TKK Solubiosysteemien perusteet syksy 2002 Harkkatyö M.Tarvainen Proteiinin rakenteen selvittämisestä ja visualisoinnista 1. Yleistä proteiineista 2. Röntgensädekristallografia 3. Ydinmagneettinen resonanssimenetelmä (NMR) 4. Elektronimikroskopia 5. Koordinaattitiedostot 6. Esimerkki PDB-tiedostosta 7. Proteiinien visualisointi 8. Visualisointiin käytettyjä ohjelmistoja 9. Esimerkkejä Protein Explorerilla tehdyistä kuvista 10. Lähteet 1. Yleistä proteiineista Proteiinit ovat aminohapoista koostuvia polymeerejä, jotka osallistuvat erilaisiin solun toimintoihin. Proteiinin toiminnan määrää sen kolmiulotteinen rakenne. Kolmiulotteinen rakenne taas riippuu pääasiassa proteiinin aminohappojärjestyksestä, joka taas on koodattuna DNA:n emäsjärjestykseen. Lisäksi muotoon vaikuttaa proteiinin kemiallinen ja fysikaalinen ympäristö, esim. ph-arvo ja lämpötila. Proteiinien synteesissä käytetään solussa 21:ä erilaista aminohappoa. Kaikkia proteiinin rakenteeseen vaikuttavia tekijöitä ei kuitenkaan tunneta tarkasti. Siksi ei kyetä pelkän aminohappojärjestyksen perusteella saamaan selville proteiinin muotoa, joka taas voisi kertoa jotain sen tehtävistä soluissa. Laskennallisia menetelmiä proteiinin rakenteen ennustamiseksi aminohappojärjestyksen pohjalta yritetään kehittää (Ks. Leo Lahti: Laskennallisia näkökulmia proteiinien laskostumisongelmaan, www.lce.hut.fi/teaching/s-114.500/2002/foldaus.pdf ). Proteiinin laskostumiseen (kolmiulotteisen rakenteen syntymiseen) vaikuttaa kuitenkin niin monia tekijöitä (kaikkia ei välttämättä edes tunneta), että ongelmaa ei ole vielä kyetty selvittämään. Toistaiseksi ennustamismenetelmät käyttävät hyödyksi jo tunnettuja rakenteita, joiden aminohappoketjuilla on yhtäläisyyksiä tutkittavan ketjun kanssa.
Ainakin siis toistaiseksi tarvitaan proteiinien kolmiulotteisen rakenteen kokeellista selvittämistä jo edellä mainituista syistäkin johtuen.. Tällä hetkellä rakenteita on selvitetty n. 20 000. Tässä selostuksessa tehdään pääpiirteittäin matka proteiinin rakenteen selvittämisestä - tiedon tallentamisen kautta - datan visualisointiin. Ensin käsitellään kolmea eri menetelmää, joilla rakennetta voidaan tutkia. 2. Röntgensädekristallografia Röntgensädekristallografiassa käytetään hyödyksi röntgensäteiden diffraktoitumista. Röntgensäteitä suunnataan proteiininäytteeseen, joka on kristallisoitunutta ts. muodostuu säännöllisistä rakenteista. Röntgensäteiden diffraktoitumisen vuoksi saadaan filmille kuva, josta voidaan päätellä elektronien tiheyden jakautuma. Luotettavan tuloksen saamiseksi tarvitaan usein satoja eri kuvia, joissa on proteiiniin on lisätty eri raskasmetalliatomeja. Röntgensädekristallografia etuna on se, että sillä voidaan tutkia melko suuria proteiineja, mutta heikkoutena se, että proteiini täytyy saada ensin kristallisoituneeseen muotoon, mikä ei ole mahdollista kaikkien proteiinien kohdalla. Proteiinin rakenne saattaa myös olla kristallisoituneena hieman erilainen kuin solun ympäristössä. Proteiineja, joita ei ole kyetty kristallisoimaan, voidaan tutkia ydinmagneettisella resonanssimenetelmällä. 3. Ydinmagneettinen resonanssimenetelmä (NMR) NMR- tekniikka (Nuclear magnetic resonance) perustuu radiotaajuisten pulssien aiheuttamalle resonanssille atomissa. Kun atomit asetetaan voimakkaaseen magneettikenttään ja annetaan erilaisia pulsseja, ne emittoivat radiotaajuista säteilyä. Kukin atomi emittoi säteilyä omalla taajuudella, johon vaikuttaa myös atomin fysikaalinen ympäristö. Vertaamalla annettuja pulsseja eri atomien emittoimiin pulsseihin voidaan päätellä atomien keskinäiset sijainnit. NMR- tekniikan etuna on se, että näytteen ei tarvitse olla kristallisoitunut, mutta haittapuolena sillä ei voi tutkia yhtä suuria proteiineja kuin röntgensädekristallografialla. 4. Elektronimikroskopia Elektronimikroskopialla voidaan tutkia proteiinin kvarternäärirakennetta pienellä resoluutiolla. Vain joissain tapauksissa sen avulla voidaan päätellä peptidiketjun reitti proteiinissa.
