PAPERIKONEEN KIERTOVESIEN KONSENTROITUMISEN VAIKUTUS MIKROBIEN KASVUUN

Transkriptio

1 Helsinki University of Technology Control Engineering Laboratory Espoo Report 1 PAPERIKONEEN KIERTOVESIEN KONSENTROITUMISEN VAIKUTUS MIKROBIEN KASVUUN Terhi Ylöstalo Katri Salonen Matti Siika-aho Sonja Suni Heikki Hyötyniemi Hannes Rauhala Heikki Koivo TEKNILLINEN KORKEAKOULU TEKNISKA HÖGSKOLAN HELSINKI UNIVERSITY OF TECHNOLOGY TECHNISCHE UNIVERSITÄT HELSINKI UNIVERSITE DE TECHNOLOGIE D HELSINKI

2 Helsinki University of Technology Control Engineering Laboratory Espoo September Report 1 PAPERIKONEEN KIERTOVESIEN KONSENTROITUMISEN VAIKUTUS MIKROBIEN KASVUUN Terhi Ylöstalo 1 Katri Salonen Matti Siika-aho Sonja Suni Heikki Hyötyniemi 1 Hannes Rauhala 1 Heikki Koivo 1 1 Teknillinen korkeakoulu, Systeemitekniikan laboratorio Konemiehentie, 15 Espoo Puh: , Fax: terhi.ylostalo@hut.fi VTT Biotekniikka Teknillinen korkeakoulu Automaatio- ja systeemitekniikan osasto Systeemitekniikan laboratorio

3 Distribution: Helsinki University of Technology Control Engineering Laboratory P.O. Box 54 FIN-15 HUT, Finland Tel Fax ISBN ISSN Picaset Oy Helsinki

4 Esipuhe Tässä raportissa esiteltävä tutkimus kuuluu CACTUS- Vähävetinen paperinvalmistusteknologiaohjelman osa-alueeseen Mittaustekniikka ja prosessikemia. CACTUS-teknologiaohjelma toteutettiin vuosina ja sen päärahoittajat olivat Tekes sekä seuraavat metsäklusterin yritykset: Ahlström Machinery Oy, Hadwaco Oy, Kemira Chemicals Oy, Metsä-Serla Oyj, Myllykoski Paper Oy, Raisio Chemicals Oy, Stora Enso Oyj, UPM-Kymmene Oyj, Valmet Oy. Paperikoneen kiertoveden konsentroitumisen vaikutusta mikrobien kasvuun tutkittiin yhteistyöprojektissa, jonka osapuolina olivat TKK Systeemitekniikan laboratorio ja VTT Biotekniikka. Koko projektin keston ajan ( ) tehtiin tiivistä yhteistyötä kolmen teollisuus-osapuolen kanssa: Kemira Chemicals Oy, Metsä-Serla Oyj ja Stora Enso Oyj. Kiitämme yhteistyökumppaneitamme! Espoossa, syyskuussa Heikki Koivo Matti Siika-aho Terhi Ylöstalo

5

6 Tiivistelmä Paperikoneiden kiertovesien konsentroituessa mikrobien kasvuolosuhteet paranevat. Muodostuva mikrobifloora riippuu kiertovesissä olevista mikrobeille käyttökelpoisista ravinteista ja vallitsevista olosuhteista, kuten ph:sta ja lämpötilasta, sekä kontaminaatiolähteistä. Tutkimuksessa pyrittiin kasvatuskokeiden ja mallituksen avulla selvittämään konsentroitumisen ja paperikoneella vallitsevien olosuhteiden vaikutusta mikrobien kasvuun. Tutkimuksen kohteeksi otettiin kaksi eri tyyppistä paperikonetta, neutraali ja hapan, ja kaksi kyseisillä paperikoneilla yleisesti esiintyvää haittamikrobia, Acinetobacter lwoffii ja Bacillus coagulans. A. lwoffii oli eristetty neutraalilta paperikoneelta ja B. coagulans happamalta, tosin jälkimmäinen voi kasvaa myös neutraaleissa olosuhteissa. B. coagulans on termofiilinen itiöivä sauvabakteeri, joka kestää korkeitakin lämpötiloja. A. lwoffii on mesofiilinen kokki, joka ei käytä hiilenlähteenään glukoosia (kuten B. coagulans ja useimmat muut mikrobit) vaan esim. etanolia, asetaattia, pitkäketjuisia rasvahappoja tai fenolisia yhdisteitä. Mallimikrobien lämpötila-, ph- ja ravinnevaatimuksia tutkittiin esikokeiden avulla. Bioscreen-laitteistolla ja rikkailla kasvatusalustoilla tehdyillä kokeilla saatiin A. lwoffiille lämpötila-optimiksi 3 ºC ja ph-optimiksi 7-1. B. coagulansin ph-optimi oli riippuvainen lämpötilasta. Nopein kasvu havaittiin 5 ºC:ssa ja ph:n ollessa 5.5 6, kun taas lämpötilassa 55 ºC nopein kasvu oli ph:ssa 7. Esikokeissa selvitettiin myös keinotekoisen, konsentroidun kiertoveden valmistusta ja päädyttiin LK-aineiden yksinkertaiseen uuttoon (6 ºC, 3 h) paperikoneiden massakomponenteista kolmen prosentin sakeudessa. Uutos suodatettiin ja suodos pakkaskuivattiin käytettäväksi kasvatusalustoihin. Keinotekoisen kiertoveden raakaaineina käytettiin mallipaperikoneiden hylkypaperia ja mekaanista massaa. Mallimikrobien ravinnevaatimusten perusteella laboratoriokasvatuksia varten kehitettiin perusalustat, jotka sisälsivät mikrobikasvulle tarpeellisten suolojen lisäksi hiilenlähteen (A. lwoffii: asetaatti, B. coagulans: glukoosi), puskurin ph:n stabiloimiseksi (A. lwoffii: fosfaatti, B. coagulans: fosfaatti + piperatsiini) sekä ravinnelisänä hiivauutetta B. coagulans-kasvatuksissa. Pakkaskuivattua kiertovesiuutetta lisättiin kolmena eri pitoisuutena kasvatusalustoihin. Mallimikrobien käyttäytymistä eri kasvatusolosuhteissa tutkittiin ns. fermentoripullokasvatuksissa. Kasvatusten aikana mitattiin ph, hiilenlähteen (asetaatti tai glukoosi) kulutus, sameus, sekä hiilidioksidin ja ATP:n tuotto. Kiertovesiuutteesta peräisin oleva liukenematon aines kasvatusalustoissa häiritsi kasvatusten aikana tehtyjä mittauksia ja määrityksiä. Erityisesti sameusmittaus oli epäluotettava. Mittaustiedoista määritettiin kasvua kuvaavia tunnuslukuja: mm. hiilenlähteen kulutusnopeus, ph:n muutosnopeus ja viive, joka kuluu siirrostuksesta kasvun alkamiseen. Laskettujen tunnuslukujen ja kasvatuksessa käytettyjen olosuhdemuuttujien (lämpötila, ph, kiertovesikonsentraatio) välisiä korrelaatioita tutkittiin tilastollisilla monimuuttuja-analyysimenetelmillä. Fermentoripullokokeissa kiertovettä sisältävillä kasvatusalustoilla A. lwoffii kasvoi parhaiten 3 ºC lämpötilassa ph:ssa 8. Kasvu oli suhteellisen hidasta ja joissakin kokeissa viive ennen kasvun alkamista saattoi olla jopa 1 h. A. lwoffii ei kasvanut mallipaperikoneen ajolämpötilassa. Kasvaessaan A. lwoffii muodosti limaa ja vaahtoa kasvatuspulloihin sekä tarttui pintoihin ja kiintoaineeseen muodostaen kasaumia. Tarttuminen ja kasaumat

