1. IMMUNO Aktiengesellschaft, Industriestrasse 67, 1221 Wien, Österreich, (AT)

SUOMI FINLAND 11111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 F I 00008 (B) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSICRIFT C (45) Pat,;;: Āti myöurietty Patent mefidelat 11 12 1ODZI (51) Kv.lk.6 - Int.c1.6 A 61K 39/104, 39/395 (21)Patenttihakemus - Patentansökning 894048 (22)Hakemispäivä - Ansökningsdag 29.08.89 (FI) (24) Alkupäivä - Löpdag 29.08.89 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 01.03.90 Patentti - ja rekisterihallitus (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Patent - och registerstyrelsen Ansökan utl agd och utl.skriften publ i cerad 31.08.95 (71) Hakija - Sökande (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 29.08.88 AT 2113/88 P 1. IMMUNO Aktiengesellschaft, Industriestrasse 67, 1221 Wien, Österreich, (AT) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Rotering, Heinz, Lindenweg 22, 6074 Rödermark-Waldacker, Germany, (DE) 2. Eibl, Johann, Gustav Tschermakgasse 2, 1180 Wien, Österreich, (AT) 3. Dorner, Friedrich, Peterlinigasse 17, 1230 Wien, Österreich, (AT) (74) Asiamies - Ombud: Seppo Laine Oy (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä Pseudomonas aeruginosa-infektioita vastaan vaikuttavien valmisteiden sekä immunoglobuliini-g-pitoisten, Pseudomonas aeruginosa-bakteeria vastaan vaikuttavien valmisteiden tuottamiseksi Förfarande för framställning av Pseudomonas aeruginosa-infektioner motverkande preparat salat immunoglobulin-g-haltiga, bakterien Pseudomonas aeruginosa motverkande preparat (56)Viitejulkaisut - Anförda publikationer FI C 85221 (A 61K 39/104), FI C 86508 (A 61K 39/104) (57) Tiivistelmä - Sammandrag Pseudomonas aeruginosa-infektioita vastaan vaikuttavat rokotteet, jotka sisältävät serotyypin a yhtä ainoaa flagella(h)-antigeeniä tai serotyypin a yhden ainoan'flagella(h)- antigeenin ja serotyypin b flagella(h)-antigeenin yhdistelmät. Keksinnön mukaiset rokotteet saavat aikaan ihmisessä vastaaineiden muodostumisen, jotka vaikuttavat osa-flagella(h)- antigeenien ap, al, a2, a3, a4 ja b kaikkien yhdistelmien Pseudomonas aeruginosa- itiöitä vastaan, jolloin ne estävät itiöiden motiliteetin ja indusoivat tuhoutumisen ihmisen immuunijårjestelmån fagosytoivien solujen avulla I4ot Pseudomonas aeruginosa-infektioner verkande vaccin, som innehåller en enda flagella(h)-antigen av serotypen a eller en kombination av en enda flagella(h)-antigen av serotypen a och av flagella(h)-antigenen av serotypen b. Vaccinet enligt uppfinningen ger i månniskan upphov till bildning av antikroppar, som verkar på Pseudomonas aeruginosa-bakterier av alla kombinationerna av partial-flagella(h)- antigener ao, al, a2, a3, a 4 och b, varvid de håmmar bakteriernas motilitet och inducerar deras utplåning med hjålp av fagocyterande celler i det månskliga immunsystemet.

Menetelmä Pseudomonas aeruginosa-infektioita vastaan vaikuttavien valmisteiden sekä immunoalobuliini-g-pitoisten, Pseudomonas aeruginosa-bakteeria vastaan vaikuttavien valmisteiden tuottamiseksi Keksinnön kohteena on patenttivaatimuksen 1 johdannon mukainen menetelmä sellaisten Pseudomonas aeruginosa-infektioita vastaan vaikuttavien valmisteiden, etenkin rokotteiden, valmistamiseksi, joiden vaikutus ulottuu osa-flagella (H) -antigeenien a o, a 1, a 2, a 3, a 4 ja b kaikkiin yhdistelmiin ja jotka on tarkoitettu aktiivista immunisointia varten. Keksintö koskee myös patenttivaatimuksen 7 johdannon mukaista menetelmää immunoglobuliini-g-pitoisten, Pseudomonas aeruainosa-bakteeria vastaan vaikuttavien valmisteiden tuottamiseksi, jotka valmisteet on tarkoitettu passiivista suojaa varten. Pseudomonas aeruginosa-bakteeri on opportunistisesti patogeeninen taudinaiheuttaja, jota esiintyy usein sairaalainfektioissa, pääasiassa potilailla, joilla on heikentynyt vastustuskyky, sekä palovammapotilailla, henkilöillä, joilla on kystinen fibroosi tai joilla on orgaanisia virhetoimintoja, ja tuumoripotilailla. Antibiootit ovat vain rajoitetusti tehokkaita Pseudomonas-infektioita vastaan resistenssin esiintymisen johdosta, mistä syystä yritetään löytää immunologisia menetelmiä Pseudomonas aeruginosan aiheuttamien infektioiden torjumiseksi. Infektioita voivat aiheuttaa lukuisat kannat, jotka voidaan karakterisoida 0-antigeeneillä (lipopolysakkaridi) ja H-antigeeneillä (flagellit), jolloin H- ja 0-antigeenityypit ovat vapaasti yhdistettäviä. On tunnettua, että Pseudomonas aeruginosan motiliteetti (liikkuvuus) edistää taudinaiheuttajan virulenssia (elinvoimaisuutta) (Montie et al., Infect. Immunity 38, 1296-1298, 1982). Liikkuvilla Pseudomonas aeruginosa-kannoilla on yksi ainoa flagelli. Burned Mouse-mallitutkimukset ovat osoittaneet, että suurempi prosenttimäärä hiiristä jää eloon, jos

2 liikkumattomia Pseudomonas aeruginosa-kantoja inokuloidaan kokeellisesti tuotettuihin palovammoihin, kuin jos käytetään liikkuvia kantoja (Montie et al., ks. yllä). Muut tutkimukset Pseudomonas aeruginosan patogeneesistä ovat osoittaneet,että eläimet, jotka immunisoitiin flagelli-antigeenivalmisteilla, olivat suojattuja, kun niille aiheutettiin palovamma ja infektoitiin bakteerien liikkuvilla kannoilla (Holder et al., Infect. Immunity 35, 276-280, 1982). Pseudomonas aeruginosa-flagelleja tukittiin serologisilla menetelmillä ja osoitettiin, että voitiin erottaa kaksi pääantigeenityyppiä, joita nimitetään R. Ansorgin mukaan (Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A, 242, 228-238, 1978) a-tyypiksi ja b-tyypiksi. a-tyypin flagella(h)-antigeenissä käyttämällä epäsuoraa immunofluoresenssiteknilkkaa voidaan erottaa osa-antigeenit a o, a 1, a 2, a 3 ja a, jotka ilmaistaan (exprimieren) Pseudomonas aeruginosa-kannoista erilaisina yhdistelminä, jolloin osa-antigeeni a o havaitaan kaikissa a-tyyppisissä flagelleissa. b-tyypin flagella(h)-antigeeni käytäytyy serologisesti yhtenäisesti, s.o. mitään alaryhmiä ei voida identifioida. Kaikkiaan Ansorgin mukaan Pseudomonas aeruginosassa voidaan erottaa 17 H-tyyppiä, nimittäin yksi H-tyyppi b ja flagellaantigeenin a 16 H-tyyppiä, jotka koostuvat kaikissa a-tyypeissä esiintyvästä osa-antigeenistä a o ja mandollisesti osa-antigeeneistä a l ja/tai a 2 ja/tai a 3 ja/tai a 4. Pseudomonas aeruqinosa-kantojen 5142 ja 13030 flagellien perusteelliset tutkimukset, jotka kannat Ansorg karakterisoi kuuluviksi yksinomaan alaryhmään a o, osoittivat nämä biokemiallisesti ja immunologisesti identtisiksi b-tyypin flagellien suhteen (Montie et al., Infect. Immunity 49(3), 770-774, 1985). Polydisperssien natiivisten (luontaisten) flagella(h)-antigeenien (FAg) talteenotto on esitetty PCT-julkaisussa Wo 86/03974. Tätä varten kasvatetaan bakteeriviljelyitä minimaalisella alustalla ja käsitellään tämän jälkeen detergentillä, minkä jälkeen FAg erotetaan viljelystä. Tällöin bak-

