II 1111111 11 1 111011 1111111 1111110111111111

(12 ) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI 101552 B II 1111111 11 1 111011 1111111 1111110111111111 F 1000101552B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 15.07.98 SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (51) Kv.lk.6 - Int.k1.6 C 12P 21/02, C 12N 15/31 C 07K 14/31, A 61K 38/16 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 882562 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 31.05.88 (24) Alkupäivä - Löpdag 31.05.88 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 02.12.88 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 01.06.87 SE 8702272 P (73) Haltija - Innehavare 1. Alfa-Laval Agri International Aktiebolag, Box 39, 147 00 Tumba, Sverige, (SE) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Höök, Magnus, 4734 Bridge Water Road, Birmingham, AL 35243, USA, (US) 2. Lindberg, Martin Kjell, Kornvägen 5, 752 57 Uppsala, Sverige, (SE) 3. Signås, Lars Christer, Hamnesplanaden 2A, 753 23 Uppsala, Sverige, (SE) 4. Wadström, Torkel Mikael, Rektorsvägen 7, 223 67 Lund, Sverige, (SE) 5. Fröman, Gunnar, Lindsbergsgatan 5 B, 752 40 Uppsala, Sverige, (SE) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab, Jaakonkatu 3 A, 00100 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Hybridi-DNA-molekyyli, joka koodaa fibronektiiniå sitovaa proteiinia sekå menetelmä proteiinin valmistamiseksi Hybrid-DNA-molekyl, som kodar fibronektinbindande protein och förfarande för frammtållning av protein (83) Mikro-organismitalletus - Deposition av mikroorganism: 4124 DSM (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer FEMS Symposium 31 (1986) 263-268 (Fröman et al.), J. Biol. Chem. 262 (14) (1987) 6364-6571 (Fröman et al.), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 697-701 (Löfdahl et al.), Chemical Abstracts 97 (1982) 106722e (Esperson och Clemmensen) - Infection and Immunity 37 (1982) 526-531 (57) Tiivistelmä - Sammandrag Esillä oleva keksintö kohdistuu uuteen yhdistelmä-hybridi-dna-molekyyliin,joka käsittää S. aureuksesta peräisin olevan nukleotidisekvenssin,jokakoodaaprote - iinia tai polypeptidiä, jolla on fibronekliiniä sitovia ominaisuuksia.

Föreliggande uppfinning avser en ny re- kombinanthybrid-dna-molekylinnefattan- de en nukleotidsekvens från S. aureus, som kodar protein eller polypeptid, som har fibronektinbindande egenskaper. 101552 Ball 1 L + + + + + + CO GGCC..,:=AATAI5C- GGCCGTCT =;L GC:1-,=.,,,.TAT Gly81nAsnSerGlyAsnGlnSerPhe810(318,4spThrGluGluspLyzysTyr 61 + t + + -+, -' --+ 120 GAACAAGGT88CAATATCGT,L:GMTATCGTTTTGATGTGTACCCTTCATTii=,., GluGlr.81yeilyAsnileYa~lleApPhe.erlYs1PrGlnileHIEClyGlr, 121 + + + + + 180 A.,,,To,,AAGGTAATCGTCATTCGGGA,48gTAC C,,,,.:CGTATGAT,=.inLys-GlErerPhe0luGlu.4EpThrG10Lys,.'ipL ":t.d1_,,, styrgluhis -1&60-- 161 + + + -4-.. - + 240 GGCGGTA,,,CATCTTGAT,;TCGACTTCGACAGTGTL:CT, TTC,C.GGTTCATI48 GlyGlyAsnllellesplleAspPheEper1P-Illtlis131,yFh"Et,Lys. 241 + + + t + + 100 CAC,,,CTG.4.gATTTTGA.,,G.W.Tii,.C.,,A=JA A,TTATCATTCG0TGGA HisThrGlul1e11eG1uGluipThrAsrd_yrk -:-,,TyrG1131Gly 31/C21). 