7 vaikeuttivat määrityksiä A. lwoffii-kasvatuksissa. Kiertovesiuutteen konsentraation lisääminen nopeutti selvästi A. lwoffiin sopeutumista kasvatusalustaan (siirrostuksen jälkeinen viive lyheni), mutta ei merkittävästi lisännyt A. lwoffiin kasvunopeutta. B. coagulans kasvoi parhaiten 46 ºC lämpötilassa, joka on alempi kuin mallipaperikoneen ajolämpötila. Kaikissa fermentoripullokokeiden testilämpötiloissa optimi oli ph 6., joka on korkeampi kuin mallipaperikoneen ph. B. coagulans kasvoi nopeammin kuin A. lwoffii. Tyypillisesti kasvu alkoi - 1 h siirrostamisesta ja hiilenlähteenä ollut glukoosi käytettiin loppuun nopeimmillaan alle kymmenessä tunnissa. Kiertovesiuutteen konsentraation lisääminen hidasti jossain määrin kasvua. Nykyisillä menetelmillä ei ole mahdollista seurata paperikoneilla esiintyvien mikrobien määriä on-line. Mallipaperikoneiden tarjolla olevia on-line-mittaustietoja (lämpötila, ph, johtokyky) ja mikrobimääritysten tuloksia (saatiin paperitehtaasta riippuen noin parin-kolmen viikon väliajoin) käytettiin tutkimukseen, jossa selvitettiin voitaisiinko saatavilla olevia mittauksia käyttää mikrobitason monitorointiin/ennustamiseen paperikoneella. Mittaustietojen analysoinnissa selvisi, etteivät mallipaperikoneilta saatujen lämpötila-, ph- ja johtokykymittausten vaihtelut riittäneet selittämään mikrobitasojen vaihtelua. Mahdollisissa jatkotutkimuksissa kannattaa kiinnittää huomiota mittausdatan laatuun: mikrobimäärityksiä on tehtävä riittävän usein ja niiden luotettavuutta on parannettava. Lisäksi olisi syytä etsiä mikrobitasojen vaihteluille myös muita selittäviä tekijöitä (esim. pesut, ajotavat, seisokit). Vaikeimmat asiat projektin kannalta olivat sopivien ja todellisuutta vastaavien kasvatusalustojen tekeminen, todellisuutta vastaavien kasvuolosuhteiden luominen laboratoriokasvatuksissa sekä mikrobiologinen monimuotoisuus paperikoneilla. Jälkimmäisestä syystä laboratoriokokeiden perusteella tehtyjen mallien relevanssi ja käytäntöön soveltuvuus ovat melko vaatimattomat. Projektin yhtenä pullonkaulana oli tiedon saanti kiertoveden konsentroitumisesta; mitkä aineet todella konsentroituvat kiertoveteen ja mitkä eivät. Mikrobien kasvatuksissa käytetty kiertovesikonsentraatti oli vain approksimaatio siitä, millaiseksi paperikoneen kiertovesi kiertoa suljettaessa konsentroituisi. Jatkossa tutkimuksia kannattaisi tehdä mahdollisuuksien mukaan myös paperikoneella ja käyttäen koneiden vesiä. Paperikoneiden mikrobiologian tutkimiseen ja mallintamiseen tarvitaan parempia mikrobien mittaus- ja tunnistusmenetelmiä. Nykyiset määritysmenetelmät eivät ole riittävän tarkkoja ja spesifisiä. Lisäksi mikrobiologisia määrityksiä tehdään suhteellisen harvoin ja off-line. Eri mikrobien, esim. tiettyjen haittamikrobien mittaamiseksi tarvittaisiin spesifisiä menetelmiä. Asiasanat: mikrobien kasvu, paperikoneen kiertovesi

8 Sisällysluettelo Esipuhe Tiivistelmä 1. Projektin tausta 1. Tavoite 3. Toteutus 3.1 Mallipaperikoneiden valinta 3. Mallimikrobien valinta 3.3 Kiertovesi mikrobien kasvualustana Mikrobien kasvatus laboratoriossa Mallituskoesarja laboratoriossa Tehdasdatan analysointi Fermentoripullokasvatusdatan analysointi 5 4. Tulokset Mikrobien kasvuolosuhteet mallipaperikoneilla Mallipaperikoneiden on-line-mittaukset Mallipaperikoneilta haettujen näytteiden analyysit 7 4. Keinotekoisen kiertovesiuutoksen valmistus Mikrobien esikasvatuskokeet Mikrobien kasvuolosuhdevaatimusten määrittäminen Acinetobacter lwoffii Acinetobacter baumannii Bacillus coagulans Mikrobien ravinnevaatimusten määrittäminen Acinetobacter lwoffii Bacillus coagulans Esikokeet fermentoripulloissa Yhteenveto esikasvatuskokeista Mallituskoesarja laboratoriossa Koesuunnitelma mallituskoesarjalle Mallituskoesarjan tulokset Acinetobacter lwoffii Bacillus coagulans Yhteenveto mallituskoesarjoista Teollisuusdatojen analysointi Neutraali paperikone Tehtaalta saatu data Datan esikäsittely Mallitus 4

9 MLR-malli perälaatikon mikrobitasolle PLS-malli perälaatikon mikrobitasolle PLS-malli paperikoneen märän pään mikrobitasolle Hapan paperikone Tehtaalta saatu data Datan esikäsittely Mallitus Viirakaivon malli Perälaatikon MLR-malli Perälaatikon PLS-malli Kokonaismalli Kokonaismalli + kaoliinin mikrobipitoisuus input-muuttujana Yhteenveto teollisuusdatojen analysoinnista Fermentoripullokasvatusdatojen analysointi Acinetobacter lwoffii kasvatukset A. lwoffiin kasvua kuvaavat tunnusluvut Tilastolliset monimuuttujamallit A. lwoffii kasvatusten tunnusluvuille Bacillus coagulans kasvatukset B. coagulansin kasvua kuvaavat tunnusluvut Tilastolliset monimuuttujamallit B. coagulans kasvatusten tunnusluvuille Yhteenveto fermentoripullokasvatusdatojen analysoinnista Projektin tulosten hyödyntämissuunnitelma 54 Viitteet 55 Liitteet 1-3: Acinetobacter lwoffii kasvatusdatoista laskettujen tunnuslukujen väliset riippuvuudet Liitteet 4-5: Acinetobacter lwoffii kasvatusten tunnuslukujen mallitus Liitteet 6-1: Bacillus coagulans kasvatusdatoista laskettujen tunnuslukujen väliset riippuvuudet Liite 11: Bacillus coagulans kasvatusten tunnuslukujen mallitus Liite 1: Tilastolliset regressiomallit

10 PAPERIKONEEN KIERTOVESIEN KONSENTROITUMISEN VAIKUTUS MIKROBIEN KASVUUN 1 Terhi Ylöstalo, Katri Salonen, Matti Siika-aho, Sonja Suni, 1 Heikki Hyötyniemi, 1 Hannes Rauhala, 1 Heikki Koivo 1 Teknillinen korkeakoulu, Systeemitekniikan laboratorio Konemiehentie, 15 Espoo Puh: , Fax: terhi.ylostalo@hut.fi VTT Biotekniikka Tämä loppuraportti sisältää projektin toteutuneet toimenpiteet ja tärkeimmät tulokset ajalta Tutkimustulokset julkaistaan myös TEKES:in CACTUS- Vähävetinen paperinvalmistus-teknologiaohjelman loppuraportissa (CD-levy). 1. Projektin tausta Paperikoneen kiertovesiin liuennut orgaaninen materiaali on peräisin kuiduista sekä paperinvalmistuksen päällystys- ja lisäaineista. Näiden koostumus riippuu käytetyistä raakaaineista ja prosesseista. Paperikoneeseen muodostuva mikrobifloora riippuu mikroorganismeille käyttökelpoisista yhdisteistä ja paperikoneen olosuhteista, kuten ph:sta ja lämpötilasta. Voimakkaimmin esiintyvien mikrobikontaminaatioiden tyyppiin vaikuttavat myös erityiset kontaminaatioiden lähteet sekä niiden kasvua suosivat olosuhteet. Mikrobien keskinäiseen kilpailuun ja esim. erityisen haitallisten organismien esiintymiseen vaikuttavat eri substraattien konsentraatiot, kuten hiilen- ja typenlähteet sekä esim. metalliionien pitoisuudet. Ne organismit, jotka pystyvät vallitsevissa olosuhteissa tehokkaimmin hyödyntämään näitä kasvuunsa ja lisääntymiseensä, pääsevät vallalle paperikoneessa. Paperikoneen olosuhteet vaikuttavat oleellisesti mikrobikontaminaatioiden laatuun ja mikrobitoiminnan mahdollisesti aiheuttamiin haittoihina. Voimakkaat mikrobikontaminaatiot voivat aiheuttaa vakavia ongelmia sekä paperikoneen ajettavuuteen että tuotteiden laatuun. Systeemitekniikan laboratorio on ollut aktiivisesti mukana CACTUS-teknologiaohjelmassa. Joulukuun 1997 lopussa päättyi projekti Monivaiheinen ph:n säätöstrategia painopaperin valmistuksessa ja vuosina laboratoriolla on ollut CACTUS-ohjelmassa kaksi projektia: Paperikoneen kiertovesien konsentroitumisen vaikutus mikrobien kasvuun ja Dynaamisen kemiallisen tilan mallintaminen paperikoneen yksikköoperaatioissa. Edellinen projekteista oli yhteishanke VTT Biotekniikan kanssa ja sen tavoitteena oli paperikoneen mikrobiologisen tilan mallittaminen ja jälkimmäinen yhteishanke VTT Kemiantekniikan kanssa ja tavoitteena oli paperikoneen kemiallisen tilan mallittaminen. Yhteistä hankkeille oli se, että kokeiden ja mallituksen avulla pyrittiin hakemaan optimiolosuhteita, jossa kiertovesien konsentroitumisesta johtuvat haittavaikutukset pystyttäisiin minimoimaan. 1

