1111111111 1111111111 1111 11111111 11111 1111 11111111 F1000B (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) Fl B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 31.12.2002 SUOMI - FINLAND (FI) PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (51) Kv.lk.7 - Int.kl.7 A61K 39/00, 39/145, 39/21 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 934013 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 14.09.1993 (24) Alkupäivä - Löpdag 14.09.1993 (41) Tullut julkiseksi - Biivit offentlig 15.03.1994 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 14.09.1992 US 943173 P (73) Haltija - Innehavare 1 Connaught Laboratories, Inc., Route 611, P.O. Box 187, Swiftwater, PA 18370-0187, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Becker,Robert S., RR1, 545A Sylvan Cascades, Henryville, PA 18332, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 2 Biscardi,Karen, P.O. Box 29, South Sterling, PA 18464, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 3 Ferguson,Laura, 3141 Portage Road, Bethlehem, PA 18017, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 4 Erdile,Lorne, 1318 Dreher Avenue, RR5, Box 5017, Stroudsberg, PA 18360, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (74) Asiamies - Ombud: Forssån & Salomaa Oy Eerikinkatu 2, 00100 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä koostumuksen valmistamiseksi immuunivasteen aikaansaamiseksi antigeenille Förfarande för framställning av en sammansättning för att åstadkomma ett immunsvar till en antigen (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer (57) Tiivistelmä Sammandrag Parempi immuunivaste antigeeneille, varsinkin normaalisti heikosti immunogeenisille virusauligeeueille, kuten inflt,..viruksta p e räisin olevalle HA-antigeenille, saavutetaan annostelemalla antigeenin kahta eri fysiokemiallista muotoa samaan aikaan, erityisesti niin, että saadaan antigeenin ilmentäminen sekä B-solujen että lisäsolujen toimesta. Ett förbättrat immunsvar till antigener, speciellt normalt svagt immunogeniska virusantigener, såsom HA-antigen från influensavirus, uppnås genom samtidig administrering av antigenet i två olika fysiokemiska former, speciellt för att möjliggöra presentation av antigenen både med hjälp av B-celler och tilläggsceller.
Menetelmä koostumuksen valmistamiseksi immuunivasteen aikaansaamiseksi antigeenille. Förfarande för framställning av en sammansättning för att 5 åstadkomma ett immunsvar till en antigen. 10 Keksinnön ala Esillä oleva keksintö liittyy rokotukseen ja varsinkin rokotteiden formulointiin parannetun immuunivasteen saamiseksi antigeenille.... 15 20 25 30 Keksinnön tausta Rokotus on menetelmä, jossa voidaan saavuttaa immuunivaste antigeenille isännän suojelemiseksi tartunnalta. Joillakin antigeeneillä on vahva immuunivaste ja joillakin heikko vaste. On yritetty parantaa heikosti immunogeenisten aineiden immuunivastetta. Kemiallisten apuaineiden käytöllä saavutetaan tällainen voimistaminen, mutta yleensä nämä aineet ovat myrkyllisiä kemikaaleja, joita ei voida käyttää ihmisiin. Eräs toinen menetelmä voimistamisen saavuttamiseksi on yhdistää heikosti immunogeeninen aine vahvasti immunogeeniseen aineeseen ja annostella yhdistelmä rokotteessa. Voidaan käyttää esimerkiksi Haemophilus influe,nzat tyypin b kapselimaisen polysakkaridin ja difteria (= kurkkumätä) -toksoidin yhdistelmää, kuten on kuvattu US-patenteissa nrot 4,496,538 ja 4,619,828 tai heikon antigeenin yhdistämistä monoklooniseen vasta-aineeseen, jonka kohteena on antigeenia esittävät solut, kuten on kuvattu US-patentissa nro 4,950,480.
