SUOMI FINLAND (21) Patenttihakemus - Patentansökning 860015

111111111111111111111111111 1 111111111111111111 1 111111111111111111 1 111 F 0000B (B) (U)KUULUTUBJULKAIBU UTLAGGNINGSSKRIFT '''` Pat: - t :::13cl -J.t 27 C3 12:5 (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 A 61K 39/00, 39/108, C 12N 15/31, C 07K 13/00, 15/04 SUOMI FINLAND (21) Patenttihakemus - Patentansökning 860015 (F0 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 02.01.86 (24) Alkupäivä - Löpdag 02.05.85 Patentti (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 02.01.86 - ja rekisterihallitus Patent - och registerstyrelsen (44) Nåhtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 15.12.94 (71) Hakija - Sökande (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/DK85/00045 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 02.05.84 DK 2190/84 P 1. Symbicom Aktiebolag, Box 1451, 901 24 Umeå, Sverige, (SE) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Lindberg, Frederik Carl Peter, Hedgrindsgatan 3, 811 61 Sandviken, Sverige, (SE) 2. Lund, Björn Olof, Stipendiegränd 14 F, 902 40 Umeå, Sverige, (SE) 3. Båga, Britt Monika, Biologigränd 36, 902 40 Umeå, Sverige, (SE) 4. Norgren, Mari Elisabet, Häradshövdingegatan 30 B, 902 40 Umeå, Sverige, (SE) 5. Göransson, Mikael, Språkgränd 41, 902 40 Umeå, Sverige, (SE) 6. Ohlin, Bernt Eric Anund, Rödhakevägen 20, 902 37 Umeä, Sverige, (SE) 7. Normark, Jan Staffan, Zakrisvägen 28, 913 00 Holmsund, Sverige, (SE) 8. Lark, David Lee, Trastvägen 9A, 902 37 Umeå, Sverige, (SE) (74) Asiamies - Ombud: Oy Kolster Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä rokotteen valmistamiseksi piluksia kantavien nisäkkään kudoksiin tarttuvien bakteerien aiheuttamia tauteja vastaan Förfarande för framställning av ett vaccin för immunisering av ett däggdjur mot sjukdomar förorsakade av patogena pilusbärande bakterer vilka fäster sig på däggdjursvävnader (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer GB A 2094314 (C 12N 15/00) (57) Tiivistelmä - Sammandrag Kyseessä oleva keksintö koskee antigeeniä, Ifrånavarande uppfinning avser en antigen, joka immunisoivana pääkomponenttinaan kä- vilken som immuniserande huvudkomponent omsittää adhesiini -polypeptidi-determinantin fattar en determinant av en adhesinpolypeptid tai sen immunogeenisesti aktiivisen alasek- eller en immunogenisk undersekvens därav eller venssin tai sen prekursorin, joka on muu- en föregångare till densamma, vilken kan tettavissa immunogeenisesti aktiiviseen överföras i en immunogeniskt aktiv form, muotoon, vasta-aineita, joita vastaan de- antikroppar mot vilka determinanten reagerar terminantti reagoi adhesiini-polypeptidin med adhesinpolypeptiden som produserats av kanssa, jonka ovat valmistaneet patogeeni- patogeniska, adhesinbildande bakterier, vilka set adhesiinia muodostavat bakteerit, jot- häftar vid däggdjursvävnad, antikroppar mot ka tarttuvat nisäkäskudokseen, vasta-ainei- dylik antigen, och DNA, vilken som huvudsaklig ta sellaisesta antigeeniä kohtaan sekä DNA, genprodukt, exprimerar dylik antigen. joka ekspressoi, pääasiallisena geenituotteenaan, sellaista antigeeniä.

1 Menetelmä rokotteen valmistamiseksi piluksia kantavien nisäkkään kudoksiin tarttuvien bakteerien aiheuttamia tauteja vastaan 5 Menetelmää rokotteen valmistamiseksi nisäkkään immunisoimiseksi patogeenisten piluksia kantavien, nisäkkään kudokseen tarttuvien bakteerien aiheuttamia tauteja vastaan. Antigeenit, jotka koostuvat useista proteiineista, 10 jotka patogeenisessa bakteerikannassa tai lajissa muodostavat erillään olevan fenotyypin ja joiden siitä syystä täytyy olettaa sisältävän suuren joukon immunogeenisia determinantteja, ovat hyvin tunnettuja. Kuitenkin sellaisilla antigeeneilla sekä niistä valmistetuilla rokotteilla 15 on monia haittoja: niillä on erityisesti taipumuksena olla liian selektiivisiä siinä suhteessa, että immunisoitaessa, vastaaineet, jotka muodostuvat näistä immunogeenisia determinantteja kohtaan, jotka yhdessä tunnistavat tietyn bakteerikannan, josta antigeeni on peräisin, mutta jotka 20 eivät tunnista muita saman lajin bakteerikantoja, niin että immunisointi saadaan aikaan vain tätä tiettyä kantaa, mutta ei muita, saman lajin läheisiä kantoja kohtaan. Kyseessä oleva keksintö koskee yritystä voittaa nämä haitat antamalla käyttöön antigeeni, joka olennaisilta 25 osiltaan käsittää ainoastaan immunogeenisen determinantin (immunogeeniset determinantit), joka johtaa (jotka johtavat) haluttuun immuniteettiin ja joka (jotka) edelleen ei rajoitu (eivät rajoitu) kyseessä olevan patogeenisen bakteerin yhteen tiettyyn kantaan. 30 On tullut yhä selvemmäksi, että monien patogeenis- ten bakteereiden kyky tarttua solujen pintaan on ensisijaisen tärkeää monien infektiosairauksien alkarniselle (Beachney, J. Infect. Dis. 143, 1981, s. 325-345). Tämä tarttumiskyky johtuu nisäkäskudossolujen, kuten esimerkik- 35 si epiteelisolujen tai nisäkkäiden erytrosyyttien pinnalla

2 sijaitsevista reseptoreista, jotka konfiguraationsa johdosta muodostavat sidoksia adhesiini-polypeptidien kanssa. (Kyseessä olevassa yhteydessä termilla "adhesiini-polypeptidi" tarkoitetaan polypeptidiä, joka spesifisesti tarvi- 5 taan tarttumis fenotyyppiin ja, yleisemmin sanottuna, polypeptidiä, jonka poissa ollessa tarttumista ei tapandu (jostakin syystä).) Kukin reseptori on vastuussa sitoutumisesta eri adhesiini-rakenteen kanssa. Reseptori saattaa olla peptidireseptori, kuten esimerkiksi sokerissa sijait- 10 seva aminohappo tai - tavallisemmin - hiilihydraatti, kuten esimerkiksi neuramiinihappo-(2 3)-galaktoosi, mannoosi-a-(1 2)mannoosi tai digalaktosidi (a-d-galp-(1 4)-B-D-Galp-osa, joka sijaitsee glykolipidien globo-sarjoissa, joita kyseessä olevassa yhteydessä silloin tällöin 15 nimitetään globosideiksi). Monissa patogeenisissa bakteereissa varsinaisen adhesiini-polypeptidin uskotaan muodostavan vain osan polypeitidin suuremmasta sekvenssistä, jotka polypeptidit kaikki, tavalla tai toisella, liittyvät tarttumistoimin- 20 taan (esim. polypeptidit, jotka toimivat välittäjinä adhesiinin kuljetuksessa solunseinämän läpi tai kiinnittävät sen solunulkopintaan jne.) ja kyseessä olevan keksinnön tarkoituksen mukaisesti, spesifinen adhesiini-polypeptidi tunnistetaan sekvenssin muiden polypeptidien joukosta ja 25 sitä käytetään antigeenina. Tämän on ajateltu muodostavan vähemmän selektiivisen tunnistamismarkkerin, niin että vasta-aineita ei muodostu ainoastaan kantaa kohtaan, josta antigeeni on peräisin, vaan myös samojen bakteerilajien muita patogeenisia kantoja kohtaan. 30 Niinpä kyseessä olevassa hakemuksessa kuvataan antigeenia, joka immunisoivana pääkomponenttinaan käsittää adhesiinipolypeptidin determinantin tai sen immunogeenisesti aktiivisen alasekvenssin tai sen prekursorin, joka on muutettavissa immunologisesti aktiiviseen muotoon, vas- 35 ta-aineita, joita vastaan determinantti reagoi adhesiini-