11 . Tavoite Projektin tavoitteena oli selvittää mikrobien kasvatuskokeiden ja mallituksen avulla kiertovesien konsentroitumisasteen ja muiden olosuhteiden (ph, lämpötila) vaikutusta kontaminanttien kasvuun ja niiden esiintymisen hallintaan paperikoneilla sulkeutumisasteen kasvaessa. 3. Toteutus Paperikoneiden kiertovesien sulkeutumisasteen kasvaessa todennäköistä on, että prosessin lämpötila nousee, ravinteiden määrä lisääntyy, veden happipitoisuus laskee ja korroosio lisääntyy. Tärkeimpien muuttujien vaikutusta paperikonemikrobien kasvuun voidaan tutkia laboratoriossa vakioiduissa olosuhteissa. Paperikoneella erilaisten muuttujien vaikutusta on paljon vaikeampi havaita, koska systeemi on monimutkainen, tarkkojen mittausten suorittaminen usein hankalaa ja ajo-olosuhteet ja -tilanteet vaihtelevat. 3.1 Mallipaperikoneiden valinta Projektin ohjausryhmätyöskentelyyn osallistuneet yritykset valitsivat tehtailtaan tutkimuksen kohteeksi kaksi erityyppistä malli paperikonetta, ph-arvoltaan neutraalin koneen (myöhemmin PK1) ja ph-arvoltaan happaman koneen (myöhemmin PK). Valitut paperikoneet poikkesivat toisistaan paitsi ph-arvoltaan myös osin raaka-aineiltaan. Lisäksi kummaltakin valitulta paperikoneelta oli jo olemassa aiempaa tietoa koneiden mikrobiologiasta. Mikrobien kasvuolosuhteiden kartoitusta varten paperikoneilta saatiin mittaustietoja lämpötiloista ja ph:sta. PK1:ltä saatiin lisäksi johtokyky- ja redox-potentiaalimittauksia aikaväliltä Kummaltakin paperikoneelta myös haettiin näytteitä prosessin eri kohdista (ks. Tulokset ). Tehtailla mittausanturit on sijoitettu kiinteästi prosessien tiettyihin kohtiin, joten ne eivät anna kuvaa koko prosessin tilanteesta. Mittauksista saatuja ph- ja lämpötila-alueita pidettiin suuntaa-antavina mikrobien kasvatuskokeita suunniteltaessa, mutta myös niitä matalampia ja korkeampia arvoja testattiin. 3. Mallimikrobien valinta Paperikoneilta löytyneet mikro-organismit ovat suurimmaksi osaksi aerobisia ja anaerobisia bakteereja sekä sieniä. Paperikoneelle mikrobit tulevat ilman, tuoreveden, puuraaka-aineen ja paperinvalmistuskemikaalien mukana. Seuraavassa on lueteltu yleisimpiä paperikoneilla tavattuja mikrobilajeja (Väisänen 1991): Yleisimmät bakteerilajit: Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, Flavobacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Coryneforms, Micrococcus, Sphaerotilus, Desulphovibrio. Yleisimmät sienet: Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Geotrichum, Mucor, Rhizopus, Trichoderma, Phoma.

12 Metsä-Serla Oy:n Kirkniemen paperikoneilta on eristetty 39 aerobista bakteerilajia (Väisänen et al 1998), joista 86% pystyttiin identifioimaan. Yleisimmät bakteerit paperikoneen märässä päässä olivat Bacillus coagulans ja muut Bacillus-lajit, Burkholderia cepacia, Ralstonia pickettii ja Deinococcus, Aureobacterium ja Brevibacterium lajit. Paperivalmistuskemikaaleista ja eri prosessipintojen limoista löydettiin edellisten lisäksi mm. Bordella, Hydrogenophaga, Klebsiella pneumoniae, Pantoea agglomerans, Pseudomonas stutzeri, Staphylococcus, Sphingomonas, Acinetobacter, Methylobacterium ja Microbulbifer lajeja. Tehtaita edustavat mikrobiologit valitsivat laboratoriokasvatuksia varten mallimikrobit, jotka edustavat paperikoneilta aikaisemmin havaittuja ja eristettyjä valtalajeja. Mallimikrobeiksi valittiin Acinetobacter lwoffii ja Bacillus coagulans. Neutraaleista olosuhteista (PK1) on eristetty kaksi Acinetobacter-lajia: A. baumannii ja A. lwoffii. A. lwoffii valittiin tähän tutkimukseen mallimikrobiksi tehtyjen esikokeiden perusteella. Happamalle koneympäristölle tyypillinen B. coagulans on aiemmin eristetty Kirkniemen tehtaalta (Väisänen O. et al., 1998) ja tutkimuksessa käytetty kanta saatiin Helsingin yliopistolta. Akinetobakteerien kasvun lämpötilaoptimi on C (Balows et al 199). Yleensä ne käyttävät hiilenlähteenään esimerkiksi asetaattia tai etanolia eikä glukoosia, joka on tavallisin mikro-organismien hiilenlähde. Asetaattia tulee paperikoneelle sekä puusta että joidenkin mikrobien aineenvaihduntatuotteena. Akinetobakteerit pystyvät hajoittamaan myös pitkäketjuisia hiiliyhdisteitä kuten esimerkiksi kapraattia sekä rengasrakenteisia hiiliyhdisteitä (fenoleja). Ne pystyvät elämään yksinkertaisella suola-alustalla, eivätkä vaadi esimerkiksi vitamiineja tai aminohappoja kasvaakseen. Akinetobakteerien muodostamat pesäkkeet ovat usein limaisia. Akinetobakteereita tavataan yleisesti paperikoneilla, maaperässä, vedessä ja jätevesissä. Bacillus coagulans -bakteeri kestää korkeita lämpötiloja, jotkut kannat kasvavat vielä 65 C lämpötilassakin, optimilämpötilan ollessa 5-55 C (Balows et al 199). Se on itiöivä ja itiöt säilyvät vahingoittumattomina paperikoneen kuivausosan lämpötiloissa. B. coagulans käyttää hiilenlähteenään glukoosin lisäksi myös muita sokereita ja se tuottaa amylaasientsyymiä, jonka avulla se voi hajottaa tärkkelystä glukoosiksi. 3.3 Kiertovesi mikrobien kasvualustana Tehtailta haettiin kiertovesinäytteitä kahteen otteeseen (toukokuu ja kesäkuu 98) prosessien eri kohdista ja näytteet analysoitiin (ks. Tulokset). Tehdasvesiä ei käytetty mikrobien kasvatusalustoiksi tässä tutkimuksessa. Tähän oli syynä kuljetus- ja säilytysongelmat, tehdasvesien sisältämät bakteerit ja biosidijäämät sekä kokeiden toistettavuuden heikkeneminen tehdasveden laatuvaihtelujen myötä. Kasvatusalustoja varten valmistettiin keinotekoista kiertovettä mallipaperikoneiden raaka-aineista yksinkertaistettujen reseptien mukaan. Keinotekoista kiertovettä valmistettiin uuttamalla massaa ja hylkypaperia veden kanssa ja suodattamalla uutosta viirakankaan läpi. Aluksi vettä yritettiin myös kierrättää, mikä osoittautui laboratorio-olosuhteissa ilman erikoislaitteita liian tehottomaksi. Useita erilaisia massareseptejä kokeiltiin ja onnistumista mitattiin vertaamalla keinotekoisen veden analyysituloksia tehtailta haettuihin vesiin. Suurin vaikeus keinotekoisen kiertoveden 3