5. Koordinaattitiedostot Kun tutkittavan proteiinin rakenne on selvitetty, informaatio pitää saada muotoon, jota muutkin tutkijat voivat helposti käyttää. Tätä varten on kehitetty monia eri tiedostostandardeja. Yleisin ja laajimmin eri ohjelmistoissa tuettu - vaikkakin monilta osin puutteellinen tiedostomuoto on PDF. Uudempi parempi standardi on mmcif, mutta Protein Data Bank tukee tulevaisuudessakin molempia formaatteja. PDF-muoto kehitettiin 1970-luvun alkupuolella. Sillä voidaan toki kuvata proteiinien lisäksi muitakin molekyylejä. PDF-tiedosto sisältää atomin koordinaatit, tietoja tutkijoista ja tulokseen johtaneista tutkimusmenetelmistä yms. Tiedostossa on myös eritelty erikseen esim. aminohappojärjestykset ja sekundäärirakenteet (alfa-kierteet, beeta-levyt, käännökset jne.) Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb) kokoaa tietoja proteiineista, ja säilyttää PDFtiedostojen lisäksi proteiinien tietoja myös mmcif-muodossa. Tällä hetkellä selvitettyjä rakenteita on n. 20 000. PDF-tiedosto on ASCII-tiedosto, joka sisältää esim. seuraavanlaisia asioita (ks. esimerkkitiedosto): Rivin nimeke: HEADER COMPND SOURCE AUTHOR REVDAT JRNL REMARK SPRSDE SEQRES FTNOTE Otsikko, tiedoston nimi, päiväys Proteiinin nimi Organismi, josta proteiinia on tutkittu Tutkijoiden nimet Muutoksia, joita tehty julkaisun jälkeen Kirjallisuusviitteitä Viittauksia muuhun kirjallisuuteen, jossa ko. proteiinia on käsitelty Vanhempia koordinaattitiedostoa samalle proteiinille Aminohappojärjestys Huomautuksia HET,FORMUL Aineita, jotka eivät varsinaisesti kuulu ko. proteiiniin HELIX, Sekundäärirakenteet erikseen lueteltuna SHEET,TURN
CRYST1, Kristallirakenteisiin liittyvää tietoa (jos tutkittu röntgensädekristallografialla) ORIG,SCALE ATOM, HETATOM CONECT MASTER END Yksittäisten atomien koordinaatit Sidokset, joissa mukana proteiiniin kuulumattomia atomeja Tiettyjen tiedoston rivien määriä yhteenlaskettuna Tiedoston loppu 6. Esimerkki PDB-tiedostosta Tyypillinen PDB-tiedosto sisältää tuhansia rivejä, joten tähän on otettu esimerkiksi lyhennelty versio (PDB-koodi 1hh0, osa hemoglobiini-proteiinista) HEADER OXYGEN TRANSPORT 10-JUN-83 1HHO 1HHO 3 COMPND HEMOGLOBIN A (OXY) 1HHO 4 SOURCE HUMAN (HOMO SAPIENS) 1HHO 5 AUTHOR B.SHAANAN 1HHO 6 REVDAT 2 31-JAN-84 1HHOA 1 JRNL 1HHOA 1 REVDAT 1 27-OCT-83 1HHO 0 1HHO 7 JRNL AUTH B.SHAANAN 1HHO 8 JRNL TITL STRUCTURE OF HUMAN OXYHAEMOGLOBIN AT 2.1 ANGSTROMS 1HHOA 2 JRNL TITL 2 RESOLUTION 1HHOA 3 JRNL REF J.MOL.BIOL. V. 171 31 1983 1HHOA 4 JRNL REFN ASTM JMOBAK UK ISSN 0022-2836 070 1HHOA 5 REMARK 1 1HHO 13 REMARK 1 REFERENCE 1 1HHO 14 REMARK 1 AUTH B.SHAANAN 1HHO 15 REMARK 1 TITL THE IRON-OXYGEN BOND IN HUMAN OXYHAEMOGLOBIN 1HHO 16 REMARK 1 REF NATURE V. 296 683 1982 1HHO 17 REMARK 1 REFN ASTM NATUAS UK ISSN 0028-0836 006 1HHO 18 REMARK 2 1HHO 19 REMARK 2 RESOLUTION. 