3 polypeptidin kanssa, jonka valmistavat patogeeniset, adhesiinia muodostavat bakteerit, jotka tarttuvat nisäkäskudokseen. Tämä antigeeni saattaa käsittää ainakin viiden aminohapon muodostaman aminohapposekvenssin aina adhesii- 5 ni-polypeptidin koko aminohapposek-venssiin saakka. Adhesiini-polypeptidi saattaa olla sopivasti peräisin adhesiinia muodostavista bakteereista. Tähän bakteereiden ryhmään kuuluu sekä gram-positiivisia että gram-negatiivisia bakteereita ja kyseessä olevassa yhteydessä 10 mielenkiintoisimmat bakteerilajit, joista yhden tai useamman spesifisen adhesiini-polypeptidin olisi edullista olla peräisin, ovat Escherichia colin tai muiden suolistobakteereiden enteropatogeeniset kannat tai suunbakteerit, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningiditis, Neisseria 15 catarrhalis, Yersinia lajit, Pseudomonas aeruginosa tai muut Pseudomonas-lajit, Moraxella bovis tai muut Moraxellalajit, Bacteroides nodosus, Staphylococcus-lajit, Streptococcus-lajit tai Bordetella-lajit, kuten esimerkiksi Bordetella pertussis. 20 Vaihtoehtoisesti saatetaan adhesiini-polypeptidi valmistaa synteettisesti alla kuvatulla tavalla. Tähän ryhmään kuuluvien joidenkin patogeenisten bakteereiden suhteen on todisteita siitä, että säikeiset rakenteet, joita nimitetään piluksiksi (fimbriat) ja jotka 25 työntyvät esiin solunseinämästä, ovat jollain tavalla yhteydessä tarttumiseen ja siitä syystä - ja koska pilukset ovat helposti puhdistettavissa - kokonaisia pilusvalmisteita on käytetty rokotteissa antigeeneina, esim. gonokokkuspilus-antigeeni (tutkittu Yhdysvaltain armeijan kenttä- 30 kokeissa). Aiemmat tutkijat, jotka ovat työskennelleet pilusvalmisteiden parissa, menivät erittäin pitkälle yrityksissä valmistaa "puhdasta" pilus-proteiinia proteiinin karakterisointia ja immunisointia varten ja heidän yrityksensä 35 olivat näennäisesti onnistuneita siinä suhteessa, että

4 heidän valmisteissaan tuli esille vain yksi vyöhyke SDSgeeleissä, (Yhdysvaltain patentti nro 4 443 431 (Buchanan T.M. et al.); Saliet I.E. & E.C; Gottlisch, J. Exp. Med 146, 1977, s. 1169; Klemm P I. Orskov & F. Orskov, In- 5 fect. and Immunity 36, 1982, s. 462; Schoolnik G.K. et al., J. Exp. Med. 159, 1984, s. 1351; Svanborg E.C., Prog. Allergy 33, 1983, s. 189). Saaduilla pilus-proteiinivalmisteilla oli ainakin kolme toimintaa. Ensimmäinen toiminto oli kyky muodostaa polymeerejä, luultavasti hydrofobis- 10 ten sitoutumistapahtumien avulla; ominaisuus, joka on luonteenomainen pilussäikeen muodostamiselle monomeerisistä alayksiköistä. Toinen ominaisuus on kyky synnyttää vasta-aineita; ominaisuus, joka olisi olennainen kaikille yrityksille käyttää proteiinia rokotteena. Kolmas ominai- 15 suus oli kyky tarttua solunpintareseptoreihin. Koska tutkijat eivät pystyneet tunnistamaan enempää kuin yhden proteiinin pilusproteiinivalmisteissaan sekä piluksissa itsessään, pääteltiin, että pilukset olivat identtisten, monomeeristen proteiiniyksiköiden polymeerisiä aggregaat- 20 teja, siten että kullakin alayksiköllä oli kaikki kolme yllä kuvattua toimintoa (US-patentti nro 4 443 431 (Buchanan T.M. et al.); Rothbard J.B., PNAS 82, 1985, s. 915). Kuitenkin, kuten aiemmin on mainittu, koskemattomalla, kokonaisella piluksella, joka on peräisin yhdestä la- 25 jista, on laaja antigeeninen vaihtelevuus. Lisäksi on havainnollistettu, että kun sitä käytetään rokotteena, yksinkertaisen antigeenityypin koskematon, kokonainen pilus valmistaa vasta-ainetta ensisijaisesti tuota yksinkertaista antigeenityyppiä, pikemmin kuin jaettuja pilus-antigee- 30 neja kohtaan. Aiemmat tutkijat ovat kemiallisesti pilkkoneet puhdistetun pilusyksikön fragmentteihin, joilla on aiotut toiminnot: polymerointi, tavallinen antigeenitoiminta sekä sitoutuminen. Kukin yksittäinen toiminta tunnistettiin puhdistetun pilus-alayksikön erillisen fragmen- 35 tin avulla. Täten on oletettu, että puhdistetut pilus-pro-

5 teiinivalmisteet sisältävät yksinkertaisen proteiinin piliini-monomeerin. Tämä piliini-monomeeri on pilkottu kemiallisesti ja sen oletetaan käsittävän sitomistoiminnan sekä tärkeimmän antigeenisuuden - saman kuin polymeroitu- 5 nut huokos-pilus-proteiini. Kyseessä olevan patentin hakijoiden suorittamat, laajat tutkimukset havainnollistavat kuitenkin, että oletetut, puhtaat pilus-proteiinit koostuvat itse asiassa useista proteiinijakeista, joilla on erilliset toiminnot. 10 Tosiasiassa, pilussäie ei vastaa sitoutumisesta solun pintaan, vaan pienempi komponentti, jonka on arveltu olevan epäpuhtauden, joka on todennäköisesti kiinnittynyt säikeeseen, vastaa sitoutumisesta solunpintaan. Tämä ainutlaatuinen havainto voitiin selittää vain siten, että pilusten 15 rakenteellinen muodostuminen ja tarttumisominaisuus digalaktosidi-reseptoreihin, voi olla geneettisesti dissosioitu. Muut mutatoituneet organismit, jotka säilyttivät tunnistettavat pilusrakenteet, mutta jotka eivät kyenneet tarttumaan, varmistivat havainnon edelleen. Havainnon joh- 20 topäätös oli edelleen se, että pilus-proteiinin, jonka aiemmin oletettiin olevan puhtaan, täytyy sisältää ainakin kaksi jaetta, joista toinen on rakenteellinen aineosa, joka kytkeytyy pilusten varsinaiseen muodostumiseen ja toinen on jae, joka vastaa tarttumisominaisuudesta. Se 25 seikka, että molemmilla jakeilla on antigeenisia ominaisuuksia, avasi mandollisuuden tuottaa vasta-aineita ainoastaan adheesiosta vastuussa olevaa jaetta vastaan. Myös piluksia kantavien bakteereiden tapauksessa on edullista valmistaa antigeeni, jolla on vähemmän selek- 30 tiivisyyttä kantaa kohtaan, jos ollenkaan ja sellainen antigeeni annetaan käyttöön tunnistamalla yksi tai useampia komponentteja, jotka muodostavat osan koko piluksen rakenteesta ja jotka välittävät spesifisesti tarttumiskyvyn. Kyseessä olevassa tapauksessa, sellaista komponenttia 35 nimitetään pilus-adhesiini-polypeptidiksi. Sen kanssa yh-

6 denmukaisesti, mitä yllä on esitetty, pilus adhesiini-polypeptidi käsittää tavallisesti koko piluksen aminohapposekvenssin pienemmän komponentin piluksista, jotka ovat peräisin piluksia muodostavilta, patogeenisilta baktee- 5 reilta ja jotka eroavat piliinistä (puhdistetun piluksen alayksikön muodostaessa pilussäikeen pääosan). Esimerkkejä piluksia imuodostavista bakteereista, jotka ovat tähän tarkoitukseen käyttökelpoisia, ovat Escherichia colin uropatogeeniset tai enteropatogeeniset kannat, Neisseria go- 10 norrhoeae, Neisseria meningiditis, Neisseria catarrhalis, Moraxella bovis tai muut Moraxella-lajit sekä Bordetella pertussis. Kyseessä olevan keksinnön tarkoituksiin tässä yhteydessä julkaistut tutkimukset ovat ensi sijaisesti kos- 15 keneet E. colin uropatogeenista kantaa, joka aiheuttaa pyelonefriittiä. Tulisi kuitenkin olla ymmärrettävää, että E. colin erilaiset geneettiset järjestelmät, jotka koodittavat pilusadhesiineja, ovat hyvin samankaltaiset ja niin muodoin on erittäin luultavaa, että sellaisia vähäisiä 20 piluskomponentteja, jotka välittävät tarttumista, on olemassa piluksen kaikkia tyyppejä varten, se on piluksia varten, jotka ovat muista bakteereista kuin E. colista peräisin. Reseptori, joka vastaa patogeenisten piluksia muodostavien bakteereiden sitoutumisesta, mikä johtuu re- 25 septorin - tai reseptorin osan - kytkentärakenteista sekä adhesiini-molekyylit, vastaavasti, on uropatogeeniselle E. colille tunnistettu digalaktosidiksi, a-d-galp-(1-4)-b- D-Galp-osaksi, joka on läsnä glykolipidien globo-ryhmissä, joihin bakteerit voidaan saada kiinnittymään uroepiteelis- 30 sä ja joka on myös ihmisen erytrosyyttien pinnalla osana P-veriryhmän antigeenejä. Kyseessä olevaan keksintöön johtavan tutkimuksen kuluessa keksinnön tekijät ovat tunnistaneet uropatogeenisen E. colin kannan kromosomilla alueen, joka koodittaa 35 Pap-piluksia (pyelonefriittiin kytkeytyvät pilukset) ja

