi, näytteessä, saattamalla mainittu näyte kosketukseen vasta-aineen kanssa indikaattorin läsnäollessa. 25 Keksinnöllä saadaan myös aikaan menetelmä Haemophilus influenzaen läsnäolon määrittämiseksi tai siihen liittyvän Haemophilus lajin määrittämiseksi näytteessä saattamalla mainittu näyte kontaktiin DNA näytteen tai primeerin kanssa, joka on laadittu vastaamaan nukleiinihappoja, jotka koodittavat proteiinia D tai sen luonnossa esiintyviä tai keinotekoisesti modifioituja muunnelmia tai mainitun proteiinin im- 30 munogeenista (vastustuskykyä aiheuttavaa) tai IgD -sitovaa osaa.
7 Proteiinia D tai mainittuja muunnelmia tai osia käytetään myös menetelmässä IgD:n määrittämiseksi. Sellaisessa määritysmenetelmässä proteiini voidaan merkitä tai sitoa matriisiin. 5 Lopuksi keksintö käsittää menetelmän IgD:n erottamiseksi käyttämällä proteiinia D tai mainittuja muunnelmia tai osia, jotka valinnaisesti on sidottu matriisiin. MATERIAALIT JA MENETELMÄT 10 Bakteerit. 15 116 H. influenzae kantaa, jotka edustavat serotyyppejä a-f ja ei-tyyppisiä ja sen lisäksi bakteerikantoja, jotka edustavat 12 lajia, jotka liittyvät H. influenzaeen, saatiin eri laboratorioista Tanskasta, Ruotsista ja USA:sta. Viljelyolosuhteet R : Kaikkia Haemophilus-, Ekinella- ja Acinobasillus -kantoja kasvatettiin suklaa-agarilla.! : H. ducrey kasvoi mikrohappiatmosfäärissä lämpötilassa 37 EC ja kaikki muut lk 4 14 11 20 Haemophilus kannat atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % CO 2. 30 H. influenzae eristettä kasvoi myös yön yli lämpötilassa 37 EC aivo-sydän nnesteruiskeessa (Difco Lab., Inc. Detroit, Mi.) jota oli täydennetty nikotiiniamidiadeniininukleotidillä ja hemiinillä f * (Sigma Chemical Co. St. Louis, Mo.), josta konsentraatiossa 10 µg/ml. t 0 0 t 25 Immunoglobuliinit ja proteiinit 1 IgD jättisolukasvainproteiinia neljästä eri potilaasta puhdistettiin, kuten on kuvattu II (Forsgren, A. ja Grubb, A., J. Immunol. 122:1468, 1979). Kandeksan erilaista ihmisen IgG jättisolukasvainproteiinia, jotka edustivat kaikkia neljää aliluokkaa ja molempia 30 L -ketjutyyppejä, kolme eri IgM jättisolukasvainproteiinia ja yksi IgA jättisolukasvainproteiini eristettiin ja puhdistettiin standardimenetelmien mukaisesti.
8 Ihmisen polykloonista IgG, seerumialbumiinia ja plasminogeenia saatiin yhtiöstä Kabi Vitrum AB, Tukholma, Ruotsi ja ihmisen IgE:tä saatiin yhtiöstä Pharmacia IgE RIACT kit (Pharmacia Diagnostic AB, Uppsala, Ruotsi). Härän seerumialbumiinia, ihmisen ja härän fibrinogeenia ja ihmisen transferiinia tilattiin tai saatiin lahjana. 5 125 1-IgD sidontakoe Sidontakoe suoritettiin muoviputkissa. Lyhyesti sanottuna 4 x 108 bakteerisolua 100 gl:ssa fosfaattipuskurisuolaliuosta (PBS) lisäämällä 5 % ihmisen seerumialbumiinia 10 (HSA) sekoitettiin 100 gl:aan 125IgD samassa puskurissa (radioaktiivisuus säädettiin olemaan 7-8 x 104 cpm, s.o. noin 40 ng). Noin 0,5 viljelyn jälkeen lämpötilassa 37 EC, 2 ml jääkylmää PBS (sisältäen 0,1 % Tween 20) lisättiin putkiin. Suspensio sentrifugoitiin arvossa 4,599 xg 15 min ja kelluva faasi imettiin pois. 15 Bakteeripellettiin jäänyt radioaktiivisuus mitattiin gammalaskijassa (LKB Wallac Clingamma 1271, Turku, Finland). Jäännösradioaktiivisuus viljelyseoksista, jotka eivät sisältäneet bakteereita, s.o. tausta, oli 2,5 prosenttia. Testattiin aina kolme näytettä ja jokainen koe toistettiin ainakin kaksi kertaa, jos ei muuta ilmoiteta. 20 Monoklooniset vasta-aineet Siitettyjä naarashiiriä BALB/c (iältään 8-14 viikoa) immunisoitiin suonensisäisellä ruiskulla 25 ig:lla puhdistettua proteiinia D (25 gg/50 gl) Freundin täydellisessä apuaineessa (300 gl), jonka jälkeen seurasi kaksi suonensisäistä ruiskua proteiinia D 25 (15 gg) Freundin epätäydellisessä apuaineessa (300 gl) 3 ja 7 viikkoa myöhemmin. Viikolla 9 hiiriltä otettiin verta hännistä, seerumi erotettiin ja sen proteiinia D vastustava vaikutus testattiin entsyymiin liitetyllä immuuniimuanalyysillä (ELISA). Parhaan vastauksen antavaa hiirtä tehostettiin suonensisäisellä ruiskulla proteiinia D (2 g) 150 gl:ssa PBS. Yksi päivä viimeisen ruiskun jälkeen perna poistettiin ja 30 pernan solut valmisteltiin monokloonisten vasta-aineiden tuotantoa varten (De St Groth SF, Scheidegger SJ J Immunol Methods 35:1, 1980). 10-14 päivän jälkeen
