RespiFinder RG Panel -käsikirja

Transkriptio

1 Maaliskuu 2015 RespiFinder RG Panel -käsikirja Versio 1 25 Kvalitatiivinen in vitro -diagnostiikka Käyttöön Rotor-Gene Q -laitteiden kanssa PathoFinder B.V., Randwycksingel 45, 6229 EG Maastricht, ALANKOMAAT Myynti: QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, Hilden, SAKSA R FI Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Sample and Assay Technologies QIAGEN on johtava innovatiivisten näyte- ja määritysteknologioiden toimittaja. QIAGENin tuotteet mahdollistavat kaikkien biologisten näytteiden sisällön eristämisen ja detekoinnin. Pitkälle kehitetyt ja laadukkaat tuotteemme ja palvelumme takaavat luotettavan prosessin näytteestä tulokseen. QIAGENin uraauurtavan toiminnan ydinalueita ovat: DNA:n, RNA:n ja proteiinien puhdistaminen nukleiinihappojen ja proteiinien määritykset microrna-tutkimus ja RNAi näyte- ja määritysteknologioiden automatisointi. Tavoitteenamme on toimittaa tuotteita, joiden avulla asiakkaamme saavuttavat menestystä ja läpimurtoja. Lisätietoja on osoitteessa

3 Sisällysluettelo Käyttötarkoitus 4 Tiivistelmä ja selitykset 4 Menetelmän periaate 5 Kohdegeenit 7 Tarvittavat materiaalit 10 Sarjan sisältö 10 Tarvittavat materiaalit, jotka eivät sisälly pakkaukseen 11 Varoitukset ja varotoimenpiteet 12 Yleiset varotoimenpiteet 12 Reagenssin säilytys ja käsittely 13 Näytteiden käsittely ja säilytys 13 Toimenpide 14 Nukleiinihapon eristäminen ja valmisteleminen 14 Negatiivisen kontrollin käyttö 15 Sisäisen kontrollin ja kantaja-rna:n käyttö 15 Protokolla PCR-monistus ja sulamismääritys 17 Tulosten tulkinta 34 Normalisointi 34 Analyysi 34 Kynnysarvo 34 Vianetsintä 35 Laadunvalvonta 39 Rajoitukset 40 Suorituksen ominaispiirteet 40 Viitteet 40 Symbolit 40 Yhteystiedot 41 Tilaustiedot 42 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015 3

4 Käyttötarkoitus RespiFinder RG Panel on kvalitatiivinen multippeli PCR-koe, joka on tarkoitettu detekoimaan ja erottamaan 16 RNA-virusta,* 2 DNA-virusta ja 3 bakteeria, jotka voivat aiheuttaa hengitystieinfektioita ihmisillä: adenovirus, bokavirus, koronavirus NL63, koronavirus OC43, koronavirus 229E, koronavirus HKU1, hmpv, influenssa A -virus, influenssa B -virus, influenssa A H1N1v -virus, parainfluenssavirus 1, parainfluenssavirus 2, parainfluenssavirus 3, parainfluenssavirus 4, rinovirus/enterovirus, RSV-A, RSV-B, Bordetella pertussis, Legionella pneumophila ja Mycoplasma pneumoniae. RespiFinder RG Panel tukee hengitystieinfektion diagnosointia, kun sitä käytetään yhdessä muiden kliinisten ja laboratoriotulosten kanssa. Negatiiviset tulokset eivät välttämättä viittaa virus- tai bakteeriperäisen hengitystieinfektion puuttumiseen; negatiivista tulosta ei pitäisi käyttää ainoana perusteena diagnosoinnissa, hoidossa tai hoitoa koskevissa päätöksissä. Positiivinen tulos ei sulje pois muiden patogeenien aiheuttamaa samanaikaista infektiota. Detekoitu patogeeni ei välttämättä ole sairauden varma aiheuttaja. Lopullisessa diagnoosissa on huomioitava muut laboratoriokokeet ja kliinisten tulosten arviointi. Tuote on tarkoitettu ainoastaan laboratoriotyöntekijöiden käyttöön. Tiivistelmä ja selitykset Akuutti hengitystieinfektio on yleisin akuutin infektion tyyppi aikuisilla ja lapsilla, ja se on merkittävä sairauksien aiheuttaja immuunipuutteisilla potilailla. Hengitystieinfektiot jaetaan yleisesti ylähengitystieinfektioihin ja alahengitystieinfektioihin. Ylähengitystieinfektioita ovat mm. voimakas nuha, sidekalvotulehdus, nielutulehdus, välikorvatulehdus ja sivuontelotulehdus. Alahengitystieinfektioita ovat mm. keuhkokuume, ilmatiehyttulehdus ja keuhkoputkitulehdus. Sekä virukset että bakteerit voivat aiheuttaa akuutin hengitystieinfektion, ja taudin aiheuttajien suuri määrä ja moninaisuus tekevät diagnosoinnista hyvin haasteellista. Nukleiinihappomonistuksen on osoitettu olevan nopea ja herkkä menetelmä, ja siitä on saatavana joko singleplex- tai multiplex-vaihtoehto. Multiplexanalyysissä voidaan monistaa samanaikaisesti useampi kuin yksi kohde. Näin saadaan tietoa sekainfektioiden merkittävyydestä sekä hengitystiesairauden ennusteesta ja uudelleen pahenemisesta. * RespiFinder RG Panel detekoi 16 RNA-virusta, muttei erota rinovirusta enteroviruksesta. 4 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

5 Menetelmän periaate RespiFinder RG Panel perustuu SmartFinder-teknologiaan, joka mahdollistaa enintään 13 kohteen erittäin kompleksisen määrityksen yhdessä reaaliaikaisessa PCR-reaktiossa. RespiFinder RG Panel sisältää erilaisia MultiFinder-koetinsarjoja yhdistettyinä 12 fluoresenssimerkittyyn SMART-koettimeen (yksiputkinen multiplex-monistus reaaliajassa), jotka mahdollistavat 21 eri patogeenin detekoinnin ja yhden sisäisen kontrollin. Reaktio alkaa esimonistuksella, jossa käänteinen transkriptiovaihe ja PCR-vaihe yhdistyvät kohde-(c)dna:n monistamista varten. Sen jälkeen osa esimonistusreaktiosta siirretään 2 PCRputkeen. Seuraavaksi suoritetaan kaksi erillistä SmartFinder-reaktiota, jotka koostuvat koettimen hybridisaatiovaiheesta sekä koettimen ligaatio- ja monistusvaiheesta. Detekointi suoritetaan sulamiskäyrämäärityksen avulla. Koko työnkulku esitetään kuvan 1 taulukossa. RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015 5

6 Kuva 1. Yleiskuva työnkulusta RespiFinder RG Panel -tuotetta käytettäessä. RespiFinder RG Panel -tuotetta käytetään patogeenisten nukleiinihappojen detekointiin Rotor-Gene Q MDx- tai Rotor-Gene Q -laitteen kanssa. Määritys sisältää sisäisen kontrollin (IC), jonka avulla erotellaan oikeat negatiiviset näytteet sekä nukleiinihappojen hajoamisesta, PCR:n inhiboitumisesta tai kokeen häiriöstä aiheutuvat väärät negatiiviset näytteet. Näytteenä käytetään nenänielunäytettä, josta nukleiinihapot on kokonaan poistettu ja puhdistettu. Näytteiden valmistelu on paneelista erillinen prosessi. Käytä näytteiden käsittelyyn sekä nukleiinihappojen eristämiseen ja 6 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

