Molekyylien interaktiot

Transkriptio

1 Teknillinen korkeakoulu Sähkö- ja tietoliikennetekniikan osasto Laskennallisen tekniikan laboratorio S Solubiosysteemien perusteet Molekyylien interaktiot Johanna Hokkanen Anna-Maria Lahesmaa

2 1 Johdanto Proteiinirakenne on erittäin kiintoisa tutkimuskohde. Proteiinin aminohappojärjestyksen selvitys on nykyään yksinkertaista, kun tiedetään proteiinin koodaavan geenin ja mikä kodoni vastaa mitä aminohappoa. Vaikeampi tehtävä on selvittää miten proteiini laskostuu oikein. Proteiinit interaktoivat valtavasti solun sisällä ja nämä interaktiot ovat myös usein vaikeasti selvitettävissä. Näihin interaktiohin olennaisesti vaikuttaa proteiinin kolmiuloitteinen rakenne. Proteiinin primäärirakenne koostuu aminohapposekvenssistä jotka ovat luonteeltaan erillaisia, esimerkiksi polaarisia tai poolittomia. Sekundäärirakenne perustuu primäärirakenteesta johtuvista ominaisuuksista. Nämä sekundäärirakenteet ovat a-heliksi ja b-laskos. Nämä sekundäärirakenteet saavat uusia kohtia aminohappoketjussä lähelle toisiaan ja uusia interaktioita muodostuu. Tämä on proteiinin tertiäärirakenne. Kvarternäärirakenteessa on kyse tilanteesta, jos yksittäiseen aminohappoketjuun lisätään osia, esimerkiksi toinen proteiini tai jokin muu molekyyli. Proteiinin kolmiuloitteinen rakenne määrittelee sen, minkälaisiin interaktioihin se voi osallistua. Molekyylien välisiä interaktioita voidaan simuloida tietokoneella. Koska interaktiot ovat lähtöisin kolmiuloitteisesta rakenteesta, simuloinnissa käytetään yleisesti proteiinin kolmiuloitteista rakennetta lähtökohtana. Se, miten proteiini laskostuu on erittäin tärkeä osa interaktioiden muodostamisessa. Simulointiohjelmat yleisesti käyttävät proteiinin hydrofobisia interaktioita, vetysidoksia ja kompleksin kokonaisenergiaa simuloinnissa. Tässä työssä selvitetään kymmenen ohjelman toimintaperiaatteita ja minkälaisia algoritmeja ja tekniikoita eri ohjelmat käyttävät simuloidessa proteiinien välisiä interaktioita.

3 2 AutoDock AutoDock on graafinen molekyylien interaktio-ohjelma, joka muodostaa käyttäjälle interaktiosta 3D-rakenteisen kuvan. AutoDock soveltuu muun muassa röntgenkristallografiaan, rakenteeseen perustuva lääkemuotoiluun, ohjauksen ennustamiseen, todelliseen seulontaan, proteiiini-proteiini interaktioon ja kemikaalisten mekanismien tutkimuksiin. AutoDock koostuu kolmesta eri ohjelmasta: AutoDock suorittaa ligandien interaktion yhteen kuuluvien verkkojen kohde proteiinien kuvaamalla tavalla. AutoGrid tekee ennakkolaskelmia näille verkoille ja AutoTors asettaa ne jännitteet, mitkä työstävät näitä pyöritettäviä verkkoja. Lisäksi atomien samankaltaiset verkot voidaan visualisoida, mikä auttaa esimerkiksi opastamaan synteettisten kemiallisten sidoslankojen suunnittelussa. Pakettiin kuuluu myös AutoDockTools (ADT), mikä auttaa interaktion asentamisessa ja analysoimisessa, sekä Automated Packager, mikä sisältää ohjeet kaikkien ADT tiedostojen siirtämisestä käyttäjän omalle koneelle. ADT:n avulla pystyy muun muassa liikuttamaan molekyyliä 3D-tasossa pyörittämällä ja siirtämällä niitä ylä-ala suunnassa, lisäämään vetymolekyylejä, antamaan valinnaisia atomien latauksia ligandille ja makromolekyyleille, sekä yhdistämään ei-polaarisia vetyioneja ja niiden latauksia niiden päähiiliatomiinsa. AutoDock:lla on paljon suosituksia. Ohjelma on käytössä nyt lähes 2200 akateemisella tutkijalla, valtion- ja ei-kaupallisen alan instituutilla. Lisäksi AutoDock:sta on tehty vuoteen tammikuuhun 2003 mennessä 450 kirjallista julkaisua sen käyttämistä metodeista.

