Näytteiden inaktivointi tutkimusanalyyseihin

Näytteiden inaktivointi tutkimusanalyyseihin Pamela Österlund 16.4.2015 Pamela Österlund 1

16.4.2015 Pamela Österlund 2

Mikrobien Inaktivaatiomenetelmiä Kemialliset yhdisteet Klooriyhdisteet Alkoholit Formaldehydi Hapot, peroksidiyhdisteet, fenoli Kvartaariset ammoniumyhdisteet, detergentit Fysikaaliset menetelmät Lämpö Paine Säteily Kuivuminen 16.4.2015 Pamela Österlund 3

Haasteita Näytemateriaalin säilyminen tutkittavassa muodossa Inaktivaatiomenetelmän tehokkuuden varmistaminen Jokaiselle näyte-erälle SOP ja pistotarkastus Erilaiset ja eripitoiset näytemateriaalit Carry-overs näyteputkien/astioiden mukana Virheiden poissulkeminen Tuplavarmistus 16.4.2015 Pamela Österlund 4

Näytteiden siirto BSL-3:sta alemmalle turvatasolle THL:ssä Inaktivaatiomenetelmät testataan mikrobikohtainen Usein käytettävistä inaktivaatiomenetelmistä laaditaan SOP Näytemateriaalikohtainen Nestemäiset näytteet siirretään puhtaisiin putkiin ennen ja jälkeen ulostuonnin Adherentit näytteet (mikrsokooppilasit, platat) käsitellään kiinnityspohjineen (esim upotetaan fiksatiiviin) Kaksinkertainen riskinhallinta Kaksi erillistä inaktivaatiota Yksi inaktivaatio + BSL-2 suojaus 16.4.2015 Pamela Österlund 7

Inaktivaatiomenetelmän testaus: Koejärjestely Infektoidut solut tai virusnäyte 16.4.2015 Pamela Österlund 8

Inaktivaatiomenetelmän testaus: Koejärjestely Infektoidut solut tai virusnäyte Inaktivaatiokäsittely, (kemikaalien pesu) Käsiteltyjen näytteiden laimennussarja ja inkubaatio kasvatussoluilla (jatkokasvatus) Mikroskopointi CPE, TCID50, PFU Solujen totrna keräys Suppinäytteiden keräys vrna qpcr Virus titraus HA TCID50 PFU vrna qpcr 16.4.2015 Pamela Österlund 10

UV-käsittelyn testaus Influenssavirukselle UV kroslinkkaa proteiineja ja vaurioittaa DNA/RNAta 1. testi: 1x0,12J ja 3x0,12J ja 5x0,12J Ei mitattavaa PFU/ml arvoa 2. testi: 0,01J; 0,03J; 0,05J; 0,07J; 0,09J; 0,15J ja 0,3J 0,01J: 3,8*10^4 PFU/ml 0,03-0,3J: Ei mitattavaa PFU/ml arvoa IAV vrna Varmistus: viruksen replikaation tarkastus qpcr:llä Relative viral RNA 100000000 1000000 10000 100 30min 2h 4h 8h 1 0 J 0,03 J 0,05 J 0,1 J 16.4.2015 Pamela Österlund 11

UV-käsittelyn testaus Influenssavirukselle UV-käsittely 0,6J Ei mitattavaa PFU/ml arvoa eikä replikoituvaa virusrnata Konsentraatiolla merkitystä käsittelyn tehokkuuteen, optimointi kesken 16.4.2015 Pamela Österlund 12

Inaktivaatiomenetelmän testaus: Koejärjestely Infektoidut solut tai virusnäyte Inaktivaatiokäsittely, (kemikaalien pesu) Käsiteltyjen näytteiden laimennussarja ja inkubaatio kasvatussoluilla (jatkokasvatus) Mikroskopointi CPE, TCID50, PFU Solujen totrna keräys Suppinäytteiden keräys vrna qpcr Virus titraus HA TCID50 PFU vrna qpcr 16.4.2015 Pamela Österlund 13

RNA-lyysipuskurin testaus H5N1-infektoiduille soluille Guanidiini-isothiosyanaati (RLT puskuri, Qiagen) denaturoi proteiineja Beta-MerkaptoEtOH pilkkoo S-S -soltoja 0,0# 5,0# 10,0# 15,0# ennen# pesua,# päivä#1# Solut#H5N1#infektoitu,#RLT#käsi7ely# pesun# jälkeen,# päivä#1# päivä#2# päivä#3# päivä#4# päivä#8# päivä#11# modc#infek;olla,#rlt,#näyteaä#100µl# modcinfek;olla,#rlt,#näyteaä#30µl# modc#infek;olla,#rlt,#näyteaä#5µl# Ct# 20,0# 25,0# 30,0# 35,0# 40,0# modc#infek;olla,#näyteaä#100µl# modc#ilman#infek;ota#=#ctrl,#näyteaä# 100µl# Siirto uusille soluille 16.4.2015 Pamela Österlund 14