7 joka on 8,5 kb:n pituinen alue, jonka on havaittu koodittavan ainakin kandeksaa erilaista polypeptidiä. Kyseessä olevat keksijät ovat myös saaneet aikaan polypeptidejä, joiden poissaolo aiheuttaa E. colin solujen tarttumatto- 5 muuden. Tästä syystä näiden polypeptidien oletetaan olevan vastuussa uropatogeenisen E. colin tarttumisfenotyypistä. Niin muodoin tässä esitetään myös seuraavan aminohapposekvenssin mukaiset antigeenit: 10 Met-Lys-Lys-Ile-Arg-Gly-Leu-Cys-Leu-Pro-Val-Met-Leu-Gly-Ala-Val- Leu-Met-Ser-Gln-His-Val-His-Ala-Val-Asp-Asn-Leu-Thr-Phe-Arg-Gly- Lys-Leu-Ile-Ile-Pro-Ala-Cys-Thr-Val-Ser-Asn-Thr-Thr-Val-Asp-Trp- Gln-Asp-Val-Glu-Ile-Gln-Thr-Leu-Ser-Gln-Asn-Gly-Asn-His-Glu-Lys- Glu-Phe-Thr-Val-Asn-Met-Arg-Cys-Pro-Tyr-Asn-Leu-Gly-Thr-Met- 15 Lys-Val-Thr-Ile-Thr-Ala-Thr-Asn-Thr-Tyr-Asn-Asn-Ala-lle-Leu-Val- Gln-Asn-Thr-Ser-Asn-Thr-Ser-Ser-Asp-Gly-Leu-Leu-Val-Tyr-Leu- Tyr-Asn-Ser-Asn-Ala-Gly-Asn-lle-Gly-Thr-Ala-lle-Thr-Leu-Gly-Thr- Pro-Phe-Thr-Pro-Gly-Lys-Ile-Thr-Gly-Asn-Asn-Ala-Asp-Lys-Thr-Ile- Ser-Leu-His-Ala-Lys-Leu-Gly-Tyr-Lys-Gly-Asn-Met-Gln-Asn-Leu-Ile- 20 Ala-Gly-Pro-Phe-Ser-Ala-,Thr-Ale-Th,r-Leu-Vai7Ala-Ser-Tyr-Ser tai mitä tahansa sen immunogeenisesti aktiivista alasekvenssiä tai Met-Ile-Arg-Leu-Ser-Leu-Phe-Ile-Ser-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Val-Ala- Val-Leu-Ala-Asp-Val-Gln-lle-Asn-lle-Arg-Gly-Asn-Val-Tyr-Ile-Pro- 25 Pro-Cys-Thr-Ile-Asn-Asn-Gly-Gln-Asn-lle-Val-Val-Asp-Phe-Gly-Asn- Ile-Asn-Pro-Glu-His-Val-Asp-Asn-Ser-Arg-Gly-Glu-Val-Thr-Lys-Thr- Ile-Ser-Ile-Ser-Cys-Pro-Tyr-Lys-Ser-Gly-Ser-Leu-Trp-Ile-Lys-Val- Thr-Gly-Asn-Thr-Met-Gly-Gly-Gly-Gln-Asn-Asn-Val-Leu-Ala-Thr- Asn-lle-Thr-His-Phe-G1y-Ile-Ala-Leu-Tyr-Gln-Gly-Lys-Gly-Met-Ser- 30 Thr-Pro-Leu-Ile-Leu-Gly-Asn-Gly-Ser-Gly-Asn-Gly-Tyr-Gly-Val-Thr- Ala-Gly-Leu-Asp-Thr-Ala-Arg-Ser-Thr-Phe-Thr-Phe-Thr-Ser-Val- Pro-Phe-Arg-Asn-Gly-Ser-Gly-Ile-Leu-Asn-Gly-Gly-Asp-Phe-GIn- Thr-Thr-Ala-Ser-Met-Ser-Met-Ile-Tyr-Asn tai mitä tahansa sen immunogeenisesti aktiivista alasekvenssiä tai

8 Met-Lys-Lys-Trp-Phe-Pro-Ala-Phe-Leu-Phe-Leu-Ser-Leu-Ser-Gly- Gly-Asn-Asp-Ala-Leu-Ala-Gly-Trp-His-Asn-Val-Met-Phe-Tyr-Ala- 5 Phe-Asn-Asp-Tyr-Leu-Thr-Thr-Asn-Ala-Gly-Asn-Val-Lys-Val-Ile- Asp-Gln-Pro-Gin-Leu-Tyr-Ile-Pro-Trp-Asn-Thr-Gly-Ser-Ala-Thr-Ala- Thr-Tyr-Tyr-Ser-Cys-Ser-Gly-Pro-Glu-Phe-Ala-Ser-Gly-Val-Tyr- Phe-Gin-Glu-Tyr-Leu-Ala-Trp-Met-Val-Val-Pro-Lys-His-Val-Tyr-Thr- Asn-Glu-Gly-Phe-Asn-lle-Phe-Leu-Asp-Val-Gin-Ser-Lys-Tyr-Gly- 10 Trp-Ser-Met-Glu-Asn-Glu-Asn-Asp-Lys-Asp-Phe-Tyr-Phe-Phe-Val- Asn-Gly-Tyr-Glu-Trp-Asp-Thr-Trp-Thr-Asn-Asn-Gly-Ala-Arg-Ile- Cys-Phe-Tyr-Pro-Gly-Asn-Met-Lys-Gln-Leu-Asn-Asn-Lys-Phe-Asn- Asp-Leu-Val-Phe-Arg-Val-Leu-Leu - Pro - Val-Asp-Leu-Pro-Lys-Gly- His-Tyr-Asn-Phe-Pro-Val-Arg-Tyr-Ile-Arg-Gly-Ile-Gin-His-His-Tyr- 15 Tyr-Asp-Leu-Trp-Gin-Asp-His-Tyr-Lys-Met-Pro-Tyr-Asp-Gln-lle- Lys-Gln-Leu-Pro-Ala-Thr-Asn-Thr-Leu-Met-Leu-Ser-Phe-Asp-Asn- Val-Gly-Gly-Cys-Gln-Pro-Ser-Thr-Gln-Val-Leu-Asn-lle-Asp-His-Gly- Ser-Ile-Val-Ile-Asp-Arg-Ala-Asn-Gly-Asn-lle-Ala-Ser-Gin-Thr-Leu- Ser-Ile-Tyr-Cys-Asp-Val-Pro-Val-Ser-Val-Lys-Ile-Ser-Leu-Leu-Arg- 20 Asn-Thr-Pro-Pro-lle-Tyr-Asn-Asn-Asn-Lys-Phe-Ser-Val-Gly-Leu- Gly-Asn-Gly-Trp-Asp-Ser-Ile-Ile-Ser-Leu-Asp-Gly-Val-Glu-Gln-Ser- Glu-Glu-lle-Leu-Arg-Trp-Tyr-Thr-Ala-Gly-Ser-Lys-Thr-Val-Lys-Ile- Glu-Ser-Arg-Leu-Tyr-Gly-Glu-Glu-Gly-Lys-Arg-Lys-Pro-Gly-Glu- 25 Leu-Ser-Gly-Ser-Met-Thr-Met-Val-Leu-Ser-Phe-Pro tai mitä tahansa sen immunogeenisesti aktiivista alasekvenssiä. Nämä aminohapposekvenssit on saatu aikaan tunnetuin 30 menetelmin esimerkissä 5 kuvatulla tavalla. Kanden jälkimmäisen antigeenin puuttumisen on havainnollistettu ehdottomasti aiheuttavan kaikissa tapauksissa, että sitoutumista globosidi-reseptoriin ei tapandu (vrt. esimerkki 3 alla) ja molempien on siitä syystä ole- 35 tettu olevan varsinaisen adhesiini-polypeptidin, samalla