3 teeriviljely hajotetaan detergenttikäsittelyn edellä ja alistetaan leikkausprosessiin. Lisäämällä detergenttiä saadaan aikaan se, että antigeeni voidaan erottaa bakteerimassasta. Tällöin suspensiossa olevat antigeenit voidaan erottaa soluista erotussentrifugoinnin avulla. Tämän jälkeen yllä esitetyllä tavalla bakteerimassasta erotetut antigeenit voidaan vapauttaa kromatografisen puhdistuksen avulla kiinnittyneistä epäpuhtauksista, kuten lipopolysakkarideista, nukleiinihapoista, suoloista, polysakkarideista ja vastaavista. Vielä esiintyvä detergentti voidaan poistaa toisen pylväskromatografisen puhdistusvaiheen avulla. Pseudomonas aeruginosa-bakteeriviljelyjen valmistukseen sopivat kannat ja tuotetut antigeenit on esitetty seuraavassa taulukossa: Kanta H-tyyppi M-2 5142 a o (b) 5940 a o a 2 WR-5 a o a 2 5939 a 0 a 3 1210 aoaia2 170018 a0a3a, Julkaisusta EP-A-0 252 064 nähdään, että kaikilla PCT-julkaisussa WO 86/03974 esitettyjen tyyppien yksittäisillä flagelliantigeeneillä on rokotteiden aineosina suojaava vaikutus ja että seerumi, joka otettiin talteen hiiristä, jotka oli immunisoitu aktiivisesti PCT-julkaisussa WO 86/03974 esitetyillä flagelliantigeeneillä, soveltuu hiirien passiiviseen immunisointiin. Tosin yksittäisten antigeenien ja näistä johdettujen vastaaineiden suojaava vaikutus voitiin osoittaa ainoastaan eläinmallissa ja ainoastaan homologisessa järjestelmässä, s.o. voitiin havaita ainoastaan vaikutus sen flagelliserotyypin taudinaiheuttajia vastaan, jota käytettiin immunisointiin.

4 Lääkärin kannalta esiintyy tarve Pseudomonas aeruginosa-rokotteista, joiden vaikutus ulottuu osa-flagella(h)-antigeenien a o, a 1, a 2, a 3, a, ja b kaikkia yhdistelmiä vastaan, koska 300 kliinisen Pseudomonas aeruginosa-isolaatin analyysi Ansorgin (Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A242, 228-238, 1978) ehdotetulla H-antigeenitypisointikaaviolla osoitti, että 98 %:ssa kaikista liikkuvista Pseudomonas-taudinaiheuttajista voitiin osoittaa a- ja/tai b-tyypin osa-antigeenejä. Julkaisussa EP-A-0 252 064 esitettyjen tietojen mukaisesti tällaisen rokotteen tulee sisältää pakostakin kaikki osaantigeenit, s.o. sen on oltava polyvalenttinen rokotusaine. Tämän keksinnön tehtävänä on saada aikaan monovalenttisia tai bivalenttisia rokotteita, jotka sisältävät ainoastaan yhtä tai kahta antigeeniä, jotka muodostavat ihmisessä vasta-aineita, jotka vaikuttavat osa-flagella(h)-antigeenien a0 - a4 ja b kaikkien yhdistelmien liikkuvia Pseudomonas aeruginosataudinaiheuttajia vastaan ja siten kaikkia kliinisesti relevantteja serotyyppejä vastaan, jolloin ne estävät taudinaiheuttajien motiliteetin ja edelleenleviämisen ja lisääntymisen ja indusoivat tuhoamisen ihmisen immuunijärjestelmän kautta. Edelleen tämän keksinnön tehtävänä on saada aikaan valmisteita, jotka sisältävät vasta-aineita näitä antigeenejä vastaan ja joita voidaan käyttää passiiviseen immunisointiin Pseudomonas aeruginosa-infektioita vastaan. Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti siten, että valmistetaan rokotteet, jotka sisältävät a-serotyypin yhtä ainoaa flagella(h)antigeeniä tai ne sisältävät a-serotyypin yhden ainoan flagella(h)-antigeenin ja b-serotyypin flagella(h)-antigeenin yhdistelmää. Edullisesti rokotteet muodostetaan bivalenttisiksi ja ne sisältävät sekä a-serotyypin yhtä ainoaa flagella(h)-antigeeniä että b-serotyypin flagella(h)-antigeeniä.

5 Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, mitä on esitetty patenttivaatimusten 1 ja vastaavasti 7 tunnusmerkkiosissa. On osoittautunut, että immunoglobuliinit, jotka muodostetaan keksinnön mukaisten rokotusaineiden käytön jälkeen, pystyvät sitoutumaan vähintään 95 %:iin kaikista Pseudomonas aeruginosan kliinisesti relevanteista kannoista ja estämään niiden motiliteetin. Tämä vasta-aineiden sitoutuminen saa edelleen aikaan liikkuvien taudinaiheuttajien opsonisaation ja tuhoutumisen ihmisen immuunijärjestelmän fagosytoivien solujen ansiosta. Keksinnön mukaan aikaansaatavat esimerkkirokotteet voivat sisältää: serotyypin a o a 2 yhtä ainoaa flagella(h)-antigeeniä, joka koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 68:41:37:46:44:73:29:29:37:3:10:16:16 ja jonka molekyylipaino on 45.900; tai serotyypin a oa l a 2 yhtä ainoaa flagella(h)-antigeeniä, joka koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 76:44:40:52:50:81:32:32:41:4:12:20:18 ja jonka molekyylipaino on 51.258; tai serotyypin a 0 a 3 yhtä ainoaa flagella(h)-antigeeniä, joka koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 69:35:38:44:47:73:30:30:60:3:12:21:16 ja jonka molekyylipaino on 46.700; tai serotyypin a 0 a 3 a, yhtä ainoaa flagella(h)-antigeeniä, joka

6 koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniinia, seriiniä, glutamiinihappoa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 64:33:35:42:44:68:29:29:37:3:10:19:15 ja jonka molekyylipaino on 43.500. Erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti mainitut keksinnön mukaan tuotettavat rokotteet sisältävät vielä lisäksi b-serotyypin flagella(h)-antigeeniä, joka koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 74:48:48:49:51: 91:38:- 30:43:4:13:18:18 ja jonka molekyylipaino on 53.050. Rokotteet valmistetaan keksinnön mukaan siten, että Pseudomonas aeruginosan viljelyistä saatu (saadut), puhdistettu (puhdistetut) flagella(h)-antigeeni(t) steriilisuodatetaan, sekoitetaan mandollisesti adjuvantin, kuten Al(OH) 3 :n kanssa, haluttaessa lisätään säilöntöainetta, kuten mertiolaattia, ja valmistetaan galeeniseksi valmisteeksi. Immunoglobuliini-G-pitoiset, Pseudomonas aeruginosa-infektioita vastaan vaikuttavat valmisteet valmistetaan keksinnön mukaan siten, että vastaavalla (vastaavilla) flagella(h)antigeen(e)illä immunisoitujen luovuttajien (ihmisten) plasma käsitellään proteiininsaostusaineilla, kuten ammoniumsulfaatilla, liuotetaan saostettu immunoglobuliini-g-pitoinen fraktio, puhdistetaan ja valmistetaan galeeniseksi valmisteeksi. Keksintöä selitetään lähemmin seuraavien esimerkkien avulla, jolloin esimerkit 1 ja 2 havainnollistavat rokotteiden valmistusta ja esimerkki 3 havainnollistaa immunoglobuliini-gpitoisten valmisteiden valmistusta.