4 AutoDock on ilmainen akateemisille ja koulutus instituuteille ei-kaupalliseen käyttöön. C ja C++ koodit on varustettu kaikissa ohjelmissa Unix makefileilla helpottamaan suoritettavan tiedoston laatimista. Ohjelma toimii seuraavissa käyttöympäristöissä; Darwin, IRIX64, Linux, Mac OS X, Solaris, Windows/Cygwin ja Linux Compute Cluster. Ohjelman kotisivulta löytyy tarkat ohjeet ohjelman asennukseen ja käyttöön. Ohjelman hankkiminen vaatii lisenssihakemuksen allekirjoittamista, sen faksaamista ja sähköpostittamista ja ftp-ohjeet lähetetään käyttäjälle sähköpostitse. Tämä kestää noin viisi arkipäivää. AutoDock 3.0 version avulla interaktio voidaan suorittaa minuutissa ja kiinteää interaktiota voidaan suorittaa päivän aikana yhdellä prosessorilla. Ohjelma sisältää vapaan energian piirrotusfunktion, joka perustuu lineaariseen regressioanalyysiin, AMBER FORCE FIELD, ja suureen joukkoon monipuolisesti yhteen kuuluvien proteiini ligandi komplekseista tiedetyn inhibition pysyvyyden mukaan. 3 Schrödingerin Glide, Liaison ja QSite Ohjelmissa on graafinen Maestro-käyttöliittymiä ja ohjelmat piirtävät käyttäjälle interaktiosta 3D-rakenteisen kuvan. Nämä ohjelmat vaativat lisenssin kirjoittamisen ja faksaamisen ennen kuin ohjelman saa käyttöönsä. 3.1 Glide Glide on keskittynyt lääkekeksintöjen kehittämiseen. Tärkeimpiä tekijöitä ovat nopeus, ligandien sidostapojen tunnistaminen sekä sidosten yhteenkuuluvuuden ennustaminen. Glide:n piirrotus perustuu verkkopohjaiseen energian minimointiin, Monte Carlo