I 9 sen edellisen antigeenin on osoitettu aiheuttavan sitoutumisen puuttumisen ainoastaan tietyissä tapauksissa (vrt. esimerkki 3 al-la) ja sen tähden sitä on oletettu tarvittavan kiinnittämään muodostunut adhesiini-polypeptidi so- 5 lunseinämän ulkopintaan. Olisi huomattava, että yllä esitetyt aminohapposekvenssit ovat pilus-adhesiini-polypeptidien prekursorimuotoja, jotka sisältävät N-terminaalisia signaalipeptidin kaltaisia sekvenssejä, jotka lohkaistaan pois, kun poly- 10 peptidi kuljetetaan bakteerin sisämembraanin lävitse. Kyseessä olevan keksinnön periaatteiden mukaisesti on edullista, että keksinnön mukaisesti valmistetusta antigeenista suurin piirtein puuttuvat muut komponentit, jotka liittyvät tarttumistoimintaan, kuten esimerkiksi 15 muut piluksen komponentit, jotta vältytään monien vastaaineiden muodostumiselta, kun antigeenia käytetään immunisointiin yllä esitetyin, seuraavin haitoin. Mieluiten antigeeni on suurin piirtein puhtaassa muodossa, se on, siltä puuttuvat myös muut determinantit, jotka eivät millään 20 liity adhesiinin muodostumiseen, mutta jotka saattavat aiheuttaa ei-toivottuja immunologisia reaktioita. Eräänä toisena näkökohtana, tässä esitetään myös vasta-aine, joka on saatu aikaan antigeenia vastaan tai joka on olennaisilta osiltaan suunnattu ainoastaan yllä 25 määriteltyä antigeenia vastaan ja joka pääasiallisena immunisoivana komponenttinaan sisältää adhesiini-polypeptidin determinantin tai sen immunogeenisesti aktiivisen alasekvenssin tai sen prekursorin, joka on muutettavissa immunologisesti aktiiviseen muotoon. Sellainen vasta aine 30 saattaa oila vasta-aine, joka saadaan immunisoimalla immunisoitava eläin yllä määritellyllä antigeenilla ja hankkimalla antiseerumi, kuten esimerkiksi immunoglobuliinit, eläimestä sinänstä tunnetulla tavalla. Immunisointi suoritetaan mieluummin antigeenin stabiloidulla vesiliuoksella; 35 stabilointiaineena saattaa olla puskuri, kuten esimerkiksi

10 fosfaatilla puskuroitu keittosuclaliuos tai adjuvantti (myös antigeeniominaisuuksien lisäämiseksi) ja sopiva adjuvantti on Freundin adjuvantti tai aluminiumhydroksidi. Immunisointitarkoituksiin edullisia eläimiä ovat hiiret, 5 kaniinit, vuohet ja lammas, vaikka porsaan immunoglobuliineja voidaan myös käyttää vasta-aineina. Veren vuodattaminen eläimeltä sekä antiseerumin eristäminen suoritetaan hyvin tunnetuin menetelmin. Tässä kuvattu vasta-aine on mieluummin suurin piir- 10 tein puhtaassa muodossa, mikä tekee sen käyttökelpoiseksi diagnostisia tarkoituksia varten alla kuvatulla tavalla. Vaihtoehtoisesti saatetaan vasta-aine valmistaa myös hybridoomamenetelmän avulla, joka on tunnettu vastaaineiden valmistusmenetelmä. Hybridoomatekniikassa, jossa 15 käytetään esimerkiksi hiiriä immunisoituina eläiminä, hiiret immunisoidaan kyseessä olevalle vasta-aineella ja immunisoitujen hiirien pernasolut liitetään yhteen myeloomasolujen kanssa, minkä jälkeen yhteensulautetut hybridoomasolut kloonataan, vasta-ainetta valmistavat solut kasvate- 20 taan sopivassa elatusaineessa ja vasta-aine kootaan viljelmästä. Hybridoomamenetelmällä saaduilla vasta-aineilla on etuna suurempi spesifisyys ja siitä syystä esim. diagnoosi on tarkempi. Mandollisessa lisävaiheessa, käyttämällä yhdistelmä-dna-menetelmää, vasta-ainetta koodittava 25 geeni tai sitä koodittavat geenit siirretään hybridoomasolukloonista sopivaan vektoriin, hybridivektori siirretään sopivaan isäntään, isännän annetaan kasvaa sopivassa elatusaineessa ja syntyvä vasta-aine kootaan viljelmästä. Tällä tavalla saatetaan saada vasta-aineen parempi saanto. 30 Isäntä saattaa olla jokin, tavallisesti yhdistelmä-dnatekniikan alueella käytetty isäntä, kuten esimerkiksi Escherichia coli tai Bacillus subtilis. Hyvin tärkeä kyseessä olevan keksinnön näkökohta koskee rokotetta nisäkkään immunisoimiseksi sairauksia 35 vastaan, joita aiheuttavat patogeeniset bakteerit, jotka

11 tarttuvat nisäkäskudokseen, joka sisältää immunogeenisesti tehokkaan määrän yllä kuvattua antigeenia valinnaisesti sopivaan kantaja-aineeseen sidottuna, yhdessä immunologisesti hyväksyttävän apuaineen kanssa. Tämä apuaine saattaa 5 olla mikä tahansa apuaine, jota tavallisesti käytetään rokotteiden valmistukseen, kuten esimerkiksi laimennusaine, suspendointiaine, adjuvantti jne. Joissakin tapauksissa ei ole välttämätöntä käyttää kantaja-ainetta, koska antigeenillä on taipumus polymeroi- 10 tua itsensä kanssa, mutta silloin kun näin ei tapandu, saattaa olla edullista sitoa antigeeni kovalenttisesti kantaja-aineeseen. Tämä kantaja-aine on tavallisesti polymeerinen kantaja-aine ja - erityisesti kun rokotetta käytetään ihmisten immunisointiin - on tärkeää, että se on 15 fysiologisesti hyväksyttävä. Tunnetaan myrkyttömiä ja/tai ei allergeenisia kantaja-aineita antigeenien liikkumattomaksi tekemistä varten, esim. julkaisusta Arnon, J. Immunological Methods 61, 1983, s. 261-273. Tämäntyyppiset kantaja-aineet, jotka tällä hetkellä ovat tähän tarkoituk- 20 seen mandollisia, ovat esimerkiksi poly-l-lysiini ja poly- D,L-alaniini. Luonnossa esiintyvää kantaja-ainetta saatetaan myös käyttää, edellyttäen että se on myrkytön ja ei allergeeninen. Kyseessä oleva keksintö koskee menetelmää sellaisen 25 rokotteen valmistamiseksi, jossa immunogeenisesti tehokas määrä yllä määriteltyä antigeenia, valinnaisesti sopivaan kantaja-aineeseen sidottuna, yhdistetään, esimerkiksi sidotaan immunologisesti hyväksyttävän apuaineen kanssa sellaisena määränä, että se antaa rokotteelle antigeenin ha- 30 Tutun konsentraation. Keksinnön mukaiselle menetelmälle rokotteen valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Kyseessä olevan keksinnön tietyssä suoritusmuodossa immunogeenisesti aktiivinen aminohapposekvenssi, joka kä- 35 sittää ainakin viisi aminohappoa, sidotaan kovalenttisesti