2 Keksinnön yhteenveto.' 20 a Tämän keksinnön mukaisesti saadaan aikaan menetelmä koostumuksen valmistamiseksi immuunivasteen aikaansaamiseksi antigeenille eläimessä, jolle menetel- 5 mälle on tunnusomaista, että koostumus formuloidaan rokotteessa fysiologisesti hyväksyttävän kantajan kanssa ja mainitun antigeenin ensimmäinen fysiokemiallinen muoto suosii antigeenin tuomista B-soluilla T-soluille eläimessä, ja mainitun antigeenin toinen fysiokemiallinen muoto suosii antigeenin tuomista apusoluilla T-soluille eläimessä. Näin saadaan aikaan rokotusmenetelmä vasta-aineen paran- 1 0 netun vasteen saamiseksi antigeenille luonnollisessa (= käsittelemättömässä) eläimessä annostelemalla antigeeni ainakin kandessa eri fysio-kemiallisessa muodossa. Saman antigeenin kaksi erilaista fysiokemiallista muotoa annostellaan samanaikaisesti luonnollisessa eläimessä mandollisimman suuren voimistamisen saavuttamiseksi ja ne voidaan annostella yhteen tai kahteen injektiopaikkaan. 15 Jotta saavutettaisiin parempi immuunivaste on välttämätöntä, että eläin, jolla antigeeni yhteisannostellaan, mukaanlukien ihminen, on luonnollinen, s.o. eläintä ei aikaisemmin ole immunisoitu antigeenin korkeasti immunogeenisella (= vastustuskykyä aiheuttavalla) muodolla. Antigeenin yhteisannostelu primeeratulle (= jota on jo käsitelty samalla antigeenilllä) eläimelle ei saa aikaan immuunivasteen parannusta.... 25 2 Esillä olevalla keksinnöllä saadaan siis koostumus immuunivasteen saamiseksi antigeenille eläimessä, jolle on tunnusomaista antigeenin ensimmäinen fysiokemiallinen muoto, joka suosii antigeenin esittämistä B-soluilla T-soluille eläimessä ja antigeenin toinen fysiokemiallinen muoto, joka suosii antigeenin esittämistä ylimääräisillä osallistuvilla soluilla T-soluihin eläimessä. I, Koostumus voidaan formuloidu fysiologisesti hyväksyttävänä kantajalla antigee- 3 0 nin ensimmäistä ja toista fysiokemiallista muotoa varten rokotteessa. Parempi immuunivaste antigeenille saavutetaan luonnollisessa eläimessa annostelemalla
3 rokote luonnolliselle eläimelle koostumuksessa jommalle kummalle yksinomaan annetulle antigeenin fysiokemialliselle muodolle. Piirustusten lyhyt kuvaus 5 Kuviot 1 ja 2 sisältävät HAI-tittereiden graafisia tietoja, jotka on saavutettu HAantigeenin eri muodoilla luonnollisissa marsuissa. Yksityiskohtainen kuvaus on seuraavassa esimerkissä 1; 10 Kuviot 3-5 sisältävät IgG:n anti-ha-vasteiden graafista tietoa, jotka on saavutetta HA-antigeenin eri muodoilla marsuilla. Yksityiskohtainen selostus on seuraavassa esimerkissä 2; Kuviot 6 ja 7 sisältävät HAI-tittereiden graafista tietoa, jotka on saavutettu HA- 15 antigeenin eri muodoilla primeeratuissa (= aiemmin antigeenillä käsitellyissä) marsuissa. Yksityiskohtainen selostus on seuraavassa esimerkissä 3; ja Kuviot 8 ja 9 sisältävät graafista tietoa immuunivasteesta, joka on saavutettu OspA:n eri muodoilla luonnollisissa hiirissä. Yksityiskohtainen kuvaus on seuraa-. :. 20 vassa esimerkissä 4.... Teoria... : 25 Vaikka hakija ei halua sitoutua mihinkään teoriaan sen selittämiseksi, miksi esillä oleva keksintö toimii saaden aikaiseksi antigeenin vasteen voimistumisen annostelemalla samanaikaisesti ainakin kahta antigeenin eri fysiokemiallista muotoa seuraava teoreettinen selitys voidaan antaa. On tunnettua, että sekä B-solujen että lisäsolujen on esitettävä antigeenejä 30 T-soluille vasta-aineen vasteen käynnistämiseksi antigeenille luonnollisissa eläimissä (viitteet 1,2,3,4 ja 5). B-soluilla ja lisäsoluilla saattavat suosia antigeenin
4 eri fysiokemiallisia muotoja. Nämä mieltymykset saattavat johtua B-soluista ja lisäsoluista, jotka käyttävät eri mekanismeja antigeenien sisällyttämiseksi. B-solut sisällistävät antigeeneja erityisen sidonnan kautta niiden solupinnan 5 immunoglobuliineihin (viitteet 6,7) ja voivat esittää liukoisia antigeeneja niinkin pienissä konsentraatioissa kuin 100 µg/ml (viite 8). Toisaalta lisäsolut, jotka ovat makrofageja ja dendnittisoluja (= puumaisesti haaraisia soluja), sisällistävät antigeeneja ei-spesifisesti fagosytoimalla ja pinosytoimalla antigeeneja (viite 9). Makrofagit voivat esittää liukoisia antigeeneja, jos ne ovat konsentraatioissa noin 10 100 µg/ml (viite 8). Muut tutkimukset (viite 10) ovat osoittaneet, että liukenevan antigeenin makrofagien tarvitsemaa konsentraatiota voidaan vähentää sitomalla antigeeni tiettyyn rakenteeseen. Vasta-aineiden vasteen sukupolven aikana B-solut ja lisäsolut esittävät antigeeneja 15 T-soluille T-soluaktivoinnin/eriytymisen kandessa eri vaiheessa. Tutkimukset ovat osoittaneet, että luonnollisten T-solujen on ensin vuorovaikutettava antigeenin kanssa, joka esittää lisäsoluja, että niistä tulisi aktivoituja auttaja-t-soluja (viitteet 11,12,13,14). Keksijät uskovat, että antigeenien tietyt muodot, joita käytetään tässä, tehokkaasti välittävät luonnollisten T-solujen lisäsoluaktivoinnin. Tämä :. 