7 puhdistamiseen sopivia menetelmiä tai tuotteita (katso Näytteiden käsittely ja säilytys, sivu 13, ja Nukleiinihapon eristäminen ja valmisteleminen, sivu 14). Kohdegeenit Koetin- ja primeerimallille käytetyt kohdegeenit esitetään taulukossa 1. Taulukko 1. RespiFinder RG Panel -tuotteen kohdegeenit Kohde Kontrolli Geeni Patogeenin koodi Sisäinen kontrolli (IC) MS2-fagin lyysin proteiinin geeni IC Virukset Adenovirus Hexon-geeni (H) Adeno Bokavirus Nonkapsidigeeni (NP1) Boka Korona 229E Nukleokapsidiproteiinin geeni (NP) 229E Korona HKU1 Nukleokapsidi-fosfoproteiinin geeni (N) HKU1 Korona NL63 Nukleokapsidiproteiinin geeni (NP) NL63 Korona OC43 Nukleokapsidiproteiinin geeni (NP) OC43 hmpv Nukleokapsidiproteiinin geeni (NP) hmpv Influenssa A Matriksiproteiinin geeni (M1) InfA Influenssa B Matriksiproteiinin geeni (M1) InfB Influenssa A H1N1v Neuraminidaasin geeni H1N1 Parainfluenssa 1 Parainfluenssa 2 Parainfluenssa 3 Hemagglutiniini-neuraminidaasin geeni (HN) Hemagglutiniini-neuraminidaasin geeni (HN) Hemagglutiniini-neuraminidaasin geeni (HN) PIV1 PIV2 PIV3 Parainfluenssa 4 Päänukleokapsidiproteiinin geeni (N) PIV4 Taulukko jatkuu seuraavalla sivulla RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015 7

8 Taulukko 1. Jatkoa Kohde Virukset (jatkoa) Rinovirus / enterovirus Geeni 5' transloitumattoman alueen polyproteiinigeeni (PP) Patogeeninkoodi Rino/entero RSV-A Päänukleokapsidiproteiinin geeni (N) RSVA RSV-B Päänukleokapsidiproteiinin geeni (N) RSVB Bakteerit Bordetella pertussis Insertiosekvenssi 481 (IS481) B. pert Chlamydophila pneumoniae* Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae Pääulkokalvon geeni (OmpA) Makrofagin estoaineen herkistäjän geeni (Mip) Cytadhesin-proteiinin geeni (P1) C. pneu L. pneu M. pneu * Huomautus: Chlamydophila pneumoniaen detekointi RespiFinder RG Panel -tuotteella on tarkoitettu ainoastaan tutkimuskäyttöön. Sitä ei saa käyttää diagnostiikkaan. Minkään väittämän tai esityksen tarkoituksena ei ole antaa tietoa sairauden diagnosoinnista, ehkäisystä tai hoidosta. Jokaiselle näytteelle suoritetaan yksi esimonistus ja kaksi SmartFinder-reaktiota. Kahden SmartFinder-reaktion SMART-hybridisaatiokoettimien patogeenit, merkit ja indikoidut Tm-arvot esitetään taulukossa 2. 8 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

9 Taulukko 2. SMART-koettimien kohteet ja vastaavat Tm-arvot Merkki SMART-koetin Tm ( C) hyväksyttävä alue Patogeenikoodi (seos 1) Cy5-koetin 1 50,5 53,5 L. pneu OC43 Patogeenikoodi (seos 2) Cy5-koetin 2 54,5-57,5 B. pert NL63 Cy 5 Cy5-koetin 3 60,0-63,0 Rino/entero 229E Cy5-koetin 4 66,0-69,0 C. pneu* HKU1 Cy5-koetin 5 70,5-73,5 M. pneu Cy5-koetin 6 76,5-79,5 H1N1 ROX-koetin 1 52,5-55,5 RSVA PIV1 ROX-koetin 2 57,5-60,5 Adeno PIV2 ROX ROX-koetin 3 62,5-65,5 hmpv PIV3 ROX-koetin 4 66,5-69,5 RSVB PIV4 ROX-koetin 5 72,5-75,5 InfA Boka ROX-koetin 6 76,5-79,5 InfB BHQ 1 BHQ1-koetin 1 70,5-73,5 IC IC * Huomautus: Chlamydophila pneumoniaen detekointi RespiFinder RG Panel -tuotteella on tarkoitettu ainoastaan tutkimuskäyttöön. Sitä ei saa käyttää diagnostiikkaan. Minkään väittämän tai esityksen tarkoituksena ei ole antaa tietoa sairauden diagnosoinnista, ehkäisystä tai hoidosta. RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015 9

10 Tarvittavat materiaalit Sarjan sisältö RespiFinder RG Panel (25) Tuotenumero Reaktioiden määrä 25 Sisällysluettelo Korkin väri Määrä Pre-amplification Master Mix (Esimonistuksen Master-seos) Violetti 180 µl Internal Control (IC) (Sisäinen kontrolli (IC)) Pre-amplification Primermix (Esimonistuksen primeeriseos) Hybridization Buffer (Hybridisaatiopuskuri) Musta 300 µl Valkoinen 65 µl Keltainen 80 µl Probemix 1 (Koetinseos 1) Punainen 40 µl Probemix 2 (Koetinseos 1) Sininen 40 µl TwoStep Buffer (TwoStep-puskuri) Vihreä (kullanruske assa putkessa) 1600 µl Ligase Enzyme (Ligaasientsyymi) Ruskea 50 µl Taq Polymerase (Taq-polymeraasi) Oranssi 20 µl Dilution Buffer (Laimennuspuskuri) Läpikuultav a 1700 µl RespiFinder RG Panel Handbook (RespiFinder RG Panel - käsikirja) (englanti) 1 10 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

11 Tarvittavat materiaalit, jotka eivät sisälly pakkaukseen Kun käsittelet kemikaaleja, käytä aina asianmukaista suojavaatetusta, kertakäyttökäsineitä ja suojalaseja. Lisätietoja on asianmukaisissa käyttöturvallisuustiedotteissa, jotka ovat saatavana tuotteen toimittajalta. Reagenssit RNA/DNA extraction kit (RNA/DNA-eristyssarja) (katso Nukleiinihapon eristäminen ja valmisteleminen, sivu 14) RNase/DNase-puhdistettua vettä Tarvikkeet Hydrofobisilla suodattimilla varustetut kertakäyttökärjet Hydrofobisilla suodattimilla varustetut Low retention (vähäinen retentio) - kertakäyttökärjet 1,5 ml putket, jotka eivät sisällä RNasea/DNasea 0,2 ml PCR-putket, jotka eivät sisällä RNasea/DNasea (korkilliset yksittäisputket tai erillisillä korkeilla varustetut liuskaputket) Strip Tubes and Caps (liuskaputket ja korkit), 0,1 ml (tuotenumero tai ) käyttöön Rotor-Gene Q -laitteissa Laite Säädettävät pipetit:* 0,1 2 µl, 2 20 µl, µl Monikanavainen säädettävä pipetti:* 1 10 µl (valinnainen) Vortex-sekoittaja* Pöytämallinen sentrifugi* roottorilla 2 ml:n putkille Sentrifugi* 0,2 ml:n reaktioputkille Jäähdytin tai jäätä Termosykleri* 0,2 ml PCR-putkille, lämmitetty kansi ja ramppinopeus 1 5 C/sekunti (esi-monistukseen ja hybridisaatioon; esim. GeneAmp PCR System 9700 lohkopohjainen termosykleri) Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM*- tai Rotor-Gene Q 5plex HRM* -laite ja lisävarusteet * Varmista, että laitteet on tarkastettu ja kalibroitu valmistajan suositusten mukaan. RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