tta. 109029 9 (keskimäärin 12 päivän jälkeen) testattiin, tuottiko ristetytys vasta-aineita proteiinia D vastaan entsyymiin liitetyllä immunoimuanalyysillä (ELISA), ja hybridit, jotka tuottivat vasta-aineiden suuremmat titterit, kloonattiin ja niitä laajennettiin viljelemällä RPMI -väliaineessa, joka sisälsi 10 % härän sikiön seerumia. Yhteensä 68 kloonia, 5 jotka tuottivat vasta-aineita proteiinille D, saatiin. Kolme ristetytystä valittiin kasvamaan lisää samassa väliaineessa. Kaikki solulinjat jäädytettiin dimetyylisulfoksidin läsnäollessa ja 90 %:sen härän sikiöseerumin läsnäollessa nestemäisessä typessä. ' 000. 0:0 4O d: talot. SDS-PAGE ja proteiinin D määritys kalvoissa 10 SDS-PAGE valmistettiin käyttämällä modifioitua Laemmli -geeliä ja ajettiin menetelmän Lugtenberg et al., (FEBS Lett 58:254, 1975) mukaisesti käyttämällä 11 %:sta akryyliamidin kokonaiskonsentraatiota. H. influenzaen j a siihen liittyvien bakteerilaji en raa'an sarkosyyliraakauutteiden näytteitä esikäsiteltiin 5 minuutin keittämisellä 15 näytepuskurissa, jonka koostumus oli 0,06 M trisvetykloridia (ph 6,8), 2 % (p/t) SDS, 1 % (t/t) 13-ME, 10 % glyserolia ja 0,03 % (p/t) bromifenolisinistä. Sähköforeesi suoritettiin huoneen lämmössä käyttämällä PROTEIININ II pystysuoria paksuja sähköforeesisoluja (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) arvossa 40 ma:n per geelivakiovirta. Proteiinien värjääminen geeleissä tehtiin comassie brilliant sinisellä 20 metanolin, etikkahapon ja veden seoksessa olennaisesti, kuten on kuvannut Weber and Osborn (J. Biol. Chem. 244:4406, 1969). Proteiininauhat siirrettiin myös nitroselluloosakalvoille (Sartorius, West Germany) sähköforeesisiirrolla SDS-polyakryyliamidigeeleistä. Sähköforeesisiirto suoritettiin Trans-Blot solussa (Bio-Rad) jännitteessä 50 V 90 minuuttia. Elektrodipuskuri oli 0,025 M Tris, ph 8,3, 0,192 M glysiiniä ja 20 25 % metanolia. Kalvoja pestiin sitten tunnin huoneen lämmössä 1,5 % ovalbumiini-tris tasapainotetulla suolaliuoksella (OA-TBS), ph arvossa 7,4 lisäsidospaikkojen tyydyttämiseksi. Usean pesun jälkeen Tris tasapainotetulla suolaliuoksella (TBS) kalvoja haudottiin yön 30 yli huoneen lämmössä 1 %:11a OA-TBS puskurilla, joka sisälsi IgD (20 gg/m1) IgD sidosnauhojen määrittämiseksi, sitten pestiin kaksi kertaa TBS:llä.
11 1 109029 10 Kalvoja haudottiin sitten peroksidaasiin konjugoidun vuohen ihmisen vastaisen IgD:n kanssa (Fc) (Nordic Immunology, Tiiburg, The Nethrlands) 1-2 tuntia huoneen lämmössä; useiden pesujen jälkeen Tween-TBS:llä kalvot kehitettiin 4-kloori-1- naftolilla ja vetyperoksidilla. Proteiini D tunnistettiin myös käyttämällä proteiinin D 5 vastaisia hiiren monokloonisia vasta-aineita 16C10, 20G6 ja 19B4 1 %:sen OA-TBS 1:50 laimennuksella. H. influenzaen proteiini 1 ja 2 tunnistettiin käyttämällä hiiren P2 vastaista monokloonista 9F5 (Dr. Eric J. Hansen, Dallas, Texas, USA) 1:1000 laimennuksella ja kanin P 1 -vastaisella seerumilla (Dr. Robert S. Munson, St. Louis, Mo, USA) 1:200 laimennuksella. 10 Proteiinin D solubilisointi ja puhdistus H. influenzaesta Lyhyesti ottaen 3 g bakteereita suspensoitiin 10 ml:aan 10 mm HEPES Tris puskuria (ph 7,4) sisältäen 0,01 M EDTA ja sonikoitiin (johdettiin ääntä) kolme kertaa äänen 15 aiheuttajassa 1 minuutti samalla kun jäähdytettin jäähauteessa. Seuraamalla sonikointia (äänen johtamista) sarkosyyliä (natriumlauryylisarkosinaatti) lisättiin lopulliseksi 1 %:ksi konsentraatioksi (p/t). Suspensioita hauhdottiin huoneen lämmössä 1 h käyttämällä ravistaj aa ja sitten sonikoitiin (johdettiin ääntä) taas 2 x 1 min jäässä ja jälleenhaudottiin huoneen lämmössä 30 min. Sentrifugoinnin jälkeen paineessa 12000 20 g 15 minuuttia lämpötilassa 4 EC kelluva faasi haravoitiin ja jälleensentrifugoitiin arvossa 105000 g 1,5 h lämpötilassa 4 EC. Sarkosyyliuutteet, jotka valmistettiin H. influenzaesta, kannasta NT 772, kuten kuvattiin yllä, laitettiin SDS-PAGE:lle. Sähköforeesin jälkeen kapeita geeliliuskoja 25 leikattiin, proteiini siirrettiin kalvoihin ja IgD:tä sitova nauha määritettiin Western täpläkokeella käyttämällä IgD:tä ja peroksidaasiin sidottua vuohen ihmisen vastaista IgD:tä, kuten edellä on kuvattu (Katso SDS-PAGE ja proteiinin D määritys kalvoissa). Vertaamalla IgD:tä sitovaan nauhaan kalvossa (Western blot) sopiva nauha geelissä voitiin tunnistaa ja leikata pois. IgD sitovien molekyylien (proteiini D) 30 sähköforeesieluointi suoritettiin ja SDS poistettiin proteiinista, joka sisälsi liuosta, saostamalla kaliumfosfaattipuskurissa käyttämällä Susukin ja Teradan menetelmää