13 valmistamisessa oli se, että vaikka käytetyt raaka-aineet olivat samat kuin tehtaalla, laboratorio-olosuhteissa ei voitu riittävästi jäljitellä sitä prosessia, jonka massa ja vesi käyvät läpi paperikoneella. Keinotekoisen kiertoveden valmistukseen käytettiin suunniteltua enemmän resursseja, koska katsottiin, että mahdollisimman oikeanlainen ja todellisuutta hyvin vastaava kasvatusalusta on mikrobikasvatuskokeiden onnistumiselle ensiarvoisen tärkeä. Kasvatusalustan komponenttina käytetyn keinotekoisen kiertoveden valmistuksesta enemmän kohdassa Tulokset. 3.4 Mikrobien kasvatus laboratoriossa Mikrobien esikasvatuskokeet aloitettiin loppukesästä Ne käsittivät mikrobien elvytyksen ja alustavat kokeet joissa selvitettiin, miten valitut mikrobit saadaan laboratorioolosuhteissa kasvamaan. Lisäksi selvitettiin missä lämpötila- ja ph-alueilla mikrobit pystyvät kasvamaan, kartoitettiin mikrobien ravinnevaatimuksia sekä määritettiin lämpötila- ja phoptimit. Mikrobien esikasvatuskokeissa todettiin mm., että lämpötilalla ja ph:lla on yhteisvaikutuksia mikrobien kasvuun. Esikasvatuskokeiden tulokset on esitetty kohdassa Tulokset. Mikrobien esikasvatuskokeissa mallimikrobien kasvuolosuhteiden ph- ja lämpötilarajoja tutkittiin Bioscreen-laitteistolla (Labsystems Oy). Kyseisellä laitteistolla voidaan tehdä useita kasvatuksia samanaikaisesti yhdessä lämpötilassa kerrallaan. Laitteessa on kasvatuskuoppaa ja yhden kasvatuskuopan koko on 4 µl. Laitteistolla voidaan mitata ainoastaan sameuden muutosta käyttäen kirkkaita kasvatusalustoja, joten laitteistoa ei voitu käyttää varsinaisten mallituskokeiden tekemiseen. Sonja Sunin diplomityö Mikrobien kasvu paperikoneen prosessivesissä valmistui Työssä on tarkat kuvaukset mikrobien esikasvatuskokeista ja kasvatusalustojen valmistuksesta (Suni 1999). 3.5 Mallituskoesarja laboratoriossa Mallituskoesarjan kasvatukset aloitettiin loppukesästä 1999 ja ne kestivät huhtikuulle. Kasvatukset tehtiin ns. fermentoripulloissa. Fermentoripullo (ks. kuva 7) on steriloitu laboratoriopullo, jonka korkissa on läpiviennit sisääntulevalle ilmalle, ulostuleville kaasuille ja näytteenotolle. Sisääntulevan ilman määrä on säädettävissä ja mitattavissa rotametrillä ja ulostulevan kaasun koostumus voidaan mitata massaspektrometrillä. Näytteenotto ei häiritse kasvatusta, koska se voidaan tehdä aseptisesti korkkia aukaisematta. Pullot olivat koko ajan lämpöhauteessa ja niiden sekoitus tapahtui magneettisekoittimen avulla. Fermentoripulloissa kasvatukset voitiin tehdä pienemmässä tilavuudessa kuin fermentoreissa, joten oli mahdollista säästää alustakomponenttina käytettävää kiertovettä, jonka valmistus oli melko työlästä. Fermentoripullokasvatuksia tehtiin yhtä aikaa neljä rinnakkaista pulloa (koska vesihaude oli yhteinen, kasvatukset tehtiin samassa lämpötilassa). Fermentoripullokasvatuksista saatiin dataa staattista mallitusta varten, mutta dynaamiseen mallitukseen tarvittaisiin jatkuvatoimisia fermentorikasvatuksia. Mallituskoesarjan koesuunnitelma sisälsi fermentoripullokasvatusta/mikrobi. Koesuunnitelma on esitetty kohdassa Tulokset. Ennen varsinaista mallituskoesarjaa tehdyissä alustavissa fermentoripullokasvatuksissa kokeiltiin kahta eri keinotekoisen kiertovesiuutteen pitoisuutta kasvatusalustassa. Käytetty 4

14 kiertovesiuutos valmistettiin uuttamalla tehtaiden raaka-aineita vedellä ja pakkaskuivaamalla uutos. Tarkempi selostus kasvatuksista on esitetty kohdassa Tulokset. 3.6 Tehdasdatan analysointi Tehdasdatan analysoinnin tarkoituksena oli tutkia voisiko paperikoneilla olemassaolevia online-mittauksia ja tietyin väliajoin tehtäviä mikrobimäärityksiä käyttää mikrobitason ennustamiseen paperikoneen märässä päässä. Tehdasdataa saatiin kesän 99 kuluessa tutkimukseen valituilta paperikoneilta. Tehtailta saatujen on-line-mittausten (mm. lämpötila, ph, johtokyky) ja perälaatikon sekä paperikoneen märän pään mikrobimäärien välille muodostettiin mallit käyttämällä monen muuttujan lineaarista regressiota (MLR) ja PLS (Partial Least Squares)-menetelmää. Käytetyistä menetelmistä PLS ottaa huomioon myös muuttujien keskinäisen korrelaation. Tarkemmat esitykset kyseisistä menetelmistä on esitetty liitteessä 1. Mallien hyvyyttä tutkittiin ristivalidoinnilla. Ristivalidoinnissa yksi mittauspiste jätetään vuorollaan pois ja estimoidaan mallin parametrit jäljellä olevien mittauspisteiden avulla. Seuraavaksi lasketaan mallin ulostulo (joka on tässä tapauksessa mikrobien määrä) sekä erotus mallin ulostulon ja todellisen mittauksen välillä ko. mittauspisteessä. Tulokset on esitetty kohdassa Tulokset. 3.7 Fermentoripullokasvatusdatan analysointi Fermentoripullokasvatuksista kerätyistä mittauksista laskettiin mikrobien kasvua kuvaavia tunnuslukuja. Suoraa mittausta, joka olisi kertonut mikrobien määrän, ei ollut käytettävissä, koska itse kasvatusalustan sameuden takia kuiva-ainemääritystä tai sameusmittausta ei voitu käyttää tähän tarkoitukseen. Kiertovesiuutteessa olevat ainesosat häiritsivät myös useita epäsuoria solumassan määritysmenetelmiä. Kasvuolosuhteiden (lämpötilan, ph:n ja kasvatusalustan kiertovesikonsentraation) vaikutusta kasvua kuvaaviin tunnuslukuihin tutkittiin mallituksen avulla. Acinetobacter lwoffii A. lwoffii kasvatusdatoista laskettiin seuraavat kasvua kuvaavat tunnusluvut: Asetaatin kulutusnopeus (asetaattimittauksiin sovitetun suoran kulmakerroin) ph:n nousunopeus (ph-mittauksiin sovitetun suoran kulmakerroin) Lisäksi sovitettiin sameus- ja ATP-mittauksiin 1. tai. asteen polynomiyhtälö pienimmän neliösumman menetelmällä. Kolmannen asteen yhtälöä ei kokeiltu siinäkään tapauksessa, että toisen asteen yhtälön sovitus ei antanut tyydyttävää tulosta, koska datapisteiden vähyyden vuoksi kolmannen asteen yhtälössä on liian paljon estimoitavia parametreja. 1. ja. asteen mallien sovituksen hyvyyttä tarkasteltiin R -arvon avulla, joka kertoo paljonko todellisen ulostulon vaihtelusta malli selittää. 5