7 Esimerkki 1 Rokoteohje monovalenttista Pseudomonas aeruginosa-flagellirokotusainetta varten Pseudomonas aeruginosa 5940-bakteerin viljelystä valmistettu ja yllä esitetyllä tavalla detergenttikäsittelyllä, leikkaamalla ja kromatografisella käsittelyllä puhdistettu flagelliliuos säädettiin tislatulla pyrogeenivapaalla vedellä 100 ug/ml:n proteiinikonsentraatioon ja tehtiin isotoniseksi lisäämällä kiinteää natriumkloridia ja mertiolaattia (loppukonsentraatio 0,9 % NaCl:a tai vastaavasti 0,01 % mertiolaattia). Tämän jälkeen liuos steriilisuodatettiin 0,2 pm:n steriilisuodattimen läpi. Steriilisuodatetun näytteen proteiinimäärityksen jälkeen flagellisuspensio säädettiin NaCl/mertiolaattiliuoksella (0,9 %/0,01 %) 25 pg/ml:n proteiinikonsentraatioon ja laimennettiin tämän jälkeen 20 pg/ml:n proteiinikonsentraatioon lisäämällä 1 %:sta aluminiumhydroksidiliuosta steriilissä NaCl/mertiolaattiliuoksessa. Valmiiksi adjuvantoitu rokote sisälsi ml:aa kohden: 20 pg serotyypin a0a2 flagelliproteiinia 2 mg aluminiumhydroksidia 9 mg NaCl:a 0,1 mg mertiolaattia stabilisaattorina Vastaavasti voidaan valmistaa muita monovalenttisia rokotteita Pseudomonas aeruginosa-kannoilla 1210 (serotyyppi a0ala2), 5939 (serotyyppi a0a3) ja 170018 (serotyyppi a0a3a4). Esimerkki 2 Rokoteohje bivalenttista Pseudomonas aeruginosa-flagellirokotusainetta varten Bakteerikantojen M-2 ja 5939 viljelyistä valmistetut ja yllä esitetyllä tavalla detergenttikäsittelyllä ja geelisuodattamalla puhdistetut flagellisuspensiot säädettiin tislatulla

8 pyrogeenivapaalla vedellä 100 myg/ml:n proteiinikonsentraatioon ja tehtiin isotoniseksi lisäämällä kiinteää natriumkloridia ja mertiolaattia (loppukonsentraatio 0,9 % NaCl:a tai vast. 0,01 % mertiolaattia). Tämän jälkeen liuos steriilisuodatettiin 0,2 pm:n suodattimen läpi. Steriilisuodatettujen näytteiden proteiinimäärityksen jälkeen flagellisuspensiot laimennettiin steriilillä NaCl/mertiolaattiliuoksella (0,9 %/0,01 %), jolloin M-2-flagellien suspensio säädettiin konsentraatioon 50 pg/ml ja 5939-f1agellien suspensio säädettiin konsentraatioon 25 pg/ml. Molemmat suspensiot yhdistettiin samoiksi määriksi ja säädettiin tämän jälkeen 20 tai vastaavasti 10 pg/ml:n antigeenikonsentraatioon lisäämällä 1 %:sta aluminiumhydroksidiliuosta steriilissä NaCl/mertiolaattiliuoksessa. Valmiiksi adjuvoitu rokote sisälsi ml:aa kohden: 20 myg b-serotyypin flagelliproteiinia 10 myg serotyypin a0a3 flagelliproteiinia 2 mg aluminiumhydroksidia 9 mg NaCl:a 0,1 mg mertiolaattia stabilisaattorina. Yllä esitetyn Pseudomonas-kannan 5939 flagellien suspension sijasta voidaan käyttää vastaavasti muiden kantojen serotyypin a0a3 flagelleja sekä serotyyppien a0a2; a0ala2 tai a0a3a4 flagelleja ja serotyypin b flagelleja esim. yllä esitetyssä seoksessa ja valmistaa rokotteiksi. Esimerkki 3 3.1 Plasmaluovuttajien immunisointi flagellirokotteilla 50 vapaaehtoista koehenkilöä saivat kukin 20 myg esimerkin 1 mukaisesti viljelystä 5940 valmistettua rokotusainetta subkutaanisesti. 4 viikon kuluttua 40 koehenkilöä saivat jälleen kukin 20 pg subkutaanisesti ja vielä 4 viikon kuluttua immunisoitiin uudelleen 20 pg:llä flagelliantigeeniä. Flagelliantigeenien muodostusta seurattiin immunisoinnin aikana myöhemmin selitettävällä flagelli-elisa-menetelmällä. Immu-

9 nisoinnin jälkeen kerättiin kolme kertaa immunisoitujen koehenkilöiden plasma ja yhdistettiin. 3.2 Spesifisen Pseudomonas aeruginosa-flagelli-immunoglobuliinivalmisteen valmistus Vasta-aineita Pseudomonas aeruginosaa vastaan sisältävien immunoglobuliinien eristys tapahtui julkaisussa AT-B - 359.641 esitetyn menetelmän mukaisesti. Tätä varten säädettiin luovuttajilta saatu yhdistetty plasma ph-arvoon 7,0-7,2 ja pidettiin -2 C:n lämpötilassa. Liuokseen lisättiin 8 paino-% etanolia, jolloin saostui sakka, joka sisälsi pääasiassa fibrinogeeniä. Tämän sakan erottamisen jälkeen etanolikonsentraatiota korotettiin 25 paino-%:iin ja lämpötilaa alennettiin -6 C:seen. Saostuva sakka, joka koostui pääasiassa raa'asta immunoglobuliinista, uutettiin fosfaattiasetaatti-puskurissa ja siihen lisättiin 12 paino-% etanolia ph-arvossa 5,3-2 C:ssa. Sakka (joka sisälsi alfa- ja betaglobuliinia) heitettiin pois ja emäliuoksen etanoli-konsentraatiota korotettiin ph-arvossa 7,2 ja -10 C:n lämpötilassa 25 paino-%:iin, jolloin immunoglobuliini saostui. Näin valmistettu kerätty pastamainen gamma-globuliinifraktio käsiteltiin keksinnön mukaisesti edelleen seuraavasti: 1 kg immunoglobuliinipastaa liuotettiin 2 l:aan 0,9 %:sta NaCl-liuosta sekoittaen ja dialysoitiin. Tämän jälkeen proteiinikonsentraatio saatettiin arvoon 20 g/1 sekä ionivahvuus arvoon 0,15 ja ph-arvossa 6,25 lisättiin 176 g/1 ammoniumsulfaattia, sakka heitettiin pois ja emäliuokseen lisättiin edelleen ammoniumsulfaattia 275 g/l:n loppukonsentraation asti ja ph asetettiin arvoon 7,2. Saostuva immunoglobuliinipitoinen sakka liuotettiin veteen ja dialysoitiin vesijohtovettä vastaan. Sitten liuokseen lisättiin 80 g/1 polyetyleeniglykolia glukoosin (150 g/l) läsnäollessa ph-arvossa 6,0 ja ionivahvuuden ollessa 0,15. Sakka heitettiin pois ja polyetyleeniglykolikonsentraatiota korotettiin 95 g:aan/1 ph-arvossa 6,5-6,6. Uudelleen saostuva sakka heitettiin pois.