11 (Anal. Biochem. 172:259, 1988). Lisättiin kaliumfosfaattia 20 mm lopullisessa konsentraatiossa ja hautomisen jälkeen lämpötilassa 4 EC yön yli SDS saos poistettiin sentrifugoimalla arvossa 12000 g. Sen jälkeen kaliumsisältö säädettiin arvoon 60 mm ja 4 tunnin jälkeen lämpötilassa 4 EC sentrifugointi suoritettiin kuten edellä. Lopuksi 5 kelluva faasi väkevöitiin ja laaja dialyysi suoritettiin. Piste-täpläkoe Proteiineja levitettiin nitroselluloosakalvoille (Schleicher & Schuell, Dessel, West 10 Germany) manuaalisesti käyttämällä piste-täplälaitetta (Schleicher & Schuell). Kyllästämisen jälkeen kalvoja hauhdottiin yön yli huoneen lämmössä 1 %:ssa 0A- TBS liuoksessa, joka sisälsi 1251 merkittyä proteiininäytettä (5-10 x 10 5 cpm/ml), pestiin neljä kertaa TBS liuoksella, joka sisälsi 0,02 Tween-20, kuivattiin ilmalla ja tehtiin autoradiografia lämpötilassa -70 EC käyttämällä Kodak CEA.0 röntgensädefil- 15 mejä ja Kodak X-Omat tavanomaista vahvistavaa suodatinta (Eastman Kodak, Rochester, NY). Aminohapposekvenssianalyysi II 20 Automatisoitu aminohapposekvenssianalyysi suoritettiin Applied Biosystems 470A kaasu-neste kiinteä faasi sekvenssilaitteella (A) vapautuneen aminohapon fenyylitiohydantoiinij ohdannaisten on-line määrityksellä, jonka toimitti Applied Biosystems Model 120A PTH Analyzer. 25 Bakteerikannat, plasmidit, baketriofagit ja väliaineet, joita käytettiin proteiinin D kloonaamiseen H. influenzae, ei-tyyppinen kanta 772, biotyyppi 2, eristettiin nenänielun vanutuposta lääketieteellisen mikrobiologian osastolla, Malmön yleisessä sairaalassa, Lundin 30 yliopistossa, Ruotsissa. E. coli JM83 -kantaa käytettiin plasmidien puc18 ja puc19 ja niiden johdannaisten vastaanottajana. E. coli:n kantoja JM101 ja JM103 käytettiin
12 isäntinä bakteriofageille M13mp18 ja mpl9. H. influenzae basillia viljeltiin aivosydännesteliuoksessa (Difco Lab., Inc. Detroil, Mi.), jota on täydennetty NAD:llä (nikotiiniadeniinidinukleotidillä) ja hemiinillä (Sigma Chemical Co., St. Liuos, Mo.), kumpaakin konsentraatiossa 10 gg/ml. E. colin kantoja kasvatettiin L -liemessä tai 5 2 x YT väliaineissa. L -agari ja 2 x YT agari sisälsi lisäksi 1,5 g agaria per litra. L lientä ja L agaria täydennettiin silloin kuin ilmoitetaan ampisilliinilla (Sigma) konsentraatiossa 10 gg/ml. DNA -valmistukset 10 Kromosomi -DNA:ta valmistettiin H. influenzae kannasta 772 käyttämällä Berns ja Thomas modifioitua menetelmää (J Mol. Biol. 11:476, 1965). Uutosvaiheen jälkeen liuoksella fenoli:kloroformi:isoamyylialkoholi (25:24:1) DNA saostettiin etanolilla. DNA liuotettiin liuokseen 0,1 x SSC (1 x SSC x 0,15 M NaC1 ja 15 0,015 M natriumsitraattia) ja käsiteltiin RNase:lla 2 tuntia lämpötilassa 37 EC. RNase poistettiin kandella kloroformi:isoamyylialkoholin seoksella (24:1). DNA nauhoitettiin ScCI-etidiinibromidi tasapainogradientissa... Ot.. a y Plasmidi -DNA ja fagin M13 toistettu muoto bakteerista E. coli JM101 saatiin 20 alkaalisella liuotusmenetelmällä, jonka jälkeen puhdistettiin lisää CsC1 etidiinibro- midigradientissa. Joissakin tapauksissa plasmidi -DNA:ta valmistettiin Quiagen plasmidi -DNA:n kittiä (Diagen GmbH, Dösseldorf, FRG). käyttämällä Yksisäikeistä (ss) DNA:ta fagin M13 klooneista valmistettiin yhtäläisistä täplistä 25 (Messing, J. Meth. Enzymol 101C:20, 1983). Proteiini -D geenin molekyylikloonaus 30 H. influenzaen perimäkirjasto tehtiin lähtien 40 gg:sta H. influenzae kantaa 772 DNA, joka osittain merkittiin 1,2 yksiköllä Sau3A tunniksi lämpötilassa 37 EC. Halkaistu DNA fraktioitiin sakkaroosigradientille (Clark-Curtiss, J.E. et al., J. Bacteriol.