301 + + + 4 + + 360 C;-.CH,TAJ.T13TT,CTTTC,Ai-,,G,AA&4TACL.TTC1_,,,,,.,--,,,,TA.,38-1- rglyglnlugly HisAsnSerVal.zpFt.eGluGlupThrLuEr:_ys 361 + + + -+ + + 420 CAACACLIATTC-GTAL:.-,.CL.C.TCL.T..,T,1,_,_,-,_---... L..,,,L,-.L.,_ GlnG1nThrlleG1uGluiTnrThrPrz,Pre.li, Ys1Pr.:F- -- t-,rprfr.:,thrl..: 421 + 1- +,. +- + 43 :. c -: -,-..-,:' :.----:,T,LL,,, 81uUa1Pro8erG1ug'roGluTr,rPrThrProF1, rty -F1Free., GIL,P. c, 481 t- -+ t 540 G1uThrProThrPr8Pr rogluvalpror;11.51,thrfr:, Tt r:, P44ff 541 -I 559 ACACCAGAGGTi;C:CGCTC, ThrProGluValFoAla

101552 Hybridi-DNA-molekyyli, joka koodaa fibronektiiniä sitovaa proteiinia sekä menetelmä proteiinin valmistamiseksi Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään fibronektiiniä sitovan proteiiniin val- 5 mistamiseksi sekä hybridi-dna-molekyyleihin, esim. plasmideihin tai faageihin, jotka käsittävät nukleotidisekvenssin, joka koodaa sanottua proteiinia. Lisäksi hakemuksensa kuvataan mikro-organismeja, jotka käsittävät sanottuja molekyylejä, ja niiden käyttöä sanottuja proteiineja valmistettaessa. Esillä olevan keksinnön kohteena on saada aikaan minimaalinen fibronektiiniä sito- 10 va proteiini. Lisäksi kohteena on saada aikaan sanottu proteiini geenitekniikalla käyttämällä esim. plasmidia, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodaa sanottua proteiinia. Muut kohteet ilmenevät seuraavasta selityksestä. WO-A1-85/05553 selostaa bakteerisolupintaproteiineja, joilla on fibronektiiniä, 15 fibrinogeeniä, kollageeniä ja/tai laminiinia sitova kyky. Täten on osoitettu, että eri bakteereilla on kyky sitoutua fibronektiiniin, fibrinogeeniin, kollageeniin ja/tai laminiiniin. Lisäksi on osoitettu, että fibronektiiniä sitovan proteiinin molekyylipaino on 165 kd ja/tai 87 kd, joten on oletettavissa, että pienempi proteiini on suuremman osa.. 20 Fibronektiini on suuri glykoproteiini (Mr suunnilleen 450 kd), jossa on kaksi sa- manlaista alayksikköä, joiden molekyylikoko voi vaihdella riippuen prekursori- mrna:n (1) kompleksiliitoskaavasta. Fibronektiinin pääasiallinen funktio, jota fibronektiiniä on löydetty ruumiinnesteistä, verihyyteistä ja solunulkoisista matrikseista, näyttää olevan kohdistunut proteiinin kykyyn välittää useimpien eukaryootti- 25 solujen substraattiadheesiota (2, 3, 4, 5). Seitsemänkymmentäluvun loppupuolella Kuusela havaitsi, että fibronektiini ei vain toimi yhdessä eukaryoottisolujen kanssa, vaan sitoutuu Staphylococcus aureuksen. soluihin (6). Tästä havainnosta lähtien on lukuisten patogeenisten mikro-organis-. mien osoitettu sitoutuvan fibronektiiniin suurella spesifisyystasolla ja suurella affi- 30 niteetillä (7). Fibronektiini näyttää toimivan solunulkoisessa matriksissa myös eri- laisten mikro-organismien kasvualustana. Fibronektiiniin sitoutuminen on monille