10 Nyt liuoksen polyetyleeniglykoli-pitoisuutta korotettiin 180 g:aan/1 ph-arvossa 7,2, jolloin saostui epäpuhtauksista vapaa immunoglobuliini. Tuote sentrifugoitiin ja se pestiin viisi kertaa vielä esiintyvän polyetyleeniglykolin poistamiseksi. Näin saatu suonensisäisesti annettava spesifinen Pseudomonas-flagelli-immunoglobuliini rekonstituoitiin tislatulla vedellä (Aqua dest.) 5 %:seksi (p/t) liuokseksi. Spesifisesti serotyypin a0a2 flagelleja vastaan suunnattujen vasta-aineiden tiitteri määritettiin flagelli-elisa:ssa ja se on esitetty taulukossa 2. Tällöin suhteella 1:25.000 esitetty tiitteri koskee 5 %:sen immunoglobuliiniliuoksen 1:25.000-laimennusta, joka tuotti ELISA-testissä vielä selvästi osoitettavan positiivisen reaktion. Tämän menetelmän mukaisesti valmistettiin myös kaikki muut, alla mainitut Pseudomonas aeruginosa-flagelli-immunoglobuliinivalmisteet. Keksinnön mukaisten rokotteiden ja keksinnön mukaisten immunoglobuliini-g-pitoisten Pseudomonas aeruginosa-bakteeriinfektioita vastaan vaikuttavien valmisteiden (Pseudomonas aeruginosa-flagelli-immunoglobuliinivalmisteiden) vaikutuksen dokumentoimiseksi osoitetaan ensin, että flagella(h)- antigeenit (serotyypit b, b(a0), a0a2, a0ala2, a0a3 ja a0a3a4, jotka sisältävät kaikki kuusi kliinisesti relevanttien Pseudomonas-taudinaiheuttajien osa-antigeenit), johtavat ihmisessä vasta-aineiden muodostumiseen. Tätä varten yllä esitettyjen kuuden relevantin serotyypin flagellit erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla mandollisesti vielä kiinnittyneistä, minimaalisista epäpuhtauksista. Flagellikaistat, jotka sisälsivät detergentillä SDS ja merkaptoetanoli depolymerisoidun flagelliinin, saatiin seuraavissa molekyylipainoissa: b-tyyppi: 53.050, a0-tyyppi: 52.000, a0ala2-tyyppi: 51.250, a0a2-tyyppi: 45.900; a0a3a4-tyyppi: 43.500; a0a3-tyyppi: 46.700. Molekyy-

11 lipainot laskettiin standardiproteiinien karboanhydraasi (mp: 31.000), ovalbumiini (mp: 45.000) ja BSA (66.200) kulkuvälien (Laufstrecken) kautta. Proteiinikaistat siirrettiin sähkösiirron (Elektrotransfer) avulla polyakryyliamidigeelistä nitroselluloosakalvolle. Sen jälkeen kun vapaat proteiinisidoskohdat nitroselluloosakalvolla oli pidätetty kyllästämällä Tween 80:11ä, kalvoa inkuboitiin ihmisen seerumin sopivassa laimennuksessa. Tämä seerumi saatiin luovuttajilta, jotka oli immunisoitu useaan kertaan monovalenttisilla flagellirokotteilla, jotka sisälsivät yllä mainittuja antigeenejä. Edellä oli ELISA-kontrolleilla varmistettu, että luovuttajien seerumit eivät sisältäneet ennen immunisointia mitään merkittäviä flagellivasta-ainetiittereitä. Flagellispesifisten vasta-aineiden läsnäolo immunisoinnin jälkeen voitiin osoittaa sitomalla nämä vasta-aineet kulloinkin kyseessä olevaan flagelliinikaistaan nitroselluloosakalvolla, joka voidaan tehdä näkyväksi kalvolla kehittämällä entsyymileimatulla toisella vasta-aineella ja kromogeenisella substraatilla. Värjäyksen intensiteetti sallii rajoitetusti päätelmät sidotun spesifisen vasta-aineen määrästä. Tulokset on esitetty taulukossa 1, jolloin arviointia varten homologisella antiseerumilla saadut värjäysintensiteetit merkittiin merkillä "++" ja arvioitiin vasta-aineiden sitoutuminen muiden serotyyppien flagelliiniin sen suhteen. Jos nitroselluloosakalvolla ei havaittu mitään kaistaa, taulukossa on merkintä "-".

12 Taulukko 1 H-antiseerumeiden ristireaktiot Western-täplissä Seerumi H- Antigeeni Western-täplällä tyyppiä vastaan b b(a0) aoa2 aoala2 aoa3 a0a3a4 b ++ ++ (+) (+) - (+) b(ao) ++ ++ - - - - a0a2 + + ++ + + ++ aoala2 + + + ++ ++ +++ aoa3 + + + + ++ + aoa3a4 + + + + + ++ Taulukosta 1 nähdään ristireaktiivisuus, koska esim. määrättyä a-tyypin flagelliinia vastaan vaikuttava seerumi reagoi myös muita a-tyypin antigeenejä vastaan. Nähdään jopa se, että a-tyypin flagelliinia vastaan vaikukttavat vasta-aineet eivät sitoudu ainoastaan tähän, vaan myös b- tai vastaavasti b(a0)-tyypin flagelliiniin. Tämän sitoutumisen intensiteetti on kuitenkin useimmiten selvästi heikompi kuin erilaisissa a-tyypeissä havaittu keskinäinen ristireaktio. Sitä vastoin b- tai vastaavasti b(a0)-tyypin flagelliineja vastaan vaikuttavat vasta-aineet eivät sitoudu tai sitoutuvat ainoastaan hyvin heikosti a-tyypin flagelliiniin. Sen osoittamiseksi, että flagella(h)-antigeenejä b, b(a0), aoa2, aoala2, aoa3 ja a0a3a4 voidaan käyttää korkeatiitteristen vasta-aineiden tai vastaavasti korkeatiitteristen ihmisperäisten, intravenoosisesti annettavien immunoglobuliini-g-pitoisten valmisteiden valmistamiseksi, immunisoitiin kliinisen tutkimuksen vaiheen I puitteissa vapaaehtoisia koehenkilöitä säännöllisin välein useita kertoja monovalenttisilla antigeeneillä b, a0, a0a2, aoala2, a0a3 ja aoa3a4. Näiltä luovuttajilta kerättiin plasma ja yhdistettiin serotyyppien mukaisesti erotettuna. Tästä valmistettiin esimerkissä 3 esitetyn menetelmän mukaisesti immunoglobuliini- G-pitoisia valmisteita suonensisäistä käyttöä varten. Näitä