12 Varoitukset ja varotoimenpiteet In vitro -diagnostiikkaan Kun käsittelet kemikaaleja, käytä aina asianmukaista suojavaatetusta, kertakäyttökäsineitä ja suojalaseja. Lisätietoja on vastaavissa käyttöturvallisuustiedotteissa. Ne ovat saatavana PDF-tiedostoina Internetosoitteessa Voit hakea, lukea ja tulostaa kaikkien QIAGEN -tarvikesarjojen ja niiden osien käyttöturvallisuustiedotteet. Käytettyä puhdistussarjaa koskevia turvallisuustietoja on vastaavan sarjan käsikirjassa. Laitteita koskevia turvallisuustietoja on vastaavan laitteen käyttöohjeessa. Hävitä näyte- ja analyysijäte paikallisten turvallisuusmääräysten mukaisesti. Yleiset varotoimenpiteet Noudata aina seuraavia ohjeita: Tämän molekyylianalyysin saa suorittaa vain pätevä laboratoriohenkilökunta. Säilytä ja eristä positiiviset materiaalit (näytteet ja positiiviset kontrollit) erikseen kaikista muista reagensseista, ja lisää ne reaktioseokseen erillisessä tilassa. Käytä testin aikana kertakäyttökäsineitä. Estä ristikontaminaatio käyttämällä hydrofobisilla suodattimilla varustettuja kertakäyttökärkiä. Käytä hydrofobisilla suodattimilla varustettuja Low retention (matala retentio) -kärkiä käsitellessäsi RT-PCR-entsyymiseosta, ligaasientsyymiä ja Taq-polymeraasia. Käytä PCR-injektiopulloja, jotka eivät sisällä RNasea/DNasea. Sulata RNA/DNA-näytteet aina jäässä ja säilytä niitä jäässä tai jäähdyttimessä. Pidä entsyymejä aina jäässä tai jäähdyttimessä otettuasi ne pakastimesta. Käsittele entsyymejä huolellisesti ja sekoita hyvin varovasti. Sentrifugoi sulatettuja reagensseja 5 sekuntia sentrifugissa ja sekoita pipetoimalla varovasti ylös- ja alaspäin. Kaikki sykliohjelmat on syötettävä Rotor-Gene Q -ohjelmistoon ennen analyysin aloittamista. 12 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

13 Sentrifugoi PCR-injektiopulloja ja levyjä aina lyhyesti ja avaa varovasti aerosolien välttämiseksi. Huomautus: Kontaminaation välttämiseksi suosittelemme ehdottomasti suorittamaan koetoimenpiteet PCR-kaapeissa seuraavalla kolmella erillisellä alueella: Alue 1: Valmistele master-seokset esimonistukseen, hybridisaatioon ja ligaatio- /sulatuskokeeseen. Alue 2: Lisää RNA/DNA-näyte seokseen. Alue 3: Suorita esimonistus, hybridisaatio ja sulatuskäyrämääritys 3 vaiheessa: Suorita esimonistus. Lisää esimonistustuotteet hybridisaatioseokseen (mieluiten PCRkaapissa) ja suorita hybridisaatio. Lisää hybridisaatiotuotteet TwoStep-seokseen (mieluiten PCR-kaapissa) ja suorita ligaatio, monistus ja sulamiskäyrämääritys. Reagenssin säilytys ja käsittely RespiFinder RG Panel -tuotteen osia on säilytettävä valolta suojattuina C:n lämpötilassa. Ne ovat stabiileja etikettiin merkittyyn viimeiseen käyttöpäivämäärään saakka. Toistuvaa sulatusta ja pakastusta (> 5 kertaa) on vältettävä, sillä se saattaa heikentää analyysin suoritusta. Näytteiden käsittely ja säilytys Olennaista hengitysteiden patogeenin detekoinnissa on korkealaatuisten näytteiden ottaminen, niiden nopea kuljetus laboratorioon ja asianmukainen säilytys ennen laboratoriokoetta. Nenänielunäytteet sopivat hengitysteiden virusja/tai bakteeri-infektioiden detekointiin. Kliiniset näytteet on kuljetettava laboratorioon mahdollisimman nopeasti sekä alikvoitava ja käsiteltävä. Näytteitä on säilytettävä 4 C:n lämpötilassa. Jos näytteitä ei voida käsitellä 48 tunnin kuluessa, niitä on säilytettävä pakastettuina alle -20 C:n ja mieluiten -70 C:n lämpötilassa. RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

14 Toimenpide Nukleiinihapon eristäminen ja valmisteleminen QIAGENin QIAamp MinElute Virus Spin -sarja (katso taulukko 3) on validoitu DNA:n ja RNA:n puhdistamiseen indikoidusta ihmisen näytetyypistä RespiFind RG Panel -tuotteessa käyttöä varten. Suorita nukleiinihapon puhdistus sarjan käsikirjassa annettujen ohjeiden mukaisesti. Taulukko 3. RespiFinder RG Panel -tuotteen kanssa käyttöön validoitu puhdistussarja Näytetyyppi Nenänielunäytteet Nukleiinihapon eristyssarja QIAamp MinElute Virus Spin Kit (50) Tuotenumero (QIAGEN) Ota 200 µl näytemateriaalia ja eluoi 60 µl eluaattipuskuriin. Älä yritä konsentroida nukleiinihappoja, sillä se saattaa lisätä RT-PCR-entsyymien inhiboitumisriskiä. Lysoituneeseen näytteeseen lisätään sisäinen kontrolli (katso Sisäisen kontrollin ja kantaja-rna:n käyttö, sivu 15). QIAamp MinElute Virus Spin -sarjaa käytettäessä suosittelemme lisäämään lyysipuskurin näytteeseen laminaarivirtauskaapissa. Eristämistoimenpidettä voidaan jatkaa pöytätasolla näytteen lysoitumisen jälkeen. Suosittelemme laminaarivirtauskaapin dekontaminointia käytön jälkeen dekontaminointiliuoksella (esim ppm valkaisu)* ja UV-valon käyttöä 30 minuuttia. Vältä eristetyn DNA/RNA:n pakastus-/sulatusjaksoja niin paljon kuin mahdollista ja säilytä nukleiinihappoeristeitä 4 C:n lämpötilassa, kun ne käsitellään yhden päivän kuluessa. Jos eristetty RNA/DNA käsitellään vasta myöhemmin, säilytä sitä -20 C:n tai -70 C:n lämpötilassa. * Kun käsittelet kemikaaleja, käytä aina asianmukaista suojavaatetusta, kertakäyttökäsineitä ja suojalaseja. Lisätietoja on asianmukaisissa käyttöturvallisuustiedotteissa, jotka ovat saatavana tuotteen toimittajalta. 14 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