20 vuorovaikutus on kuitenkin riittämätön, jotta B-solut käynnistäisivät vastauksen T-soluista riippuvalle antigeenille. Suoraa solujen välistä kontaktia B-solujen ja aktivoitujen auttaja-t-solujen välillä vaaditaan vasta-aineen erittämisen käynnistämiseksi B-soluista (viite 15). Tämän vuorovaikutuksen välittävät B-solut, jotka käsittelevät ja esittävät antigeenin aktivoidulle T-solulle (viite 16). Tämän tyyppis- 25 tä B-solu - T-solu vuorovaikutusta sanotaan samaan alkuperää olevaksi T-solu avuksi. Keksijät uskovat, että antigeenin liukeneva muoto, jota käytetään tässä, parhaiten välittää B-solujen vuorovaikutuksen auttaja-t-solujen kanssa. Näiden kanden vuorovaikutuksen järjestys on olennainen, jotta saataisiin vaadittu 30 immuunivaste luonnollisissa T-soluissa. On äskettäin osoitettu, että B-solujen antigeeniesitys luonnollisille T-soluille aikaansaa T-solujen toleranssin pikem-
5 minkin kuin aktivoinnin (viitteet 2,3). Koska optimaaliset immuunivasteet vaativat tehokkaan antigeenin esittämisen sekä B-soluilla että T-soluilla, sellainen optimivaste voidaan saavuttaa esillä olevassa keksinnössä annostamalla samanaikaisesti antigeenia kandessa fysiokemiallisessa muodossa joko yhdessä tai 5 kandessa injektiopaikassa. Keksinnön yleinen kuvaus Kuten edellä on todettu, uudessa menetelmässä vahvistetun immuunivasteen 10 saavuttamiseksi antigeenille luonnollisessa eläimessä, mukaanlukien ihmiset, antigeeni annostellaan samanaikaisesti ainakin kandessa eri fysiokemiallisessa muodossa. Keksintö on laajasti sovellettavissa hyvin erilaisiin antigeeneihin, varsinkin virus-, bakteeri-, sieni-, prototsoa- ja parasiittiproteiiniantigeeneihin ja on erityisen käyttökelpoinen antigeenien yhteydessä, jotka sisältävät suojaavia 15 epitooppeja, joilla on normaalisti heikko immunogeenivastaus. Esimerkkejä virusantigeeneistä, joihin keksintöä voidaan soveltaa, ovat retrovirusten gp120- ja gp160-proteiinit, varsinkin HIV, influenza-viruksen veren agglutiiniantigeeni ja muut virusproteiinit, jotka liittyvät virusmembraaneihin.. : 25 0 Keksintöä kuvataan seuraavassa influenza-virusten haemagglutiiniantigeenien (HA) yhteydessä, mutta niistä tuloksista, jotka on annettu HA-antigeeneistä ja edellä olevasta keskustelusta on selvää, että keksintöä voidaan soveltaa hyvin erilaisiin antigeeneihin. Seuraavassa on esitetty myös tietoa immuunivasteesta B. hurgflorferi spirochetin ulomman pintaproteiinin A (OspA) immuunivasteesta (s.o. bakteeriproteiini) erilaisissa fysiokemiallisissa muodoissa. Lipidoitu OspA on vahva immunogeeni ja siten yhteisannostelua OspA:n muiden muotojen kanssa ei yleensä vaadita. Esitetyt tulokset esittävät kuitenkin menetelmää yleisesti. 30 Eräs tietty virus-proteiini, johon keksintöä voidaan soveltaa on ihmisen im- muunipuutosviruksen (HIV) 1 60-proteiini. HIV:in gp 1 20-proteiini sisältää
6 suojaepitooppeja, mutta on heikko immunogeeni. Immunovastetta 120:11e voidaan vahvistaa yhteisannostelemalla gp120-proteiinia inaktivoituj en HIVvirionien (täysin kehittynyt virus), gp160:n ja pseudo-virionien kanssa. Gp160-proteiini on edeltäjäproteiini, joka on proteolyyttisesti halkaistu gp120:n ja 5 gp40:n muodostamiseksi. Gp120-proteiini liittyy normaalisti H1V-virioneihin gp40:n kautta. Puhdistettu gp120-proteiini on liukeneva proteiini, joka on heikosti immunogeeninen, kun taas virus erityisesti ja gp160-proteiini ovat immunogeenisempiä. Yhteisannostelu esillä olevan keksinnön mukaisesti voi saada aikaiseksi parannetun immuunivasteen gp120-proteiinille. 10 Antigeenin eri fysiokemialliset muodot yhteisannostelua varten voi vaihdella laajasti riippuen valitusta antigeenista ja antigeenin erityisistä muodoista, jotka ovat saatavilla. Edullisesti nämä kaksi muotoa räätälöidään, että saataisiin antigeeniesitys sekä B-soluilla että lisäsoluilla T-soluille vasta-aineen vastauksen 15 käynnistämiseksi.. 20 a : 4. 9 *: 25 Esimerkiksi toinen fysiokemiallinen muoto voi olla liukeneva, kun taas toinen voi olla liukenematon, kuten HA-antigeenin tapauksessa. Vaihtoehtoisesti antigeenin eri fysiokemialliset muodot voivat olla lipidoitu proteiini ja ei-lipidoitu proteiini kuten OspA-antigeenin tapauksessa. Lisäksi antigeenin eri fysiokemialliset muodot voivat käsittää proteiinia, joissa on tai ei ole hydrofobista aluetta. Lisäksi antigeenin eri fysikaaliskemialliset muodot voivat käsittää proteiineja, joita on käsitelty esim. geneettisesti tai kemiallisella synteesillä, jotta saataisiin alueita, joissa on tai ei ole erityisiä epitooppeja.