13 161:1093, 1985). Fraktiot, jotka sisälsivät sopivan kokoisia DNA fragmentteja (2-5 kiloperusparia (kbp)) yhdistettiin ja DNA sidottiin defosforyloituun BamHI:lla merkittyyn puc18 plasmidiin standardiolosuhteissa (Maniatis, T. et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 1982). Sidosseos siirrettiin komponenttiin E. coli JM83 5 korkeajännite-sähköforeesilla Gene Pulser TM kontrollilaitteella molemmat yhtiöstä Bio-Rad Lab. (Richmond, CA). Bakteerit laitettiin levyihin L agariin ja täydennettiin ampisilliinilla ja X-geelillä (5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-13-D-galaktopyranosidi)..... G 1 r *. 0 o 9 Viljelmän imuunikoe 10 Viljelmän immuunikoetta varten E. coli muunnelmia viljeltiin yön yli L -agarilla, siirrettiin nitroselluloosasuodattimille (Sartorius GmbH, Göttingen, FRG) peittämällä agaripinnat kuivilla suodattimilla. Levyt jätettiin 15 minuutiksi ennenkuin suodattimet poistettiin ja ne altistettiin kyllästetylle kloroformihöyrylle 15 minuuttia. Jäljellä olevat 15 proteiinin sidospaikat suodattimessa tukittiin hautomalla suodattimia Tris tasapainoitetulla suolaliuoksella, joka sisälsi muna-albumiinia 30 minuuttia (TBS-ova; 50 mm Tris-HC1, 155 mm NaC1, 1,5 % ova.; ph 7,4). Tukkimisen jälkeen suodattimia haudottiin vuorostaan (i) viljelmän kelluvilla faaseilla, jotka sisälsivät hiiren monokloonista vasta-aineita (MAbs), jotka kohdistettiin proteiiniin D laimennuksella 20 1:10 TBS-ovassa, (ii) hevosretiisiperoksidaasiin konjugoidulla kanin hiirenvastaisella IgGs:llä (DAKOPATTS AIS, Glostrup, Denmark) TBS-ovassa laimennuksella 1:2000 TBS-ovassa ja (iii) 4-kloori- 1 -naftolilla ja H 202:11a. Suodattimet pestiin 3 x 10 minuuttia pesupuskurissa (TBS-0,05 % Tween 20) jokaisen vaiheen välillä. Kaikki hautomiset tehtiin huoneen lämmössä. 25 Viljelmien IgD -sidonta tarkistettiin myös hautomalla muita suodattimia puhdistetulla ihmisen jättisolukasvain IgD:llä, kanin ihmisvastaisella IgD:llä (5 ketjut) (DAKOPATTS) hevosretiisiperoksidaasiin konjugoidulla vuohen kanin vastaisella IgS:llä (BIo-Rad Lab.) ja 4-kloori- 1 -naftolilla ja H 202 :11a kuten edellä. 30
14 Restriktioendonukleaasianalyysi ja DNA käsittelyt Plasmidi ja fagi DNA merkittiin restriktioendonukleaaseilla valmistajien ohjeiden mukaisesti (Boehringer Mannheim mbh, Mannheim, FRG ja Beckman 5 Instruments, Inc., England). Restriktioentsyymifragmentit alikloonausta varten visualisoitiin pitkän aallonpituuden UV-valolla ja poistettiin 0,7-1,2 %:sta agaroosigeeleistä (Bio-Rad), jotka sisälsivät 0,5 % etidiinibromidia. DNA nauhat uutettiin GenecleanTM kitillä (BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.), kuten tuottaja suositteli. 10 Sidonnat suoritettiin 14 DNA ligaasilla (Boehringer Mannheim) standardiolosuhteissa (Maniatis ei al., 1982). Sidosliuoksia käytettiin siirtämään oikeita E. coli soluja. 0 1.... Rekombinanttiplasmidin phic348 progressiiviset poistot sekvenssimenetelmää varten tuotettiin vaihtelemalla KpnI-BamHI avatun plasmidi -DNA:n eksonukleaasi III 15 merkintäaikaa (Henikoff, S. Gene 28:351, 1984). Tuloksena saadun yksisäkeisten päiden poistamiseksi, käytettiin pavun nukleaasia. Molempia nukleaasia saatiin yhtiöstä Bethesda Research Laboratories Inc. (Gathersburg, Md.). 20 Proteiinin D uutto E. colista S e, r 1k e a r : E. colin soluja, jotka ilmaisivat proteiinia D, kasvatettiin L liemessä, jota oli täydennetty ampisilliinillä aikaiseen logaritmiseeen faasiin ja sitten niille annettiin osmoottinen shokki. Solujen solulimaosan poistamisen jälkeen solut liuotettiin NaOH:lla 25 (Russel, M. and Model, P., Cell 28:177, 1982) ja solulimaosa erotettiin kalvo-osasta sentrifugoimalla. Solulimaproteiinit saostettiin 5 %:sella trikloorietikkahapolla.
15 DNA sekvensointi ja sekvenssin muokkaukset Nukleotidisekvenssi määritettiin suoralla alikloonien plasmidisekvensoinnilla (Chen, E.Y. and Seeburg, P.H. DNA 4:165, 1985) ja plasmidin phic348 johdannaisten 5 poistamisella käyttämällä ketjupäätemenetelmää a[ 35 S]-dATP (Amersham) ja SequenaseTM, versio 2 (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) seuraamalla toimittajan ohjeita. Osa sekvensoinnista tehtiin yksisäikeisellä M13 DNA:11a, johon on sisällytetty osia, jotka on johdettu phic348:sta. Autoradiografia suoritettiin Fuji röntgensädefilmillä. 