15 Negatiivisen kontrollin käyttö Jokaiseen ajoon pitää sisältyä negatiivinen kontrolli. Negatiivinen kontrolli sisältää 200 µl PCR-tyyppistä vettä ja sisäisen kontrollin (IC). Tätä negatiivista kontrollia käsitellään tavallisena näytteenä, mukaan lukien nukleiinihapon eristämistoimenpide. Lopullisessa analyysissä negatiivisen kontrollin signaali toimii viitteenä taustasignaalille FAM/ROX- ja FAM/Cy5- kanavissa sekä positiiviselle IC-signaalille Green-kanavassa (IC). Sisäisen kontrollin ja kantaja-rna:n käyttö QIAamp MinElute Virus Spin -sarjan käyttäminen yhdessä RespiFinder RG Panel -tuotteen kanssa edellyttää sisäisen kontrollin (IC) lisäämistä puhdistusprosessiin näytteen valmistelun ja senjälkeisen analyysin tehon valvontaa varten. Lisäksi QIAamp MinElute Virus Spin Kit -sarjan käyttö vaatii kantaja-rna:n valmistelun. Sisäinen kontrolli on MS2-fagi, ja sen tehtävänä on toimia lyysin, RNA/DNA:n eristämisen ja RespiFinder RG Panel -tuotteen analyysin suorituksen kontrollina sekä tarkistaa mahdollinen PCR:n inhiboituminen. Sisäinen kontrolli lisätään kantaja-rna:n kanssa lyysipuskuriin ennen lisäämistä näytteeseen. Lisätyn sisäisen kontrollin määrä ei riipu näytteen alkuperäisestä määrästä. Lisätyn sisäisen kontrollin määrä riippuu eluaatin määrästä. Käytettäessä QIAamp MinElute Virus Spin -sarjaa eristetty RNA/DNA eluoidaan 60 µl:aan. AL-puskuriin lisättävän sisäisen kontrollin määrä on 5,5 µl/näyte (katso taulukko 4). Vakavassa infektiossa ja/tai moni-infektiossa sisäisen kontrollin sulamishuippu ei välttämättä näy lopullisessa analyysissa. Tämä johtuu siitä, että suuri määrä patogeenisiä nukleiinihappoja kuluttaa suurimman osan analyysin reagensseista. Sen vuoksi analyysi on kuitenkin kelvollinen, vaikka sisäisen kontrollin signaali puuttuisi yhden tai useamman infektioon viittaavan sulamishuipun esiintyessä. RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

16 Taulukko 4. Tarvittava AL-puskurin, kantaja-rna:n ja AVE-puskurin seoksen sekä sisäisen kontrollin määrä Näytteiden määrä AL-puskurin määrä (ml) Kantaja-RNA AVE:n määrä (µl) Sisäisen kontrollin määrä (µl) 1 0,22 6,2 5,5 2 0,44 12, ,66 18,5 16,5 4 0,88 24, ,1 30,8 27,5 6 1,32 36, ,54 43,1 38,5 8 1,76 49, ,98 55,4 49,5 10 2,2 61, ,42 67,7 60,5 12 2,64 73, RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

17 Protokolla: PCR-monistus ja sulamismääritys Ennen käyttöä tehtävät toimenpiteet Sulata (mahdollisesti pakastettu) malli-rna/dna ja kaikki reagenssit. Pidä putkia jäässä. Valmistele hieman tarvittavaa suurempi määrä eri seoksia pipetoinnin aikana tapahtuvan hävikin kompensoimiseksi. Toimenpide Esimonistus 1. Käännä esimonistuksen master-seosta useita kertoja varmistaaksesi, että master-seos on sulanut ja homogenisoitunut kokonaan. Sentrifugoi putki lyhyesti. Valmistele esimonistuksen reaktioseos taulukon 5 tietojen mukaisesti ja säilytä sitä jäässä. Reaktioseos sisältää yleensä kaikki PCR-reaktioon vaadittavat komponentit näytettä lukuun ottamatta. Huomautus: Hybridisaatioseokset (vaihe 6) ja TwoStep-seos (vaihe 12) voidaan valmistella samanaikaisesti esimonistuksen kanssa, ja niitä on säilytettävä valolta suojattuna 4 C:n lämpötilassa käyttöön saakka. Kaikki 3 seosta voidaan valmistella samanaikaisesti vain siinä tapauksessa, että koko protokollaa noudatetaan ilman viiveitä; eri vaiheiden välillä ei saa pitää taukoja. Seosten stabiliteettia ei taata pidemmän säilytysajan jälkeen (esim. yön yli). Taulukko 5. Esimonistuksen reaktioseoksen valmistelu Näytteiden määrä (reagenssiputken korkin väri) 1 12 Laimennuspuskuri (läpikuultava) 6,25 µl 75 µl Esimonistuksen master-seos (violetti) 6,25 µl 75 µl Esimonistuksen primeeriseos (valkoinen) 2,5 µl 30 µl Kokonaismäärä 15 µl 180 µl RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

18 2. Sekoita esimonistuksen reaktioseos varovasti mutta perusteellisesti, ja pipetoi 15 µl seosta jokaiseen 0,2 ml:n PCR-putkeen. Lisää sitten 10 µl eluoitua näyte-dna/rna:ta tai negatiivista kontrollia (katso taulukko 6). 3. Sulje PCR-putket. Sekoita hyvin. Sentrifugoi putkia lyhyesti ja aseta putket takaisin jäähän tai jäähdyttimeen. Taulukko 6. Esimonistuksen reaktioiden valmistelu Näytteiden määrä 1 12 Esimonistuksen reaktioseos 15 µl Kukin 15 µl Näyte tai negatiivinen kontrolli 10 µl Kukin 10 µl Kokonaismäärä 25 µl Kukin 25 µl 4. Ohjelmoi lohkopohjainen termosykleri taulukon 7 mukaan. Taulukko 7. Esimonistuksen termosykleriohjelma Käänteinen transkriptio: 20 minuuttia 50 C Ensimmäinen aktivointivaihe: 2 minuuttia 95 C 3-vaiheinen sykli: Denaturointi 25 sekuntia 94 C Lämpökäsittely 25 sekuntia 55 C Pidennys 40 sekuntia 72 C Jaksojen määrä 40 Pito: 20 C 5. Käynnistä esimonistusohjelma PCR-putkien ollessa edelleen jäässä. Odota, kunnes termosykleri saavuttaa 50 C:n lämpötilan. Aseta sitten putket termosyklerin lohkoihin ja sulje lämmitetty kansi. 18 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

19 Hybridisaatio 6. Valmistele hybridisaatioseos 1 taulukon 8 mukaan ja hybridisaatioseos 2 taulukon 9 mukaan ja sekoita varovasti mutta perusteellisesti. Jos hybridisaatioseokset valmisteltiin jo vaiheessa 1, odota, kunnes esimonistusohjelma on valmis, ja jatka sitten vaiheesta 7. Taulukko 8. Hybridisaatioseoksen 1 valmistelu Näytteiden määrä (reagenssiputken korkin väri) 1 12 Hybridisaatiopuskuri (keltainen) 1,5 µl 18 µl Koetinseos 1 (punainen) 1,5 µl 18 µl Laimennuspuskuri (läpikuultava) 3,0 µl 36 µl Hybridisaatioseoksen 1 kokonaismäärä 6,0 µl 72 µl Taulukko 9. Hybridisaatioseoksen 2 valmistelu Näytteiden määrä (reagenssiputken korkin väri) 1 12 Hybridisaatiopuskuri (keltainen) 1,5 µl 18 µl Koetinseos 2 (sininen) 1,5 µl 18 µl Laimennuspuskuri (läpikuultava) 3,0 µl 36 µl Hybridisaatioseoksen 2 kokonaismäärä 6,0 µl 72 µl 7. Pipetoi jokaista näytettä varten 6 µl hybridisaatioseosta 1 uuteen PCRputkeen ja pipetoi 6 µl hybridisaatioseosta 2 uuteen PCR-putkeen. 8. Ota PCR-putket termosykleristä esimonistusvaiheen päätyttyä (vaihe 5) ja sentrifugoi lyhyesti. Pipetoi 2 µl jokaista -esimonistusreaktiota kumpaankin putkeen, joista toinen sisältää hybridisaatioseosta 1 ja toinen hybridisaatioseosta 2 (katso taulukko 10). RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