7 Esimerkit Esimerkki 1 5 Tämä esimerkki osoittaa influenza-viruksesta saadun HA-antigeenin erilaisten fysiokemiallisten muotojen yhteisannostelun vaikutuksen. On olemassa useita erilaisia HA:n fysiokemiallisia muotoja, nimittäin HA(p), halkaistu HA ja inaktivoitu kokovirus. HA(p) on HA:n hyvin puhdas muoto, jonka 10 hydrofobinen pääty on poistettu ja se on liukeneva veteen. Halkaistu HA on pintaaktiivinen aine, joka on HA-antigeenin uutettu ja osittain puhdistettu muoto. Inaktivoitu kokovirus käsittää formaliinilla inaktivoidun kokoviruksen hiukkasia. Halkaistu HA ja inaktivoitu koko virus ovat immunogeenisiä luonnollisissa 15 eläimissä ja ihmisissä. HA(p) ei ole immunogeeninen luonnollisissa eläimissä tai lapsissa, vaikka se on antigeeninen vasta-aineantigeenireaktioissa..:. 20 :. Suoritettiin kaksi koesarjaa, jossa marsuja immunisoitiin erilaisilla A/Taiwan -influessakannasta saadun HA:n fysiokemiallisilla muodoilla yksinään tai yhdessä ja niiden vasteet mitattiin veren agglutinointi-inhibointi (HAI)-tittereillä, HAItittereiden tiedetään vastaavan hyvin suojaavia immunovasteita. Kokeissa saadut tulokset piirrettiin graafisesti ja ne ilmenevät kuvioista 1 ja 2. Näissä kokeissa HA(p):n määrä ylläpidettiin vakiona (1,0 p,g) ja lisättyä inaktivoidun kokoviruksen määrää vaihdeltiin. Kolmesta käytetystä inaktivoidun viruksen määrästä (1,0 kg, 0,1 itg ja 0,01 kg) immuunivasteet vahvistuivat parhaiten yhteisannostelulla, kun käytettiin 0,1 iug inaktivoitua kokovirusta, kuten voidaan nähdä kuvioista 1 ja 2. 30 Kun tämän yhdistelmän tittereitä verrattiin HA(p):n tittereihin tai 0,1 kg:n inakti- voituun kokovirukseen yksinomaan, yhteisannostelu vahvisti immuunivasteita
8 nelin- tai seitsenkertaisesti 2-4 viikkoa annostelun jälkeen. Inaktivoidun kokoviruksen korkeammalla annoksella, 1,0 gg, immuunivasteet yhteisannostelulla olivat samanlaiset kuin vastaukset viruksella yksinomaan, kuten taas voidaan nähdä kuvioista 1 ja 2. Inaktivoidun kokoviruksen alemmalla annoksella, 0,01 gg, 5 immuunivastaus sekä yhteisannosteluun että inaktivoituun kokovirukseen yksinomaan olivat alhaiset (kts. kuvio 2). Koska HAI-titterit vastaavat hyvin suojattavia immuunivasteita, nämä tulokset ehdottavat, että yhteisannostelu parantaa suoj aimmuunivastauksia marsuissa. 10 Halkaistun HA:n ja HA(p):n yhteisannostelu paransi myös anti-ha vastaainevasteita marsuissa. Paras parannus yhteisannostelulla havaittiin kun käytettiin 0,01 gg HA(p) ja 0,01 gg halkaistua HA:ta, kuten voidaan nähdä kuvioiden 1 ja 4 tuloksista. Kolmin-seitsenkertainen parannus HAI-tittereissä havaittiin, kun käytettiin näitä antigeenimääriä. 15 Esimerkki 2.. Esimerkissä 1 saatujen tulosten lisäksi vasta-ainevasteita analysoitiin EIA:lla (ELISA-immunoanalyysi) sen määrittämiseksi, liittyikö HAI-tittereiden parannus... 20 yhteisannostelulla tuotetun IgG:n anti-ha vasta-aineen kokonaismäärään. Näissä..... kokeissa HA-e:ta (HA:n hyvin puhdas muoto, jossa on jäljellä hydrofobinen ' pääty) käytettiin EIA-levyn reikien peittämiseksi ja marsun anti-igg:tä käytettiin tunnistavana vasta-aineena. Koe-antiseerumien liuotuskäyriä verrattiin marsun...antiseerumin standardi-liuotuskäyrään ja tämän vertailun perusteella IgG:n anti- 25 HA:n yksiköt laskettiin jokaisessa seerumissa. 0. I II Käyttämällä samoja marsun seerumeja hyvä vastaavuus havaittiin, kun EIA:n tuloksia, jotka voidaan nähdä kuviosta 3, verrattiin HAI:n tuloksiin, jotka voidaan nähdä kuviosta 2. Nämä tulokset osoittavat, että HA:n eri muotojen yhteisannoste- 30 lu parantaa HA:ta vastaan tuotetun IgG:n kokonaismäärää.
