SUOMI-FINLAND 1t KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT C 12 k 5/00 Lk./KL 30 h 6 Patenttihakemus Patentansökning 3119/67 Hakemispäivä Ansökningsdag 20 XI 1967 Alkupäivä Giltighetsdag Tullut julkiseksi Blivit offentlig 1 VII 1968 :4) Pantu nähtäväksi Utlagd 1 III 1971 Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och rogisterstyrolson 6 Pyydetty etuoikeus Begärd prioritet 21 XI 1966 Ranska-Prankrike PV 84337 (71) Rhöne-Poulenc S.A., 22 Avenue Montaigne,Pariisi-Paria 8 e, Ranska-Frankrike (72) Keksijä-Uppfinnare: Georges Werner, 21, rue du Cheneaux, 92 Sceaux, Ranska-Frankrike Asiamies-Ombud: Oy Kolster Ab (54) Tapa valmistaa influenssarokotteita - Sätt att framställa influensavacciner. Tämän keksinnön kohteena on tapa valmistaa yksitehoisia tai monitehoisia rokotteita poistamalla aktiivisuus ihmisen, hevosen; sian tai lintujen influenssavirussuspensiosta, jotka virukset on viljelty sikiöasteella olevien kananmunien sisäisellä allantoiskalvolla, konsentroitu sekä erottavasti sentrifugoimalla puhdistettu. Näiden rokotteiden valmistukseen. käytetään ihmisinfluenssan viruksia (tyyppejä A, A l, A 2 tai B) samoinkuin hevosen, sian tai lintujen viruksia. Tämän keksinnön mukainen valmistustapa perustuu siihen, että istutetaan jotain edellä mainittua virusainetta sikiöasteella olevien kananmunien allantoisonteloon, haudotaan täten ympättyjä munia, otetaan talteen virussuspensio, ja poistetaan tämän aktiivisuus käsittelemällä sitä etyylieetterillä tai etyyliasetaatilla. Täten saatu suspensio emulgoidaan määrätyn koostumuksen omaavaan öljymäiseen lisäaineeseen, jolloin saadaan influenssavirusten stabiileja öljyemulsioita, joista viruksen aktiivisuus on poistettu, ja jotka voidaan antaa ihmisille tai
2 eläimille näiden suojaamiseksi vastaavien viruslajien aiheuttamilta influenssatartunnoilta. Käytännössä edellä mainittuja antigeenisiä influenssavirushiukkasia viljellään tavanomaisia menetelmiä soveltaen sikiöasteella olevan kananmunan allantoisontelossa, ja noin 2...3 päivää kestäneen haudonnan jälkeen allantoisontelossa olevat nesteet otetaan talteen ja puhdistetaan sentrifugoimalla ja suodatetaan. Täten saadaan virussuspensioita, joista aktiivisuus voidaan poistaa. Näiden virussuspensioiden aktiivisuuden poistaminen suoritetaan etyylieetterikäsittelyllä käyttämällä tekniikkaa, jonka ovat selittäneet F.M.Davenport ja kumpp., J. Lab. Clin. Med. 63, 5 (1964), niin että saadaan hemagglutinoivia virusfraktioita, jotka ovat antigeenisiä, mutta eivät aiheuta infektioita. Käsittely etyylieetterillä suoritetaan sekoittamalla lähellä 0 C:ssa seosta, joka on saatu lisäämällä eetteriä edellä selitetyllä tavalla saatuun, puhdistettuun virussuspensioon, minkä jälkeen dekantoimalla erotetaan hemagglutinoivat virusfraktiot. Näissä olosuhteissa virusten neuramidinaasi-aktiivisuus säilyy. Tämän jälkeen varmistetaan tavanomaista menetelmää soveltaen, että tämä suspensio ei aiheuta influenssan virustartuntaa eikä kuumetta. Aktiivisuutta poistettaessa voidaan etyylieetterin asemesta menestyksellisesti käyttää etyyliasetaattia. Ihmisille tai eläimille ihonalaisesti tai lihaksensisäisesti ruiskutettavaksi tarkoitetun virushiukkasten vesisuspensio, josta aktiivisuus on poistettu, emulgoidaan seokseen, jossa on kasvis- tai mineraaliöljyä tai luonteeltaan hydrofiilistä triglyseridiä ja jotain sopivaa emulgoimisainetta, niin että saadaan stabiileja ja helposti annettavia suspensioita. Kasvisöljynä käytetään sopivasti soijaöljyä, mutta voidaan myös käyttää seesami-, maapähkinä- tai