20 Taulukko 10. Hybridisaatioreaktioiden valmistelu Näytteiden määrä 1 12 Hybridisaatioseos 1 (vaihe 7) 6,0 µl Kukin 6,0 µl Esimonistusreaktio (vaihe 8) 2,0 µl Kukin 2,0 µl Kokonaismäärä 8,0 µl Kukin 8,0 µl Hybridisaatioseos 2 (vaihe 7) 6,0 µl Kukin 6,0 µl Esimonistusreaktio (vaihe 8) 2,0 µl Kukin 2,0 µl Kokonaismäärä 8,0 µl Kukin 8,0 µl 9. Sulje PCR-putket ja sentrifugoi lyhyesti. 10. Ohjelmoi lohkopohjainen termosykleri taulukon 11 mukaan. Taulukko 11. Hybridisaation termosykleriohjelma Denaturointi: 10 minuuttia 98 C Koettimien hybridisaatio: 30 minuuttia 60 C Pito: 60 C 11. Aseta esimonistusreaktio- ja hybridisaatioseosta sisältävät putket termosyklerin lohkoon ja sulje lämmitetty kansi. Käynnistä hybridisaatioohjelma. Ligaatio ja PCR 12. Valmistele TwoStep-seos taulukon 12 mukaan. Sekoita varovasti mutta perusteellisesti, ja säilytä jäässä käyttöön saakka. Huomautus: Koska näytteet jaettiin 2 osaan (hybridisaatioseos 1 ja hybridisaatioseos 2), TwoStep-seos on valmisteltava kaksinkertaisena. Kumpaankin hybridisaatioseokseen tarvitaan 32,0 µl TwoStep-seosta. Jos TwoStep-seos valmisteltiin jo vaiheessa 1, jatka vaiheesta RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

21 Taulukko 12. TwoStep-seoksen valmistelu Näytteiden määrä (reagenssiputken korkin väri) 1* 2 x 1 2 x 12 TwoStep-puskuri (vihreä) 30,6 µl 61,2 µl 734,4 µl Ligaasientsyymi (ruskea) 1,0 µl 2,0 µl 24,0 µl Taq-polymeraasi (oranssi) 0,4 µl 0,8 µl 9,6 µl Kokonaismäärä 32,0 µl 64,0 µl 768,0 µl * Huomautus: Yhden TwoStep-seoksen valmistelu ei ole koskaan tarpeen, sillä jokaiselle näytteelle on valmisteltava 2 x 1 TwoStep-seosmäärä. 13. Laadi jokaiselle Rotor-Gene Q -laitteelle lämpötilaprofiili seuraavien ohjeiden mukaan. Taulukossa 13 sivulla 22 on yleiskuva termosykleriohjelmasta. Yleisten analyysiparametrien asetus Kuvat 2, 3 Uusien kanavien luominen Kuvat 4 7 Vahvistuksen muokkaus Kuvat 8, 9 Lämpötilaprofiilin ohjelmointi Kuva Sulamisohjelman ohjelmointi Kuvat 17, 18 Yhteenveto ja mallin tallennus Kuvat 19, 20 Ajon käynnistys Kuva 21 Kaikki tiedot viittaavat Rotor-Gene Q -ohjelmiston versioon Lisätietoja Rotor-Gene-laitteiden ohjelmoinnista on laitteen käyttöohjeessa. Kuvissa näissä asetuksissa on paksunnetut mustat kehykset. Rotor-Gene Q -laitteita koskevat kuvat on lisätty. RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

22 Taulukko 13. TwoStep-jakson lämpösykleriohjelman yleiskuva Koettimien ligaatio: 15 minuuttia 54 C Huomautuksia Ensimmäinen denaturointivaihe: 2 minuuttia 95 C PCR 1: 3-vaiheinen sykli: Denaturointi 15 sekuntia 94 C Erittäin tarkka PCR Lämpökäsittely 15 sekuntia 60 C Pidennys 15 sekuntia 72 C Jaksojen määrä 10 PCR 2: 3-vaiheinen sykli: Denaturointi 15 sekuntia 94 C Lämpökäsittely 15 sekuntia 50 C Hankinta* Denaturointi 15 sekuntia 72 C Jaksojen määrä 23 Denaturointi: 2 minuuttia 95 C Sulamisohjelma: C Hankinta * Hankintakanavat: Green, vahvistus 4; Red, vahvistus 1; FAM /ROX, vahvistus 8; ja FAM/Cy5, vahvistus 10. Hankintakanavat: Green, Red, FAM/ROX ja FAM/Cy5. Käytä Optimize gain before melt on all tubes (Vahvistuksen optimointi ennen sulamista kaikissa putkissa). Vahvistus, jolla saadaan suurin fluoresenssi alle 95, valitaan. 22 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

23 14. Avaa ensin New Run Wizard (Uuden ajon asetusohjelma) (kuva 2). Merkitse Locking Ring Attached (Lukitusrengas kiinnitetty) -ruutu ja napsauta Next (Seuraava). 1 2 Kuva 2. New Run Wizard -ikkuna. 15. Valitse reaktiomääräksi 40 ja napsauta Next (kuva 3). 1 2 Kuva 3. Yleisten analyysiparametrien asetus. RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

24 16. Napsauta Create New (Luo uusi) -painiketta seuraavassa New Run Wizard -ikkunassa ja ohjelmoi 2 lisäkanavaa kuvissa 5 7 esitetyllä tavalla. 1 Kuva 4. Uusien kanavien luominen. 1 2 Kuva 5. Uuden FAM/ROX -kanavan luominen. 24 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

25 1 2 Kuva 6. Uuden FAM/Cy5 -kanavan luominen. 1 2 Kuva 7. Uudet kanavat mukana. 17. Muokkaa jokaisen kanavan vahvistusta kuvassa 8 esitetyllä tavalla. Jokaisen kanavan lopulliset vahvistusasetukset käyvät ilmi kuvasta 9. Rotor-Gene Q -laitteiden vahvistusasetukset valitaan niin, että saturaatio vältetään detekointikanavissa. Jos jossakin detekointikanavassa kuitenkin havaitaan saturaatiota, on muutettava kyseisen saturoidun kanavan vahvistusasetuksia ja suoritettava uusi sulamiskäyrämääritys. RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

26 1 2 Kuva 8. Vahvistuksen muokkaus. Esimerkkinä kuvassa näkyy vahvistuksen asetus arvoon 4 Cycling Green -kanavassa. 1 Kuva 9. Kaikkien kanavien lopulliset vahvistusasetukset. Tarvittavat kanavat: Green, vahvistus 4; Red, vahvistus 1; FAM/ROX, vahvistus 8; and FAM/Cy5, vahvistus RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

27 18. Napsauta Edit Profile (Muokkaa profiilia) -painiketta seuraavassa New Run Wizard -ikkunassa (kuva 10) ja ohjelmoi lämpötilaprofiili kuvissa esitetyllä tavalla. 1 Kuva 10. Profiilin muokkaus. 1 2 Kuva 11. Koettimien ligaatio. 3 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