10 TULOKSET Proteiinin D jakautuminen Haemophilus influenzaessa : : : 15 Kerätyistä viljelmistä saatua kaikkiaan 116 H. influenenzae kantaa, jotka äskettäin oli eristetty nenänielun vanutupoista valittiin IgD-sidoskokeita varten. Yksitoista kantaa olivat koteloituja, jotka edustivat serotyyppejä a-fja 105 kantaa olivat koteloimattomia (ei-tyyppisiä). Nämä 105 kantaa kuuluivat biotyyppiin I (21 kantaa), biotyyppiin II (39 kantaa), biotyyppiin III (14 kantaa), biotyyppiin IV (2 kantaa) ja biotyyppiin I (5 20 kantaa). Koteloimattomista kannoista 31:11e ei määritetty biotyyppiä (NBT), mutta sen IgD sidonta testattiin. Noin 4 x 10 8 cfu H. influenzae bakteereita, jotka olivat kasvaneet suklaa-agarilla sekoitettiin ja haudottiin yhdessä 40 ng:n radioaktiivisuusmerkityn ihmisen jättisolu- 25 kasvaimen IgD:n kanssa. Sen jälkeen suurempi PBS -tilavuus (2 ml), joka sisälsi Tween 20 lisättiin, bakteereita kiidettiin alaspäin ja pellettien radioaktiivisuus mitattiin. Kaikki H. influenzaen eri eristeet sitoivat IgD:tä erittäin hyvin (38-74 %) (Fig. 1). Koteloidun H. influenzaen eri serotyyppien (a-f) IgD sidoskyvyssä ei ollut eroa. Eri koteloimattomien kantojen eri biotyyppien välillä ei myöskään ollut eroja. 30 kantaa 30 edustaen erilaisia sero- ja biotyyppejä kasvatettiin myös aivo-sydännesteruiskeessa. Kun näitä bakteereja, jotka kasvoivat nesteväliaineessa verrattiin samoihin
16 bakteereihin, jotka olivat kasvaneet suklaa-agarissa, ei voitu havaita mitään eroja niiden IgD sidoskyvyssä. Proteiinia D solubilisoitiin kaikista 116 H. influenzae kannoista johtamalla ääntä ja 5 sarkosyylin uutolla. Sen jälkeen uutteet, jotka sisälsivät proteiinia D, altistettiin SDS- PAGE:lle. Proteiinit värjättiin tai merkittiin sähköllä nitroseulloosakalvoille ja koestettiin ihmisen IgD jättisolukasvainproteiinilla ja kolmella erilaisella hiiren monokloonisella vasta-aineella, jotka tunnistavat proteiinia D. Useita proteiininauhoja voitiin määritellä kaikissa SDS geeleissä, mutta uutteiden sähköforeesi kaikista H. 10 influenzae eristeistä antoi proteiininauhan, jonka näennäinen molekyylipaino oli 42000 (42 kilodaltonia). IgD ja myös kaikki kolme proteiinin D vastaista monokloonista vasta-ainetta (16C10, 20G6 ja 19B4), jotka oli sidottu samaan nauhaan kaikkien uutteiden sähköforeesin jälkeen ja sen jälkeinen siirto kalvoille ja merkintä. 15 12 eri lajin bakteerikannan, jotka taksonometrisesti liittyvät H. influenzaeen (H. ducreyi, H. paraphrophilus, H. parasuis, H. parainfluenzae, H. haemolyticus, H. parahaemolyticus, H. aphrophilus, H. segnis, H. aegypticus, H. harmoglobinophilus, E. corrodens, A. actinomycetemcomitans) kykyä sitoa 125I merkittyä ihmisen IgD:tä testattiin. Samoin bakteereista testattiin myös sakrosyyliraakauutteet Western blot 20 analyysillä IgD:llä ja kolmella proteiinin D vastaisella monokloonisella vasta-aineella (MAbs 16C10, 20G6, 19B4). * Kaikista testatuista kandestatoista lajista, ainoastaan H. haemolyticus (5/5 kantaa) ja H. Aegypticus (2/2 kantaa) sitoivat radioaktiivisuusmerkittyä IgD:tä, 21-28 % ja 25 vastaavasti 41-48 % suorassa sidosanalyysissä (Fig. 2). Western blot analyysissä IgD ja kaikki kolme monokloonista vasta-ainetta määrittävät yhden ainoan nauhan, jonka näennäinen molekyylipaino oli 42000 (42 kilodaltonia). Mikään 6 kannasta, jotka olivat H. paraphrophilus, 11 H. parainfluenzae, 8 H. 30 aphrophilus ja 3 A. actinomycetemcomitans, ei sitonut radioaktiivisuusmerkittyä IgD:tä suorassa sidoanalyysissä tai reagoinut IgD:n kanssa Western blot analyysissä.
17 Kaikkien näiden kantojen uutteet reagoivat kuitenkin kanden tai kolmen monokloonisen vasta-aineen kanssa Western blot analyysissä ja ilmeni yksi ainoa 42 kilodaltonin proteiininauha. E. corrodensin kolmen kannan Western biot analyysi antoi yhden ainoan korkeamolekyylipainoisen nauhan (90 kilodaltonia MAb 16C10:11a 5 kaikissa kolmessa kannassa. Yhden kannan uutteessa, havaittiin yksi ainoa 42 kilodaltonin nauha kanden muun monokloonisen vasta-aineen kanssa. Kaksi H. ducreyin kantaa, H. parasuis (2 kantaa), H. parahaemolyticus (2 kantaa), H. sengius (2 kantaa), H. haemoglobinophilus (1 kanta) ei sitonut radiomerkittyä IgD:tä suorassa sidosanalyysissa ja sarkosyyliuutteet samasta bakteerista ei antanut mitään prote- 10 iininauhaa, jota voitiin havaita IgD:llä tai kolmella monokloonisella vasta-aineella. Proteiinin D solubilisointi " 11 1 H. influenzaen kolme eri kantaa (kaksi ei-tyyppistä kantaa, 772 ja 3198 ja yksi B 15 tyyppinen, Min A.) kasvoi yön yli liemessä. Tehtiin yrityksiä solubilisoida proteiini D hyvin tunnetulla menetelmällä H. influenzaen ulomman kalvoproteiinin eristämiseksi johtamalla ääntä poistamalla solun jätteet sentrifugoinnilla ja uuttamalla kelluva osa sarkosyylillä, jonka jälkeen tehtiin ultrasentrifugointi (Barenkamp SJ and Munson RS J Infect Dis 143:668, 1981). Pelleteille (solun jäte) (d) ja kelluville osille (s) äänen 20 kohdistamisen jälkeen, kuten myös pelleteille (p) ja kelluville osille (ss) sarkosyylikäsittelyn