5 näytteenottoon sekä GlideScore-ohjelmaan. GlideScore on muunnettu versio paremmin tunnetusta CheScore-ohjelmasta. Se on testattu yli 200 kompleksilla, joiden kokeelliset sidosreaktiot ovat saatavilla. Glide on myös suunniteltu yhtäaikaiseen täsmälliseen näytteenottoon ja piirrotukseen. Gliden tehokkuus perustuu hierarkkisiin suodattimiin, jotka nopeasti ohjautuvat mahdollisiin ligandi paikkoihin ja taipumukseen helposti käsiteltävien numeroiden yksityiskohtaiseen tarkasteluun. Nämä filtterit sisältävät uuden karkean piirrotus funktion, joka tunnistaa hydrofopiset ja polaariset yhteydet reseptori ja hylkäys interaktion perusteella. Enemmän täsmällisiä piirrotusprosesseja voidaan suorittaa myöhemmissä interaktiovaiheissa laskennan kokonaisnopeutta liikuttamatta. Glide toimii Unix:ssa ja Linuks:ssa. Glide:ssä on graafinen kaäyttöliittymä ja sen käyttö on siitä syystä helpompaa. Yksi paneeli suorittaa prosesseissa tarvittavia parametreja. Tulosten analysointi on yksinkertaistettu. Glid antaa käyttäjälle myös mahdollisuuden tutkia vetysidoksia ja yhteyksiä ligandin ja reseptorin välillä. Glide tulokset voi jatko käsitellä Schrödingerin vapaan energian estimointi ohjelmalla, Liaison. 3.2 Liaison Liaison on suunniteltu ensisijaisesti lääkesuunnitteluun. Liaison on nopeampi kuin Glide. Liaison ohjelma käyttää jatkuvaa solvaatiota exblisiittisen solvaation sijaan sekä lineaarista vuorovaikutusaproksimaatio (LIA) menetelmää. Vain kaksi simulaatiota täytyy suorittaa Liaisonin sitoutumistapahtuman kuvaamisessa; vapaa ligandi vesipohjaisessa ympäristössä ja ligandin sitoutuminen reseptoriin, siksi menetelmä on laskennallisesti todella nopea. Täydentävä laskenta-aika simulaatiossa on lisätty sallimalla energian minimoinnin käyttö Molecular Dynamics:n ja Monte Carlo näytteenoton sijaan. Simulaatiotuloksista lasketaan parametrien avulla yhteenkuuluvien sidosten paikat ja tästä

6 ohjelma antaa piirrotusfunktion sitoutumisenergialle. Empiirinen parametrisointi korjaa mallien systemaattiset virheet, mikä sallii Liaisonin käytön rajatuissa alueissa erilaisilla kemiallisilla rakenteilla. Liaison energiat on laskettu käyttäen OPLS-AA voima kenttää. Solvaatio efektit on otettu huomioon täsmällisessä S-GB jatkuvassa mallissa, mikä tuottaa laskennallisia kuormituksia lyhyemmän piirrotuksen ajan. Käyttämällä jatkuvaa menetelmää myös varmistetaan nopeampi simulaation konvergenssi. Automatisoidut prosessit Liaisonissa mahdollistavat ligandien sarjojen tutkimisen samalle reseptorille ilman käyttäjän väliintuloa, kuten yhtä hyvin myös sidosenergioiden seurannan helpon analysoinnin. Liaisonissa on helppo asettaa läpi yksittäinen paneeli graafisessa Maestro käyttöliittymässä. Se käsittelee ligandeja, jotka ovat kemiallisesti erilaisia. S-GB jatkuva solvaatio varmistaa täsmälliset tulokset ja nopean konvergenssin. 3.3 QSite QSite on yhdistetty moodi QM/MM ohjelmasta täsmälliselle proteiini-ligandin vuorovaikutuksien energian laskemiselle aktiivisessa paikassa. Ohjelma on erityisesti suunniteltu proteiineille. QSite käyttää Jaguar ohjelman (myös Schrödingerin ohjelma ja hankittava erikseen) tehoa ja nopeutta suorittaakseen huomattavan mekaanisen osan laskennoista ja OPLS-AA:ta suorittaakseen molekyylien mekaanisen osan laskennasta. QSite ei toimi ilman Jaguarohjelmaa.Yhdistetyssä moodi laskennassa vain kriittinen kulma on käsitelty kvantti mekaanisesti. Moodi mahdollistaa myös minkä tahansa ligandin tutkimisen ilman huolta parametrisaatiosta. Koska ligandit on käsitelty kvanttimekaanisesti, voidaan myös tutkia uusia ulokkeita