15 Selitysaste R : R = n ( yˆ j y) j= 1 n ( yj y) j= 1, missä n = havaintojen määrä, y j = mittaus hetkellä j (todellinen ulostulo), y = mittausten keskiarvo ja y ˆ j = mallin antama ulostulo hetkellä j. R -arvo ei yksinään kerro sitä, miten käyttökelpoinen malli on. Tässä työssä 1. ja. asteen malleja käytettiin vain kasvatusten tunnuslukujen laskemiseen. Hiilidioksidimittausten tuloksia ei käytetty tunnuslukujen laskemiseen mittausepävarmuuksien takia. A. lwoffiin kasvatusliuosten ph oli useimmissa tapauksissa yli 7. Koska hiilidioksidista muodostuu karbonaatti-ioneja liuoksen ph ollessa yli 7, kaikki hiilidioksidi ei käytetyissä olosuhteissa vapaudu kaasuna ulostulevaan ilmaan. Tällöin syntyneen CO :n määrää ei voida mitata luotettavasti. Lag-ajat eli kasvun alkamisen viiveet siirrostamisen jälkeen määritettiin kuitenkin hiilidioksididatasta, joskin muutamissa kasvatuksissa hiilidioksidimittaukset epäonnistuivat ja tarkkaa lag-vaiheen pituutta oli vaikea määrittää luotettavasti. Useimmissa A. lwoffii kasvatuksissa havaittiin, että kasvu tapahtui kahdessa vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa mikrobit käyttivät ilmeisesti hiililähteenään joitain kasvatusalustan komponentteja ja lisäksi jonkin verran asetaattia ja toisessa vaiheessa pääosin asetaattia. Tunnusluvut laskettiin näille vaiheille erikseen (ks. Tulokset). Bacillus coagulans B. coagulans kasvatusdatoista laskettiin seuraavat kasvua kuvaavat tunnusluvut: Glukoosin kulutusnopeus (glukoosimittauksiin sovitetun suoran kulmakerroin) ph:n laskunopeus (ph-mittauksiin sovitetun suoran kulmakerroin) lag-aika (lag arvioitiin hiilidioksimittauksista. Tarkkaa lag-aikaa ei datasta voitu määrittää, sillä näytteenottoväli oli pitkähkö ja se vaihteli jonkun verran eri kasvatuksissa. Datasta määritettiin se näytteenottoväli, jolla todellinen lag-arvo oli, ja mallituksessa käytettiin lag-aikana näin määritetyn aikavälin keskipistettä.) Poistokaasun hiilidioksidipitoisuuden maksimi (korkein hetkellinen CO -pitoisuus, joka mitattiin) Poistokaasun hiilidioksidipitoisuus, kun puolet glukoosista oli kulunut (Määritettiin siten, että glukoosikäyrästä haettiin se ajanhetki, jolloin puolet käytettävissä olevasta glukoosista oli kulunut. Hiilidioksididatasta saatiin vastaavalle ajanhetkelle hiilidioksidipitoisuuden arvo laskemalla se CO -käyrään sovitetusta 1. tai. asteen yhtälöstä.) 6

16 Lisäksi sameus- ja ATP-mittauksiin sovitettiin 1. tai. asteen yhtälö (kuten A. lwoffii:n tapauksessa). Kaikki yhtälöiden sovitukset tehtiin kasvatusten eksponentiaalivaiheen datoille. Kaikille malleille laskettiin R -arvot (ks. Tulokset). B. coagulans kasvatuksissa hiilidioksidin mittaus toimi paremmin kuin A. lwoffii kasvatuksissa, joten sen tuloksia käytettiin tunnuslukujen laskemiseen. Sekä A. lwoffii- että B. coagulans-kasvatuksista laskettujen tunnuslukujen vaihtelua kasvuolosuhteiden funktiona pyrittiin mallittamaan käyttämällä tilastollisia monimuuttujaanalyysimenetelmiä: monen muuttujan lineaarista regressiota (Multiple Linear Regression = MLR), pääkomponenttiregressiota (Principal Component Regression = PCR), PLSmenetelmää (Partial Least Squares) ja kanonista korrelaatioregressiota (Canonical Correlation Regression = CCR). Kolme viimeisintä soveltuvat käytettäviksi erityisesti silloin, kun (input)muuttujia on paljon ja ainakin osa niistä korreloi toistensa kanssa. Tässä työssä inputmuuttujat ovat säätömuuttujia (lämpötila, ph ja kasvatusalustan kiertovesikonsentraatio), joille annetaan tietyt asetusarvot. Ne eivät korreloi toistensa kanssa. Sen sijaan osa outputmuuttujista (tunnusluvut) korreloivat toistensa kanssa (ks. Tulokset). Liitteessä 1 on lyhyesti selitetty mallituksessa käytettyjen menetelmien pääpiirteet. 4. Tulokset 4.1 Mikrobien kasvuolosuhteet mallipaperikoneilla Projektin mallipaperikoneiden ajo-olosuhteet ja raaka-aineet poikkeavat toisistaan. PK1:n pääraaka-aineena on kuusihioke ja täyteaineena kalsiumkarbonaatti. Sideaineina käytetään mm. tärkkelystä, lateksia ja karboksimetyyliselluloosaa. PK1:n keskimääräinen ajolämpötila on 5 C ja ph 7.4. PK käyttää ECF-valkaistua sellua ja lisäksi hioketta, täyteaineena on kaoliini ja sideaineena tärkkelys ja karboksimetyyliselluloosa. PK:n keskimääräinen ajolämpötila on 5 C ja ph Mallipaperikoneiden on-line-mittaukset Mikrobien kasvuolosuhteiden kartoitusta varten paperikoneilta saatiin mittaustietoja lämpötiloista ja ph:sta. PK1:n mittaustiedot olivat perälaatikosta ja nollavedestä ja PK:n viiravedestä. PK1 on selkeästi neutraali kone: ph vaihteli, mittauspaikasta riippuen, välillä Lämpötilavaihtelu, myös mittauspaikasta riippuen, oli välillä C. PK1:llä tehtiin lisäksi Biosensor-laitteistolla johtokyky- ja redox-potentiaalimittauksia aikaväliltä Redox-potentiaalin tyypillinen vaihteluväli oli n. 1 mv - +1 mv (huom. valkaisuun käytetään ditioniittiä) ja johtokyvyn 7-1 µs/cm. PK:lla ph:n vaihteluväli oli ja lämpötilavaihteluväli (mittaukset olivat tunnin keskiarvoja) Mallipaperikoneilta haettujen näytteiden analyysit Prosessin eri vaiheista otetuista tehdasnäytteistä mitattiin: kuiva-aine, ph, johtokyky, monosakkaridit, orgaaniset hapot, polysakkaridit, absorptiospektri (-1 nm) sekä eräiden metallien pitoisuudet. Näytteet joko laskeutettiin mittalasissa yön yli (+4 C) tai lingottiin kevyesti (5 g, 3 min), koska näytteistä haluttiin säilyttää sekä liukoinen että kolloidaalinen osa. 7

17 Tehdasnäytteistä ei löytynyt monosakkarideja tai niiden määrät olivat hyvin pieniä (enimmillään 4-5 mg/l). Polysakkarideja oli 5-3 mg/l ja orgaanisia happoja 3-83 mg/l (ks. taulukko 1). PK:n näytteistä löytyi enemmän ravinteita kuin PK1:lta. Tehdasnäytteiden tuhkapitoisuudet olivat 7-8 %, eli suurin osa näytteiden kuiva-aineesta oli epäorgaanista ainesta. Taulukko 1. Tehdasnäytteiden (toukokuu 98) mono- ja polysakkaridipitoisuudet sekä orgaanisten happojen määrä. monosakkaridit g/l polysakkaridit g/l maitohappo g/l muurahaishappo g/l etikkahappo g/l PK1 Hioke -, <,,4,11 (neutr.) Konesäiliö -, Kokonaishylky -, vesi -,5 <, <,,3 Viirakaivovesi -,5 <, <,,3 PK Kiertovesi,3/,4,16 <,,3,41 (hapan) Viirakaivo -/,4,17 <,,3,4 Kirkassuodos -,18 <, <,,3 Konemassa,/,5, Hioke,4/,5,3 <,,11,83 (glukoosi/arabinoosi) 4. Keinotekoisen kiertovesiuutteen valmistus Keinotekoinen kiertovesiuute (KV-uute) valmistettiin molempien mallipaperikoneiden omista raaka-aineista yksinkertaistettujen reseptien mukaisesti. KV-uutteen raaka-aineina käytettiin hioketta (PK1) tai hierrettä (PK) sekä mm. hylkypaperia, kaoliinia, kipsiä ja kalsiumkarbonaattia. Komponentteja sekoitettiin + 6 ºC lämpötilassa kolme tuntia ja suodatettiin viirakankaan läpi. Suodos pakkaskuivattiin. Keinotekoisen kiertoveden valmistamiseksi testattiin eri reseptejä ja uuttomenetelmiä sekä mm. kiertoveden kierrätystä laboratorio-olosuhteissa. Tulosten perusteella päädyttiin KVuutteeseen, joka valmistettiin uuttamalla mallipaperikoneiden mekaanista massaa ja hylkypaperia kolmen prosentin sakeudessa. Eri menetelmin valmistettuja kiertovesiä verrattiin tehdasnäytteisiin (ks. taulukko ). 8