oliiviöljyä. Luonteeltaan hydrofiilisinä triglyserideinä voidaan käyttää esim. polyoksietyleeniöljyhapon triglyseridejä tai polyetyleenipalmitosteariini-triglyseridejä. Emulgoimisaineena käytetään sopivasti mannitolioleaattia. Emulsio saadaan soveltamalla tunnettuja menetelmiä, esim. sekoittamalla nopeasti virussuspensiota, josta aktiivisuus on poistettu, ja molempia öljymäisiä lisäaineita lähellä 0 C olevassa lämpötilassa. Täten saadaan hemagglutinoiva virusfraktioemulsio, jota voidaan käyttää ihmisten tai elinten immunointiin. Tämä emulsio muodostaa rokotteen, joka voidaan antaa ihonalaisena tai lihaksen sisäisenä ruiskeena. Virussuspensiota, josta aktiivisuus on poistettu, voidaan samoin käyttää suoraan, erikoisesti antaa nenän kautta jollain sopivalla tavalla sumutettuna. Erikoisesti suspensio voidaan sijoittaa sumutuspul-
3 loihin tai säiliöihin, joissa on sopivaa kaasumaista tai nestemäistä ponnetinta, niin että saadaan syntymään dispersio pieninä pisaroina tai aerosoleina. Peräaukon kautta tapahtuvaa antamista varten voidaan v:"_rushiukkasten vesisuspensio, josta aktiivisuus on poistettu, sisällyttää peräpuikkojen johonkin tavanomaiseen perusaineeseen. Edellä selitetty menetelmä soveltuu käytettäväksi yksitehoisten influenssarokotteiden valmistamiseksi. Haluttaessa monitehoisia rokotteita voidaan sekoittaa erikseen valmistettuja yksitehoisia hemagglutinoivia virusfraktiosuspensioita keskenään ja lisätä sitten nämä öljymäiseen lisäaineeseen, kuten edellä selitettiin. Edellä selitetyn valmistustavan mukaan voidaan saada uusia influenssarokotteita, jotka erinomaisen immunoivan aktiivisuutensa ansiosta syntyneen immuniteetin pitkän kestävyyden ja helpon antotavan (ihonalaisesti, lihaksensisäisesti, nenään tai peräaukkoon) ja kuumetta aiheuttamattoman vaikutuksensa ansiosta esittävät tällä alalla tärkeätä parannusta. Seuraavat esimerkit esittävät, miten keksintöä voidaan soveltaa käytännössä. Esimerkki 1 Influenssaviruksen A 2 kantaa A 2 /Englanti/1/66 tai influenssaviruksen B kantaa B/Romania/2/66 taikka influenssaviruksen A l kantaa Ann Arbor/1/57 tai mitä tahansa muuta antigeenista ihmisen influenssavirusta A, A 1, A 2 tai B, jotka saadaan Lontoossa olevan "World Influenza Centre"-keskuksen kokoelmasta, viljellään 10 vuorokautta haudottujen sikiöasteella olevien kananmunien allantoisontelossa. Istutetut munat haudotaan 37 C:ssa 48...72 tuntia, minkä jälkeen jäähdytetään 4 C:ssa 18 tuntia, jolloin etukäteen huolellisesti poistetaan ne munat, joiden sikiöt ovat kuolleet. Jäähdyttämisen jälkeen istutettujen munien allantoisontelon nesteet otetaan talteen aseptisesti imemällä tyhjösondin avulla ja ne yhdistetään seokseksi, jonka tilavuus on 500...1000 cm 3. Tässä seoksessa oleva virusmäärä määritetään hemagglutinaatioreaktion avulla ja titraamalla "in ovo". Vaihtelemalla käytetyn kannan mukaan istutusaineen laimennusastetta ja istutettujen munien itämisaikaa yritetään saada yhteisiä varastoja, jotka sisältävät 512...2048 hemagglutinoivaa yksikköä viruksen cm 3 :ä kohden (UHA/cm 3 ). Nämä yhteiset varastot selkeytetään sitten sentrifugoimalla pienellä nopeudella (noin 1000 g painovoiman kiihtyvyys) 15 minuuttia; erottuvaa nestettä sentrifugoidaan 60 minuuttia 40 000 g:ssa preparaatti-ultrasentrifugissa.. Saatu sakka suspendoidaan homogeenisesti sopi-