12 fysiologisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen, kuten esimerkiksi yllä mainittuun. Liitettyjen polypeptidien valmistusmenetelmät ovat tunnetut, esim. julkaisusta, Casabadan et al., Methods in Enzymology 100, 1983, s. 5 293-308. Kyseessä olevan keksinnön eräässä toisessa suoritusmuodossa yllä määriteltyä antigeenia koodittava nukleotidisekvenssi liitetään nukleotidisekvenssiin, joka koodittaa fysiologisesti hyväksyttävää kantajapolypeptidiä, 10 yhdistetty DNA-sekvenssi insertoidaan sopivaan vektoriin, hybridivektori transformoidaan sopivaan bakteeri-isäntään, isäntä kasvatetaan sopivassa elatusaineessa ja yhdistetty polypeptidi otetaan takaisin viljelmästä ja valinnaisesti puhdistetaan. 15 Lisänäkökohtana kyseessä oleva hakemus kuvaa DNAfragmenttia, joka käsittää vähintään nukleotidisekvenssin, joka koodittaa yllä määriteltyä antigeenia. On edullista, että DNA-fragmentti on sellainen, joka oleellisesti ei koodita mitään muuta antigeenia. Tämä nukleotidisekvenssi 20 saattaa olla sekvenssi, joka koodittaa koko adhesiini-polypeptidiä tai joka koodittaa adhesiini-polypeptidin prekursoria, joka on muutettavissa immunogeenisesti aktiiviseen muotoon tai joka koodittaa adhesiini-polypeptidin immunogeenisesti aktiivista alasekvenssiä. Immunogeenises- 25 ti aktiivisen aminohapposekvenssin koodittamiseksi DNAfragmentilla tulisi olla vähintään viiden kodonin pituus (triplettit). Tämä DNA saattaa olla osa kromosomiperäistä tai plasmidiperäistä geneettistä informaatiota, joka on saatu patogeenisiltä, adhesiinia muodostavilta bakteereil- 30 ta, joiden edustavia esimerkkejä ovat Escherichia colin uropatogeeniset tai suolistopatogeeniset kannat tai muut suolistobakteerit tai suunbakteerit, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Neisseria catarrhalis, Yersinia lajit, Pseudomonas aeruginosa tai muut Pseudomo- 35 nas-lajit, Moraxella bovis tai muut Moraxella-lajit, Bac-

13 teroides modosus, Staphylococcus-lajit, Streptococcus-lajit tai Bordetella-lajit, kuten esimerkiksi Bordetella pertussis. Täten DNA-fragmentti saattaa olla DNA-sekvenssi tai 5 osa DNA-sekvenssiä, joka koodittaa pilus-adhesiini-polypeptidiä, joka saattaa olla peräisin patogeeniselta piluksia muodostavalta bakteerilta, kuten esimerkiksi Echerichia colin uropatogeeniselta tai suolistopatogeeniselta kannalta, Neisseria gonorrhoeaelta, Neisseria meningidi- 10 tikseltä, Neisseria catarrhalikselta, Moraxella bovikselta tai muilta Moraxella-lajeilta tai Bordetella pertussikselta. Valaisevana esimerkkinä DNA-fragmentti saattaa olla fragmentti, joka käsittää täydellisesti tai osittain DNA- 15 sekvenssin, joka koodittaa yhtä tai useampaa adhesiini-polypeptidiä, joka on peräisin E. colin uropatogeeniselta kannalta. Kyseessä on siis DNA-fragmentti, joka - pääosiltaan - koostuu seuraavasta DNA-sekvenssistä: 20 ATGAAAAAGATAAGAGGTTTGTGTCTTCCGGTAATGCTGGGGGCAGTGT- TAATGTCTCAGCATGTACATGCAGTTGATAATCTGACCTTCAGAGGAAA- ACTGATTATTCCTGCCTGTACTGTAAGCAACACAACTGTTGACTGGCAG- GATGTAGAGATTCAGACCCTGAGTCAAAATGGAAATCACGAAAAAGAGT- TTACTGTGAATATGCGGTGTCCCTATAATCTGGGAACAATGAAGGTTAC- 25 GATAACGGCAACAAACACTTATAACAATGCTATTTTAGTTCAGAATACA- TCAAACACATCTTCTGATGGGTTACTCGTTTATCTTTATAACAGTAATG- CAGGAAATATTGGGACTGCGATAACTTTAGGGACTCCATTTACGCCCGG- AAAAATCACAGGTAATAATGCAGATAAAACTATATCACTTCATGCCAAA- CTTGGATATQAAGGGAATATGCAGAATTTGATAGCCGGTCCTTTCTCT- 30 GCAACAGCAACGCTGGTTGCATCATATTCGTAA,tai ATGATTCGTTTATCATTATTTATATCGTTGCTTCTGACATCGGTCGCT- GTACTGGCTGATGTGCAGATTAACATCAGGGGGAATGTTTATATCCCC- CCATGCACCATTAATAACGGGCAGAATATTGTTGTTGATTTTGGGAAT- ATTAATCCTGAGCACGTGGACAACTCACGTGGTGAAGTCACAAAAACC- 35 ATAAGCATATCCTGTCCGTATAAGAGTGGCTCTCTCTGGATAAAAGTT-

14 5 10 15 ACGGGAAATACTATGGGAGGAGGTCAGAATAATGTACTGGCAACAAAT- ATAACTCATTTTGGTATAGCGCTGTATCAGGGAAAAGGAATGTCAACAC - CTTATATTAGGTAATGGTTCAGGAAATGGTTACGGAGTGACAGCAGGT - CTGGACACAGCACGTTCAACGTTCACCTTTACTTCAGTGCCCTTTCGT- AATGGCAGCGGGATACTGAATGGCGGGGATTTCCAGACCACGGCCAGTA- TGAGCATGATTTATAACTGA, tai ATGAAAAAATGGTTCCCTGCTTTTTTATTTTTATCCCTGTCAGGCGGT- AATGATGCTTTAGCTGGATGGCACAATGTCATGTTTTATGCTTTTAAC- GACTATTTAACTACAAATGCTGGTAATGTTAAGGTTATTGACCAACCT- CAGCTATATATACCCTGGAATACAGGCTCTGCTACAGCAACTTATTAT- TCGTGCTCAGGTCCGGAATTTGCGAGTGGAGTGTATTTTCAGGAGTAT- CTGGCCTGGATGGTTGTTCCTAAACATGTCTATACTAATGAGGGGTTT- AATATATTTCTTGATGTTCAGAGCAAATATGGTTGGTCTATGGAGAAT- GAAAATGACAAAGATTTTTACTTCTTTGTTAATGGTTATGAATGGGAT- ACATGGACAAATAATGGTGCCCGTATATGTTTCTATCCTGGAAATATG- AAGCAGTTGAACAATAAATTTAATGATTTAGTATTCAGGGTTCTTTTG- CCAGTAGATCTCCCCAAGGGACATTATAATTTTCCTGTGAGATATATA- 20 CGTGGAATACAGCACCATTACTATGATCTCTGGCAGGATCATTATAAA- ATGCCTTACGATCAGATTAAGCAGCTACCTGCCACTAATACATTGATG- TTATCATTCGATAATGTTGGGGGATGCCAGCCGTCAACACAAGTACTT- AATATAGACCATGGGAGTATTGTGATTGATCGTGCTAACGGAAATATT- GCAAGTCAGACGCTTTCAATTTATTGCGATGTACCAGTTAGTGTAAA- 25 ATATCTCTGCTCAGAAATACACCACCAATATACAATAATAATAAATTT- TCGGTTGGGTTAGGTAATGGCTGGGATTCGATAATATCTCTTGATGGG- GTTGAACAGAGTGAGGAAATATTACGCTGGTACACAGCCGGCTCAAAA- ACAGTAAAGATTGAGAGCAGGTTGTATGGTGAAGAGGGAAAGAGAAAA- 30 CCCGGGGAGCTATCTTGGTTCTATGACTAGTGTTCTGAGTTTCCCCTGA tai jostain sen alasekvenssistä, joka, kun se ekspressoidaan, muodostaa adhesiini-polypeptidin immunogeenisesti aktiivisen alasekvenssin, joka on yllä esitetyn, minkä 35 tahansa kokonaisen DNA-sekvenssin koodittama.

15 Vastaavien DNA-fragmenttien sekvenssi on saatu aikaan hyvin tunnetuin menetelmin, kuten esimerkissä 4 kuvataan. Eräänä tärkeänä keksinnön näkökohtana on valmistus- 5 menetelmä antigeenille, joka immunisoivana pääkomponenttinaan käsittää adhesiini-polypeptidin determinantin, jossa menetelmässä bakteeri-isäntää, joka sisältää hybridivektorin, jossa on insertoitu DNA-fragmentti, joka käsittää ainakin nukleotidisekvenssityypin, joka koodittaa yllä 10 mainittua antigeenia, DNA-fragmentti, joka ei koodita olennaisesti muuta antigeenia, viljellään ja DNA-fragmentista ekspressoitu tuote otetaan talteen, jonka jälkeen valinnaisesti seuraa puhdistus. DNA-fragmentti, joka koodittaa adhesiini-polypepti- 15 diä tai sen immunogeenisesti aktiivista alasekvenssiä tai sen prekursoria, joka on muutettavissa immunologisesti aktiiviseen muotoon, saatetaan saada, esim. leikkaamalla se bakteeriperäisestä DNA:sta, jossa se esiintyy luonnossa, käyttämällä yhdistelmä-dna-tekniikkaa, esim. seuraavasti: 20 Kromosomiperäinen DNA, adhesiini-polypeptidiä muodostavalta bakteerilta, leikataan restriktioendonukleaasia käyttäen ja yksityiset DNA-fragmentit liitetään sopivien vektoreiden kanssa, jotka sitten transformoidaan sopiviin bakteeri-isäntiin. Bakteerikloonit, jotka ovat vastaanot- 25 taneet vektorinl tutkitaan sitten tarttumistoiminnan suhteen, siten että määritetään niiden kyky sitoutua kiinteään, spesifisen reseptorin sisältävään pintaan, esimerkiksi erytrosyyttien kanssa suoritettavan agglutinaatiokokeen avulla, standardimenetelmiä käyttäen. Adhesiini-toi- 30 minnon säilyttäneistä klooneista saadut DNA-fragmentit alakloonataan sitten sopivassa vektorissa ja sitten suoritetaan transposonmutageneesi ja/tai osittainen pilkkominen ja uudelleen yhteenliittäminen, jolloin saadaan aikaan alaklooneja, jotka sisältävät pienimmät DNA-fragmentit, 35 jotka vielä säilyttävät kyvyn koodittaa adhesiini-funktio-