7 luotettavasti. Lisäksi voidaan verrata suhteellisia energioita kahden erilaisen rakenteen telakoituessa reseptorin paikkaan täsmällisesti. Pystytään myös tarkistamaan lääkkeen kahden erilaisen sidosmoodin suhteellisen voimakentän energiat QSite:ssa Shrödingerin ab initio ohjelmisto Jaguar suorittaa kvanttimekaaniset laskennat sisältäen molekyyli mekaniikan ympäristön yhteydet. Jaguar on tunnettu nopeudestaan, tehokkuudestaan ja täsmällisyydestään. Tyypillisesti tietty ligandi tai mikä tahansa proteiinin aktiivisen puolen avain jäännös on kuvattu kvanttimekaniikalla, kun samanaikaisesti suurempi joukko proteiineja on kuvattu molekyylimekaniikalla. QSite on erityisesti suunniteltu proteiinin aktiivisen puolen mallintamiseen. QSite tarjoaa mahdollisuuden kvanttimekaniikan laskennan eri tasoilla; HF (high frequency), DFT (discrete Fourier transformation) ja LMP2. Molekyylimekaniin laskennat on suoritettu käyttämällä Jorgensenin OPLS-AA:n voima kenttää. QM vyöhyke jäädytetään MM optimoinnin ajaksi, joten molekyylin mekaaninen vyöhyke optimoidaan adiabaattisesti reaktion jokaiseen geometriseen askeleeseen QM vyöhykkeellä, näin turvataan koko systeemin nopea minimointi. 4 Hint Hint on molekyylimallinnus ohjelma, jonka tarkoitus on visualisoida hydrofoobisia ja hydrofiilisia interaktioita biologisten molekyylien välillä. Tätä ohjelmaa voidaan käyttää etsiessä uudenlaisia lääkkeitä ja proteiinin tai nukleotidin rakenteen analyysissä. Hint käyttää jo hyvin kehiteltyjä lääketiettelisen kemian ja QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) periaatteita sekä LogP -arvoa ja hydrofoobisuutta hyväksi. Ohjelma muodostaa vapaaenergioihin perustuvan interaktiomallin. Vapaaenergiat perustuu kokeellisesti havaittuihin tuloksiin, jotka on saatu neste-erotuksista. Erotuskerroin (LogP)

8 on termodynaaminen parametri, joka sisältää tiedon kaikista interaktioista biologisessa ympäristössä, jotka eivät ole kovalenttisia. Tämä johtuu siitä, että tätä arvoa ei ole muokattu ja se on puolueeton kokeellinen arvo. Ohjelma laskee kolmiuloitteiset hydpaattiset kentät, joita käytetään myöhemmissä osissa ohjelmassa. Näitä kenttätietoja voidaan käyttää, kun halutaan analysoida biologisten makromolekyylien rakennetta. Mahdollisia tutkittavia interaktioita ovat miten substraatti tai muu pieni molekyyli sitoutuu proteiiniin tai nukleotidiin, proteiinien osien interaktioita ja proteiinin laskostumista. Tällä ohjelmalla on mahdollista myös verrata miten interaktio muuttuu erilaisissa ympäristöissä, esimerkiksi ph-muutoksen jälkeen. 5 Ligplot Ligplot on ohjelma, joka tuotaa kaksiuloitteisia kuvia, jotka esittää kahden molekyylin välisiä interaktioita. Interaktiot on visualisoitu eri väreillä ja ne esittävät vetysidoksia ja hydrofoobisia interaktioita. Ohjelma on tehty Unix käyttöliittymälle, mutta uusi versio on tulossa Windows käyttöliittymälle. Ohjelmalle annetaan kolmiuloitteinen tieto proteiinista. Ohjelma ensin kiertää kolmiuloitteisen rakenteen auki, sen kiertyvien sidosten ympäri. Tuloksena on kaksiuloitteinen kuva, missä sidokset on kuitenkin lähes täysin oikeilla paikoillaan ja interaktiokohdat pysyvät samanlaisina. Ohjelmassa on useampi ohjelma toimimassa yhdessä. HBPLUS laskee kaikki interaktiossa olevat vetysidokset. HBADD muutta PDB-tiedoston muotoon, mistä HBPLUS voi käyttää tietoja. Tämä tapahtuu käyttämällä tiedostokirjastoa. Jos tätä ohjelmaa ei käytetä, muutto pitää tehdä manuaalisesti. Lopulta NACCESS laskee liuoksen mahdollisuuden päästä proteiinin eri kohtiin. Erillinen DIMPLOT ohjelma laskee interaktioita kahden