18 Taulukko. Tehdasnäytteiden (toukokuu 98) ja eri uuttojen happamuus, johtokyky, haihdutusjäännös, polysakkaridipitoisuus (ka = kuiva-aine) ja absorbanssi aallonpituudella 8 nm. ph Κ Kuivapaino Polysakkaridit A 8 ms/cm g/l g/l %-ka PK1 (neutr.) Viirakaivovesi 8,1 1,5 1,4,5 3,8 1, -vesi 8, 1,4 1,,5 4,,8 3%-uutto (I) 8,,3,4,5 11,6,1 3%-uutto (II) 7,9,,3,4 13,6 1,4 3%-uutto (III) 8,4,,5,8 15,4,9 PK (hapan) Kiertovesi 5,6 6,4 7,3,16, 5,8 Viirakaivovesi 5,5 6,4 7,4,17,3,8 Kirkassuodos 5,5 4,5 5,6,18 3, 3,7 3%-uutto (I) 5,1,3 3,1,33 1,7 3, 3%-uutto (II) 5,,,6,31 11,7 3, 3%-uutto (III) 5,4, 1,4,37 6,5 7,8 Uutto I = veden kierrätys laboratoriossa; raaka-aineina mekaaninen massa, hylkypaperi, mineraalit Uutto II = kertauutto; raaka-aineina mekaaninen massa, hylkypaperi, mineraalit Uutto III = kertauutto, raaka-aineina mekaaninen massa ja hylkypaperi Mekaanisesta massasta ja hylystä valmistetun kiertoveden kuiva-ainesaanto oli PK1:n raakaaineilla.5 g/l ja PK:n 1.4 g/l. Absorbanssit aallonpituudella 8 nm olivat.9 ja 7.8. Happamuudet vastasivat todellisen prosessin arvoja, mutta johtokyky oli tässäkin uutossa huomattavasti alhaisempi kuin tehdasnäytteissä. Monosakkaridimäärät jäivät alle määritysrajan. Polysakkaridisaanto (per kuiva-aine) sen sijaan oli PK1:n vesissä noin nelinkertainen ja PK:n vesissä jopa kymmenkertainen verrattuna tehdasnäytteisiin, indikoiden kiertovesikomponenttien parempaa retentiota kuituun paperikoneolosuhteissa. Kiertovesiuutteiden metallipitoisuudet vastasivat osittain tehdasarvoja (ks. taulukko 3). 9

19 Taulukko 3. Tehdasnäytteiden (kesäkuu 98) ja uutto-iii:n metallipitoisuudet suhteutettuna kuiva-aineeseen Na K Ca Mg Fe Zn Cu Mn Ni mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g PK1 (neutr.) viirakaivovesi 19,4 83, vesi 1,6 83, hioke 138, 49 1, ,31-3%-uutto (III) 43,6 169, PK (hapan) kiertovesi 157,9 75,1,49,8 -,44,1 viirakaivo 154,9 73,1,49,8 -,46,1 kirkassuodos 148 4, 73,5,65,1 -,65,1 hioke -,4 44 1,8,46,6 -,39,1 3%-uutto (III) 14 6, 7,,58, = alle määritysrajan Suolojen konsentraatiot paperikoneilla ovat pitkän tasapainoprosessin tulos. Prosessia, jonka massa ja vesi käyvät läpi paperikoneella, ei voida täysin jäljitellä laboratorio-olosuhteissa ilman erikoislaitteita. Tästä johtuen monet komponentit, jotka paperikoneella sitoutuvat puukuituihin, jäivät laboratorio-olosuhteissa veteen. Mineraalien pitoisuuteen vaikutti myös käytetty hylkypaperi. Työssä käytetyillä analyyseillä löydettiin vain osa epäorgaanisesta aineksesta. Varsinaisessa kasvualustassa keinotekoinen kiertovesiuute oli yhtenä alustakomponenttina. Tällöin kiertovesiuutteen määrää voitiin vaihdella ja tutkia sen vaikutusta. Uutteesta saatiin lähinnä puuperäiset aineet, täyteaineet, liimat ja pastakomponentit, joita liukenee paperinteon aikana vesiin. 4.3 Mikrobien esikasvatuskokeet Esikokeissa tutkittiin mallibakteerien lämpötila- ja ph-rajoja, ravinnevaatimuksia sekä kehitettiin bakteereille kasvualusta, jossa yhtenä komponenttina oli mekaanisesta massasta ja hylkypaperista uutettu pakkaskuivattu kiertovesikonsentraatti. Bakteerit oli eristetty kahdelta eri tehtaalta, joten kullekin kannalle valmistettiin oma kiertovesikonsentraattinsa ko. paperikoneen raaka-aineista. Tarkoituksena oli löytää kasvatusalusta, jossa on mukana kiertovesikomponentteja ja jolla tutkittavat mikro-organismit kasvavat hyvin, mutta joka oli kuitenkin mahdollisimman yksinkertainen. Kasvuolosuhdevaatimukset ja kasvurajat lämpötilan sekä kasvualustan ph:n suhteen tutkittiin Bioscreen C-laitteella. Bioscreen C-kasvatuslaitteistolla voidaan kasvattaa yhtäaikaa useampia näytteitä ja seurata niiden kasvua alustan samenemisen avulla. Kasvatukset tehtiin rikkailla, puskuroimattomilla alustoilla. 1

20 4.3.1 Mikrobien kasvuolosuhdevaatimusten määrittäminen Acinetobacter lwoffii Acinetobacter lwoffiin (VTT-E-8417) (aiemmin nimetty myös A. calcoaceticus) kasvurajoja tutkittiin Bioscreen C-laitteella lihaliemi kasvualustana (Bacto Nutrient broth, Difco ) lämpötiloissa C, happamuusalueilla 4-1. A. lwoffii kasvoi lämpötiloissa -4 ºC, mutta ei enää lämpötiloissa 45 C ja 5 ºC. Parhaiten A. lwoffii kasvoi lämpötilassa 3 C, jossa se kasvoi myös laajimmalla ph-alueella. A. lwoffii kasvoi kaikissa lämpötiloissa parhaiten ph-välillä (ks. kuva 1). Acinetobacter lwoffii,1 ph A 6 / h, lämpötila ( C) Kuva 1. Sameuden muutos A. lwoffii -kasvatuksissa ( A 6 / h) eri happamuuksissa lämpötilan funktiona Acinetobacter baumannii Verrattaessa Acinetobacter lwoffiin ja Acinetobacter baumanniin (VTT-E-98114) kasvua lihaliemellä eri lämpötiloissa todettiin, että A. lwoffii (kuva 3) pystyi kasvamaan korkeammissa lämpötiloissa kuin A. baumannii (kuva ). Alhaisemmissa lämpötiloissa (+ 3 C) niiden kasvussa ei todettu merkittäviä eroja. A. baumanniin ph-optimi oli selvästi alhaisempi. 11

21 1 A. baumannii, T = 4 C 1 A. lwoffii, T = 4 C A,8,6,4, aika (min) ph 5.5 ph 6. ph 7. ph 8. A,8,6,4, aika (min) ph 6. ph 7. ph 8. ph 9. ph 1. Kuva. A. baumanniin kasvu eri happamuuksissa lämpötilassa 4 C. Kuva 3. A. lwoffiin kasvu eri happamuuksissa lämpötilassa 4 C Bacillus coagulans Bacillus coagulans -bakteeria (VTT-E-98164) kasvatettiin TYD-alustalla (TYD-alusta sisältää tryptonia, hiivauutetta ja dekstroosia). Tässä tutkittiin B. coagulansin kasvua lämpötilavälillä C, ph-alueella 4-9. B. coagulans kasvoi lämpötiloissa 3, 4, 5 ja 55 ºC, tosin lämpötiloissa 3 ja 55 C sameuden kokonaiskasvu oli heikompaa kuin muissa lämpötiloissa. B. coagulansin ph-optimi oli selkeästi lämpötilariippuvainen, korkeammissa lämpötiloissa ph-optimi oli korkeampi. Lämpötilassa 5 C ph-optimi oli (kuva 4). Bacillus coagulans,15 ph A 6 / h,1,5 5 5, lämpötila ( C) Kuva 4. Sameuden muutos Bacillus coagulans -kasvatuksissa ( A 6 / h) eri happamuuksissa lämpötilan funktiona. 1