4 vaan määrään isotonista puskurifosfaattia. 5H 7,2; ks R. DULBECCO ja M. VOGT, J. Exp. Med. 99, 167 (1954)7. Tämä konsentroitu suspensio puhdistetaan sitten sentrifugoimalla kaliumtartraatin tai sakkaroosin avulla eri tiheysgradienteissa (ks C.E. SCHWERDT ja F.L. SCHAFFER, Virology 2, 665 (1956); J.F. Mc CREA ja kumpp., Nature 189, 220 (1961)) käyttämällä preparaatti-ultrasentrifugia. Ne gradienttivyöhykkeet, jotka sisältävät suurimman määrän UHA/cm 3, yhdistetään siten, että saadaan virussuspensio, joka sisältää vähintään 5000 UHA/mg proteiinia. Tätä suspensiota voidaan sitten laimentaa isotonisella puskurifosfaatilla siten, että saadaan 1000...2000 UHA/cm 3 virusta. Etyylieetterikäsittelyä varten lisätään edellä selitetyllä tavalla saatuun puhdistettuun virussuspensioon kaksinkertainen tilavuusmäärä etyylieetteriä, josta peroksidi on poistettu, ja 1 mg/cm 3 sorbitoli-polyoksietyleenin mono-oleaattia ("Tween 80"). Tämä seos pannaan sulavaa jäätä sisältävään kylpyyn ja sekoitetaan jatkuvasti 5 tuntia siipisekoittimella; käsittely suoritetaan aseptisissa olosuhteissa. Eetteri j4 virussuspensio, joka pääasiallisesti sisältää hemagglutinoivia virusfraktioita, erotetaan dekantoimalla, ja jäljellä oleva eetteri haihdutetaan tyhjössä. UHA/cm 3 -pitoisuus määritetään tavanomaista menetelmää soveltaen tämän käsittelyn jälkeen, jolloin yleensä todetaan, että tämä pitoisuus on hiukan suurempi kuin alkuperäinen pitoisuus. Hemagglutinoiva virusfraktiosuspensio suodatetaan sitten kaikkien epäpuhtauksien poistamiseksi selluloosaesterikalvojen avulla (huokosten keskimääräinen koko 0,45 mikronia). Steriilisyyskokeet bakteereihin ja sieniin nähden suoritetaan soveltamalla tavanomaisia menetelmiä tioglykolaattiliemellä, "National Institute of Health" valmistamalla hyytelöravinneaineella, "Sabouraud"' in hyytelöravinneaineella ja "Mycoplasmaa" varten tarkoitetulla rikastetulla erikoisliemellä. Tarttuvan influenssaviruksen puuttuminen eetterikäsittelyn jälkeen määritetään suorittamalla kaksi peräkkäistä läpikulkua eri laimennusasteita käyttäen sikiöasteella olevan kananmunan allantoisontelossa. Kuumetta aiheuttavan vaikutuksen puuttuminen tutkitaan tavanomaista tekniikkaa soveltaen ruiskuttamalla näyte laskimonsisäisesti kaniineihin. Bakteriologisesti steriili suspensio, joka ei aiheuta influenssaviruksen tartuntaa eikä kuumetta, säilötään 4 C:ssa suljettuihin ampulleihin sen jälkeen, kun on lisätty natriummertiolaattia lopullista konsentraatiota vastaava määrä (1:10000). Edellä selitetty influenssaviruksen hemagglutinoiva virusfraktiosuspensio emulgoidaan öljymäiseen lisäaineeseen seuraavalla tavalla:
5 30 cm 3 :iin tätä suspensiota-lisätään 27 cm 3 soijaöljyä, 3 cm 3 mannitolioleaattia ja 0,5 cm 3 sorbitolipolyoksietyleeni-mono-oleaattia ("Tween 80"), jotka on etukäteen steriloitu (kasvisöljyt steriloidaan suodattamalla selluloosaesterikalvojen avulla; mannitolioleaatti ja sorbitolipolyoksietyleeni-mono-oleaatti steriloidaan autoklaavissa). Tämä seos pidetään sulavaa jäätä sisältävässä kylvyssä, ja seokseen pannaan aseptisesti turpiinityyppisen sekoittimen (tyyppiä Ultra-Turrax) varsi, jonka annetaan toimia 5 minuuttia. Saadaan valkoinen kermamainen homogeeninen ja stabiili emulsio, joka säilötään 4 C:ssa kumitulpilla suljettuihin pulloihin, jotka varustetaan metallikapseleilla. Täten saatu yksitehoinen rokote on tarkoitettu annettavaksi ihmiselle ihonalaisena tai lihaksensisäisenä ruiskeena, jolloin käytetään 1 cm 3 lihaksiin tai 0,4 cm 3 ihonalaisesti ruiskutettaessa. Esimerkki 2 Menetellään samalla tavoin kuin esimerkissä 1 ja käytetään samaa kantaa, mutta aktiivisuuden poistamiseen käytetään etyyliasetaattia, jolloin saadaan lähtöviruksen hemagglutinoiva virusfraktiosuspensio, jonka