9331 0 16 ta bakteeri-isännässä. Tällä tavalla saadaan pienin, välttämätön osa DNA-operonia solun pinnan adhesiini-toiminnon ekspressoimiseksi. Edelleen, joko transposon-mutageneesi tai deleetiokäsittelyä, käyttämällä hyväksi yhdistelmä- 5 DNA-tekniikkaa, käytetään tunnistamaan operonissa sijaitsevia yksityisiä geenejä, jotka ekspressoivat adhesiinipolypeptidiä. Adhesiini-polypeptidiä ekspressoiva geeni tai geenit insertoidaan sitten sopivassa vektorissa valinnaisesti sopivien promoottoreiden insertion avulla adhe- 10 siini-polypeptidin tai -polypeptidien ekspression lisäämiseksi. Sitten vektori transformoidaan sopivaan isäntäorganismiin, bakteeriin, esim. gram-negatiiviseen bakteeriin, kuten E. coliin tai B. subtilikseen. Eräs toimintatapa viimeisessä vaiheessa on selektiivisesti sulkea tai pois- 15 taa geenit, jotka eivät ole välttämättömiä adhesiini-polypeptidin valmistamiselle, E. colin tapauksessa, PapA ja papc-geenit, jotka sijaitsevat DNA-operonin yllä mainitussa pienimmässä, välttämättömässä palasessa. Koska pienemmän pilus-adhesiini-polypeptidin puh- 20 distaminen klassisin, kemiallisin menetelmin valmisteesta, jossa se on seoksena suurehkon pilus-rakennekomponentin kanssa (jota normaalisti valmistetaan samasta operonista), on erittäin vaikeaa, joskaan ei mandotonta, siitä syystä, että rakennekomponentti, joka on immunogeeninen sinänsä, 25 on läsnä paljon suuremmassa määrin, tämä yhdistelmä-dnatekniikka pienemmän pilus-adhesiini-polypeptidin valmistamiseksi on ratkaisevan tärkeää, jotta saadaan immunogeenisesti tehokas ja riittävän puhdas antigeeni kyseessä olevan keksinnön tarkoituksiin, koska yhdistelmä-dna-tekniik- 30 ka sallii selektiivisesti poistettavan geenit, jotka koodittavat ei-toivottuja antigeenejä tai ekspressoivat toisella tavalla, on mandollista valita geeni tai geenejä, jotka koodittavat haluttuja, pieniä adhesiini-polypeptidejä. Insertoimalla tämä geeni tai nämä geenit sopivassa 35 vektorissa, joka valinnaisesti on liitetty muiden tässä

17 yhteydessä kuvattujen geenien kanssa, on mandollista saada suuria määriä pieniä pilus-adhesiini-polypeptidejä, joita muuten on läsnä vain immunogeenisesti lähes tehottomina, tähän saakka huomiota vaille jääneinä, pieninä erinä tun- 5 netuissa pilusvalmisteissa. Erityisen patentinsuoritusmuodon mukaisesti, useita geenejä, jotka koodittavat yhtä tai useita halutuista adhesiini-polypeptideistä, saatetaan insertoida samassa vektorissa, niin että mikro-organismin valmistama, syntyvä 10 tuote tulee olemaan tuote, jossa on kyseessä olevan antigeenin toistuvia determinantteja ja jonka avulla immunogeenisuutta tai reseptoriin sitoutumisen tehokkuutta lisätään. Nämä kaikki toimenpiteet suoritetaan yhdistelmä- 15 DNA-tekniikan alueella hyvin tunnetuin menetelmin, joita on yksityiskohtaisemmin kuvattu alla esimerkeissä 1-3. Tässä menetelmässä käytetty vektori saattaa olla mikä tahansa tällaiseen tarkoitukseen käytetty vektori, kuten esimerkiksi pbr322-johdannaiset, IacUV5-promoottorivekto- 20 rit, vektorit, joilla on laaja isäntäalue, kuten esimerkiksi Tac-promoottorivektorit, sukkulavektorit (shuttle), runaway-plasmidijohdannaiset jne. Elatusaine, jossa bakteeri-isäntää kasvatetaan, saattaa olla mikä tahansa käymismenetelmiin tavanomaisesti käytetty elatusaine, kuten 25 esimerkiksi L-lihaliemi tai M9-glyserolielatusaine. Bakteeri-isäntä on sopivaa valita bakteereiden joukosta, joiden käyttäytyminen käymisolosuhteissa on tunnettua, kuten esimerkiksi Escherichia colin tai Bacillus subtiliksen joukosta. 30 Puhdistus, joka, kuten yllä on mainittu, on monissa tapauksissa edullista, kun asiaankuulumattomien vasta-aineiden, kuten esimerkiksi vasta-aineiden, jotka eivät osallistu immunisointiin kyseessä olevaa antigeenia vastaan ja jotka saattavat saada aikaan ei-toivottuja reak- 35 tioita eläimen osassa, jossa ne muodostuvat, muodostuminen

0 -z -Z 1 0 j JJ 18 sekä samanaikaisesti tapahtuva, isäntäbakteerien muodostamien, mandollisesti myrkyllisten aineiden antigeenin, esim. lipopolysakkaridin, kanssa tapahtuva antaminen vältetään, on kuitenkin havaittu ongelmalliseksi. Puhdistuk- 5 sen helpottamiseksi on suunniteltu menetelmä, johon kytkeytyy yhteenliitettyjen polypeptidien käyttö. Tässä menetelmässä DNA-fragmentti, joka koodittaa ensimmäistä polypeptidiä, joka käsittää adhesiini-polypeptidin tai sen immunogeenisesti aktiivisen alasekvenssin tai sen prekur- 10 sorin, joka on muutettavissa immunologisesti aktiiviseen muotoon, liitetään DNA-sekvenssiin, joka koodittaa toista polypeptidiä, yhteenliitetty DNA-sekvenssi insertoidaan sopivaan bakteeri-isäntään, isäntä kasvatetaan sopivassa elatusaineessa, yhteenliitetty polypeptidi otetaan talteen 15 elatusaineesta ja puhdistetaan käyttämällä menetelmää, johon liittyy vasta-aineiden muodostaminen toista polypeptidiä vastaan ja toinen polypeptidi pilkotaan valinnaisesti sopivan proteaasin avulla, jonka jälkeen eristetään kaksi polypeptidiä. 20 Esimerkki DNA-sekvenssistä, jota saatetaan edulli- sesti käyttää tähän tarkoitukseen, on lacz-geeni, joka koodittaa 13-galaktosidaasia, koska tämän geenituotteen ja niin muodoin adhesiini-polypeptidin tai sen alasekvenssin tai prekursorin ekspressio on helppo havaita, esim. kas- 25 vattaimalla bakteeri-isäntää laktoosi-indikaattorilevyillä ja valita positiiviset (Lacl-pesäkkeet. Puhdistamisen jälkeen toinen polypeptidi saatetaan lohkaista proteaasin, kuten esimerkiksi trypsiinin tai kymotrypsiinin avulla. Halutut peptidifragmentit, jotka ovat 30 peräisin ainoastaan DNA-fragmentista, joka koodittaa ensimmäistä polypeptidiä, johon geeni, joka koodittaa toista polypeptidiä, on liitetty, valitaan niiden immunogeenisen aktiivisuuden perusteella, joka on määritetty esim. in vitro. Kanden polypeptidin erottaminen saatetaan suorittaa 35 standardimenetelmin, kuten esimerkiksi ioninvaihtokromato-