9 proteiinin välillä, joko proteiinidimerin välillä tai kahden proteiinin eri domainien välillä. Ligplot ohjelmalle syötetään proteiinin PDB-tiedosto ja kohta, mihin interaktiomolekyyli voi sijoittua. Ohjelman tulostukset on joko mustavalkoisia tai värillisiä kuvia. Tulostusta voi muokata omien halujen mukaan. 6 FADE ja PADRE FADE ja PADRE ohjelmat ovat San Diegon yliopiston laskentakeskuksen (Supercomputer Center at UCSD) tekemiä ohjelmia. FADE on lyhenne nimestä Fast Atomic Density Evaluator ja PADRE on lyhennen nimestä Pairwise Atomic Density Reverse Engineering. Ohjelmaa toimii sekä Unix että Macintosh käyttöliittymillä. Näillä kahdella ohjelmalla voi nopeasti havainnollistaa uria, lohkeamia ja ulokkeita proteiinin pinnalla. Tästä näkee helposti, mitkä kohdat ovat luultavasti jonkinlaisissa yhteyksissä muihin molekyyleihin. Tällä ohjelmalla voi myös suoraan laskea kuinka hyvin joku toinen proteiini sitoutuisi johonkin kohtaan tarkastelussa olevaa proteiinia. FADE toimii siten, että se laskee molekyylin pinnalla olevia atomitiheyksiä. Proteiinin kohdat, missä on suuri tiheys yleensä viittaa kohtiin, missä on ura tai lohkeama. Näitä atomitiheyksiä vertaamalla ja laskemalla yhteen, voidaan laskea miten kaksi vertailtavaa proteiinia voisi liittyä yhteen. FADE käyttää laskennassa FFT (Fast Fourier Transforms) -muunnoksia ja automaattisesti laskee optimaaliset ruudukon koot joita käyttää FFT-muunnoksien kanssa. Tämä ohjelma on kuitenkin niin helppokäyttöinen, että jopa kolmevuotias voisi sitä käyttää. Ohjelmalla on kattava ohjekirja, joka on ladattavissa internetistä.

10 PADRE laskee tiheyksiä tietyillä etukäteen määrätyillä pinnoilla. Ohjelman tehtävä on saada esille proteiinin topografisia ominaisuuksia. PADRE muodostaa pisteelle analyyttisen muotoarvon, joka määrittelee sen kohdan kolmiuloitteisessa tilassa. Nämä tiheyslaskelmat auttavat löytää proteiinista kohtia, mihin toinen molekyyli voi sitoutua ja muita yksilöllisiä piirteitä. PADRE käyttää Lennard-Jones potentiaaleja, joiden avulla se arvioi tiheysarvoja tietyissä pisteissä. Tämä ohjelma voi myös lukea MSMS ohjelman tuottamia pintatietoja. Tämän ohjelman ohjekirja löytyy myös internetistä. 7 Shape Shape on ohjelma, joka kehitettiin San Diegon Yliopistoston laskentakeskuksessa (Supercomputer Center at UCSD). Ohjelmalla voidaan analysoida proteiinirakennetta ja molekyylin pintakemiaa. Ohjelma on kirjoitettu C kielellä. Ohjelmassa on kaksi varsinaista ohjelmaa, jotka toimivat yhdessä, jotta voidaan analysoida proteiinin pinnan rakennetta ja kemiaa. Yksi ohjelmista on nimeltään Surfractal. Tämä osa laskee osittaisatomitiheyksiä tietyissä kohdissa halutusta tiedostosta. Nämä kohdat saadaan laskelmista, missä ohjelma laskee atomien keskipisteistä johtuvia atomitiheyksiä. Toinen ohjelma on MaxAccess. Tämän ohjelman tehtävänä on laskea suurin mahdollinen pallotilavuus proteiinin pinnalla. Tämä tarkoittaa siis sitä, että kuinka suuria molekyylejä mahtuu proteiinin lähelle. Tämä pallotilavuus lasketaan kaikissa pisteissä annetusta tiedostosta. Syöttötiedosto on ASCII tiedostoista. Tähän kuuluu kaksi tiedostoa. Toinen tiedosto sisältää koordinaatit proteiinin eri atomien keskipisteistä. Toinen tiedosto sisältää