22 4.3. Mikrobien ravinnevaatimusten määrittäminen Molempien kantojen kasvua testattiin eri hiililähteillä: asetaatilla, glukoosilla, laktoosilla ja maitohapolla. Typen lähteistä testattiin nitraattia ja ammoniumia. Lisäksi tutkittiin hiivauutteen ja eri suolojen lisäyksen vaikutusta kasvuun. Kasvatukset tehtiin ravistelupulloissa, Acinetobacter lwoffii lämpötilassa 3 C, ph 7 ja Bacillus coagulans lämpötilassa 5 C, ph Acinetobacter lwoffii Acinetobacter lwoffii kasvoi laboratorio-olosuhteissa hyvin mineraalialustalla (NH 4 Cl 1., MgSO 4 * 7 H O., CaCl.1, FeSO 4 * 7 H O.5, CoCl * H O.19, ZnSO 4 * 7 H O.7, MnSO 4 * 7 H O.8 g litrassa), asetaatti ainoana hiilenlähteenä. A. lwoffii vaati korkeahkon puskuripitoisuuden (1 mm fosfaatti) kasvualustan happamuuden vakioimiseksi kasvun aikana. Mekaanisesta massasta ja hylkypaperista tehdyn uutteen vaikutusta A. lwoffiin kasvuun tutkittiin mineraalialustalla asetaatti hiilenlähteenä. Vertailualustana käytettiin lihalientä. Pieni määrä (.5 g/l) kiertovesikonsentraattia mineraalialustaan lisättynä nopeutti kasvun käynnistymistä (lyhensi lag-aikaa). Kuva 5 esittää A. lwoffiin kasvua pelkällä lihaliemellä, mineraalialustalla sekä mineraalialustalla, johon lisättiin kiertovesikonsentraattia. 4 3 A(6) aika (h) mineraalialusta + KV mineraalialusta lihaliemi Kuva 5. A. lwoffiin kasvu kolmella alustalla: lihaliemi, mineraalialusta sekä mineraalialusta + kiertovesikonsentraatti (KV) Bacillus coagulans Bacillus coagulans kasvoi hyvin glukoosi hiilenlähteenä. Kokonaiskasvu oli selvästi parempi, kun mineraalialustaan lisättiin hiivauutetta ( g/l). B. coagulans tuotti happoja alustaan kasvun aikana, mikä aiheutti voimakkaan ph:n laskun. Piperatsiinipuskuri toimi B. 13

23 coagulans-bakteerin kasvualueella ph:ssa 4-7. Puskuripitoisuus 1 mm neutraloi riittävän hyvin syntyneet hapot, eikä vaikuttanut kokonaiskasvuun. Lisäksi tutkittiin kiertovesikonsentraatin vaikutusta mineraalialustalla B. coagulansin kasvuun. Alusta sisälsi glukoosia, hiivauutetta ( g/l) sekä suoloja (NH 4 Cl 1., MgSO 4 * 7 H O., CaCl.1, FeSO 4 * 7 H O.5, CoCl * H O.19, ZnSO 4 * 7 H O.7, MnSO 4 * 7 H O.8 g litrassa) piperatsiinipuskurissa (1 mm, ph 5.5). Kiertovesikonsentraatin (1 g/l) lisäys paransi kasvua mineraalialustalla (ks. kuva 6). 4 3 A (6) aika (h) hiivauute-mineraalialusta + KV hiivauute-mineraalialusta TYD-alusta Kuva 6. B. coagulansin kasvu kolmella alustalla: TYD, hiivauute + mineraalialusta sekä hiivauute + mineraalialusta + kiertovesikonsentraatti (KV) Esikokeet fermentoripulloissa Mallibakteerien kasvua verrattiin fermentoripulloissa kahdessa eri kiertovesikonsentraattipitoisuudessa, jotta voitiin varmistaa sopivat kiertovesikonsentraattipitoisuudet mallituskokeisiin. KV-pitoisuudet valittiin siten, että alemman pitoisuuden polysakkaridipitoisuus oli suunnilleen sama kuin mikrobia vastaavan mallipaperikoneen viirakaivoveden polysakkaridipitoisuus. Korkeampi pitoisuus oli kymmenkertainen alempaan pitoisuuteen verrattuna. Kiertovesikonsentraattipitoisuudet olivat A. lwoffiille.3 ja 3 g/l ja B. coagulansille.5 ja 5 g/l. Alustoina käytettiin esikokeiden perusteella rakennettua alustaa, joka sisälsi A. lwoffiilla natriumasetaattia (5 g/l), mineraaleja, fosfaattipuskuria (ph 7., 137 mm) sekä kiertovesikonsentraattia. B. coagulansin alusta sisälsi glukoosia (5 g/l), mineraaleja, hiivauutetta ( g/l), piperatsiinipuskuria (ph 5.5, 1 mm) sekä kiertovesikonsentraattia. A. lwoffiin kasvatuslämpötila oli 3 ºC ja B. coagulansin 5 ºC. 14

24 A. lwoffiin kasvatuksissa havaittiin, että pienemmässä kiertovesikonsentraattipitoisuudessa kasvu alkoi hitaammin kuin korkeammassa pitoisuudessa. Myös hiilidioksidimittausten perusteella bakteeri näytti kasvavan paremmin korkeammassa pitoisuudessa. Sameuden ja kuivapainon määritykset eivät antaneet luotettavia tuloksia. Kiertovesikonsentraatti ei liukene kokonaan alustaan, minkä takia jo kasvun alussa alusta oli samea ja kuivapainokin oli korkea. Lisäksi on mahdollista, että alustaan sameutta aiheuttavat komponentit liukenivat tai flokkuloituivat kasvatusten aikana. Asetaatin kulutusta ja sameusmittausarvoja vertailemalla vaikutti siltä, että A. lwoffii käytti hiilenlähteenään asetaatin lisäksi jotain kiertovesikonsentraatin komponenttia. ph-arvojen muutoksissa ei eri kiertovesikonsentraattipitoisuuksissa ollut juuri eroja. Johtokyvyssä ja fosfaattipitoisuudessa ei ollut kasvatusten aikana selviä muutoksia. B. coagulansin kasvatusten hiilidioksidimittausten perusteella bakteeri näytti kasvavan paremmin alhaisemmassa kiertovesikonsentraattipitoisuudessa. Myös lag-vaihe oli lyhyempi alhaisemmassa pitoisuudessa. Kuivapainon ja sameuden määrityksiä vaikeuttivat samat pulmat kuin A. lwoffiilla. Glukoosin kulutus oli lag-vaiheen jälkeen huomattavasti nopeampaa alhaisemmassa kiertovesikonsentraattipitoisuudessa. ph-arvojen muutoksissa ei ollut juurikaan eroja eri pitoisuuksissa. Johtokyvyssä näkyi pieni kohoaminen kasvun aikana molemmissa pitoisuuksissa, joka johtui todennäköisesti hapon muodostumisesta kasvun aikana. Fosfaattipitoisuuksissa ei ollut muutoksia Yhteenveto esikasvatuskokeista Esikokeissa selvitettiin Acinetobacter lwoffiin ja Bacillus coagulansin ravinne- ja kasvuolosuhdevaatimuksia. A. lwoffii kasvoi rikkaalla alustalla (lihaliemi) lämpötiloissa - 4 C. ph-optimi on välillä 7-9 testatuissa lämpötiloissa. A. lwoffiin optimikasvulämpötila oli niinkin alhainen kuin 3 C. Se käytti hiilenlähteenään asetaattia ja kasvoi hyvin myös kemiallisella alustalla. B. coagulans kasvoi rikkaalla alustalla (TYD) lämpötiloissa 3-55 C. Optimi-pH vaihteli välillä B. coagulans käytti glukoosia hiilenlähteenä, mutta kasvaakseen hyvin se vaati hiivauutelisäyksen kasvatusalustaan. B. coagulans ei kasvanut enää kovin hyvin 55 C:ssa. Fermentoripullokasvatuksissa korkeampi kiertovesikonsentraattipitoisuus paransi A. lwoffiin kasvua ja hidasti B. coagulansin kasvua. Sameuden ja kuivapainon määritykset eivät olleet luotettavia ja kasvun seuraamiseksi päätettiin jatkossa analysoida myös solujen ATP-pitoisuus hiilidioksidimittausten lisäksi. 4.4 Mallituskoesarja laboratoriossa Koesuunnitelma mallituskoesarjalle Esikokeiden perusteella tehtiin erilaisen kasvatuksen koesarja mallibakteereille. Koesarjassa tutkittiin happamuuden, lämpötilan ja KV-uutepitoisuuden vaikutusta. Koesarja koostui kolmen eri tason kokeista. Ns. keskipisteen koe uusittiin neljä kertaa ja muut kaksi kertaa. Kasvatuksista otettiin näytteitä eri aikapisteistä (1-15) joka kasvatuksesta. 15