19 grafian, HPLC-käänteisfaasikromatografian tai affiniteettikromatografian, kuten esim. immunoaffiniteettikromatografian tai reseptoriaffiniteettikromatografian avulla. Immunoaffiniteettikromatografian ollessa kysymyksessä, 5 joko vasta-aineita, jotka on saatu aikaan kyseessä olevan keksinnön mukaisia vasta-aineita vastaan (käsittäen ensimmäisen polypeptidin) tai vasta-aineita, jotka on aikaansaatu toista polypeptidiä vastaan, saatetaan käyttää pylväässä liikkumattomiksi tehtyinä vasta-aineina. Reseptori- 10 affiniteettikromatografiassa saatetaan samalla tavalla käyttää valmistetun adhesiinin reseptoria. DNA-fragmentti, jota käytetään yhteenliittämiseen toista polypeptidiä koodittavan DNA-sekvenssin kanssa, saattaa olla mikä tahansa yllä esitetyistä DNA-fragmenteista. 15 Vasta-ainetta, joka on saatu aikaan tai kohdistettu pääasiallisesti antigeenia vastaan, joka käsittää adhesiini-polypeptidin determinantin tai sen immunogeenisesti aktiivisen alasekvenssin tai prekursorin, joka on muutettavissa immunologisesti aktiiviseen muotoon, saatetaan 20 käyttää koostumuksessa, joka on tarkoitettu nisäkkään passiiviseen immunisointiin sairauksia vastaan, jotka ovat patogeenisten bakteereiden aiheuttamia, jotka bakteerit tarttuvat nisäkäskudokseen, joka koostumus käsittää immunologisesti tehokkaan määrän yllä määriteltyä vasta-ainet- 25 ta, valinnaisesti sopivaan kantaja-aineeseen sidottuna, yhdessä immunologisesti hyväksyttävän apuaineen kanssa. Tämä koostumus saatetaan valmistaa menetelmällä, joka käsittää immunogeenisesti tehokkaan vasta-aineen määrän yhdistämisen immunologisesti hyväksyttävän apuaineen kanssa, 30 esimerkiksi sekoittamalla kyseessä olevat komponentit. Kantaja-aine, johon vasta-aine kovalenttisesti sidotaan, saattaa olla mikä tahansa kantaja-aine, joka on yllä määritelty rokotteen kuvauksen yhteydessä. Apuaine, jonka kanssa vasta-aine sekoitetaan, saattaa olla jokin 35 tähän tarkoitukseen käytetty apuaine, kuten esimerkiksi

20 laimennin, adjuvantti jne., jota lisätään sellainen määrä, jotta koostumukseen saadaan haluttu vasta-aineen konsentraatio. Vaikkakin yllä kuvattua antigeenia vähemmän tehok- 5 kaana, vasta-ainetta saatetaan käyttää immunisointiin, mutta sitä käytetään pääasiallisesti diagnostisena aineena määriteltäessä infektiosairauksia, jotka ovat patogeenisten, adhesiinia muodostavien, nisäkkään, esimerkiksi ihmisen kudokseen tarttuvien bakteereiden aiheuttamia, joista 10 bakteereista esimerkkejä ovat Escherichia colin uropatogeeniset tai suolistopatogeeniset kannat tai muut suolistobakteerit tai suun bakteerit, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Neisseria catarrhalis, Yersinialajit, Pseudomonas aeruginosa tai muut Pseudomonas-lajit, 15 Moraxella bovis tai muut Moraxella-lajit, Bacteroides nodosus, Staphylococcus-lajit, Streptococcus-lajit tai Bordetella-lajit, kuten esimerkiksi Bordetella pertussis. Sen tähden tässä kuvataan diagnostista ainetta, joka käsittää yllä kuvatun vasta-aineen, kuten esimerkiksi vasta- 20 aineen, joka on saatu aikaan pilus-adhesiini-polypeptidiä vastaan tai vasta-aineen, joka on saatu antigeenin, joka ei ole adhesiini-polypeptidi tai sen alasekvenssi tai sen prekursori, immunogeenistä determinanttia vastaan. Tämä antigeeni saattaa olla esimerkiksi toinen polypeptidi, 25 jota adhesiini-geeniryhmä on koodittanut (geenien sekvenssi, joka jollakin tavalla kytkeytyy näitä geenejä kantavien bakteereiden kykyyn välittää tarttumista), esimerkiksi yksi muista polypeptideistä, jotka kytkeytyvät pilusten muodostumiseen, kun kysymyksessä ovat piluspolypeptidit, 30 jotka ovat peräisin uropatogeeniselta E. colilta, esimerkiksi geenien papb, papc tai papd (kuten on esitetty kuviossa 1 ja/tai kuviossa 2), jotka vastaavasti koodittavat 13 kd:n ja 28,5 kd:n polypeptidejä, tuotteet. Geenien papc ja papd tuotteiden nykyisin uskotaan välittävän piluksen 35 alayksiköiden (joita geeni papa on koodittanut) kokoonpa-

21 noa ja/tai ankkuroitumista piluksen erittymis- ja polymeroitumistapahtuman aikana (piluksen muodostumista varten). Kun vasta-aineita käytetään taudinmäärittelyyn, ne saatetaan merkata esimerkiksi värjäävällä aineella, niin 5 että antigeenia sisältävät bakteerit, jotka tulee havaita, tulevat näkyviin värjäytyneinä kasoina taudinmäärittelykokeessa. Saatetaan myös käyttää muita menetelmiä, kuten esimerkiksi entsyymiin kytkettyä immunosorbenttimääritystä (ELISA; vrt. materiaali ja menetelmät) tai radioimmunolo- 10 gista määritysmenetelmää (RIA), jossa käytetään radiomerkattuja vasta-aineita. Vaihtoehtoisesti saattaa taudinmäärittelyyn käytettävä aine koostua stabiilista, merkatusta DNA-sekvenssistä, joka on ainakin 60-%:isesti homologinen DNA-sekvenssin 15 kanssa, bakteerissa, jonka läsnäolo tai puuttuminen on taudinmäärittelykokeella osoitettava. Kyseessä olevassa tapauksessa termillä "stabiili" halutaan ilmaista, että nukleotidisekvenssi on suhteellisen vakio, se on että emäsparisubstituutiot, joissa yksi emäspari syrjäytetään 20 toisella, ovat kohtuullisen harvinaisia. Monissa geeneissä sellaiset emäsparisubstituutiot ovat suhteellisen yleisiä, vaikuttamatta välttämättä geenin tuotteen aminohappokoostumukseen, jonka kyseisestä geenistä on ekspressoitu, mutta emäsparisubstituutiot vaikuttavat taudinmäärittelyta- 25 pahtumaan, joka on riippuvainen jokseenkin korkea-asteisesta homologiasta, koettimesta peräisin olevan DNA:n ja bakteeriperäisen DNA:n välillä, jota käytetään tutkittavana näytteenä, koska koettimen DNA-(ala)sekvenssi tunnistaa saman sekvenssin tai sekvenssin, joka muistuttaa sitä jok- 30 seenkin läheisesti bakteeriperäisessä DNA:ssa. Taudinmäärittelymenetelmässä koettimen DNA on merkattu, DNA denaturoidaan sekä koettimen että bakteeriperäisen DNA:n säikeiden erottamiseksi; DNA:iden sekoittamisen jälkeen säikeiden annetaan muodostaa uudelleen kaksoisrihmarakenne, 35 mutta homologian ollessa kysymyksessä (DNA-sekvenssin tun-