tarkastukset suoritetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 1. Tätä suspensiota käytetään kuten esimerkissä 1 emuigoidun rokotteen valmistamiseksi. Esimerkki 3 Monitehoisten rokotteiden valmistamiseksi, jotka annetaan ihmiselle ruiskeina lihaksensisäisesti tai ihonalaisesti, viljellään "in ovo" influenssaviruksen eri kantoja, jotka ovat tyyppejä A, A l, A 2 ja B, jotka halutaan sisällyttää rokotteeseen sentrifugoimalla ja käsitellään etyylieetterillä tai etyyliasetaatilla, kuten esimerkeissä 1 ja 2 on selitetty. Täten saadut yksitehoiset eri suspensiot sekoitetaan siten, että lopullinen suspensio sisältää 100...500 UHA/cm 3 jokaista käytettyä antigeenista tyyppiä. Kokeet, joissa todetaan steriilisyys, tartuntaa aiheuttavan viruksen puuttuminen ja kuumetta aiheuttavien ominaisuuksien puuttuminen, emulgoiminen öljymäiseen lisäaineeseen ja rokotteen viimeistely suoritetaan kuten esimerkissä 1. Esimerkki 4 Sikalajien immunointiin käytettävän influenssarokotteen valmistus tapahtuu seuraavalla tavalla. Sikainfluenssaviruksen kantaa A/ Swine S 15 viljellään "in ovo", ja virus puhdistetaan kuten esimerkeissä 1 ja 2 on selitetty, jolloin kuitenkin puhdistaminen rajoitetaan ensimmäiseen asteeseen (sentrifugoimalla g-arvossa 40000 60 minuuttia). Etyylieetterikåsittely suoritetaan kuten esimerkissä 1. Lopullisessa suspensiossa on oltava 500...1000 UHA/cm 3 virusta. Kokeet, joissa tut-
6 kitaan steriilisyys ja tarttuvan viruksen puuttuminen suoritetaan kuten esimerkissä 1. Emulgoiminen öljymäiseen lisäaineeseen suoritetaan samoin kuten esimerkissä 1, mutta seokseen lisätään ennen dispergoimista 5 % luonnon sekaesteritriglyseridiä Lkuten Labrafil M 1944 C tai le Labrafil M 2735 (Gattefossg17. Tätä rokotetta annetaan lihaksensisäisinä ruiskeina 5 cm 3. Esimerkki 5 Hevosten immunointiin käytettävää influenssarokotetta valmistetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 4, mutta viruskantoina käytetään hevosinfluenssaviruksia A/Equi/Prague ja A/Equi/Miami tai muita näiden kaltaisia antigeenisia kantoja. Tämä rokote on kaksitahoinen, ja se sisältää tyyppiä A/Equi/Prague ja tyyppiä A/Equi/Miami olevia kantoja. Samalla tavoin kuin sikarokotetta valmistettaessa sisältää öljymäinen lisäaine (kasvisöljy + mannitolioleaatti) 5 % sekaesteröityä luonnon triglyseridiä. Rokote on tarkoitettu annettavaksi lihaksensisäisenä ruiskeena 5 cm 3 määrin. Esimerkki 6 Kalkkunoiden immunointiin käytettävää influenssarokotetta valmistetaan samalla tavoin kuin esimerkeissä 4 ja 5, mutta käytetään viruskantana lintuinfluenssan virusta Turkey/Englanti/63 (Langham). öljymäinen lisäaine sisältää kuten sian ja hevosen rokotteita valmistettaessakin 5 % sekaesteröityä luonnon triglyseridiä. Rokote on tarkoitettu annettavaksi lihaksensisäisenä ruiskeena (1 cm 3 määrin) tai ihonalaisesti siipikalvoon (0,2 cm 3 määrin). Esimerkki 7 Ihmisten immunointiin tarkoitettua nenän kautta annettavaa influenssarokotetta valmistetaan kuten esimerkeissä 1 ja 2, kun on kysymys viruksen viljelemisestä "in ovon ja niiden konsentroimisesta ja puhdistamisesta, niiden käsittelemisestä etyylieetterillä tai etyyliasetaatilla, jolloin sekoitetaan tyyppejä A, A l, A 2 ja B olevia ihmisviruksen kantoja siten, että saadaan yksitehoinen tai monitahoinen ro- kote. Kokeet, joissa tutkitaan steriilisyys ja tarttuvan viruksen puuttuminen, suoritetaan samalla tavoin kuin esimerkeissä 1 ja 2. Etyylieetteri- tai etyyliasetaattikäsittelyn jälkeen jätetään pois mertiolaatin lisääminen hemagglutinoiviin virusfraktiosuspensioihin. Tutkitaan, että suspensiot ovat säilyttäneet neuramiinidaasientsyymiaktiivisuuten- sa saattamalla sopiva määrä reagoimaan härän alaleukarauhasen kalvopro- teiiniuutosvalmisteen kanssa ja määräämällä N-asetyylineuramiinihapon vapautuminen tästä viljelyaineesta. Hemagglutinoivaa yksi- tai monitahoista virusfraktiovesisuspensiota ei emulgoida mihinkään öljymäiseen