2 101552 mikro-organismeille ratkaiseva vaihe isännän kudoksen asuttamisessa ja tulehduksen kehittämisessä. Useita erilaisia solupintakomponentteja on havaittu fibronektiinireseptoreiksi Grampositiivisissa bakteereissa lipotekiohapot (8, 9) ja proteiini (10) mukaanlukien. 5 Aikaisemmissa tutkimuksissa fibronektiiniä sitova proteiini, jonka Mr on 197-210 kd, on eristetty S.aureus-lajista Newman (11, 12) ja se on identifioitu kokeellisesti fibronektiinireseptoriksi. Tämän fibronektiiniä sitovan proteiinin, joka on peräisin S. aureuksesta, lisäluonnehtimiseksi kloonattiin tätä proteiinia varten oleva geeni E. colissa. Tässä proteiinissa oleva fibronektiiniä sitova alue on myös paikallistettu ja 10 tämän domeenin sisältävän fuusioproteiinin ja proteiini A:n IgG:tä sitovien alueiden käyttäytymistä selostetaan jäljempänä. Nyt on yllättäen havaittu mandolliseksi ottaa talteen hybridi-dna-molekyyli, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodaa proteiinia tai polypeptidiä, jolla on fibronektiiniä sitovia ominaisuuksia. Todisteena tästä on seuraavanlainen nukleotidi- 15 sekvenssi läsnä geenissä, joka koodaa sanottua proteiinia: -. GGC CAA AAT AGC GGT AAC CAG TCA TTC GAG GAA GAC ACA GAA GAA GAC AAA CCT AAA TAT GAA CAA GGT GGC AAT ATC GTA GAT ATC GAT TTT GAT AGT GTA CCT CAA ATT CAT GGT CAA AAT AAA GGT AAT CAG TCA TTC GAG GAA GAT ACA GAA AAA GAC AAA CCT AAG TAT GAA CAT 20 GGC GGT AAC ATC ATT GAT ATC GAC TTC GAC AGT GTG CCA CAT ATT CAC GGA TTC AAT AAG CAC ACT GAA ATT ATT GAA GAA GAT ACA AAT AAA GAT AAA CCA AGT TAT CAA TTC GGT GGA CAC AAT AGT GTT GAC TTT GAA GAA GAT ACA CTT CCA AAA GTA AGC GGC CAA AAT GAA GGT CAA CAA AGC ATT GAA GAA GAT ACA ACA CCT CCA ATC GTG CCA CCA. 25... Keksintö käsittää lisäksi plasmidin tai faagin, joka käsittää nukleotidisekvenssin, jo-.. 30 ka koodaa sanottua fibronektiiniä sitovaa proteiinia. ACG CCA CCG ACA CCA GAA GTA CCA AGT GAG CCG GAA ACA CCA ACG CCA CCA ACA CCA GAA GTA CCA AGT GAG CCG GAA ACA CCA ACA CCA CCG ACA CCA GAA GTG CCG AGT GAG CCA GAA ACT CCA ACA CCG CCA ACA CCA GAG GTA CCA GCT Keksintö käsittää lisäksi mikro-organismin, joka käsittää vähintään yhden edellä esitetyn mukaisen hybridi-dna-molekyylin. Keksintö käsittää lisäksi menetelmän fibronektiiniä sitovan proteiinin valmistamiseksi, jossa menetelmässä vähintään yksi edellä esitetty hybridi-dna-molekyyli

3 101552 viedään mikro-organismiin, viljellään sanottua mikro-organismia viljelyväliaineessa, ja eristetään täten muodostunut proteiini liukenemattomaan kantoaineeseen sitoutuneesta fibronektiinistä tehdyn affiniteettikromatografian avulla, jota seuraa ioninvaihtokromatografia. 5 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa. Sopivat kantajaproteiinit voidaan liittää aminohapposekvenssiin samoin, kuten proteiini-a:n IgG:tä sitovat alueet. Kuvio la esittää affiniteettikromatografiaa fibronektiini-sepharosella Lysaattiin (86) ml, joka saatiin E. coli -kloonin pfroo1 kylmällä osmoottisella 10 shokilla, sekoitettiin 29 ml 2 M ammoniumasetaattia. Näyte levitettiin sitten kolonniin (1,9 x 5,7 cm), joka oli tasapainotettu 0,5 M ammoniumasetaatilla 50 ml/h virtausnopeudella. Näytteen levittämisen jälkeen kolonni pestiin viidellä kolonnitilavuudella 0,5 M ammoniumasetaattia 20 ml/h virtausnopeudella. Samaan aikaan UV-monitorin herkkyys kasvoi viiden kertoimella. 