22 nistaminen), jonkin verran koettimen DNA on pantu alulle bakteeriperäisessä DNA:ssa. Tämä menetelmä tunnetaan hybridisaationa ja sitä kuvataan esimerkiksi julkaisussa Southern, Methods in Enzymology 68, 1980, s. 151-176. Jot- 5 ta koettimena käytetyllä DNA:lla on riittävää spesifisyyttä taudinmäärittelyssä, koettimena käytetyn DNA:n tulisi koostua ainutlaatuisesta nukleotidisekvenssistä ja sen nukleotidisekvenssin tulisi olla vähintään 12 nukleotidia. DNA-koetin saatetaan edullisesti leimata radioaktiivisella 10 isotoopilla, kuten esimerkiksi 3I-1:11a tai "C:llä, sinänsä tunnetulla tavalla. Koetin-DNA:na käytetty DNA-sekvenssi saattaa käsittää geenin, joka on osa adhesiini-geeniryhmää, mutta joka ei koodita adhesiini-polypeptidiä itseään tai sen diagnos- 15 tisesti tehokasta alasekvenssiä. Tämä geeni saattaa esimerkiksi olla geeni, joka koodittaa pilus-polypeptidiä, jota patogeeninen, pilusta muodostava bakteeri valmistaa ja joka ei ole pilus-adhesiini-polypeptidi tai sen diagnostisesti tehokas alasekvenssi. Tässä yhteydessä mainit- 20 tavana esimerkkinä, esitetyssä järjestelmässä piluspolypeptidiä tai sen alasekvenssiä koodittava DNA-sekvenssi on peräisin Escherichia colin uropatogeeniselta kannalta. Tässä järjestelmässä erityisen edullisiksi diagnoosin kannalta on havaittu geenit papb, papc sekä papd - mikä joh- 25 tuu niiden yllä määritellystä, geneettisestä muuttumattomuudesta - tai minkä tahansa näiden geenien alasekvenssi. Kuten yllä on kuvattu, kyseessä olevan keksinnön mukaisesti antigeenia saatetaan käyttää rokotteen komponenttina. Rokotetta voidaan käyttää nisäkkään, kuten 30 ihmisen, sairauksia vastaan, joita aiheuttavat patogeeniset bakteerit, jotka kiinnittyvät nisäkäs-, esimerkiksi ihmiskudokseen. Annostellaan rokotetta, joka sisältää immunogeenisesti tehokkaan määrän yllä kuvattua antigeenia, joka on valinnaisesti sidottu sopivaan kantaja-aineeseen, 35 ja immunologisesti hyväksyttävän apuaineen. Annostelu saa-

23 tetaan suorittaa sinänsä tunnetulla tavalla, kuten esimerkiksi ruiskuttamalla antigeenia seoksena sopivan injektioapuaineen, kuten esimerkiksi isotonisen keittosuolaliuoksen kanssa. 5 Nämä patogeeniset bakteerit saattavat olla mitä ta- hansa bakteereita, jotka muodostavat adhesiineja tai adhesiinin kaltaisia polypeptidejä, joista bakteereista esimerkkejä ovat Escherichia colin uropatogeeniset tai suolistopatogeeniset kannat tai muut suolistobakteerit tai 10 suunbakteerit, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningiditis, Neisseria catarrhalis, Yersinia-lajit, Pseudomonas aeruginosa tai muut Pseudomonas-lajit, Moraxella bovis tai muut Moraxella-lajit, Bakteroides nodosus, Staphylococcuslajit, Streptococcus-lajit tai Bordetella-lajit, kuten 15 esimerkiksi Bordetella pertussis. Sellaisten bakteereiden mielenkiintoisen luokan muodostavat piluksia muodostavat bakteerit, joista tärkeitä esimerkkejä ovat Escherichia colin uropatogeeniset ja enteropatogeeniset kannat, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningiditis, Neisseria 20 catarrhalis, Moraxella bovis tai muut Moraxella-lajit tai Bordetella pertussis. Lopuksi, on mandollista, että antigeenia saatetaan käyttää erityistä adhesiini-polypeptidiä tai sen aktiivista osaa vastaavan reseptorin läsnäolon määrittämiseen ni- 25 säkäskudossolujen, kuten esimerkiksi epiteelisolujen pinnalla. Tämä on erityisen tärkeää identifioitaessa henkilöitä, jotka kuuluvat suurriskiryhmiin, se on henkilöitä, jotka näyttävät olevan alttiita tietynlaatuiselle infektiolle, kuten esimerkiksi henkilöt, jotka valmistavat suu- 30 ria määriä reseptoria, johon kysymyksessä olevaa infektiota aiheuttavat bakteerit sitoutuvat valmistamansa adhesiinin avulla. Kun sellaiset henkilöt on tunnistettu, voidaan suorittaa ennalta ehkäisevä hoito, se on, pääasiassa imunisointi/rokotus. Menetelmä adhesiinireseptorin ja läsnä 35 olevien adhesiini-reseptorimäärienmäärittämiseksi saattaa

24 koostua kudosnäytteiden tai raaputtamalla soluista saatujen näytteiden inkuboinnista adhesiinin kanssa sekä sitä seuraavasta pesusta. Vasta-ainetta, joka on muodostunut adhesiinia kohtaan ja merkattu esim. fluoreseiinilla tai 5 radioaktiivisella isotoopilla, kuten esimerkiksi J-125- :11ä, saatetaan inkuboida näytteen kanssa tai vaihtoehtoisesti, täten merkattua adhesiinia saatetaan käyttää kokeessa suoraan. Näytteen sisältämä adhesiinin määrä saatetaan sitten määrittää mittaamalla radioaktiivisuuden tai 10 fluoresenssin määrä näytteessä, sinänsä tunnetulla tavalla. Erityisesti on mandollista, että E. colin uropatogeenisen kannan adhesiini-polypeptidejä, joiden aminohapposekvenssit on annettu edellä, saatetaan käyttää identi- 15 fioitaessa naisia, jotka valmistavat virtsatiehyessään suuria määriä globosidireseptoria ja jotka siitä syystä ovat alttiita virtsatiehyeen infektioille. Tämä näkökohta voidaan ilmaista menetelmänä, jolla määritetään reseptoritiheys tai jakaantuminen nisäkäsisän- 20 nässä, kuten esimerkiksi ihmisellä, jolloin kyseisessä menetelmässä isännästä saatua kudosnäytettä käsitellään reseptorin suhteen spesifisen polypeptidin kanssa, poistetaan sitoutumaton, reseptorin suhteen spesifinen polypeptidi ja määritetään reseptoriin spesifisesti sitoutuneen 25 polypeptidin määrä. Sidotun polypeptidin määrän määrittäminen saatetaan suorittaa joko merkkaamalla polypeptidi tai inkuboimalla näytettä merkatun vasta-aineen kanssa, kuten yllä on kuvattu. Kyseessä oleva menetelmä on erityisen edullinen 30 verrattuna aikaisempiin menetelmiin, joissa reseptoritiheys tai -jakaantuminen määritettiin vastaaineen avulla, joka oli suunnattu spesifisiä reseptoreita kohtaan, syyn ollessa se, että reseptorin suhteen spesifinen polypeptidi, josta adhesiini-polypeptidi on esimerkkinä, voi sitou- 35 tua spesifiseen reseptoriin, joko itse reseptoriin, joka

25 tavallisesti merkitsee yhtä tai kahta sokeria sokereiden muodostaman ketjun päässä tai kanden sokerin muodostamaa järjestelmää jossain ketjun keskellä, kun taas vasta-aine tunnistaa vain kaksi sokeria ketjun päässä, mutta ei ket- 5 jun keskellä sijaitsevia sokereita. Sen tähden vasta-aineen sitoutumismandollisuus on rajoitettu verrattuna adhesiini-polypeptidiin ja jokainen reseptoritiheyden kvantitointiyritys tulee olemaan alimitoitettu, kun vasta-ainetta käytetään reseptorin kanssa tapahtuvaan suoraan yhdis- 10 tämiseen. Piirroksia koskeva kuvaus Kyseessä olevaa keksintöä kuvataan edelleen viittaajmalla piirroksiin, joissa Kuvio 1 on kartta, joka esittää Pap DNA:n geneet- 15 tistä järjestystä prhu845:ssä. Ylärivi ilmaisee plasmidi pacyc184:ään sijoitetun EcoRI-fragmentin koon (kiloemäspareina). Yläpuolella on esitetty erilaisten Tn5-insertioiden asemat. Annetaan prhu845:n restriktiokartta sekä identifioitujen pap-geenien asemat. Paksu, vaakasuora sau- 20 va kuvaa signaalipeptidiä koodittavaa aluetta. Sauvojen alapuolella sijaitsevat merkinnät tarkoittavat kypsien polypeptidien molekyylipainoja (x 10 3 daltonyksikköä). Kuvio 2 kuvaa in vitro mutageneesiin käytettyjen pap-hybridi-plasmidien geneettistä järjestystä. Plasmidi 25 ppap5 kantaa koko EcoRI-BamHI-fragmenttia, joka on välttämätön Pap-pilusten ekspressiolle ja digalaktosidin suhteen spesifiselle ihmisen erytrosyyttien agglutinaatiolle. Plasmidi ppap16 kantaa ainoastaan SmaI i-bamhi-fragmenttia, joka on IacUV5-promoottorin transkriptionaalisen kontrol- 30 Ilin alainen. Plasmidi ppap9 on yhtäläinen ppap16:n kanssa, paitsi että se ei kanna lacuv5-promoottoria. Vaakasuoran viivan alapuolella Ap R merkitsee ampisilliiniresistenssiä (100 µg/ml). Kuvio 3 esittää koko pap-aluetta sellaisena kuin se 35 esiintyy ppap5:ssä tai ppap22:ssa (yläpuoli). ppap22 on