2.1 ANGSTROMS. 1HHO 20 REMARK 4 RELATES THE ALPHA-1 SUBUNIT TO BETA-1. COORDINATES ARE 1HHO 29 REMARK 4 GIVEN FOR THE ALPHA-1-BETA-1 DIMER AND THOSE FOR 1HHO 30 REMARK 4 ALPHA-2-BETA-2 ARE OBTAINED BY ROTATION OF 180 DEGREES 1HHO 31 REMARK 4 ABOUT Y. THE Y AXIS (MOLECULAR DIAD) IS A CRYSTALLOGRAPHIC 1HHO 32 REMARK 4 TWO-FOLD AXIS. 1HHO 33 SEQRES 1 A 141 VAL LEU SER PRO ALA ASP LYS THR ASN VAL LYS ALA ALA 1HHO 34 SEQRES 2 A 141 TRP GLY LYS VAL GLY ALA HIS ALA GLY GLU TYR GLY ALA 1HHO 35 SEQRES 3 A 141 GLU ALA LEU GLU ARG MET PHE LEU SER PHE PRO THR THR 1HHO 36 SEQRES 4 A 141 LYS THR TYR PHE PRO HIS PHE ASP LEU SER HIS GLY SER 1HHO 37 SEQRES 5 A 141 ALA GLN VAL LYS GLY HIS GLY LYS LYS VAL ALA ASP ALA 1HHO 38 SEQRES 6 B 146 LYS VAL LEU GLY ALA PHE SER ASP GLY LEU ALA HIS LEU 1HHO 50 SEQRES 7 B 146 ASP ASN LEU LYS GLY THR PHE ALA THR LEU SER GLU LEU 1HHO 51
SEQRES 8 B 146 HIS CYS ASP LYS LEU HIS VAL ASP PRO GLU ASN PHE ARG 1HHO 52 SEQRES 9 B 146 LEU LEU GLY ASN VAL LEU VAL CYS VAL LEU ALA HIS HIS 1HHO 53 SEQRES 10 B 146 PHE GLY LYS GLU PHE THR PRO PRO VAL GLN ALA ALA TYR 1HHO 54 SEQRES 11 B 146 GLN LYS VAL VAL ALA GLY VAL ALA ASN ALA LEU ALA HIS 1HHO 55 SEQRES 12 B 146 LYS TYR HIS 1HHO 56 FTNOTE 1 1HHO 57 FTNOTE 1 A TEMPERATURE FACTOR OF 100.00 INDICATES AN ATOM THAT IS 1HHO 58 FTNOTE 1 NOT WELL DEFINED. 1HHO 59 HET HEM A 1 45 PROTOPORPHYRIN IX GROUP CONTAINS FE++ 1HHO 60 HET HEM B 1 45 PROTOPORPHYRIN IX GROUP CONTAINS FE++ 1HHO 61 HET PO4 126 5 PHOSPHATE GROUP 1HHO 62 FORMUL 3 HEM 2(C34 H32 N4 O6 FE1 ++) 1HHO 63 FORMUL 4 HOH *109(H2 O1) 1HHO 64 FORMUL 5 PO4 *O4 P1 1HHO 65 HELIX 1 AA SER A 3 GLY A 18 1 1HHO 66 HELIX 2 AB HIS A 20 SER A 35 1 1HHO 67 HELIX 3 AC PHE A 36 TYR A 42 1 1HHO 68 HELIX 4 AD HIS A 50 GLY A 51 1 DEGEN 2 RES HLX RETAIN HOMOL 1HHO 69 HELIX 5 AE SER A 52 ALA A 71 1 1HHO 70 HELIX 15 BG ASP B 99 HIS B 117 1 1HHO 80 HELIX 16 BH THR B 123 HIS B 143 1 1HHO 81 CRYST1 53.700 53.700 193.800 90.00 90.00 90.00 P 41 21 2 8 1HHO 82 ORIGX1 -.369493.707114 -.602812 28.50700 1HHO 83 ORIGX2.369493.707114.602812 28.50700 1HHO 84 ORIGX3.852534 0.000000 -.522635 0.00000 1HHO 85 SCALE1 -.006881.013168 -.011226.53086 1HHO 86 SCALE2.006881.013168.011226.53086 1HHO 87 SCALE3.004399 0.000000 -.002697 0.00000 1HHO 88 ATOM 1 N VAL A 1 5.287 16.725 4.830 