200 ja 220 ml:n välille eluoituva 15 materiaali kerättiin, neutraloitiin ammoniumhydroksidilla ja dialysoitiin 10 mm ammoniumasetaattia vasten, ph 7,6. Kuvio 1 B esittää ioninvaihtokromatografiaa Esimerkissä 1A kuvattu affiniteettikromatografiasta dialysoitu materiaalinäyte (10 ml) levitettiin 1 ml Mono Q (Pharmacia, Ruotsi) -anionikolonniin, joka oli tasapai- 20 notettu 10 mm ammoniumasetaatilla, ph 7,6. Virtausnopeus oli 2 ml/min ja kolonni,:.:. elutoitiin vuorauksen lisäyksellä 25 mm per mooli ammoniumasetaattipitoisuudessa.., Kaksi huippua (I ja II) yhdistettiin, kuten kuviossa on osoitettu....: Kuvio 2 esittää E. coli pfro01:n osmoottinen shokki -lysaatin erilaisista puhdistus- vaiheista peräisin olevien materiaalien polyakryyliamidigeelielektroforeesia 25 Materiaali levitettiin (kaista 1) affiniteettikolonniin (fibronektiini-sepharose) adsor-... boimaton (kaista 2) ja adsorboitu (kaista 3) materiaali. Affmiteetilla puhdistetun materiaalin ioninvaihtokromatografia Mono Q FPLC -kolonni (Pharmacia, Ruotsi): yhdistelmä I (kaista 4) ja yhdistelmä II (kaista 5,) kuten kuviossa 1B on merkitty. :. :.: Kuvio 3 esittää pfroo Leen liitetyn liitoksen restriktiokarttaa, subklooneja ja delee- 30 tioita (A) 6,5 ke:n liitoksen restriktiokartta. (B) erilaisia sub-klooneja, jotka on konstruoitu. geenin alueen määrittämiseksi, joka alue koodaa fibronektiiniä sitovaa toimintaa. (C) deleetioita, jotka on tehty joko EcoRI-PstI-fragmentin 3'- tai 5'-päästä käsittele-

4 101552 mällä eksonukleaasilla Ba131 (katso selostusta yksityiskohtia varten). Erilaisten geenituotteiden fibronektiiniä sitova toiminta on osoitettu. Kuvio 4 esittää ZZ-FR-proteiinin polyakryyliamidigeelielektroforeesia Proteiini A (Sigma Chemial Co, St. Louis; kaista A) ja ZZ-FR-fuusioproteiini 5 (kaista B) redusoitiin ja alistettiin elektroforeesiin SDS:ssä 5-15-%:isella polyakryyliamidigeelillä. Geeli värjättiin lisäksi Coomassie bluella. Kaistoissa C & D fraktionoitiin ZZ-FR-fuusioproteiini ja proteiini A vastaavasti SDS-elektroforeesilla 5-9-%:isella polyakryyliamidigeelillä, sähkötäplitettiin selluloosanitraattipaperille ja testattiin 125I-merkityllä 29 kd:n fibronektiinifragmentilla, kuten on selostettu 10 (Fröman et al., 1987). Nuolet osoittavat tunnetun molekyylipainon standardiproteiinien migraatioetäisyyttä. Kuvio 5 esittää ZZ-FR-proteiinin affiniteettikromatografiaa ZZ-FR-fuusioproteiinia (0,6 mg; ruutu A) ja proteiinia A (Sigma Chemical Co; 0,5 mg, ruutu B) levitettiin 7 ml Sepharose 4B CL -kolonniin, joka oli substituoitu 29 15 kd fibronektiinifragmentilla. Kolonni pestiin 0,5 M NaCl PBS:ssä ja eluoitiin lisäksi 6 M GuHC1 PBS:ssä. 2 ml:n fraktiot kerättiin ja proteiini testattiin käyttämällä BioRad-järjestelmää....: 20 4 8 Kuvio 6 esittää ZZ-FR-fuusioproteiinivalmisteen, joka on fraktionoitu affiniteettikromatografialla, polyakryyliamidigeeli-elektroforeesia Materiaali, joka ei ollut sitoutunut (kaista A) ja joka oli sitoutunut sekä elutoitu (kaista B) vastaavasti, ja joka oli peräisin 29 kd affiniteettikolonnista, analysoitiin SDS-geelielektroforeesilla 5-15-%:isilla polyakryyliamidigeeleillä. Geelit värjättiin lisäksi Coomassie bluella. Nuolet osoittavat