9 EIA:n tulokset seerumeissa kokeesta, jossa käytettiin halkaistua HA:ta, kuten voidaan nähdä kuviosta 5, osoitti, että suuremmat HAI-titterit yhteisannostelusta olivat anti-ha vasta-aineiden suurempien määrien tulos. Näistä tuloksista, jotka on esitetty esimerkeissä 1 ja 2, on selvää, että vasta-aineiden määrät, jotka muo- 5 dostuvat yhteisannostelemalla halkaistua HA:ta yleisesti ottaen olivat pienemmät kuin ne, joita yhteisannosteltiin inaktivoidulla kokoviruksella, kuten voidaan nähdä kuviosta 1 ja kuvioiden 2 ja 4 ja kuvioiden 3 ja 5 vertailusta. Esimerkeissä 1 ja 2 suoritetuissa kokeissa käytettiin luonnollisia eläimiä yhteisan- 10 nostelun arvioimiseksi. Esimerkki 3: 15 sä. Tämä esimerkki kuvaa HA:n yhteisannostelun vaikutusta primeeratuissa eläimis- 8 f ; 20 5 25, 8 5 f t 3 t t t * 5 t. Marsuja primeerattiin joko 1,0 gg:lla inaktivoitua kokovirusta (tulokset on esitetty kuviossa 6) tai 1,0 gg:lla halkaistua HA:ta (tulokset on esitetty kuviossa 7). Kolmen viikon kuluttua marsuille annettiin toinen immunisointi joko yhdellä ainoalla flu-antigeenilla tai yhteisannostelulla flu-antigeeneilla. Tulokset, jotka on esitetty kuvioissa 6 ja 7, osoittavat, että yhteisannostelu ei paranna anti-hatuloksia primeeratuissa eläimissä ja siten yhteisannostelutekniikka on käyttökelpoinen ainoastaan luonnollisissa eläimissä, jos halutaan saavuttaa parempi immuunivastaus. Nämä tulokset osoittavat myös, että erinomainen antigeeni muistivasteiden herättämiseksi oli HA(p) yksinomaan, kun taas immunisointi HA(p):llä ensimmäisellä ja toisella immunisoinnilla ei tuottanut merkittävää immuunivastetta. Nämä tulokset osoittavat, että HA(p) voi herättää muisti-immuunivasteita 30 HA-antigeenille, mutta ei voi itse tuottaa muistia.
10 Fsimerkki 4 5 Tämä esimerkki osoittaa B hureflorferi spirokeetti OspA -proteiinin eri fysiokemiallisten muotojen vaikutusta. OspA-lipoproteiini (OspA-L) on hyvin vahva immunogeeni. Lipidiosuuden poisto OspA:sta vähentää sen immunogeenisyyttä kohtalokkaasti, mutta ei sen antigeenisyyttä, kuten on kuvattu julkaisussa WO 93/08299. 10 Pieni annos OspA-L:ää yhteisannosteltiin C3H/He-hiirille yhdessä suuren annoksen OspA-NL:n kanssa ja vastetta vertailtiin niihin vasteisiin, jotka saatiin OspA-L:llä tai OspA-NL:llä yksinomaan. Hiiret immunisoitiin päivinä 0 ja 21 antigeeneillä ja hiiristä otettiin verta 35. päivänä. Hiiristä otetun seerumin ELISA-analyysin liuotuskäyrät piirrettiin graafisesti ja tulokset on esitetty kuvios- 15 sa 8. Myös immuunivasteet on esitetty kuviossa 9. Kuten näistä tiedoista voidaan nähdä, OspA-vasteen vahvistaminen saavutettiin yhteisannostelemalla OspA-L:ää ja OspA-NL:ää verrattuna annosteluun OspA-L:ää ja OspA-NL:ää yksinomaan. Selityksen yhteenveto II. ' 25 Tämän selityksen yhteenvetona todetaan, että esillä oleva keksintö sai aikaan uuden menetelmän koostumuksen valmistamiseksi paremman immuunivasteen saamiseksi virus-antigeenille yhteisannostelemalla antigeenia eri fysiokemiallisissa muodoissa. Muutokset ovat mandollisia keksinnön piirissä.