13 nimitetään seuraavassa Pseudomonas-flagelli-immunoglobuliiniksi (PsH) lisäämällä kulloinkin kyseessä oleva serotyyppi. Esimerkiksi PsHb merkitsee niiden luovuttajien plasmasta valmistettua valmistetta, jotka oli immunisoitu b-tyypin antigeenin fiagelli-rokotteella. H-serotyypille spesifinen tiitteri selvitettiin flagelliini- ELISA:11a. Tätä varten erittäin puhtaita flagellivalmisteita inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa natriumdodekyylisulfaatin 1 %:sessa liuoksessa, mikä sai aikaan flagellien depolymeroinnin flagelliinimonomeereiksi. Tämän jälkeen flagelliiniliuos puskuroitiin uudelleen geelisuodatuspylvään läpi karbonaattipuskuria, ph 9,6, vastaan ja säädettiin proteiinimäärityksen jälkeen 0,5 pg/ml:n konsentraatioon. Tämän liuoksen flagelliini sidottiin sitten kiinteään kantoaineeseen (mikrotiitterilevyn kouru tai päällys (Kamm)). Vapaiden proteiinisidoskohtien pidätyksen jälkeen Tween 20:n 0,05 %:sella liuoksella fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa ainoastaan flagellispesifiset vasta-aineet pystyivät enää sitoutumaan immobilisoituun flagelliiniin kantoaineella. Useiden pesuvaiheiden jälkeen sidotut vasta-aineet osoitettiin entsyymileimatulla toisella vasta-aineella (anti-human- IgG POD-konjugaatti) ja määritettiin kolorimetrisesti kvantitatiivisesti. Selvitetyt tiitterit on esitetty taulukossa 2 ja ne koskevat erilaisten flagelliantigeenien samoja pgmääriä. Tiitteriarvot ilmaisevat 5 %:sten Pseudomonas-flagelli-immunoglobuliiniliuosten laimennuksen, jotka saivat aikaan ELI- SA-testissä vielä selvästi positiivisen reaktion. Immobilisoidun proteiinin määrä määritettiin kulloinkin 10 ELISA-harjanteelle sidotun proteiinin hydrolyysin jälkeen aminohappoanalyysin avulla, jota varten käytettiin puhdistettujen flagelliantigeenien julkaisussa EP-A - 0 252 064 esitettyjä aminohappokoostumuksia.

14 Taulukko 2 Immunoglobuliinivalmisteiden ELISA-tiitterit H-serotyyppi Kanta Tiitteri PsH-b M-2 1:10.000 PsH-a0a2 5940 1:25.000 PsH-a0a3 5939 1:30.000 PsH-a0ala2 1210 1:25.000 P5H-a0a3a4 170018 1:35.000 Seuraavaksi osoitetaan, että näin valmistetuista Pseudomonas-immunoglobuliinivalmisteista peräisin olevat vasta-aineet sitoutuvat homologisen flagelliserotyypin flagelliinimolekyyleihin ja että tämän lisäksi yksittäisten luovuttajien seerumissa havaittu ristireaktiivisuus (taulukko 1) pätee myös hyperimmunoglobuliinivalmisteissa. Tätä varten valmistettiin yllä esitetyllä tavalla Westerntäplät flagellivalmisteista. Ensimmäisinä vasta-aineina käytettiin ihmisen seerumin sijasta viiden hyperimmunoglobuliinivalmisteen liuoksia, jotka oli säädetty flagelli-elisa:n mukaisesti samoihin tiittereihin ja sitten laimennettu sopivasti edelleen. Blottien edelleenkehitys ja arviointi tapahtui taulukossa 1 esitetyllä tavalla. Tulokset on esitetty taulukossa 3.

15 Taulukko 3 Flagellispesifisten Pseudomonas-immunoglobuliinivalmisteiden ristireaktiivisuus Vastaaine Antigeeni Wester-täplällä b b(a0) a0a2 a0a1a2 a0a3 a0a3a4 PsHb ++ ++ (+) (+) (+) + PsHa0a2 + + ++ ++ ++ +++ PsHa0ala2 + + + ++ 44. 4-4-4. PsHa0a3 + + ++ ++ ++ ++ PsHa0a3a4 + + ++ + + ++ Kuten jo yksittäisten luovuttajien seerumeilla osoitettiin, myös tutkituissa immunoglobuliinivalmisteissa voidaan havaita voimakas kaikkien a-tyypin flagelleja vastaan suunnattujen vasta-aineiden ristireaktiivisuus kaikkien a-alaluokan koostumusten flagelliinimolekyylien kanssa. Samoin on selvää, että voi tapahtua a-tyypin flagelleja vastaan suunnattujen vasta-aineiden (heikompi) sitoutuminen b-tyypin flagelliiniin. Suhteellisesti heikosti, mutta selvästi osoitettavissa on b-tyypin vasta-aineiden sitoutuminen a-tyypin flagelliiniin. Keksinnön mukaisten vasta-aineiden vaikutus liikkuviin Pseudomonas aeruqinosa-taudinaiheuttajiin voidaan katsoa johtuvan niiden liikkuvuuden - ja siten infektiopesäkkeen leviämisen - estosta. Tämä motiliteetin esto voidaan osoittaa pehmeästä agarista valmistetuilla parveilulevyillä (Weichagar-Schwärmplatten). Tätä varten pyöreä suodatuspaperiaihio kostutettiin 20 myi:lla PsH:n 0,5 %:sta liuosta HBSSG:ssä. Tämä asetettiin istutteen päälle, jossa oli 10 5 itiötä 10 nl:ssa sen jälkeen, kun itiösuspensio oli tunkeutunut pehmeään agariin. Motiliteetin eston aste määritettiin samalla levyllä olevan kontrollin suhteen, jossa istutteen päälle oli laitettu gelatiinia sisältävässä Hank's Balance Salt Solution-liuok-

16 sessa (HBSSG) kostutettu pyöreä suodatuspaperiaihio. Samalla tavoin kuin Western-täplällä voitiin todeta ristireaktioita erilaisia a-serotyypin flagelleja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden ja kaikkien tutkittujen itiöiden välillä, joissa oli erilaisia a-alatyypin koostumuksen omaavia flagelleja. Samoin havaittiin Western-täplällä havaittu a-tyypin vastaaineiden ja b-flagellien välinen ristireaktio. Selvemmin kuin Western-täplällä esiintyi b-tyypin vasta-aineiden ja kaikkien alaluokkien a-tyypin flagellien välinen ristireaktio. Tulokset on esitetty taulukossa 4, jolloin vasta-aineilla inkuboitujen itiöiden parvelualueiden (Schwärmzonen) läpimittaa verrattiin samalla levyllä oleviin vasta-ainevapaisiin kontrolleihin: merkillä "++" on merkitty parveilualueen läpimittaa, joka on vähintään 40 % pienempi kuin kontrollin; "+": läpimitta vähintään 20 %, mutta korkeintaan 40 % pienempi kuin kontrollin. Taulukko 4 H-vasta-aineiden ristireaktiot motiliteetin estotestissä Vasta-aine Itiön H-antigeeni parveilulevyllä H-tyyppiä vastaan b b(a0) a0ala2 a0a2 a0a3 a0a3a4 b ++ ++ ++ + + ++ a0a1a2 + + + + + + a0a2 + + ++ ++ ++ + a0a3 + + + ++ ++ ++ a0a3a4 ++ + + ++ + ++ Taulukon 4 tulokset osoittavat, että flagella(h)-antigeeneillä valmistetut keksinnön mukaiset vasta-aineet estävät Pseudomonas-bakteerikantojen motiliteetin. Estämällä infektiopesäkkeessä olevien bakteereiden motiliteetti estetään tosin niiden edelleenleviäminen kolonisoitumalla potilaan kehossa, mutta pesäkkeessä olevat bakteerit