tunnetun molekyylipainon standardiproteiinien migraatioetäisyyttä. :: 25 Kuvio 7 esittää 125I-fibronektiinin sitoutumisen bakteerisoluihin Lajin Newman (ruutu A) tai lajin 8325-4 stafylokokki-soluja (5x107) inkuboitiin i.. 5x104 cpm:llä 125I-merkittyä intaktia fibronektiiniä (o-o) tai 29 kd N-terminaalista. fibronektiinifragmenttiä (A-A) PSB:ssä, jota oli täydennetty 0,1 %:lla BSA:ta ja 0,1. %:11a TweenR 80 0,5 ml:n kokonaispitoisuudessa 1 tunti ZZ-FR-fuusioproteiinin tai. 30 proteiinin A (-) lisääntyvien määrien läsnäollessa. Katso käytetyn sitoutumistestin. lisäyksityiskohtia Fröman et al. (1987). 125I-merkityn radioaktiivisuuden määrät, jotka liittyivät bakteerisoluihin määriteltiin ja fibronektiinin sitoutumisen laajuus laskettiin. Sata prosenttia sitoutumista edustaa 125I-ligandin sitoutumista bakteereihin inhiboivan proteiinin puuttuessa ja 0 % sitoutumista vastaa radioak- 35 tiivisuutta, joka on mitattu inkubaatioseoksista, joissa ei ole bakteereita.

5 101552 Kuvio 8A esittää nukleotidisekvenssiä, joka koodaa fibronektiiniä sitovaa proteiinia Nukleotidisekvenssi, joka koodaa fibronektiiniä sitovaa proteiinia vastaavine aminohappoineen esitetään. Erilaiset 38 aminohappotoisteet on merkitty samoin kuin seuraavien lähes neljän täydellisen 14 aminohappotoisteen. Restriktiopaikat BalI- 5 HincII-PvuII on merkitty kuvioon samoin kuin aminohapposekvenssit, jotka vastaavat erilaisia nukleotidisekvenssejä. Kuvio 9 esittää kemiallisesti syntetoidun polypeptidin fibronektiiniä sitovaa kykyä Testattiin esimerkin 2 mukaisesti syntetoidun 38 aminohappotähdepolypeptidin fibronektiiniä sitova kyky yhdessä sanotun polypeptidin fragmenttien fibronektiiniä si- 10 tovan kyvyn kanssa. (*-*) tarkoittaa polypeptidiä, joka vastaa aminohapposekvenssin 38(2)-toistoa; ( ) tarkoittaa polypeptidiä, joka vastaa aminohapposekvenssin aminohappoja 1-19; (o-o) tarkoittaa polypeptidiä, joka vastaa aminohapposekvenssin aminohappoja 20-38; (A-A) tarkoittaa polypeptidiä, joka vastaa aminohapposekvenssin aminohappoja no 9-30; ja (- - -) polypeptidiseosta, joka käsittää 15 aminohappojen 1-19, aminohappojen 20-38 ja aminohappojen 9-30 polypeptidit. Sitoutumiskyky on merkitty prosenteissa lisätyn polypeptidin ilg:tä kohti. Keksintöä selostetaan seuraavassa viitaten annettuihin esimerkkeihin, jotka eivät kuitenkaan rajoita sitä. Esimerkki 1 3 : : 20 Geenipankin seulonta fibronektiiniä sitovaa proteiinia varten (FNBP) Staphylococcus aureus -lajista (8325-4) peräisin olevan kromosomaalisen DNA:n plasmidissa pbr322 oleva geenipankki, joka on kuvattu aikaisemmin (13):ssa, seulottiin FNBP:tä ilmentäviä klooneja varten. E. coli -kloonit lysoitiin ja lysaattien kyky inhiboida 125I-fibronektiinin sitoutumista S. aureus -soluihin Cowan I testat- 25 tiin, kuten menetelmäkappaleessa kuvattiin. Seulonnan yksinkertaistamiseksi kloonit jaettiin 25 erään, lysoitiin ja testattiin. Kun 22 erää oli testattu, se, jolla oli suurin inhiboiva toiminta testattiin uudelleen 5:n 5:nä eränä. Lopuksi testattiin positiivisen erän yksittäiset kloonit, ja sitä seurasi yhden yksittäisen positiivisen kloonin eristäminen. Positiivisessa kloonissa oleva plasmidi nimitettiin pfro01:ksi..:. 30 Tämä plasmidi pfroo1 on tallennettu E. coli -lajissa 259 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM):iin ja on sieltä saatavissa tallennenumerolla 4124...