28 1 2 3 Kuva 12. Ensimmäinen denaturointivaihe a Kuva 13. Ligoitujen koettimien monistus RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

29 1 2 4a Kuva 14. Ligoitujen koettimien monistus ml. signaalin hankinta 50 C:ssa. Hankintaan tarvittavat kanavat näkyvät kuvassa Kuva 15. Kaikkien hankintaan tarvittavien kanavien valinta. RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

30 1 2 Kuva 16. PCR-tuotteiden ja koettimien denaturointi Kuva 17. Sulamisohjelma RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

31 1 2 Kuva 18. Hankinta sulamisohjelman aikana. 1 Kuva 19. Lämpötilaprofiilin yhteenveto. RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

32 19. Tallenna malli myöhempää tarvetta varten (kuva 20). 1 Kuva 20. Mallin tallennus myöhempää tarvetta varten. 20. Anna TwoStep-seoksen (vaiheesta 12) tasapainottua huoneenlämpötilaan (15 25 C), ja pipetoi 32,0 µl TwoStep-seosta jokaiseen Rotor-Gene Q - laitteen liuskaputkeen. Huomautus: Pipetoi jokaista näytettä varten 32,0 µl TwoStep-seosta kumpaankin uuteen putkeen. 21. Pipetoi kukin hybridisaatioreaktio (8 µl) TwoStep-seoksen sisältäviin liuskaputkiin. Lopullinen määrä on 40 µl näytettä kohti. Huomautus: Säilytä hybridisaatioreaktioita 60 C:n lämpötilassa, kunnes ne lisätään TwoStep-seokseen. 22. Sulje liuskaputket asianmukaisilla korkeilla, ja aseta ne viipymättä Rotor- Gene Q -laitteen roottoriin. 23. Aseta roottori Rotor-Gene Q -laitteeseen. Varmista, että lukitusrengas (Rotor-Gene Q -laitteen lisävaruste) on paikallaan roottorin päällä, jotta putket eivät vahingossa avaudu ajon aikana. 32 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

33 24. Käynnistä ajo (kuva 21) tallennetun mallin avulla (vaihe 19). 1 Kuva 21. Ajon käynnistys. RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

34 Tulosten tulkinta Normalisointi Rotor-Gene Q -laitteissa FAM/Cy5-kanavan raakadata on ensin normalisoitava eri kanavien välisen ylikuulumisen kompensoimiseksi. Cy5-signaalien normalisointia varten avaa raakadatakanava Melt FAM/Cy5 (suodatinasetukset nm). Napsauta Option (Lisäasetus) -painiketta ja valitse Normalise to Melt FAM/ROX (Normalisoi Melt FAM/ROX -kanavaan). Uusi raakadatatiedosto Melt FAM/Cy5/Melt FAM/ROX on normalisoitava lisäksi Red-kanavaan (suodatinasetukset 625/660 nm). Avaa tätä varten uusi raakadatatiedosto Melt FAM/Cy5/Melt FAM/ROX, napsauta Option - painiketta ja valitse Normalise to Melt Red (Normalisoi Melt Red -kanavaan). Tällä normalisoinnill korjataan Cy5:n lämpötilakohtainen fluoresenssi, jolloin sulamishuippu on symmetrisempi. Analyysi Analysoi raakadatatiedosto avaamalla Analysis (Määritys) -ikkuna ja valitsemalla FAM/Cy5-kanavalle vastaavasti normalisoitu raakadatatiedosto välilehdellä Melt (Sula). Signaaleja Green-kanavassa (IC) (suodatinasetukset nm) ja FAM/ROX-kanavassa (suodatinasetukset nm) ei tarvitse normalisoida; FAM/ROX- ja Green-kanavien raakadatatiedostot valitaan myös. SMART-koettimien eri sulamislämpötilat käyvät ilmi taulukosta 14, sivu 35. Kynnysarvo Seuraavat kynnysarvot on asetettava sulamiskäyräanalyysin kaavioissa näytetulosten määritystä varten. Tämä tehdään käyttämällä vahvistusoptimointia Rotor-Gene Q -ohjelmiston TwoStep-reaktion sulamisohjelmassa taulukossa 13 (sivu 22) ja kuvassa 17 (sivu 30) esitetyllä tavalla. FAM/ROX-kanava: Kynnysarvo = 1 FAM/Cy5-kanava (normalisoitu): Kynnysarvo = 0 Green-kanava (IC): Käännä df/dt-merkki, ja valitse kaikki näytteet, joissa ei havaittu positiivista sulamishuippua FAM/ROX- ja FAM/Cy5-kanavissa molemmilla seoksilla. Aseta kynnysarvo manuaalisesti korkeimmalle fluoresenssitasolle 50 C:ssa, joka saatiin näillä negatiivisilla näytteillä. Näytteitä, joissa havaittiin sulamishuiput molemmilla seoksilla sisäisen kontrollin Tm-hyväksymisalueella (70,5 73,5 C), voidaan nyt kutsua 34 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

35 oikeiksi negatiivisiksi näytteiksi. Jos näytteessä havaittiin ainoastaan yksi positiivinen sisäinen kontrolli tai ei lainkaan positiivista sisäistä kontrollia, se on kelvoton. Kelvottomat näytteet on testattava uudelleen. Taulukko 14. SMART-koettimien kohteet ja vastaavat Tm-arvot Merkki SMART-koetin Tm ( C) hyväksyttävä alue Patogeenikoodi (seos 1) Cy5-koetin 1 50,5 53,5 L. pneu OC43 Patogeenikoodi (seos 2) Cy5-koetin 2 54,5-57,5 B. pert NL63 Cy5 Cy5-koetin 3 60,0-63,0 Rino/entero 229E Cy5-koetin 4 66,0-69,0 C. pneu* HKU1 Cy5-koetin 5 70,5-73,5 M. pneu Cy5-koetin 6 76,5-79,5 H1N1 ROX-koetin 1 52,5-55,5 RSVA PIV1 ROX-koetin 2 57,5-60,5 Adeno PIV2 ROX ROX-koetin 3 62,5-65,5 hmpv PIV3 ROX-koetin 4 66,5-69,5 RSVB PIV4 ROX-koetin 5 72,5-75,5 InfA Boka ROX-koetin 6 76,5-79,5 InfB BHQ1 BHQ1-koetin 1 70,5-73,5 IC IC * Huomautus: Chlamydophila pneumoniaen detekointi RespiFinder RG Panel -tuotteella on tarkoitettu ainoastaan tutkimuskäyttöön. Sitä ei saa käyttää diagnostiikkaan. Minkään väittämän tai esityksen tarkoituksena ei ole antaa tietoa sairauden diagnosoinnista, ehkäisystä tai hoidosta. Vianetsintä Tästä vianetsintäohjeesta saattaa olla apua mahdollisesti ilmenevien ongelmien ratkaisemiseen. Katso lisätietoja myös teknisen tukikeskuksemme usein kysytyistä kysymyksistä: QIAGENin tukikeskuksen asiantuntijat vastaavat mielellään kysymyksiisi joko tähän käsikirjaan liittyvistä RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

36 tiedoista ja protokollista tai näyte- ja analyysiteknologioista (katso yhteystiedot takakannesta tai osoitteestawww.qiagen.com). 36 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