1.00 77.31 1HHO 89 ATOM 2 CA VAL A 1 5.776 17.899 5.595 1.00 70.91 1HHO 90 ATOM 3 C VAL A 1 7.198 18.266 5.104 1.00 81.71 1HHO 91 ATOM 4 O VAL A 1 7.301 19.067 4.161 1.00 77.16 1HHO 92 ATOM 5 CB VAL A 1 5.498 17.697 7.118 1.00 51.33 1HHO 93 ATOM 6 CG1 VAL A 1 6.457 16.822 7.917 1.00 78.39 1HHO 94 ATOM 7 CG2 VAL A 1 5.211 18.976 7.922 1.00 48.23 1HHO 95 ATOM 8 N LEU A 2 8.272 17.653 5.632 1.00 67.33 1HHO 96 ATOM 9 CA LEU A 2 9.698 18.050 5.442 1.00 27.11 1HHO 97 ATOM 10 C LEU A 2 10.047 19.267 6.283 1.00 33.71 1HHO 98 ATOM 11 O LEU A 2 9.566 20.404 6.099 1.00 55.97 1HHO 99 ATOM 12 CB LEU A 2 10.129 18.317 4.001 1.00 30.38 1HHO 100 ATOM 13 CG LEU A 2 10.208 17.036 3.175 1.00 29.73 1HHO 101 HETATM 2370 O HOH 101 13.353 4.872-25.923 1.00 47.91 1HHO2458 HETATM 2371 O HOH 102 14.347 5.418-28.379 1.00 37.78 1HHO2459 HETATM 2372 O HOH 103 12.894 3.552-28.856 1.00 43.99 1HHO2460 HETATM 2373 O HOH 105-1.665 17.886-11.236 1.00 54.82 1HHO2461 HETATM 2374 O HOH 106 1.103 1.291-1.908 1.00 45.22 1HHO2462 HETATM 2375 O HOH 107 29.861-8.827 16.448 1.00 46.83 1HHO2463 CONECT 2282 2280 1HHO2578 CONECT 2283 2240 2284 1HHO2579 CONECT 2284 2283 1HHO2580 CONECT 2394 2395 2396 2397 2398 1HHO2581 CONECT 2395 2394 1HHO2582 CONECT 2396 2394 1HHO2583 CONECT 2397 2394 1HHO2584 CONECT 2398 2394 1HHO2585 MASTER 24 3 3 16 0 0 0 6 2396 2 99 23 1HHOA 9 END 1HHO2587
7. Proteiinien visualisointi Proteiinin rakenne on yleensä hyvin monimutkainen ja se sisältää suuren määrän atomeja. Siksi sen esittämisellä perinteisellä pallo-tikku-menetelmällä ei ole juuri mitään käytännön arvoa. Koska proteiinin toiminta perustuu erilaisiin sekundäärirakenteisiin ja motiiveihin (sekundäärirakenteiden yhdistelmiin, joilla on tietty kolmiulotteinen muoto), proteiineja kannattaa esittää tavoilla, joissa nämä oleelliset rakenteet näkyvät - sen sijaan että visualisoitaisiin proteiini atomi atomilta. Eri tapoja voidaan käyttää sen mukaan, mitä rakenteesta halutaan kulloinkin päätellä (Ks. Protein Explorerilla otettuja kuvia). 8. Visualisointiin käytettyjä ohjelmistoja Proteiinien visualisointiin käytettyjä ohjelmistoja ovat mm. VMD, RasMol, Chime ja Protein Explorer. Nämä ohjelmat lukevat kaikki PDF-tiedostoja, osa myös monia muitakin. Protein Explorer käyttää Chimeä (selaimeen asennettava plug in, joka visualisoi PDF-tiedostoja), mutta sisältää huomattavan paljon ominaisuuksia, joita ei Chimessä ole. Protein Explorerilla ei voi kuitenkaan tutkia eri molekyylien välisiä interaktioita, eikä sillä pysty muokkaamaan molekyyliä. Sillä voi siis vain tutkia jo olemassa