Stafylokokkiperäisen FNBP:n eristäminen E. colista 6 101552 E. coli -kloonia, joka on FNBP-positiivinen, viljeltiin LB-väliaineessa 37 C:ssa muuttumattomaan kasvufaasiin. Bakteerisolut sentrifugoitiin ja lysoitiin osmoottisella shokkimenetelmällä (14). Sen poissulkemiseksi että shokkilysaatin inhiboiva 5 toiminta 125I-fibronektiinin sitoutumiseen S. aureus -soluihin johtuisi proteolyyttisestä vaikutuksesta, lysaatti lisättiin inkubointiseokseen, ja S. aureukseen sitoutuneen 125I-fibronektiinin määrä määritettiin 1, 2, 3, ja 4 tunnin inkuboinnin jälkeen. Tämän inkubointijakson avulla lysaatin aiheuttama inhibitiotaso jäi vakaaksi (esim. 50 %) osoittaen, että inhibitio ei johtunut 125I-merkityn ligandin tai vastaavan re- 10 septorin kehittyvästä degradaatiosta. Jos inhiboiva toiminta johtuu lysaatissa läsnäolevien FNBP-kaltaisten rakenteiden läsnäolosta, niiden pitäisi osoittaa spesifistä affiniteettia fibronektiiniin. Lysaatti analysoitiin sen tähden affiniteettikromatografialla fibronektiini-sepharose-pylväällä, kuten Materiaaleissa ja menetelmissä (kuvio 1A) on kuvattu. Puhdistus oli noin 15 30-kertainen. Lisäfraktionoiminen saatiin alistamalla affiniteettipuhdistettu materiaali ioninvaihtokromatografiaan käyttämällä mono Q- pylvästä sovitettuna FPLCjärjestelmään. Tässä fraktionointivaiheessa saatiin kaksi suurempaa huippua (kuvio 1 B). Analyysit polyakryyliamidigeelielektroforeesilla osoittivat, että nämä kaksi huippua sisälsivät proteiineja, joiden molekyylipainot olivat vastaavasti 165 ja 87. 20 kd (kuvio 2). Molemmat komponentit inhiboivat 125I-fibronektiinin sitoumista S.... aureukseen. Fraktiolla, joka sisälsi 165 kd:n proteiinin, oli 220 yksikköä/qg:n spe- sifinen inhibointitoiminta, joka osoittaa 430-kertaisen puhdistumisen alkuperäisestä.. shokkilysaatista ja se oli 30 kertaa aktiivisempaa, kuin 87 kd:n proteiini moolipe-.. rustalla (tietoa ei esitetty). ::: 25 Näiden kanden proteiinin aminohappoanalyysi osoitti, että niillä oli hyvin samanlai- nen aminohappokoostumus, joka myös muistutti tarkalleen sitä, mikä on määritetty luonnolliselle FNBP:lle, joka on eristetty S. aureus -lajista Newman (taulukko 1). E.. colista pfroo1 eristetyn 165 kd:n proteiinin immunologinen suhde luonnolliseen S. aureus -lajista Newman eristettyyn FNBP:hen analysoitiin. 165 kd:n proteiini. : -.. 30 1251-merkittiin ja immunopresipitoitiin S. aureus -lajin Newman vasta-aineen kasvavilla laimennoksilla. Vastaseerumin 300-kertainen laimennus presipitoi 50 %. 1251-merkitystä proteiinista. Merkitsemättömät 165 ja 87 kd proteiinit sekä luon- nollinen FNBP ehkäisivät merkityn 165 kd:n proteiinin immunopresipitaatiota (tie-. toa ei esitetty). Nämä havainnot osoittavat, että S. aureus -lajista Newman eristetyt 35 165 ja 87 kd:n proteiinit ovat läheistä sukua fibronektiiniä sitovalle proteiinille (FNBP).