11 Viitteitä 5 1. "Mechanisms of T cell-b Interaction", Singer et al Ann. Rev. Immumol. 1983, 1:211-41. 2. "Antigen presentation in Acquired Immunological Tolerance", Parker et al, The FASEB Journal, Vol. 5, Ict. 1991, pp. 2771-2784. 3. "Do Small B Cells Induce Tolerance", Eynon et al, Transplantation Proceed- 10 ings, Vol. 23, No 1 (February) 1991: pp. 729-730. 15 4. "Small B Cells as Antigen-Presenting Cells in the Induction of Tolerance to Soluble Protein Antigens", by Eynon et al, J. Exp. Med. Vol. 175, January 1992, pp. 131-138. 5. "Role of B Cell Antigen Processing and Presentation in the Humoral Immune Response", Myers, The FASEB Journal, Vol. 5, August 1991, pp. 2547-2553. 6. "Antigen Presentation by Hapten-Specific B Lymphocytes", Abbas et al, J. Immun. Vol 135, No. 3, Sept. 1985, pp. 1661-1667. 7. "Requirements for the Processing of Antigen by Antigen-Presentatig B Cells", Grey et al, J. Immun., Vol. 129, No. 6, Dec. 1982, pp. 2389-2395. 8. "Antingen-Specific B Cells Efficiently Present Low Doses of Antigen for Induction of T Cell Proliferation", Malynn et al, J. Immun. Vol 135, No. 2, Aug. 1985, pp. 980-987. 9. "Antigen-Presenting Function of the Macrophage", Unanue, Ann. Rev. Immunol., 1985, 2: 395-428.
12 10. "Analysis of TX Lymphocyte Reactivity to Complex Antigen Mixtures by the Use of Proteins coupled to Latex Beads", Wirbelauer et al, Immun. Letters, 23 (1989/1990), 257-262. 5 11. "The Function and Interrelationships of T. Cell Receptors, 1r Genes and other Histocompatibility Gene Products", Katz et al, Transplant. Rev. (1975), Vol 22, pp. 175-195. 12. "Restricted Helper function of F. Hybrid T Cells Positively Selected to Het- 10 erologous Erythtrocytes in Irradiated Parental Strain Mice I", Sprent, J. Exp. Med., 1978, Vol 147, pp. 1142-1158. 13. "Restricted Helper Function of F. Hybrid T Cells Positively Selected to Heterologous Erythrocytes in Irradiated Parental Strain Mice. II", Sprent, J. Exp. 15 Med., 1978, Vol 147, pp. 1159-1174. 14. The Role of H-2-Linked Genes in Helper T-Cell Function", Swierkosz et al, J. Exp. Med., 1978, Vol 147, pp. 554-570. 15. "Role of the major Histocompatibily Complex in T Cell Activation of B Cell Subpopulations", Singer et al, J. Exp. Med., 1981, Vol 154, pp. 501-516. 16. "Antigen-specific Interaction between T and B Cells", Lanzavecchia, Nature, Vol. 314, April 1985, pp. 537-539.
13 Patenttivaatimukset 1. Menetelmä koostumuksen valmistamiseksi immuunivasteen aikaansaamiseksi antigeenille eläimessä, tunnettu siitä, että koostumus formuloidaan rokot- 5 teessa fysiologisesti hyväksyttävän kantajan kanssa ja mainitun antigeenin ensimmäinen fysiokemiallinen muoto suosii antigeenin tuomista B-soluilla T-soluille eläimessä, ja mainitun antigeenin toinen fysiokemiallinen muoto suosii antigeenin tuomista apusoluilla T-soluille eläimessä. 10 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ensimmäinen fysiokemiallinen muoto on mainitun antigeenin liukoinen muoto ja mainittu toinen fysiokemiallinen muoto on antigeenin liukenematon muoto. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 15 antigeenin toinen fysiokemiallinen muoto on lipidoitu ja toinen fysiokemiallinen muoto on lipidoimaton. 4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeenin toinen fysiokemiallinen muoto on proteiini, jossa on hydrofobinen alue ja toinen on proteiini, josta puuttuu hydrofobinen alue. * 25 * * 5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeenin toinen fysiokemiallinen muoto on proteiini, jota on käsitelty siten, että se sisältää erityisen epitoopin ja/tai alueen ja toinen on proteiini, josta puuttuu mainittu erityinen epitooppi ja/tai alue. 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeenin toinen fysiokemiallinen muoto on liukoinen, kun taas toinen on liukenematon ja/tai hiukkasmainen. 7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että
14 mainittu antigeeni on virus-, bakteeri-, sieni-, alkueläin- tai parasiittiproteiini. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu antigeeni on HA-antigeeni influenssaviruksesta, gp120-proteiini HIV-viruksesta 5 tai OspA-proteiini. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että antigeeni on HA ja mainitun antigeenin eri fysiokemialliset muodot käsittävät inaktivoitua kokovirusta ja HA(p):ta, tai antigeeni on OspA ja antigeenin eri fysiokemialliset 10 muodot käsittävät fi burpylorferin OspA-L:ää ja OspA-NL:ää.