ja ultrasentrifugoinnin jälkeen tehtiin SDS-PAGE. Proteiinit värjättiin tai merkittiin sähköllä Immobilon kalvoille ja koestettiin ihmisen IgD jättisolunkasvainproteiinilla, jonka jälkeen haudottiin peroksidaasiin konjugoidulla ihmisen IgD vastaisella vasta-aineella ja substraatilla. Kuten on esitetty kuviossa 3, äänen johdatus- 25 menetelmä solubilisoi tehokkaasti proteiineja, jotka sisältävät proteiinia D. IgD:tä sitovia molekyylejä (proteiinia D) voitiin kuitenkin myös havaita solun jätteissä, s.o. ei solubilisoitunut ääntä johtamalla. IgD:tä sitovien molekyylien saanti kelluvassa osassa vaihteli eri kokeissa. Kuvio 3 osoittaa myös, että proteiinia D useimmiten voitiin havaita sarkosyyliin liukenevassa kelluvassa faasissa ultrasentrifugoinnin 30 jälkeen. Sitä vastoin aiemmin kuvatut H. influenzaen ulommat kalvoproteiinit (proteiinit 1-6) helposti solubiloisoituvat johtamalla ääntä ja niitä kutsutaan sarkosyyli-
18 liukenemattomiksi. Proteiinin D saannin parantamiseksi kokeiltiin useita uuttomenetelmiä. Peräkkäisissä kokeissa bakteerisoluihin johdettiin ääntä ja koko solun suspensioon johdettiin ääntä 5 ja uutettiin erilaisissa pinta-aktiivissa aineissa (sarkosyyli, NP-40, Triton X-100 ja Tween 80). Solun jäte poistettiin sentrifugoimalla (12000 g) ja kelluva osa ultrasentifugoitiin. Näin saatu solun jäte (d), kelluva osa (s) ja pelletit (p) analysoitiin SDS- PAGE:lla, laitettiin sähköllä kalvoille ja sen jälkeen koestettiin IgD:llä. Kuten on esitetty kuviossa 4, sarkosyylikäsittely solubilisoi tehokkaasti proteiinia D jättämättä 10 paljon jäljelle solun jätteeseen ja pellettiin. NP-40, Triton X-100 ja Tween-80 solubilisoi proteiinia D tehottomammin. Yritettiin myös solubilisoida proteiinia D bakteereista lysotsyymillä ja erilaisilla proteolyyttisillä entsyymeillä (papain, pepsin ja trypsin) eri konsentraatioissa. Entsyy- 15 meistä ainoastaan lysotsyymi solubilisoi proteiinia D (Fig. 4). Proteiinin D puhdistus I 1 : Proteiini D solubilisoitiin koko bakteerin sarkosyyliuutolla, kuten on kuvattu edellä 20 ja puhdistus suoritettiin kelluvan osan SDS-PAGE:lla ultrasentrifugoinnin jälkeen. Sähköforeesin jälkeen kapeita geeliliuskoja leikattiin, proteiinit siirrettiin kalvoille ja IgD sitoava nauha (proteiini D) havaittiin Western blot analyysillä. Geeliliuskoja, jotka sisälsivät proteiininauhaa, jotka vastaavat IgD sitoavia molekyylejä, leikattiin geelistä ja solubilisoitiin sähköeluoinnilla. Suorittamalla sähköforeesi uudestaan, puhdistettu 25 proteiini, proteiini (D), siirtyi yhtenä ainoana nauhana (42 kilodaltonia) (Fig. 5) ilman näkyviä hajoamistuotteita. Sen varmistamiseksi, että proteiini D ei ollut identtinen aiemmin kuvattujen ulompien kalvojen proteiinien 1 tai 2 kanssa, joiden molekyylipainot olivat 49 ja 39 kilodalto- 30 nia, H. influenzae koko bakteerien jätteelle (d) ja kelluvalle osalle (s) sarkosyylikäsittelyn tehtiin SDS-PAGE, siirrettiin Immobilon suodattimille ja merkittiin vasta-aineilla
19 proteiinia 1 ja proteiinia 2 vastaan ja myös ihmisen IgD:llä. Kuten voidaan nähdä kuviosta 4, proteiini D siirtyy eri lailla proteiinista 1 ja proteiinista 2. Proteiinin D sidosominaisuudet 5 Proteiinin D vuorovaikutus ihmisen IgD:n kanssa vahvistettiin lisäksi geelisuodatuskokeilla, jossa 125 I-proteiinia D eluoitiin yhdessä IgD:n kanssa, kun kanden proteiinin seos ajettiin Sephadex G-200 kolonnissa (uvio 6c). Proteiini D ajettiin yksin samalla kolonnilla, eluoitiin lievästi 43 kilodaltonin standardiproteiinin jälkeen 10 (ovalbumiini) vahvistaen, että proteiinin D näkyvä molekyylipaino oli 42 kilodaltonia.... II Radioaktiivisuusmerkittyä proteiinia D tutkittiin myös eri täpläkokeissa molekyylin sidosominaisuuksien tutkimiseksi lisää. Kuvio 7 osoittaa, että proteiini D sitoi tehokkaasti kahta hyvin puhdistettua ihmisen IgD jättisolukasvainproteiinia. Erillinen 15 reaktio voitiin havaita kanden IgD proteiinin arvossa 0,15 ja 0,3 lig. Kaksi IgD jättisolukasvainproteiinia lisää, jotka testattiin samalla tekniikalla, voitiin myös erillisesti havaita arvossa 0,3 gg (tietoja ei esitetty). IgD fab fragmenttien ja IgD Fc fragmenttien piste-täplissä sitoivat proteiinia D arvoissa 2,5 ja 1,2 lig. Sitävastoin 8 eri IgG jättisolukasvainproteiinia edustaen kaikkia aliluokkia ja L-ketjutyyppejä, ei 20 näkyvästi reagoinut proteiini D:n kanssa arvossa 5 lig. Ei myöskään voitu havaita mitään reaktiota proteiinin D ja kolmen monokloonisen IgM:n välillä, yhden monokloonisen IgA valmistuksen, polykloonisen IgE:n tai muutaman muun proteiinin välillä. Polykloonisen IgG:n geelin kanssa voitiin kuitenkin havaita heikko reaktio arvossa 5 µg (Fig. 7). 25 Proteiinin D geenin kloonaus H. influenzaesta 772 eristettyä DNA:ta merkittiin osittain Sau3A:lla ja rikastettiin fragmenttien osalta, jotka olivat kooltaan 2-7 kilobasepairs (kbp) fraktioimalla 30 sakkaroosigradientilla. Nämä fragmentit sidottiin BamHI-leikkeeseen ja käsiteltiin fosfataasi vektorilla puc18. E. colin JM83 solut siirrettiin sidosseoksella korkeajänni-