37 Huomautuksia ja ehdotuksia Ei spesifisiä näkyviä sulamishuippuja ja IC-sulamishuippu ei näkyvissä a) Ohjelmointivirhe(itä) termosykleriohjelmassa Ohjelmoi lämpösykleri kohdan Protokolla: PCRmonistus ja sulamismääritys, sivu 17, mukaisesti ja toista analyysi. b) Pipetointivirhe tai reagenssi puuttuu c) Sisäistä kontrollia ei ole lisätty tai sisäinen kontrolli on lisätty ennen lyysipuskurin lisäämistä näytteeseen d) Näytteessä on PCRestäjiä Toista RespiFinder-analyysi kohdan Protokolla: PCR-monistus ja sulamismääritys, sivu 17 mukaisesti. On tärkeää lisätä sisäinen kontrolli ja kantaja- RNA lyysipuskuriin, mieluiten sen näytteeseen lisäämisen jälkeen, käytetystä eristämisprotokollasta riippumatta (katso Sisäisen kontrollin ja kantaja-rna:n käyttö, sivu 15). Muuten sisäinen kontrolli saattaa hajota näytteen sisältämien nukleaasien vuoksi. Toista nukleiinihapon eristäminen ja RespiFinderanalyysi. Toista analyysi käyttämällä viisinkertaista laimennusta eristetystä RNA/DNA:sta. Sisäisen kontrollin sulamishuippua ei ole näkyvissä patogeenikohtaisten sulamishuippujen yhteydessä Vakava infektio ja/tai moni-infektio. Virheellisiä sulamishuippuja on näkyvissä Ristikontaminaatio Sisäinen kontrolli on alistettu analyysissä. Tulos on edelleen kelvollinen. Ristikontaminaation ehkäisemiseksi varmista, että reaktiovaiheet suoritetaan erillisessä tilassa. Toista RespiFinder-analyysi. Tarkista sykliohjelma ja varmista, että kaikki käsittelyvaiheet suoritetaan kohdassa Protokolla: PCR-monistus ja sulamismääritys, sivu 17, kuvatulla tavalla. Käytä työskentelyyn jäätä aina protokollan osoittamissa vaiheissa. Toista RespiFinder-analyysi. RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

38 Huomautuksia ja ehdotuksia Voimistuneita fluoresenssin taustasignaaleja voi olla havaittavissa, jos samassa reaktiossa ei ole ilmennyt spesifistä monistusta. a) Näytteen nukleiinihapon eristyksessä ilmenevät inhiboivat tekijät haittaavat tehokasta ja spesifistä monistusta. Voimistuneet taustasignaalit saattavat olla RespiFinder RG Panel -tuotteen kynnysarvojen yläpuolella, mutta ne tunnistetaan helposti eispesifisiksi sulamishuipuiksi. Kuvassa 22 sivulla 39 on esimerkki voimistuneesta taustasta. b) Sisäisen kontrollin puuttuminen negatiivisissa näytteissä Voimistuneet taustasignaalit saattavat olla RespiFinder RG Panel -tuotteen kynnysarvojen yläpuolella, mutta ne tunnistetaan helposti eispesifisiksi sulamishuipuiksi. Toista RespiFinder-analyysi. Kuvassa 22 sivulla 39 on esimerkki voimistuneesta taustasta. 38 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

39 FAM/ROX-kanava Seos 1 Seos 2 Oikea Negatiivinen kontrolli Ei sisäistä kontrollia Ei sisäistä kontrollia Negatiivinen kontrolli FAM/Cy5-kanava Seos 1 Seos 2 Ei sisäistä kontrollia Negatiivinen kontrolli Oikea positiivinen Negatiivinen kontrolli Ei sisäistä kontrollia Green-kanava (IC) Seos 1 Seos 2 Negatiivinen kontrolli Ei sisäistä kontrollia Ei sisäistä kontrollia Negatiivinen kontrolli Kuva 22. Esimerkki voimistuneesta taustasta. Negatiivinen kontrolli: Linjat vastaavat negatiivista kontrollia, jossa ei havaita signaaleja FAM/ROX- ja FAM/Cy5-kanavissa, mutta joka ilmaisee spesifisen sisäisen kontrollin huipun Green-kanavassa (IC). Oikea positiivinen: FAM/ROX-kanavan seoksen 1 ja FAM/Cy5-kanavan seoksen 2 linjat esittävät näytteitä, joissa havaitaan oikea positiivinen sulamishuippu. Ei sisäistä kontrollia: Linjat vastaavat näytettä, johon ei oltu lisätty sisäistä kontrollia. Tässä näytteessä ei tapahtunut spesifistä monistusta, minkä seurauksena taustafluoresenssi lisääntyi FAM/ROX-kanavassa, jossa ei näy selvää sulamishuippua, mutta jossa fluoresenssitaso on kynnysarvon yläpuolella. Laadunvalvonta RespiFinder RG Panel -tuotteen valmistaja on PathoFinder BV, Maastricht, Alankomaat. Paneeli on valmistettu ISO 13485:2003-standardin ja EN ISO 13485:2012 -standardin mukaisia laadunvalvontajärjestelmiä noudattaen. RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

40 Rajoitukset RespiFinder RG Panel tukee hengitystieinfektion diagnosointia, kun sitä käytetään yhdessä muiden kliinisten ja laboratoriotulosten kanssa. Negatiiviset tulokset eivät välttämättä viittaa virus- tai bakteeriperäisen hengitystieinfektion puuttumiseen. Negatiivisia tuloksia ei pidä käyttää ainoana perusteena diagnostiikassa, hoidossa tai hoitopäätöksissä. Positiivinen tulos ei sulje pois muiden patogeenien aiheuttamaa samanaikaista infektiota. Detekoitu patogeeni ei välttämättä ole sairauden varma aiheuttaja. Lopullisessa diagnoosissa on huomioitava muut laboratoriokokeet ja kliinisten tulosten arviointi. Suorituksen ominaispiirteet määritettiin QCMD:n validoitujen EQA-paneelien avulla. Tuote on tarkoitettu ainoastaan laboratoriotyöntekijöiden käyttöön. Chlamydophila pneumoniaen detekointi RespiFinder RG Panel -tuotteella on tarkoitettu ainoastaan tutkimuskäyttöön. Sitä ei saa käyttää diagnostiikkaan. Minkään väittämän tai esityksen tarkoituksena ei ole antaa tietoa sairauden diagnosoinnista, ehkäisystä tai hoidosta. Suorituksen ominaispiirteet Katso RepliFinder RG Panel -tuotteen suorituksen ominaispiirteet osoitteesta Viitteet QIAGEN ylläpitää laajaa ja päivitettyä verkkotietokantaa QIAGEN-tuotteita koskevista tieteellisistä julkaisuista. Mittavien hakumahdollisuuksien avulla löydät tarvitsemasi artikkelit joko yksinkertaisella hakusanahaulla tai määrittelemällä sovellukset, tutkimusalueen, otsikon jne. Luettelo kirjallisuusviitteistä on QIAGENin viitetietokannassa osoitteessa Voit myös tilata sen QIAGENin teknisestä palvelupisteestä tai paikalliselta jälleenmyyjältä. Symbolit Pakkauksessa ja etiketissä saattaa olla seuraavia symboleita: <N> Sisältää <N> reaktioon riittävän määrän reagenssia 40 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