.. 15 Patentkrav 1. Förfarande för framställning av en sammansättning för att åstadkomma ett immunsvar till en antigen i ett djur, kännetecknat därav, att en samman- 5 sättningen formuleras med en fysiologiskt acceptabel bärare i ett vaccin och första fysiokemisk form av nämnda antigen favoriserar presentation av antigenen med B-celler till T-celler i djuret, och en andra fysiokemisk form av nämnda antigen befrämjar presentationen av antigenet med tilläggsceller till T-celler i djuret. 10 2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat därav, att nämnda första fysiokemiska form är en löslig form av nämnda antigen och nämnda andra fysiokemiska form är en olöslig form av nämnda antigen. 3. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat därav, att den ena 15 fysiokemiska formen av antigenen är lipidiserad och den andra fysiokemiska formen är icke-lipidiserad. = = 20 4. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat därav, att den ena fysiokemiska formen av antigenen är ett protein med ett hydrofobiskt område och den andra är ett protein som saknar hydrofobiskt område. 1 25 5. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat därav, att den ena fysiokemiska formen av antigenen är ett protein som behandlats att innehålla en specifik epitop och/eller ett område och den andra är ett protein som saknar en sådan specifik epitop och/eller område. 6. Förfarande enligt något av patentkraven 1-5, kännetecknat därav, att den ena fysiokemiska formen av antigenen är löslig och att den andra är olöslig och/eller partikelformig. 7. Förfarande enligt något av patentkraven 1-6, kännetecknat därav, att
16 nämnda antigen är ett virus, ett bakterie-, ett svamp-, ett protozan- eller ett parasitprotein. 8. Förfarande enligt patentkrav 7, kännetecknat därav, att nämnda antigen 5 är HA-antigenen från influenza-virus, gp120-proteinet från HIV-virus eller OspA-proteinet. 9. Förfarande enligt patentkrav 8, kännetecknat därav, att nämnda antigen är HA och de olika fysiokemiska formerna av antigenen innefattar inaktiverat 10 helvirus och HA(p) eller antigenen är OspA och de olika fysiokemiska formerna av nämnda antigen innefattar OspA-L och OspA-NL av R hurgdorferi
Kuvio 1 HAp:n samanaikainen annostelu inaktivoidun kokoviruksen ja A/Taiwanin halkaistun HA:n kanssa Laura Fergusonin CHS-4-tutkimuksesta 8000 E-1 z 0 6000 4000 2000 2 3 4 5 6 7 8 Immunisointiryhmät Q Päivä 21 - Ensimmäinen vastaus EE3 Päivä 35 - Toinen vastaus MM Päivä 49 - Toinen vastaus MM Päivä 77 - Toinen vastaus Luettelo käyrän immunisointiryhmistä Ryhmä 1-1,0 pg HAp Ryhmä 2-1,0 pg halkaistua HA:ta Ryhmä 3-0,1 pg halkaistua HA:ta Ryhmä 4-0,1 pg inaktivoitua kokovirusta Ryhmä 5-1,0 pg inaktivoitua kokovirusta Ryhmä 6-1,0 pg HAp + 1,0 pg halkaistua HA:ta Ryhmä 7-1,0 pg HAp + 1,0 pg inaktivoitua kokovirusta Ryhmä 8-1,0 pg HAp + 0,1 pg inaktivoitua kokovirusta
Kuvio 2 HAp:n yhteisannostelu A/Taiwanista saadun inaktivoi4un kokoviruksen kanssa Co-adminFlu 2 -tutkimuksesta 350 300 250 200 100 50 0 1 2 3 4 5 6 7 Immunisointiryhmät [::] Päivä 21 - Ensimmäinen vastaus Effil Päivä 35 - Aikainen toinen vastaus lel Päivä 49 - Myöhäinen toinen vastaus 1 0 ; Luettelo käyrän immunisointiryhmistä Ryhmä 1-1,0 pg HAp Ryhmä 2-1,0 pg inaktivoitua kokovirusta Ryhmä 3-0,1 pg inaktivoitua kokovirusta Ryhmä 4-0,01 pg inaktivoitua kokovirusta Ryhmä 5-1,0 pg HAp + 1,0 gg inaktivoitua kokovirusta : Ryhmä 6-1,0 pg HAp + 0,1 pg inaktivoitua kokovirusta Ryhmä 7-1,0 pg HAp + 0,01 pg inaktivoitua kokovirusta