17 pystyvät kuitenkin edelleen kuormittamaan potilaan elimistöä luovuttamalla esim. toksiineja, proteaaseja jne. Varma suoja infektiota vastaan on tästä syystä taattu ainoastaan silloin, kun aktiivisessa immunisoinnissa muodostuneet vastaaineet johtavat sisääntunkeutuneiden bakteereiden nopeaan tuhoutumiseen. Seuraavassa osoitetaan, että flagella(h)-vasta-aineet indusoivat homologisen Pseudomonas-bakteerikannan fagosytoosin ja solusisäisen tuhoutumisen. Fagosytoosikokeiden suorittamiseksi kasvatettiin kantojen M-2 (b), WR-5 (a0a2), 1210 (a0ala2), 5939 (a0a3) ja 170018 (a0a3a4) itiöitä Luria Broth Medium-alustassa ja laimennettiin vähän ennen stationaarista kasvufaasia HBSSG:ssä elävien itiöiden määrään 8. 10 8 itiötä/ml. Kaikista 5 %:sista flagelli-immunoglobuliinivalmisteista valmistettiin 1:18-, 1:72- ja 1:288-laimennus HBSSG:ssä. Kulloinkin 450 pl näitä liuoksia inkuboitiin itiösuspension (50 pl) ja HBSSG:n (4,5 ml) kanssa 2 tunnin ajan jään päällä. Tässä inkubaatiossa tapahtui spesifisten vasta-aineiden sitoutuminen bakteerisoluihin. Fagosytoivina soluina käytettiin ihmisen granulosyyttejä. Nämä otettiin talteen juuri eristetystä koaguloituneesta veriplasmasta (buffy coats). Koaguloitunut veriplasma vapautettiin suurimmaksi osaksi erytrosyyteistä kerrostamalla (Unterschichten) suolaliuos-dekstroosi-dekstraani-liuoksella. Tämän jälkeen suoritettuun useita sentrifugointivaiheita, joiden avulla poistettiin pitkälti jäljellä olevat erytrosyytit ja trombosyytit. Pestiin suolaliuoksessa ja sitten solumäärä määritettiin Coulter-solulaskimessa ja säädettiin arvoon 1. 10 7 solua/ml HBSSG:ssä. Tästä solususpensiosta valmistettiin verenkuva. Tällöin granulosyyttien suhde lymfosyytteihin tulisi olla normialueella n. 6:4. Monosyyttien pitoisuus on normaalisti 4-8 %. Soluisolaatteja, jotka täyttävät nämä kriteerit, voidaan käyttää fagosytoositestissä.

18 Komplementtilähteenä käytettiin absorboitua ihmisen seerumia (ABA) veriryhmän AB omaavien luovuttajien yhdistelmästä. Tämä seerumi oli adsorboitu edellä kaikkiin yllä mainittuihin itiöihin, jolloin 1 ml seerumia/itiö inkuboitiin viisi kertaa 5 x 10 9 itiöllä 0,5 tunnin ajan jään päällä. Jokaista inkubaatiota seurasi sentrifugointivaihe, joka kesti 5 minuuttia 8.000 g:ssä. Viimeisen inkubaation jälkeen sentrifugoitiin lisäksi 15 minuutin ajan 14.000 g:ssä. Absorption jälkeen seerumin komplementtipitoisuus testattiin C'HSO-yksiköissä. Tämä oli 15 % vähemmän kuin lähtöseerumin pitoisuus. Näin talteenotettu ABA-seerumi esilaimennettiin Hank'in puskurissa 1:50 ja käytettiin fagosytoositestissä. Fagosytoositestierää varten sekoitettin 100 pl granulosyyttisuspensiota, 60 pl itiösuspensiota ja 40 pl absorboitua ABA-seerumia mikrotiitterilevyn kourussa. Heti sekoittamisen ja tunnin ajan 37 C:ssa kestävän inkuboinnin jälkeen otettiin 25 pl testierästä ja laimennettiin 5 ml:aan kandesti tislattua vettä. Tällöin granulosyytit liuotettiin (lysieren) osmoottisesti ja vapautettiin siihen sisältyvät bakteerisolut. 25 pl tätä suspensiota päällystettiin elävien itiöiden määrän määrittämiseksi. Kuolleisuusmäärä laskettiin 0- ja 60 min-arvon koloniamäärällä seuraavan kaavan mukaisesti: luku_t_=_60 kuolleisuus %:na = 1 - vertailu x 100 luku t = 0 Kontrolliarvon laskemiseksi toimivat t = 0 ja t = elävien itiöiden 60 min-arvot, jotka oli saatu testin kohdasta, jossa käytettiin vasta-ainekuormitettujen itiöiden sijasta kuormittamattomia itiöitä. Näin saatujen 60- ja 0-min-arvojen osamäärää käytettiin kontrollina yllä esitetyssä kaavassa. Fagosytoositestin tulokset on esitetty taulukossa 5.

19 Taulukko 5 Pseudomonas aeruginosan tuhoutuminen flagellivasta-aineilla suoritetun opsonisaation jälkeen ihmisen granulosyyteillä VA H- Itiön H-antigeeni fagosytoositestissä tyyppiä vastaan b a0ala2 a0a2 a0a3 a0a3a4 PsHb 1: 30 korkea*) korkea 40 27 PsHa0a2 1: 60 102 120 86 65 PsHa0a3 1: 78 105 korkea 108 84 PsHa0ala2 1: 60 200 korkea 125 72 PsHa0a3a4 1: 78 korkea 190 80 78 *): Kaikissa vasta-ainekonsentraatioissa tuhottiin vähemmän kuin 50 % käytetyistä itiöistä. Taulukossa esitetyt tiitteriarvot osoittavat H-tyypille spesifisen flagelli-immunoglobuliinivalmisteen konsentraation, joka oli säädettävä opsonisoitaessa 4 x 10 8 itiötä 5 ml:n erässä, jotta fagosytoositestissä tuhotaan 50 % käytetyistä itiöistä. Tämä fagosytoositiitteri laskettiin homologisten vasta-ainetiittereiden flagelli-elisa:ssa selvitettyjen absoluuttisten arvojen ja fagosytoosikokeessa määritettyjen laimennustekijöiden osamääränä, joissa 50 % käytetyistä itiöistä tuhottiin kulloinkin kyseessä olevalla (homologisella tai heterologisella) flagelli-immunoglobuliinilla. Taulukosta 5 nähdään, että Pseudomonas-flagelli-immunoglobuliinivalmisteet opsonisoivat itiöitä, joissa on homologisia ja heterologisia flagelliserotyyppejä. Tällöin on erittäin huomiota herättävää kaikkien PsHa-valmisteiden ristireaktio kaikkien a-tyypin ja b-tyypin itiöiden kanssa. PsHa0a2:n erittäin alhaiset konsentraatiot indusoivat a- ja b-tyypin flagelleja sisältävien itiöiden fagosytoosin. b-tyypin itiöiden tuhoamiseksi tarvitaan PsHa-valmisteita korkeampina konsentraatioina kuin PsHb-valmisteita. Nämä tulokset osoittavat, että a0a2-spesifisyyden omaavilla vasta-aineilla on suojavaikutus kaikkia kliinisesti rele-

20 vantteja flagelliserotyyppejä sisältäviä itiöitä vastaan ja että tämän suojavaikutuksen täytyy olla voimakkaampi seoksessa, joka koostuu a0a2-vasta-aineista ja b-vasta-aineista, b-tyypin flagelleja sisältävien itiöiden suhteen. Tähän mennessä ei ole ollut tunnettua, onko vasta-aineilla, jotka on eristetty erittäin puhtailla flagellivasta-aineilla immunisoitujen luovuttajien plasmasta, suojavaikutus Pseudomonas aeruginosan aiheuttamia infektioita vastaan. Yllä esitetyllä fagosytoositestillä tämä osoitettiin PsH-valmisteille, joilla on spesifisyys kaikkien kliinisesti relevanttien H-serotyyppien suhteen. Seuraavassa taulukossa on esitetty keksinnön mukaisen monovalenttisen vasta-ainevalmisteen PsHa0a2 vaikutus ja keksinnön mukaisten bivalenttisten valmisteiden PsHb/a0a2, PsHb/a0ala2, PsHb/a0a3 ja PsHb/a0a3a4 vaikutus, jotka valmistettiin esimerkissä 2 esitetyllä tavalla. Taulukko 6 Terapeuttisten Pseudomonas-immunoglobuliinivalmisteiden vaikutus fagosytoositestissä VA H-tyyp- Itiön H-antigeeni fagosytoositestissä piä vastaan b a0ala2 a0a2 a0a3 a0a3a4 0 PsHba0a2 1: 60 102 120 86 65 87 standardi 1: 3 19 31 28 9 18 PsHb/a0a2 1: 6 24 30 80 20 32 PsHb/a0ala2 1: 5 28 59 32 13 27 PsHb/a0a3 1: 11 23 32 25 7 20 PsHb/a0a3a4 1: 19 34 15 54 6 26 Taulukossa 6 on esitetty ensinnäkin PsHa0a2-valmisteen vaikutus fagosytoositestissä. Tällöin tiitteriarvot koskevat immunoglobuliinin sitä konsentraatiota, joka on säädettävä kuormitettaessa itiöt, jotta tämän jälkeen fagosytoositestissä tuhottaisiin 50 % itiöistä. Kuviossa 1 on esitetty, miten tämä tiitteri on selvitetty: 450 pl:aan 5 %:sen