20 te-sähköforeesilla ja laitettiin levyille, jotka valittiin ampisilliinivastustuskyvyn mukaan. Yksittäisiä viljelmiä siirrettiin nitroselluloosasuodattimille ja seulottiin monokloonisten vasta-aineiden seoksella (MAbs), kuten on kuvattu materiaaleissa ja menetelmissä. 5 15000 testattujen viljelmien joukossa, 60 havaittiin olevan positiivisia. Kandeksan positiivista viljelmää poimittiin, puhdistettiin ja niille tehtiin vielä kaksi seulontaa. Kaikki kloonit jäivät positiiviseksi puhdistuksen aikana. Puhdistettujen kloonien IgD sidonta ihmisen IgD:hen testattiin, kanin ei-ihmisen IgD:hen ja peroksidaasiin sidotun 10 vuohen kaninvastaiseen IgS:ään viljelmäimmunoanalyysissä, kuten on kuvattu Materiaaleissa and Menetelmissä). Kaikki olivat positiivisia mitä tuli IgD sidontaan. Lisäksi kloonien havaittiin olevan positiivisia, kun seulottiin kolmella Mabs:llä erikseen. 15 Positiivisten kloonien plasmidi -DNA rajoitusentsyymianalyysi osoitti, että kaikkiin paitsi yhteen klooniin oli sisällytetty 3,3 kbp kahta sisäistä Sau3A paikkaa. Yksi klooni sisälsi ylimääräisen 2,0 kbp Sau3A fragmentin. Yksi pienemmistä rekom- binanttiplasmideista, phij32 valittiin sen tunnistamiseksi lisää. Osittaista restriktioent- syymikarttaa käytettiin H. influenzae DNA:n sisällyttämiseksi phij32:teen (Fig. 8). 20 Sen alueen tunnistamiseksi, joka koodittaa proteiinia D, restriktioentsyymifragmentit alikloonattiin kantaan puc 18. Tuloksena saatuja muunnelmia testattiin proteiinin D ilmaisemisen suhteen käyttämällä viljelmä immuunitäpläanalyysiä, kuten on kuvattu edellä. Nämä kokeet osoittivat, että plasmidit, joissa on 19, kpb HindIII-ClaI frag-. menttia sisällytetyn osan yhdessä päässä salli IgD:tä sitoavan proteiinin ilmaisemisen. 25 Tämä rekombinattiplasmidi, jota kutsuttiin phic348 säilytettiin lisäkokeita varten. Proteiinin D geeni, joka kloonattiin plasmidiin phic348 ilmaistaan promoottorista osasta puc18. Tämä osoitettiin kloonaamalla HindIII-ClaI fragmentti phij32:n vastakkaisessa suunnassa puc19:sta. Kaikki muunnelmat ilmaisivat IgD sidontaa, kuten voitiin olettaa, jos geeni on endogeenisen promoottorin kontrollissa. Muunnel- 30 mat, joissa on HindIII-ClaI fragmentti vastakkaisessa suunnassa verrattuna plasmidiin phic348 kasvoi heikosti ja hajosi itsestään viljelyn aikana. Tämä johtui luultavasti
21 5 puc19 lacz promoottorista, joka oli asetettu samaan suuntaan kuin proteiinin D promoottori, joka johti proteiinin D yli-ilmaisemiseen, joka oli kuolettavaa soluille. phic348:ssa lacz promoottori oli vastakkaisesti asetettuna, kun proteiinin D promoottori. Proteiinin D geenin DNA sekvenssianalyysi phic348:n lisäyksen molempien säikeiden nukleotidisekvenssi määritettiin joko suoralla alikloonien tai poistorakenteiden plasmidisekvenssoinnilla tai alikloonaamalla 10 restriktiofragmentit fageiksi M13mp18 ja M13mp19. Käytettiin kaupallisesti saatavia yleismaailmallisia ja käänteisiä M13 primeerejä. Sekvenssointi tehtiin kaikkiin restriktioentsyymipaikkoihin, joita käytettiin alikloonauksessa ja sekvenssoinnin strategia on esitetty kuviossa 8... : 1 15 DNA sekvenssi (Fig. 9) vapauttaa 1092 bp:n avoimen lukemarungon lähtien ATG koodista asemassa 204 ja loppuu asemaan 1296 TAA päätekoodilla. Avoin lukema vastaa 364 aminohappojäännösten proteiinia. 10 nukleotidia ylöspäin metioniinikoo- dista on sekvenssi AAGGAG, joka täydentää E. colin 16S rrna 3' päätettä (Shine, J. and Dalgarno, L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71:1342, 1974). Tämän oletetun 20 ribosomia sitoavan paikan (rbs) keskustan ja lähtökoodin etäisyys on 13 bp verrattuna keskimääräiseen etäisyyteen 10 bp E. colissa. 5' -sivualue, ylöspäin ehdotetusta rbs:stä, esittää mandollisten promoottoreiden läsnä- olon. -10 alueen sekvenssit TAAAAT (151-1556) ja -35 alue TTGCTT (127-132) näyttää homologiaa E. colin promoottoreihin (Rosenberg, M. and Court, D., Annu. 25 Rev. Genet, 13:319, 1979) ja ovat identtisiä promoottoreiden kanssa, jotka E. coli RNA polymeraasi tunnistaa. Oletettujen -10 ja -35 sekvenssien etäisyys on 18 bp, joka on verrattavissa edulliseen arvoon 17 bp. : 1 Asemien 1341 ja 1359 välillä on käänteinen toisto ja mandollisuus muodostaa varsi 30 ja silmukkarakenne. Tämä toisto ei kuitenkaan mandollista tyypillistä rho riippumatonta transkriptiopäätettä.