11 koordinaatit proteiinin pinnasta. Yhteensä, tässä tiedostossa on siis tietoa proteiinin jokaisen atomin halkaisijasta, koordinaatista sekä pintatietoja. Shape ohjelman saa käyttöön täyttämällä lisenssin. Ohjelmalla on tekstipohjainen käyttöliittymä, mutta tulokset saadaan kuvamuotoon, missä näkee proteiinin kolmiuloitteisen rakenteen sekä mahdollisia sitoutumiskohtia. 8 DOCK DOCK käyttää geometrista sopivuus algoritmia heijastamaan ligandi sidostaskun negatiiviseen kuvaan. Algoritmi kykenee löytämään matalimman energian sidosmoduulin, sisältäen voimakenttään perustuvan piirrotuksen. DOCK on kirjoitettu C++ kielellä ja on käytännöllisesti erotettu itsenäisiin komponentteihin. DOCK ennustaa muun muasssa pienien molekyyli-proteiini kokonaisuuksien sitoutumismoodeja. Ohjelma etsii ligandin tietokannoista yhdistelmiä, jotka haittaavat entsyymiaktiivisuutta, sitovat tiettyjä proteiineja tai sitovat nukleiinihappokohteita. DOCK tutkii myös proteiini-proteiini ja proteiini-dna kokonaisuuksien mahdollisia sitoutumisorientaatioita. Se auttaa ohjaamaan synteettisiä vaikutuksia tutkimalla pieniä molekyylejä, jotka ovat laskennallisesti derivoituja. DOCK toimii seuraavissa käyttöliittymissä; Linux, Unix, Windows, Sun, IBM AIX ja Macintosh OSX. DOCK on maksuton akateemisille instituuteille ja lisenssi on saatavilla myös teollisuuden laitoksille. Ohjelman saa käyttöön täyttämällä lisenssin ja faksaamalla sen DOCK:n ylläpidolle. Lisäksi tulee lähettää sähköpostitse tilaajan akateeminen osoite. DOCK ohjelmalla on tekstipohjainen käyttöliittymä ja ohjelma sisältää paljon parametrejä, jotka on saatavilla käyttäjälle DOCK:n kotisivuilta.kotisivuilta löytyvät

12 myös ohjeet parametrien käyttöä varten ja parametrien arvot. 9 DOT (Daughter of Turnip) DOT ei ole niin visuaalinen kuin AutoDock. DOT perustuu Turnip ohjelmaan, jonka on kehittänyt Victoria Roberts Scripps Research Instituutista. DOT käyttää geometrisen sopivuuden informaatiota sekä Poisson-Boltzmann sähköstaatista potentiaalia. DOT:n ensisijainen määränpää on löytää suhteellisen nopeasti lyhyt luettelo ehdokasmolekyylien paikasta. DOT tekee perustan yhdestä kiinteästä molekyylistä ja ottaa luettelon kierteistä, jonka avulla se muodostaa seuraavan liikkuvan molekyylin. Joka kierteelle kierteisyys operaatio laskee suhteellisuuden potentiaalisen kentän ja kiinteän molekyylin välille, sekä liikkuvan molekyylin kierretyn latauksen jakautumisen. Lopputuloksesta DOT laskee sähköstaattisen vuorovaikutuksen energiat sekä van der Waals vuorovaikutukset. Jokainen kiemura arvioi energiaa yli koko avaruudellisen verkon tälle kiinteälle kierteelle. DOT muodostaa listan suhteellisen myönteisistä paikoista kahden molekyylin välille. Korkeammalle viedyt tulokset voidaan suorittaa muilla ohjelmilla, jotka esittävät energian minimoinnin molekyylien dynamiikan tai vapaan energian simuloinnin tai visuaalisen tarkastelemisen kautta. DOT toimii hitaasti sillä se suorittaa monia laskutoimituksia samanaikaisesti ja se käy läpi kaikki vaihtoehtoiset kierre- ja käännöspaikat. Jos käytetään useampaa työasemaa, voidaan laskentaa nopeuttaa. Tämä tarkka laskeminen hyödyttää kuitenkin siitä syystä, että algoritmien valinta on todella tehokasta. Kun annetaan yksi kierre, ohjelma laskee energiat kaikille translaatiomahdollisuuksille samalla kertaa. Kaikki DOT:n aritmetiikat soveltuvat hyvin nykyisille mikroprosessoreille, mutta ne vaativat paljon prosessoritilaa.