21 PsH-a0a2-liuoksen 1:18-, 1:72- ja 1:288-esilaimennuksia lisätään 50 }tl suspensiota, jossa on 8 x 10 8 5940-itiötä/ml, ja 4,5 ml Hank'in puskuria, joka sisältää gelatiinia. Näin saadaan 1:200-, 1:800- ja 1:3200-loppulaimennuksia. PsHa0a2:n flagelli-elisa:ssa selvitetty tiitteri on arvossa 1:25.000. Siten ovat flagellivasta-aineiden konsentraatiot bakteereiden kuormituksen aikana 1:125, 1:31,5 ja 1:7,8. Kuviossa 1 on esitetty fagosytoositestissä aikaansaatu itiöiden tuhoutuminen näitä immunoglobuliinikonsentraatioita vastaan. Näistä tuhoutumiskäyristä voidaan selvittää taulukossa esitetyt immunoglobuliinin konsentraatiot, joissa 50 % tutkitusta itiöstä tuhoutuu. PsHa0a2-valmisteen vaikutuksen arvioimiseksi vertailuna toimii standardi, joka on seos kaikista viidestä taulukossa 6 esitetystä PsH-valmisteesta, jolloin kaikki yksittäiskomponentit säädettiin ELISA-tiitteriin 1:2.000. Taulukko 6 osoittaa edelleen PsHb:stä ja valmisteista PsHa0a2 tai vast. PsHa0ala2 tai vast. PsHa0a3 tai vast. PsHa0a3a4 koostuvien seosten vaikutuksen. Nämä seokset säädettiin anti-b-tiitteriin, joka oli n. 1:7.500, ja samansuuruiseen anti-a-tiitteriin. Taulukko 6 osoittaa fagosytoositiitterin, joka selvitettiin näillä immunoglobuliiniseoksilla Pseudomonas aeruginosa-kannoille, jotka sisälsivät kaikkie kliinisesti relevanttien serotyyppien flagelliepitoopit. Nämä tiitterit koskevat immunoglobuliiniseoksen konsentraatiota, joka oli säädettävä lähdettäessä molempien komponenttien tiitteristä 1:7.500 kuormitettaessa itiöillä, jotta tämän jälkeen fagosytoositestissä voitiin tuhota 50 % käytetyistä itiöistä. Kuviosta 2 voidaan nähdä, miten tämä tiitteri selvitettiin PsHb:n ja PsHa0a3:n seokselle: Seos, jossa oli 1 ml PsHb:tä ja 0,33 ml PsHa0a3:a, jolloin b- ja a0a3-tiitterit olivat 1:7.500, kuten yllä on esitetty, esilaimennettiin ja käytettiin fagosytoositestissä. Kuviossa 2 on esitetty fagosytoo-

22 sitestissä aikaansaatu tuhoutuminen bakteerien kuormituksessa esiintyvää vasta-ainetiitteriä vastaan yksittäiskomponenteille b ja a0a3. Taulukosta 6 nähdään, että PsHa0a2-valmiste vaikuttaa tosin kaikkia relevantteja serotyyppejä vastaan, mutta sen vaikutus ei ole kuitenkin niin selvä kuin standardin. Sitä vastoin seoksilla, jotka koostuvat PsHb:stä ja jostakin valmisteista PsHa0a2, PsHa0ala2, PsHa0a3 tai PsHa0a3a4, on vaikutus, joka on lähes yhtä hyvä kuin standardivalmisteen ja selvästi parempi kuin yksittäiskomponenttivalmisteiden (vrt. taulukko 5). Tämän havainnollistamiseksi sarakkeessa 0 on esitetty keskimääräinen tiitteri eri valmisteille tai vastaavasti seoksille. Immunoglobuliinivalmisteet, jotka valmistettiin sekoittamalla luovuttajien plasma, jotka oli immunisoitu serotyypin b flagelliantigeenillä ja jollakin neljästä a-alatyypin yhdistelmästä, pystyvät siten indusoimaan kaikkien kliinisesti relevanttien serotyyppien flagelleja sisältävien itiöiden tuhoutumisen. Luonnostaan yllä esitettyjen tulosten mukaisesti myös keksinnön mukaiset bivalenttiset rokotteet, jotka koostuvat flagelliantigeenistä b ja jostakin antigeeneistä a0a2, a0ala2, a0a3 tai a0a3a4, tai niitä käyttämällä valmistettu keksinnön mukainen immunoglobuliinivalmiste pystyvät suojaamaan flagelleja sisältävien Pseudomonas aeruginosabakteereiden aiheuttamia infektioita vastaan. Aktiiviseen immunisointiin käytettävien antigeenien suojavaikutuksen suora osoitus voidaan suorittaa ainoastaan eläinmallissa ja sitä selitetään seuraavassa. Tilanteiden simuloimiseksi, jotka altistavat (predisponoivat) potilaat Pseudomonas-infektioille käytettiin kahta kirjallisuudessa esitettyä eläinmallia: burned mouse-malli (Stieritz, D. D. ja I. A. Holder (1975) J. Infect. Dis. 131, 688-691) ja endoksaani-alli (Cryz, S. J. Jr., FUrer, E., Germanier, R. (1983), Infect. Immunity 40, 659-664).

23 Molempia malleja varten selvitettiin Pseudomonas aeruginosan LD50-arvo immunisoimattomissa eläimissä, jotka endoksaanimallissa immunosuppressoitiin. Burned mouse-mallissa aiheutettiin määrätyn suuruinen palovamma. Taulukossa 7 esitetyillä flagella(h)-antigeeneillä suoritetun immunisoinnin jälkeen eläimet, joilla oli palovamma, tai vast. immunosuppressoidut eläimet infektoitiin homologisen Pseudomonaskannan edellä selvitetyn LD50-itiöluvun kerrannaisella. Taulukko 7 esittää LD50-itiölukujen kerrannaiset, jotka 100 % antigeenin esitetyllä konsentraatiolla immunisoiduista eläimistä sietivät endoksaani- ja burned mouse-mallissa. Tulokset osoittavat bivalenttisen flagellirokotteen vaikutuksen normaalissa ja immunosuppressoiduissa eläimessä. Taulukko 7 Aktiivinen suojakoe Pseudomonas aeruginosa-flagellirokotteilla Antigeeni Määrä/hiiri Immunis. Endoksaani- Burned outadjuvoitu päivät mallin suo- out-mallin Al(OH)3:11a ennen al- jatekijä suojatekijä tistamista (x LD50) (x LD50) b 3 lig 14 b 3x10 1 >10 4 a0a3 1,5 ig 14 a0a3 2x10 1 10 3 b/a0a3 3/1,5 lig 14 b 10 2 a0a2 4x10 1 a0ala2 2x10 1 a0a3 10 2 a0a3a4 10 2 >10 4 b 10 3 a0ala2 10 4 a0a2 10 4 a0a3 >10 4 a0a3a4