Kuvio 3 IgG:n anti-ha-vastaus HAp:n ja A/Taiwanista saadun inaktivoidun kokoviruksen yhteisannostelulle Co-adminFlu 2 -tutkimuksesta 3000 4-) cn 2000 1 4.) 1500 0 ba 1000 1-4 500 1 3 4 5 6 7 Immunisointiryhmät ED Päivä 21 - Ensimmäinen vastaus Päivä 35 - Aikainen toinen vastaus ENE Päivä 49 - Myöhäinen toinen vastaus Luettelo käyrän immunisointiryhmistä Ryhmä 1-1,0 pg HAp Ryhmä 2-1,0 gg inaktivoitua kokovirusta Ryhmä 3-0,1 pg inaktivoitua kokovirusta Ryhmä 4-0,01 pg inaktivoitua kokovirusta Ryhmä 5-1,0 pg HAp + 1,0 pg inaktivoitua kokovirusta Ryhmä 6-1,0 pg HAp + 0,1 pg inaktivoitua kokovirusta Ryhmä 7-1,0 pg HAp + 0,01 pg inaktivoitua kokovirusta
Kuvio 4 HAp:n yhteisannostelu A/Taiwanista saadun halkaistun HA:n kanssa Co-adminFlu 2 -tutkimuksesta 203 150 50 0 1 2 3 4 5 6 7 Immunisointiryhmät E..= Päivä 21 - Ensimmäinen vastaus EM Päivä 35 - Aikainen toinen vastaus MW Päivä 49 - Myöhäinen toinen vastaus Luettelo käyrän immunisointiryhmistä Ryhmä 1-1,0 pg HAp Ryhmä 2-1,0 pg halkaistua HA:ta Ryhmä 3-0,1 pg halkaistua HA:ta Ryhmä 4-0,01 pg halkaistua HA:ta Ryhmä 5-1,0 pg HAp + 1,0 pg halkaistua HA:ta Ryhmä 6-1,0 pg HAp + 0,1 pg halkaistua HA:ta Ryhmä 7-1,0 pg HAp + 0,01 pg halkaistua HA:ta
Kuvio 5 IgG:n anti-ha-vastaus HAp:n ja A/Taiwanista saadun halkaistun HA:n yhteisannostelulle Co-adminFlu 2 -tutkimuksesta 1500 :0 1000 4.3 500 bo 0 1 2 3 4 5 6 7 Immunisointiryhmät ED Päivä 21 - Ensimmäinen vastaus 00 Päivä 35 - Aikainen toinen vastaus Mill Päivä 49 - Myöhäinen toinen vastaus Luettelo käyrän immunisointiryhmistä Ryhmä 1-1,0 pg HAp Ryhmä 2-1,0 pg halkaistua HA:ta Ryhmä 3-0,1 pg halkaistua HA:ta Ryhmä 4-0,01 pg halkaistua HA:ta Ryhmä 5-1,0 pg HAp + 1,0 pg halkaistua HA:ta Ryhmä 6-1,0 pg HAp + 0,1 pg halkaistua HA:ta Ryhmä 7-1,0 pg HAp + 0,01 pg halkaistua HA:ta
Kuvio 6 Yhteisannostelun vaikutus toissijaisiin immuunivastauksiin A/Taiwanille Laura Fergusonin FluPrime-1 tutkimuksesta 400 Immunisoitu A/Taiwanilla ja B/Panamalla Analysoitu Anti-A/Taiwanin vaikutus 300 0 1-1 200 100 0 1 2 3 4 5 Immunisointiryhmät Päivä 21 - Ensimmäinen vastaus Em Päivä 28 - Toinen vastaus Mee Päivä 35 - Toinen vastaus Ryhmä # Ensimmäinen immunisointi Toinen immunisointi 1 1,0 gg HAp 1,0 gg HAp 2 1,0 gg inaktivoitua kokovirusta 0,1 gg inaktivoitua kokovirusta 3 1,0 gg inaktivoitua kokovirusta 1,0 gg HAp + 0,1 g inaktivoitua kokovirusta 4 1,0 gg inaktivoitua kokovirusta 1,0 gg HAp + 0,1 gg halkaistua HA:ta 5 1,0 gg inaktivoitua kokovirusta 1,0 gg HAp. 47!P
Kuvio 7 Yhteisannostelun vaikutus toissijaisiin immuunivastauksiin A/Taiwan HA:lle Co-adminFlu 3 -tutkimuksesta 400 300 o 200 100 0 1 2 3 4 5 6 Immunisointiryhmät E=3 Päivä 0 - Ennen verenottoa ma Päivä 21 - Ensimmäinen vastaus 1E1 Päivä 35 - Aikainen toinen vastaus 1111 Päivä 49 - Myöhäinen toinen vastaus Ryhmä # Ensimmäinen immunisointi Toinen immunisointi 1 1,0 gg HAp 1,0 gg HAp 2 0,1 gg halkaistua HA:ta 0,1 gg halkaistua HA:ta 3 1,0 gg HAp + 0,1 mg halkaistua HA:ta 1,0 gg HAp + 0,1 gg halkaistua HA:ta 4 1,0 gg halkaistua HA:ta 1,0 g HAp + 0,1 gg halkaistua HA:ta 5 1,0 gg halkaistua HA:ta 1,0 gg halkaistua HA:ta 6 1,0 gg halkaistua HA:ta 1,0 HAp
Kuvio 8 Seerumin laimennus (log -1 ) o Ennen verenottoa 50 ng OspA-L 100 ng OspA-L 100 ng OspA-NL 500 ng OspA-NL 50 ng OspA-L + 50 ng OspA-NL 50 ng OspA-L + 500 ng OspA-NL ELISAn laimennuskäyrät seerumeista, jotka on on saatu C3H-hiiristä, jotka on immunisoitu 0. ja 21. päivänä osoitetuilla antegeeneilla. Hiiristä otettiin verta 35. päivänä.
Kuvio 9 Toissijainen immuunivastaus OspA-L:n ja OspA-NL:n yhteisannostelulle 3.5 3.0 2.5 ro /0-2 1.0 0.5 0.0 0.01 0.02 0..03 Seerumin konsentraatio (1 / seerumin laimennus) o Seerumi ennen verenottoa 100 ng OspA-L V 500 ng OspA-NL 100 ng OspA-L + 500 ng OspA-NL,