olevaa koordinaattitiedostoa havainnollistamalla siinä olevaa dataa. Tästäkin huolimatta sillä voi tehdä yllättävän paljon. Protein Exploreria voit käyttää webissä osoitteessa www.proteinexplorer.org tai asentaa sieltä sen omalle koneellesi. Sieltä löydät myös ohjeet Chimen asentamiseen selaimeesi. Ohjelman avulla on helppo tutustua proteiinien rakenteeseen se toimi siis ainakin allekirjoittaneen tapauksessa opetusohjelmana. Täysveriselle ammattilaiselle ohjelma ei tosin anna mitään mullistavaa, vaikka tekijät tuntuvat antavan niin ymmärtää. Voit antaa ohjelmalle haluamasi proteiinin PDB-koodin, jolloin ohjelma noutaa sen verkon kautta suoraan Protein Data Bankista. Vaihtoehtoisesti voit antaa URL-osoitteen, joka sisältää tiedoston. Webissä käytettynä ohjelma siirtää sinut halutessasi muille sivuille, joissa käsitellään asiaa, josta haluat lisää tietoa, ellei sitä löydy itse ohjelmasta. Se sisältää myös linkkejä sivuille, joilla voit tehdä temppuja, joita ei Protein Explorissa voi tehdä. Linkin kautta voit esim. laskea minkä tahansa proteiinin varauksen haluamassasi ph-ympäristössä, tai voit laskea, missä ph:ssa varaus on neutraali. 9. Esimerkkejä Protein Explorerilla tehdyistä kuvista: (Esimerkkikuvat on tehty käyttäen erästä Protein Data Bankista saatua PDB- tiedostoa)
Kuva 1 : Kuva 2: Kuva 3: Kuva 4: Kuva 5: Kuva 6: Pallo-tikku-kuva, jossa värityksillä on kuvattu yksittäisten atomien lämpövärähtelyä tai mahdollisia poikkeamia tietyn atomipaikan sijainnissa kiteen eri kohdissa. (Ilmiöitä ei voi erottaa toisistaan ) Cartoon-kuva, jossa alfa-kierteet on kuvattu punaisella ja beeta-levyt keltaisella. Cartoon-kuva, jossa aminohappoketjujen suunnat on kuvattu aminopäästä karboksipäähän - sinisestä punaiseen. Kuvassa näkyy kaksi eri ketjua. Cartoon-kuva, jossa molemmat ketjut väritetty omilla väreillään. Vine-kuva, jossa näkyy pääketju ja siitä lähtevät sivuketjut. Lisäksi väreillä on kuvattu sivuketjujen kemiallisia ominaisuuksia, esim. vesipakoiset ketjut ovat harmaita. Surface-kuva, joka kertoo, kuinka lähelle proteiinia toinen molekyyli voi tulla. Tässä tapauksessa on kuvattu pintaa, jota lähimmäksi ei pääse pallo, jonka säde on 1,4 ångströmiä. (Vastaa hyvin vesimolekyylejä, joiden seassa proteiini solussa lilluu) Kuva 1 (Ball and stick) Kuva 2 (Cartoon) Kuva 3 (Cartoon) Kuva 4 (Cartoon) Kuva 4 (Vine) Kuva 5 (Surface)
10. Lähteet: C. Branden, J.Tooze: Introduction to protein structure A. Leach: Molecular modelling principles and applications Protein Data Bankin elektroniset artikkelit osoitteessa www.rscb.org/pdb