7 lisäaineeseen kuten edellisiåsä esimerkeissä, vaan tämä suspensio pannaan painetypen alaiseen sumutuskojeeseen, ja sitä annetaan sumuttamaila sieraimiin. Esimerkki 8 Ihmisten immunointiin peräaukon kautta tarkoitettuja peräpuikkoja valmistetaan seuraavasti: tyyppejä A, A l, A 2 ja B olevia viruksia viljellään "in ovo", konsentroidaan ja puhdistetaan ja käsitellään etyylieetterillä tai etyyliasetaatilla kuten esimerkeissä 1, 2 ja, 3. Hemagglutinoivat yksi- tai monitehoiset virusfraktiovesisuspensiot, joihin ei lisätä mertiolaattia, lyofilisoidaan ja täten saatu kuiva tuote sisäilytetään sekaesteröityyn hydrattuun palmuöljyvalmisteeseen (»tyyppiä Labrafil M 2273-C (GattefossW, joka on ennalta sulatettu 38 C:ssa, ja jonka annetaan sitten kovettua sopivissa muoteissa peräpuikon muodon aikaansaamiseksi. Hemagglutinoivan lyofilisoidun virusfraktiosuspension määrä, joka lisätään edellä selitettyyn peräpuikkomassaan, lasketaan siten, että jokainen peräpuikko sisältää vähintään 1000 hemagglutinoivaa yksikköä jokaisesta rokotteessa olevasta viruskannasta.
Patenttivaatimuksets 1. Tapa valmistaa yksitehoisia tai monitehoisia rokotteita poistamalla aktiivisuus ihmisen, hevosen, sian tai lintujen influenssavirussuspensiosta, jotka virukset on viljelty sikiöasteella olevien kananmunien sisäisellä allantoiskalvolla, konsentroitu sekä erottavasti sentrifugoimalla puhdistettu, t u n n e t t u siitä, että virussuspensiosta poistetaan aktiivisuus sekoittamalla sitä lämpötilassa 0-5 C yhdessä ainakin'kaksinkertaisen tilavuusmäärän kanssa etyylieetteriä tai etyyliasetaattia, ja liuottimen poistamisen jälkeen virussuspensio saatetaan lihaksensisäisesti, ihonalaisesti, nenänsisäisesti tai peräaukon kautta otettavaan muotoon. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen tapa lihaksensisäisesti tai ihonalaisesti otettavien rokotteiden valmistamiseksi, t u n n e t t u siitä, että virussuspensio, jonka aktiivisuus on poistettu, emulgoidaan sinänsä tunnetulla tavalla lisäaineessa, joka on joko kasvisöljyä, luonnon hydrofiilistä triglyseridiä tai mannitolioleaattia.
9 Patentkrav: 1. Sätt att frametälla monofunktionella eller polyfunktionella vaooiner. genom att inaktivera en människo- häst, svin- eller fitgelinfluensavirussuspension, vilka virus är odlade på den inre allantoishinnan av hönsägg på embryostadiet, koncentrerade och renade genom differentierande centrifugering, k ä n n e t e c k n a t därav, att virussuspensionen inaktiveras genom omröring vid en temperatur av 0-5 C tillsamman med åtminstone en dubbel volymmängd av etyleter eller etylacetat,00h att virmr suspensionen efter avlägsnande av lösningsmedlet bringas i en intramuskulärt, subkutant, intranasalt eller rektalt administrerbar form. 2. Sätt enligt patentkravet 1 för framställning av intramuskulärt eller subkutant administrerbara vacciner, k ä n n e t e c k n a t därav, att den inaktiverade virussuspensionen emulgeras på i och för sig känt sätt i ett tillsatsämne, som utgörs av antingen en vegetabilisk olja, naturligt hydrofil triglycerid eller mannitololeat. Viitejulkaisuja-Anförda publikationer Patenttijulkaisuja:-Patentskrifter: Ranska-Frankrike 2333 M