24 Patenttivaatimukset: 1. Menetelmä sellaisten Pseudomonas aeruginosa-infektioita vastaan vaikuttavien divalenttisten rokotteiden valmistamiseksi, joiden vaikutus ulottuu kaikkia osaflagella(h)- antigeenien ao, a 1, a 2, a3, a4 ja b kaikkiin yhdistelmiin ja jotka sisältävät serotyypin a yhden ainoan flagella(h)-antigeenin ja serotyypin b flagella(h)-antigeenin yhdistelmää, tunnettu siitä, että steriilisuodatetaan Pseudomonas aeruginosa -viljelmistä saatu (saadut), puhdistettu (puhdistetut) flagella(h)-antigeeni(t), sekoitetaan mandollisesti adjuvantin, kuten Al(OH) 3 :n kanssa, haluttaessa lisätään säilöntöainetta, kuten mertiolaattia, ja valmistetaan galeeniseksi valmisteeksi. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan divalenttinen rokote, joka sisältää serotyypin a0a 2 flagella(h)-antigeeniä, joka koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 68 : 41 : 37 : 46 : 44 : 73 : 29 : 29 : 37 : 3 : 10 : 16 : 16 ja jonka molekyylipaino on 45.900. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan divalenttinen rokote, joka sisältää serotyypin aoa 1 a2 flagella(h)-antigeeniä, joka koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, gly-. siiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 76 : 44 : 40 : 52 : 50 : 81 : 32 : 32 : 41 : 4 : 12 : 20 : 18 ja jonka molekyylipaino on 51.250. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan divalenttinen rokote, joka sisältää serotyypin aoa 3 flagella(h)-antigeeniä, joka koostuu monomee-

25 risistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 69 : 35 : 38 : 44 : 47 : 73 : 30 : 30 : 60 : 3 : 12 : 21 : 16 ja jonka molekyylipaino on 46.700. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan rokote, joka sisältää serotyypin aoa 3a4 flagella(h)-antigeeniä, joka koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniinia, seriiniä, glutamiinihappoa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 64 : 33 : 35 : 42 : 44 : 68 : 29 : 29 : 37 : 3 : 10 : 19 : 15 ja jonka molekyylipaino on 43.500. 6. Jonkin patenttivaatimuksen 2-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan rokote, joka sisältää lisäksi vielä b-serotyypin flagella(h)-antigeeniä, joka koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, glysliniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 74 : 48 : 48 : 49 : 51 : 91 : 38 : 30 : 43 : 4 : 13 : 18 : 18 ja jonka molekyylipaino on 53.050. 7. Menetelmä sellaisten immunoglobuliini-g-pitoisten valmisteiden tuottamiseksi, jotka estävät Pseudomonas aeruginosaitiöiden motiliteettiä, parantavat näiden itiöiden fagosytoosia ja tuhoavat opsonisoidut itiöt, tunnettu siitä, serotyypin a yhden ainoan flagella(h)-antigeenin ja serotyypin b flagella(h)-antigeenin yhdistelmällä immunisoitujen luovuttajien plasma käsitellään proteiininsaostusaineilla, kuten ammoniumsulfaatilla, liuotetaan saostettu immunoglobuliini-g-pitoinen fraktio, puhdistetaan ja valmistetaan galeeniseksi valmisteeksi.

26 Patentkrav: 1. Förfarande för framstållning av sådana divalenta vaccin verkande mot Pseudomonas aeruginosa -infektioner, vilkas verkan täcker alla kombinationer av partial-flagella(h)- antigenerna a o, a l, a 2, a 3, a 4 och b och vilka innehåller en kombination av en enda flagella(h)-antigen av serotypen a och en flagella(h)-antigen av serotypen b, kännetecknat av sterilfiltrering av den (de) ur Pseudomonas aeruginosa -kulturer erhållna, renade flagella(h)-antigenen(-erna), sammanblandning med en eventuell adjuvant, såsom Al(OH) 3, tillsättning, om så önskas, av ett konserveringsmedel, såsom mertiolat, och bearbetning till ett galeniskt preparat. 2. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k n a t av att ett divalent vaccin framstålles, som innehåller en flagella(h)-antigen av serotypen a 0a 2, vilken antigen består av monomera beståndsdelar och innehåller såsom aminosyror asparaginsyra, threonin, serin, glutaminsyra, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, fenylalanin, lysin och arginin i förhållandet 68 : 41 : 37 : 46 : 44 : 73 : 29 : 29 : 37 : 3 : 10 : 16 : 16, och vilken antigen uppvisar en molekylarvikt på 45.900. 3. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k n a t av att ett divalent vaccin framställes, som innehåller en flagella(h)-antigen av serotypen a oal a 2, vilken antigen består av monomera beståndsdelar och innehåller såsom aminosyror asparaginsyra, threonin, serin, glutaminsyra, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, fenylalanin, lysin och arginin i förhållandet 76 : 44 : 40 : 52 : 50 : 81 : 32 : 32 : 41 : 4 : 12 : 20 : 18, och vilken antigen uppvisar en molekylarvikt på 51.250. 4. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att ett divalent vaccin framstålles, som innehåller en

27 flagella(h)-antigen av serotypen a 0a3, vilken antigen består av monomera beståndsdelar och innehåller som aminosyror asparaginsyra, threonin, serin, glutaminsyra, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, fenylalanin, lysin och arginin i förhållandet 69 : 35 : 38 : 44 : 47 : 73 : 30 : 30 : 60 : 3 : 12 : 21 : 16, och vilken antigen uppvisar en molekylarvikt på 46.700. 5. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k n a t av att ett divalent vaccin framställes, som innehåller en flagella(h)-antigen av serotypen a 0a 3a 4, vilken antigen består av monomera beståndsdelar och innehåller såsom aminosyror asparaginsyra, threonin, serin, glutaminsyra, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, fenylalanin, lysin och arginin i förhållandet 64 : 33 : 35 : 42 : 44 : 68 : 29 : 29 : 37 : 3 : 10 : 19 : 15, och vilken antigen uppvisar en molekylarvikt på 43.500. 6. Förfarande enligt något av patentkraven 2-5, k ä n - netecknat av att ett divalent vaccin framställes, som vidare innehåller en flagella(h)-antigen av serotypen b, vilken antigen består av monomera beståndsdelar och innehåller såsom aminosyror asparaginsyra, threonin, serin, glutaminsyra, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, fenylalanin, lysin och arginin i förhållandet 74 : 48 : 48 : 49 : 51 : 91 : 38 : 30 : 43 : 4 : 13 : 18 : 18, och vilken antigen uppvisar en molekylarvikt på 53.050. 7. Förfarande för framställning av sådana immunoglobulin-ghaltiga preparat, som hämmar Pseudomonas aeruginosa - bakteriernas motilitet, förbättrar deras fagocytos och utplånar opsoniserade bakterier, k ä n n e t e c k n a t av att plasma från donatorer immuniserade med kombinationen av en enda flagella(h)-antigen av serotypen a och en flagella(h)-antigen av serotypen b behandlas med proteinutfällningsmedel, såsom ammoniumusulfat, den utfällda immunoglobulin-g-haltiga fraktionen upplöses,

28 renas och bearbetas till ett galeniskt preparat.

100 90 80 70 60 j, 50 H 40 E-, 30 20 10 011 1:10 VASTA-AINETIITTERI 1:100 100 90 80 70 FIG. 2 60 er 50 40 El ö 30 E-I 20 10 o b o 00 (2 10 2 4 (2a (22 aci3 ck,a,a, 0 11 1:10 VASTA-AINETIITTERI 1:100