25 Kerätyistä näytteistä mitattiin: ph, sameus, CO poistokaasusta, kasvualustan glukoosi tai asetaatti (hiilenlähteen kulutus) ja ATP. Solunsisäisen ATP:n mittausmenetelmällä voidaan monitoroida jo hyvin pienet kasvunopeuden muutokset, jotka eivät vielä näy selvästi muissa analyyseissä. Toisaalta ATP:n määrä indikoi sekä solujen määrää että niiden aktiivisuutta ja solujen ATP-pitoisuus riippuu niiden fysiologisesta tilasta. Mm. tästä johtuen mitatut solunsisäiset ATP-arvot vaihtelivat hyvin voimakkaasti joissakin kasvatuksissa. Käytetyt analyysimenetelmät on esitetty taulukossa 4. Kasvatukset tehtiin yhden litran fermentoripulloissa. Kasvatustilavuus oli 7 ml. Korkeissa oli läpiviennit ilmastukselle, ulostuleville kaasuille ja näytteenotolle (ks. kuva 7). Siirroste kasvatettiin Acinetobacterille lihaliemessä ja Bacillukselle TYD-alustalla (tryptoni, hiivauute, dekstroosi) ravistelupullossa. Siirrosteen kasvatus standardoitiin siten, että kasvatuksiin siirrostettava mikrobimäärä pyrittiin pitämään vakiona. Siirrostetta käytettiin sama määrä eri kasvatuksiin ja sen sameus oli aina sama (noin 1 AU, A 6 ). Siirrosteiden kasvatustiedot on esitetty taulukossa 5. Kuva 7. Fermentoripullo 16

26 Taulukko 4. Kasvatusnäytteiden analyysimenetelmät. analyytti menetelmä Glukoosi: Unimate Gluc GDH (Roche ) Asetaatti: HPLC, kolonni: Aminex HPX-87H, T=35 C, eluentti 5mM H SO 4 ATP: Bio-Orbit ATP Biomass Kit (BO ) Sameus: Spektrofotometri (A6) CO: Massaspektrometri Taulukko 5. Siirrosteiden kasvatus Laji lämpötila ( C) sekoitus (rpm) A 6 kestoaika (h) alusta Acinetobacter lwoffii Bacillus coagulans 3,8 11 Nutrient broth, Difco 3 5 1, TYD (tryptoni, hiivauute, dekstroosi) Fermentoripullokasvatuksissa alustojen pohjana oli mineraalialusta, jonka koostumus oli seuraava: NH 4 Cl 1 g/l, KH PO 4 5 g/l, MgSO 4 * 7 H O. g/l, CaCl.1 g/l, FeSO 4 * 7 H O.5 mg/l, CoCl * H O 1.85 mg/l, ZnSO 4 * 7 H O.7 mg/l ja MnSO 4 * 7 H O.8 mg/l. Alustoihin lisättiin komponentteja taulukon 6 mukaan: Taulukko 6. Käytetyt hiilenlähteet, puskurit ja KV-uutteen määrä Laji Hiilenlähde Puskuri KV-konsentraatti Acinetobacter lwoffii Na-asetaatti 5 g/l fosfaattipuskuri 1 mm ks. Taulukko 7. Bacillus coagulans Glukoosi 5 g/l piperatsiinipuskuri 1 mm ks. Taulukko 8. Mikrobit kasvatettiin kolmessa eri lämpötilassa ja happamuudessa, käyttäen kolmea eri kiertovesiuutekonsentraatiota (KV-uute). Lämpötilat ja ph-arvot valittiin mikrobien esikasvatuskokeiden (Bioscreen-kasvatukset) avulla, ottaen huomioon myös paperikoneilla vallitsevat olosuhteet. Koesuunnitelman kolmella muuttujalla lämpötila, ph ja KVuutekonsentraatio oli kolme arvoa: ylätaso (1), alataso (-1) ja keskipiste (). Lämpötilan ja ph:n keskipiste laskettiin normaalisti ylä- ja alatason arvon aritmeettisena keskiarvona. KVuutekonsentraation ylä- ja alatason arvoista laskettiin geometrinen keskiarvo. Mallituskokeiden lämpötilat, happamuudet ja KV-uutteen konsentraatiot on esitetty taulukoissa 7 ja 8. 17

27 Taulukko 7. Acinetobacter lwoffii -mallituskokeiden lämpötilat, happamuudet sekä KVuutteen konsentraatiot. z11 = lämpötila z1 = ph z13 = konsentraatio (g/l) z11(1) = +38 ºC z1(1) = 8. z13(1) =.5 g/l z11(-1) = +3 ºC z1(-1) = 6.6 z13(-1) =.3 g/l z11() = +34 ºC z1() = 7.3 z13() = (log(.5)+log(.3)/) =.87 g/l Taulukko 8. Bacillus coagulans -mallituskokeiden lämpötilat, happamuudet sekä KV-uutteen konsentraatiot. z1 = lämpötila z = ph z3 = konsentraatio (g/l) z1(1) = +54 ºC z(1) = 6. z3(1) = 4.5 g/l z1(-1) = +46 ºC z(-1) = 5. z3(-1) =.5 g/l z1() = +5 ºC z() = 5.6 z3() = (log(4.5)+log(.5)/) = 1.5 g/l Molemmille kannoille tehtiin koetta (ks. taulukko 9). Näissä kokeissa ns. keskipistekasvatuksista tehtiin neljä toistoa, joiden avulla saatiin selville normaalivaihtelu kasvatuksissa. Ylä- ja alarajakasvatuksista tehtiin kaksi toistoa. Projektiin käytettävissä olleen ajan puitteissa ei pystytty satunnaistamaan kokeita, vaan niitä oli tehtävä neljän sarjoissa samassa lämpötilassa (samassa lämpöhauteessa). Tämän vuoksi molemmilla kannoilla tehtiin viisi kappaletta koesarjoja (ks. taulukko 1): Taulukko 9. Kokeet eri muuttujayhdistelmillä (N=1,) koe zn1 zn zn3 koe zn1 zn zn

28 Taulukko 1. Koesarjojen muodostuminen yksittäisistä kokeista Sarja Kokeet Mallituskoesarjan tulokset Sekä Acinetobacter lwoffiin, että Bacillus coagulansin kohdalta jouduttiin muuttamaan alkuperäisiä, esikokeiden perusteella suunniteltuja happamuuksia ja lämpötiloja. Kasvatusten alettua todettiin, että A. lwoffii kasvoi fermentoripullon olosuhteissa vasta ph:ssa 6.6 (suunniteltu alin ph oli 6.). B. coagulans ei taas kasvanut alunperin suunnitellussa ph 4.8:ssa. Uusiksi alatason ph-arvoiksi valittiin A. lwoffiille 6.6 ja B. coagulansille 5.. B. coagulansin kasvu oli erittäin heikkoa suunnitellussa korkeimmassa lämpötilassa 55 C, joten ylintä lämpötila-arvoa muutettiin asteella (uusi ylätaso 54 C). A. lwoffii ei kasvanut suunnitellussa korkeimmassa lämpötilassa 4 ºC, joten ylätasoksi valittiin 38 C Acinetobacter lwoffii A. lwoffii kasvoi parhaiten 3 C lämpötilassa, emäksisissä olosuhteissa. KV-uutteen määrällä ei ollut kovin suurta vaikutusta A. lwoffiin kasvuun. A. lwoffii -kasvusto pyrki tarttumaan kasvatuspullon eri pinnoille - sekä metalliin että lasiin. Tämä vaikeutti näytteenottoa ja mm. sameuden mittausta etenkin korkeassa KV-uutepitoisuudessa. A. lwoffii -kasvatukset vaahtosivat runsaasti nopeimman kasvun aikana (joidenkin Acinetobacter-kantojen on raportoitu tuottavan emulgoivia aineita). Seuraavissa kuvissa on esitetty A. lwoffiin keskipisteen kasvatusten (4 rinnakkaista) sameuden lisääntyminen, substraatin kulutus, hiilidioksidin muodostuminen, syntyneen ATP:n määrä (kuvat 8-11) ja ph:n muutokset (kuva 1) kasvatuksen aikana. 19