22 Proteiinin D rakenne Proteiinin D geeni koodittaa 364 aminohappojäännösten proteiinia, joka on johdettu nukleotidisekvenssistä (Fig. 9). N-päätteisellä aminohapposekvenssillä on tyypilliset 5 bakteerisen lipoproteiinin signaalipeptidiominaisuudet (Vlasuk et al., J. Biol. Chem. 258:7141, 1983). Siinä on hydro fiilisen ja emäksisen aminohappoj en jakso N- päätteessä, jota seuraa 13 jäännöksen hydrofobinen alue ja siinä on glysiini hydrofobisessa ytimessä. Oletettu signaalipeptidi loppuu yhtäpitävään Leu-Ala-Gly-Cys sekvenssiin, jonka entsyymisignaalipeptidaasi II tunnistaa (Spasell). Primeerisella 10 käännöstuotteella on johdettu molekyylipaino 41821 daltonia. Spasell halkeaminen johtaisi proteiiniin, jossa on 346 aminohappoa, jonka laskettu molekyylikoko on 40068 daltonia päinvastoin kuin emäproteiinin D oletettu koko, joka on noin 42 kilodaltonia. Esiproteiinin käännösten jälkeinen muokkaus saattaa ottaa tämän eroavuuden huomioon. Tehtiin useita yrityksiä määrittää proteiinin D aminopäätteinen 15 aminohapposekvenssi laittamalla noin 1000 pikomoolia siitä automatisoituun aminohapposekvenssilaitteeseen. Koska ei saatu mitään aminohapon fenyylitiohydantoiinijohdannaisia, yksittäisen IgD reseptorin polypeptidiketjun aminopääte on luultavasti estetty. 20 Proteiinin D, joka on ilmaistu E. coli:ssa JM 83, johon sisältyy plasmidi phic348 analysoitiin immuunitäpläkokeilla (Fig. 10). Sytoplastiset, periplastiset ja kalvofraktiot soluista myöhäisemmässä logaritmisessa vaiheessa erotettiin SDS-PAGE geelille ja sähköisesti laitettiin Immobilon suodattimelle. Proteiini, joka sitoo kaikkia kolmea proteiinin D vastaisia monokloonisia vasta-aineita (16C10, 20G6 ja 19B4) ja ra- 25 diomerkittyä IgD:tä voitiin havaita kaikissa kolmessa fraktiossa (linjat 2-4) e. colista JM83/pHIC348 yksittäisenä nauhana, jonka arvioitu molekyylipaino on 42 kilodaltonia s.o. sama tai samanlainen kuin H. influenzaesta johdettu proteiini D (linja 1, Fig. 10). Nukleotidisekvenssiä ja H. influenzae 772 proteiinista D johdettu aminohapposek- 30 venssejä verrattiin muihin proteiineihin, joilla on tunnettu sekvenssi homologian määrittämiseksi käyttämällä tietokonehakua EMBL ja Genbank Data Libraries
23 (geenitietopankkikirjastot). Paitsi samankaltaisuuksia signaalisekvenssissä, ei löydetty homologiaa. YHTEENVETO 5 Kuvataan uusi H. influenzaen tai siihen liittyvien Haemophilus lajien pintaproteiini. Proteiini, jota kutsutaan proteiiniksi D on ihmisen IgD:n Ig reseptori ja sen näkyvä molekyylipaino on 42000. Proteiinia D voidaan määrittää kaikissa tutkituissa 116 kapseloidussa ja kapseloittamassa H. influenzaen eristeessä. Kaikkien kantojen 10 proteiinilla on sen lisäksi sama näkyvä molekyylipaino immunogeenisia samankaltaisuuksia, koska proteiini D kaikista kannoista vuorovaikuttaa kolmen erilaisen hiiren monokloonisen vasta-aineen kanssa ja monokloonisen ihmisen IgD:n kanssa. Menetelmä proteiinin D puhdistamiseksi kuvataan. Proteiinin D geenin kloonaus H. influenzaesta ja E. cloista kuvataan, kuten myös nukleotidisekvenssi ja johdettu aminohap- 15 posekvenssi, joka vastaa molekyylipainoa 41821 daltonia, johon kuuluun olettu 19 aminohapon signaalisekvenssi, joka sisältää yhtäpitävän bakteeristen lipoproteiinien sekvenssin Leu-Ala-Gly-Lys.
24 Patenttivaatimukset 1. Menetelmä pintaproteiinin valmistamiseksi, jota pintaproteiinia on monessa Haemophilus influenzaen tai siihen liittyvien Haemophilus-lajien kannoissa, jonka 5 pintaproteiinin näennäinen molekyylipaino on 42000, jolla on kyky sitoa ihmisen IgD:tä, ja jolla pintaproteiinilla on kuviossa 9 esitetty aminohapposekvenssi, tai sen luonnossa esiintyvien tai keinotekoisesti modifioitujen muunnelmien, joilla on sama funktio kuin mainituilla proteiineilla tai mainitun proteiinin tai sen muunnelmien immunogeenisen tai IgD:tä sitovan osan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 10 menetelmässä pintaproteiini eristetään proteiinia ilmentävästä bakteerisolusta ja viljelyalustasta ja puhdistetaan. 2. Plasmidi tai faagi, tunnettu siitä, että plasmidi tai faagi sisältää Haemophilus influenzaen tai siihen liittyvien Haemophilus-lajien proteiinin geneettisen koodin, 15 jonka mainitun proteiinin näennäinen molekyylipaino on 42000, jolla proteiinilla on kyky sitoa ihmisen IgD:tä ja jolla proteiinilla on kuviossa 9 esitetty aminohapposekvenssi, tai sen luonnossa esiintyvien tai keinotekoisesti modifioitujen muunnelmien, joilla on sama funktio kuin mainituilla proteiineilla tai mainitun proteiinin tai muunnelmien immunogeenisen tai IgD:tä sitovan osan geneettisen koodin. 20 3. Isäntäsolu, joka ei ole peräisin ihmisestä, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksessa 2 määritellyn plasmidin tai faagin ja kykenee tuottamaan mainittua proteiinia tai mainitun proteiinin muunnelmia tai proteiinin tai muunnelman osaa, joka isäntäsolu valitaan bakteerien, hiivojen ja kasvien joukosta. 25 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on E. coli. 5. DNA segmentti, tunnettu siitä, että se käsittää DNA sekvenssin, joka koodittaa Haemophilus influenzae:n tai siihen liittyvän Haemophilus-lajien proteiinia, 30 jolla on kuviossa 9 esitetty aminohapposekvenssi, jonka mainitun proteiinin näennäinen molekyylipaino on 42000 ja jolla on kyky sitoa ihmisen IgD:tä, tai sen luonnossa