RNA-lyysipuskurin testaus H5N1-infektoiduille soluille H5#vRNA Ct#values Dilution 1:10 1:33 1:200 Condition#of#cells HA Untreated#cell#control from#inoculum 34,85 after#inoculation 35,43 2nd#day 3rd#day 33,74 A#lot#of#diead#cells 2nd#day#P2 34,06 6th#day#P2 34,67 8th#day#P2 35,93 Untreated#H5N1#control from#inoculum 13,09 16,07 19,54 after#inoculation 16,42 17,32 19,04 2nd#day 12,22 14,18 17,36 CPE#in#all#dilutions 8 4 2 3rd#day 11,19 10,12 11,76 CPE#in#all#dilutions 64 18 8 2nd#day#P2 16,83 16,04 17,29 CPE#through#1:33#dilution 32 16 4 6th#day#P2 12,85 12,93 14,59 CPE#in#all#dilutions 32 16 16 8th#day#P2 16,80 16,92 18,29 32 16 16 RLTJtreated#H5N1#samples from#inoculum 13,58 14,91 20,15 #J after#inoculation 21,47 23,80 28,12 #J 2nd#day 22,97 23,64 28,44 #J 3rd#day 24,56 26,13 26,95 Cell#toxicity#through#1:200#dilution #J # 2nd#day#P2 29,04 29,73 30,92 #J 6th#day#P2 30,66 30,17 32,20 some#cell#toxicity #J 8th#day#P2 31,32 30,77 33,64 16.4.2015 Pamela Österlund 15

Metanoli-fiksauksen testaus H5N1- infektoiduille soluille Vähentää proteiinien liukoisuutta, denaturoi/presipitoi proteiineja Liuottaa lipidejä Solut#H5N1,infektoitu,#metanoli,käsi7ely# 0,0# 5,0# 10,0# ennen# pesua,# päivä#1# pesun# jälkeen,# päivä#1# päivä#2# päivä#3# päivä#4# päivä#8# päivä#11# modc#infek;olla,#metanoli,#näyte>ä# 100µl# modc#infek;olla,#metanoli,#näyte>ä#30µl# Ct# 15,0# 20,0# 25,0# modc#infek;olla,#metanoli,#näyte>ä#5µl# modc#infek;olla,#näyte>ä#100µl# 30,0# 35,0# 40,0# modc#ilman#infek;ota#=#ctrl,#näyte>ä# 100µl# 45,0# Siirto uusille soluille 16.4.2015 Pamela Österlund 16

Paraformaldehydi-fiksauksen testaus H5N1- infektoiduille soluille Aldehydit kroslinkkaavia fixejä, muodostaa kovalenttisia sidoksia proteiinien välille Suojaa tertiäärirakenteita Solut#H5N1,infektoitu,#4%#PFA#käsi:ely# 0,0# ennen# pesua,# päivä#1# pesun# jälkeen,# päivä#1# päivä#2# päivä#3# päivä#4# päivä#8# päivä#11# modc#infek;olla,#4%#pfa,#näytebä#100µl# 5,0# 10,0# modc#infek;olla,#4%#pfa,#näytebä#30µl# 15,0# modc#infek;olla,#4%#pfa,#näytebä#5µl# Ct# 20,0# 25,0# 30,0# 35,0# 40,0# modc#infek;olla,#näytebä#100µl# modc#ilman#infek;ota#=#ctrl,#näytebä# 100µl# Siirto uusille soluille 16.4.2015 Pamela Österlund 17

Inaktivaatiomenetelmän testaus: Koejärjestely Infektoidut solut tai virusnäyte Inaktivaatiokäsittely, (kemikaalien pesu) Käsiteltyjen näytteiden laimennussarja ja inkubaatio kasvatussoluilla Jatkoviljelmät Mikroskopointi CPE, TCID50, PFU Solujen totrna keräys Suppinäytteiden keräys vrna qpcr Virus titraus HA TCID50 PFU vrna qpcr 16.4.2015 Pamela Österlund 18

PFA-testauksen uusinta Solut#H5N1,infektoitu,#4%#PFA#käsi:ely# Ct# 0" 5" 10" 15" 20" 25" 30" 35" 40" 45" 50" päivä"1"" päivä"2" päivä"3" päivä"4" päivä"7" päivä"8" päivä"9" päivä"10" modc"infek7olla,"4%"pfa,"näyteaä"100µl" modc"infek7olla,"4%"pfa,"näyteaä"5µl" modc"infek7olla,"näyteaä"5µl" Siirto uusille soluille 16.4.2015 Pamela Österlund 19

Yhteenveto Heikko näyte onko negatiivinen varmasti inaktiivinen Voimakas näyte infektiivisyyden pudotus ei riitä BSL3 tasolla Kemikaalien toksisuus hankaloittaa inaktivaation varmennusta Laimennettu näyte = heikko näyte Jatkoviljely tarpeeksi pitkään (rikastus) Read-out menetelmän herkkyys Mittaako infektiivistä partikkelia Voidaanko osoittaa mikrobien lisääntyminen 16.4.2015 Pamela Österlund 20

Kiitos! Veera Westenius Janne Tynell Sanna Mäkelä Hanna Valtonen Esa Rönkkö Riitta Santanen Susanna Sissonen Ilkka Julkunen 16.4.2015 Pamela Österlund 21