13 DOT toimii seuraavissa tekstipohjaisissa käyttöliittymissä: DIGITAL MPI, Sun MPI, CRAY MPI, IBM MPI. Käytettäessä DOT:ia on ensin määritettävä paljon esitietoja, joiden laskemiseen on olemassa monia ohjelmia. DOT:n kotisivuilta löytyy maininta näistä ohjelmista, jotka tulee kuitenkin tilata ja asentaa erikseen kyseisten valmistajien kotisivuilta. DOT:n käytön aloittaminen on monivaiheista. Käyttäjän tulee ensin asentaa monia tiedostoja koneeseensa, jotka sisältävät esitiedot ja määritykset tarvittaviin laskutoimituksiin. Lisäksi käyttäjän tulee etsiä kaikki ohjelmat näiden esimääritelmien laskemista varten ja asentaa ne omalle koneelle ja suorittaa määritelmät näillä ohjelmilla. Kaikkiin vaiheisiin löytyy kuitenkin DOT:n kotisivuilta ohjeet. DOT on tekstipohjainen ohjelma ja se suorittaa erilaisia laskutoimituksia ja tehtäviä käskyjä antamalla. Myös kaikki käskyt, niiden käyttötarkoitus ja parametrit löytyvät DOT:n kotisivuilta. DOT:n kotisivuilta ei kuitenkaan löydy suosituksia/viitteitä tälle ohjelmalla. DOT vaatii rekisteröitymisen, jotta ohjelman pääsee lataamaan kotisivulta. Tähän järjestelmään vaadittava salasana lähetetään käyttäjälle sähköpostitse. 10 Johtopäätökset Tässä työssä on käsitelty kymmenen eri ohjelmaa ja niiden toimintaa. Suurin osa ohjelmista vaati useamman ohjelman käyttöä, jotta saataisiin varsinainen simulointi toimimaan. Ohjelmien käyttöön opastettiin eri tavoilla. Joillain ohjelmilla oli kattavat oppaat, mutta joistain ohjelmista kerrottiin käyttäjälle hyvin vähän jos ei ollut itse ohjelmaa. Suurin osa ohjelmista oli ilmainen akateemisia tarkoituksia varten, mutta ohjelman saaminen ja käyttö vaati lisenssisopimusten täyttämistä ja telefaksaamista. Suurin osa ohjelmista oli varustettu graafisella käyttöliittymällä, mutta tämä ei kuitenkaan taannut sitä, että ohjelma olisi helppokäyttöinen. Yleisesti nähtiin, että ohjelmia oli useita, ja ne olivat kaikki jonkin verran erilaisia. Käyttäjän tulee itse valita, mitä ohjelmaa käyttää, riippuen halutusta tuloksesta ja sovellutuksesta missä ohjelmaa käyttää. Tästä kokoelmasta ohjelmia löytyy varmasti sopiva kaikkiin tarkoituksiin.