41 Viimeinen käyttöpäivämäärä In vitro diagnostinen lääkinnällinen laite Tuotenumero Eränumero Materiaalinumero GTIN-koodi (Global Trade Item Number) Lämpötilarajoitus Valmistaja Noudata käyttöohjeita Huomio Yhteystiedot Teknisiä ohjeita ja lisätietoja saat teknisestä tukikeskuksesta osoitteessa tai puhelinnumerossa Voit myös ottaa yhteyttä QIAGENin tekniseen huoltopisteeseen tai paikalliseen jälleenmyyjään (katso yhteystiedot takakannesta tai osoitteesta RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

42 Tilaustiedot Tuote Sisällysluettelo Tuotenro RespiFinder RG Panel (25) CE (RespiFinder RG Panel (25) CE) 25 reaktiota varten: Esimonistuksen master-seos, sisäinen kontrolli, esimonistuksen primeeriseos, koetinseokset, ligaasientsyymi, Taqpolymeraasi ja puskurit QIAamp MinElute Virus Spin Kit (QIAamp MinElute Virus Spin - sarja) samanaikaiseen virus-dna:n ja -RNA:n puhdistukseen nenänielunäytteistä RespiFinder RG Panel -tuotteessa käyttöä varten QIAamp MinElute Virus Spin Kit (50) 50 pienoisvalmistelua varten: 50 QIAamp MinElute -sarakkeet, QIAGEN-proteaasi, kantaja-rna, puskurit, näytteenottoputket (2 ml) Rotor-Gene Q MDx IVD-validoituun reaaliaikaiseen PCRanalyysiin kliinisessä käytössä Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Reaaliaikainen PCR-sykleri ja High Resolution Melt -analysaattori, jossa 5 kanavaa (vihreä, keltainen, oranssi, punainen, karmiini) sekä HRMkanava, kannettava tietokone, ohjelmisto, lisävarusteet: sisältää 1- vuotisen takuun osille ja työlle. Ei sisällä asennusta ja koulutusta Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Reaaliaikainen PCR-sykleri ja High Resolution Melt -analysaattori, jossa 5 kanavaa (vihreä, keltainen, oranssi, punainen, karmiini) sekä HRM-kanava, kannettava tietokone, ohjelmisto, lisävarusteet: sisältää 1-vuotisen takuun osille ja työlle, asennuksen ja koulutukse RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

43 Tuote Sisällysluettelo Tuotenro Rotor-Gene Q erinomainen suoritus reaaliaikaisessa PCR:ssä Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Rotor-Gene Q 5plex HRM System Reaaliaikainen PCR-sykleri ja High Resolution Melt -analysaattori, jossa 5 kanavaa (vihreä, keltainen, oranssi, punainen, karmiini) sekä HRMkanava, kannettava tietokone, ohjelmisto, lisävarusteet: sisältää 1- vuotisen takuun osille ja työlle. Ei sisällä asennusta ja koulutusta. Reaaliaikainen PCR-sykleri ja High Resolution Melt -analysaattori, jossa 5 kanavaa (vihreä, keltainen, oranssi, punainen, karmiini) sekä HRMkanava, kannettava tietokone, ohjelmisto, lisävarusteet: sisältää 1- vuotisen takuun osille ja työlle, asennuksen ja koulutukse Rotor-Gene Q -lisävarusteet Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) 250 liuskaa, jotka sisältävät 4 putkea ja korkkia, reaktioon µl 10 x 250 liuskaa, jotka sisältävät 4 putkea ja korkkia, reaktioon µl Katso päivitetyt lisenssitiedot ja tuotekohtaiset vastuuvapauslausekkeet vastaavan QIAGEN-sarjan käsikirjasta tai käyttöoppaasta. QIAGEN-sarjojen käsikirjat ja käyttöoppaat ovat saatavina osoitteessa tai ne voi tilata QIAGENin teknisestä palvelupisteestä tai paikalliselta jälleenmyyjältä. RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/

44

45 Tämä sivu on jätetty tarkoituksella tyhjäksi

46 Tavaramerkit: QIAGEN, QIAamp, MinElute, Rotor-Gene (QIAGEN Group); BHQ (Biosearch Technologies, Inc.); Cy (GE Healthcare); FAM, GeneAmp, ROX (Life Technologies Corporation); RespiFinder (PathoFinder BV). RespiFinder RG Panel -tuotteen rajoitettu lisenssisopimus Tämän tuotteen käyttö merkitsee tuotteen ostajan tai käyttäjän suostumusta seuraaviin ehtoihin: 1. Tuotetta saa käyttää ainoastaan tuotteen mukana toimitettujen protokollien ja tämän käsikirjan mukaisesti sekä ainoastaan paneelin sisältämien osien kanssa. QIAGEN ei myönnä henkisen omaisuutensa lisenssiä tarkoitukseen käyttää tai liittää tämän paneelin sisältämiä osia muiden osien kanssa, jotka eivät sisälly tähän paneeliin lukuun ottamatta osia, jotka kuvataan tuotteen mukana toimitetuissa protokollissa, tässä käsikirjassa ja muissa protokollissa, jotka ovat saatavana osoitteessa QIAGENin käyttäjät ovat toimittaneet joitakin näistä protokollista toisille QIAGENin käyttäjille. QIAGEN ei ole testannut tai optimoinut näitä protokollia perusteellisesti. QIAGEN ei myönnä niille takuuta eikä myöskään takaa, etteivät ne loukkaa kolmansien osapuolten oikeuksia. 2. Muutoin kuin selvästi ilmoitettujen lisenssien osalta QIAGEN ei takaa, että tämä paneeli ja/tai sen käyttäjä(t) ei (eivät) loukkaa kolmansien osapuolten oikeuksia. 3. Tämä paneeli ja sen osat on lisensoitu kertakäyttöön, ja niiden uudelleenkäyttö, kunnostaminen tai edelleenmyynti ovat kiellettyjä. 4. QIAGEN kiistää spesifisesti kaikki muut lisenssit, suorat tai epäsuorat, kuin nimenomaisesti on ilmoitettu. 5. Paneelin ostaja tai käyttäjä suostuu siihen, ettei hän suorita tai anna muiden suorittaa toimenpiteitä, jotka voisivat johtaa edellä mainittuihin kiellettyihin tapahtumiin tai edesauttaa niiden syntymistä. QIAGEN saattaa vedota tämän rajoitetun lisenssisopimuksen kieltoihin tuomioistuimessa. QIAGEN perii kaikki tutkinta- ja oikeuskulut asianajajan palkkiot mukaan lukien, jotka aiheutuvat tämän rajoitetun lisenssisopimuksen tai sen henkistä omaisuutta koskevien oikeuksien toimeenpanemisesta paneelin ja/tai sen osien osalta. Katso päivitetyt lisenssiehdot osoitteesta Huomautus ostajalle Tämän RespiFinder-tuotteen valmistaja on PathoFinder BV, Maastricht, Alankomaat. Tuotteen valmistuksessa on noudatettu ISO 13485: standardin mukaista laadunvalvontajärjestelmää. Nämä tuotteet myydään yksinomaan loppukäyttäjien käyttöön. Niitä ei saa myydä, jakaa eikä pakata uudelleen QIAGEN, kaikki oikeudet pidätetään. 46 RespiFinder RG Panel -käsikirja 03/2015

47

48 Australia Itävalta Belgia Brasilia Kanada Kiina Tanska Suomi Ranska Saksa Hongkong Intia Irlanti Italia Japani Etelä-Korea Luxemburg Meksiko Alankomaat Norja Singapore Ruotsi Sveitsi UK FI Sample & Assay Technologies