7 101552 fnbp-geenin sitovaa toimintaa koodaavan alueen identifiointi Liitoksen koko plasmidissa pfroo1 on noin 6,5 kep. Liitoksen restriktiokartta on osoitettu kuviossa 3(A). Transkriptiosuunnan määrittämiseksi ja sitovaa toimintaa koodaavan alueen paikallistamiseksi noin 3,7 kep PstI-fragmentti uudelleenkloonat- 5 tiin pbr322:n PstI-paikkaan. Tämä aiheuttaa tämän plasmidin ampisilliiniresistanssi-fenotyypin katoamisen. Kandeksan tällaista kloonia otettiin talteen, joista klooneista oli viisi fibronektiiniä sitovalle toiminnalle positiivisia ja negatiivisia kolme. Jokaisesta testattiin PstI-fragmentin orientaatio. Positiivisen kloonin pfroo4 plasmidilla oli EcoRI-paikka lähimpänä Amp-promoottoria ja negatiivisen kloonin Eco- 10 RI-paikalla oli päinvastainen orientaatio. Nämä tiedot osoittivat, että transkriptioorientaatio on EcoRI:sta PstLeen 3,7 kep EcoRI-Pst-fragmentissa ja että vähintään osa fnbp-geenistä, joka koodaa sitovaa toimintaa, sijaitsee tässä fragmentissa. Tämän varmentamiseksi pfro04:ssä oleva Amp-promoottori poistettiin EcoRI-hajotuksella, mitä seurasi plasmidin uudelleenligatointi. Tuloksena saatu plasmidi 15 pfroo8 ei osoita fibronektiiniä sitovaa toimintaa. Endogeeninen promoottori sijaitsee täten otaksuttavasti pfroo1:ssä jossain EcoRI-paikan vasemmalla puolella, kuten kuviossa 3(A) on osoitettu nuolella. Plasmidikonstruktiolla (ei kuvattu yksityiskohtaisesti) vietiin sitten pfro01:stä peräisin oleva EcoRl (liitoksessa) -SalI (pbr322:ssa) -fragmentti pfro08:aan. Fibronektiiniä sitova toiminta palautui fnbp- 20 geenistä peräisin olevan endogeenisen promoottorin palauttamisen ansiosta. Kun tiedettiin fnbp-geenin transkriptiosuunta (vasemmalta oikealle, kuten kuviossa. 3(A) on esitetty) fuusioita geenin stafylokokkiproteiini Aita varten suoritettiin.... Konstruoitiin ilmentymis/sekreetiovektori, joka on nimetty prit3:ksi, joka perustuu e proteiini A -geeniin, ja jossa on restriktioentsyymimultiliittäjä (15). Multiliittäjä ::: 25 sijaitsee välittömästi myötävirtaan viimeisestä IgG:tä sitovasta alueesta, ja eliminoi : :. : siten proteiini A:n C-terminaalisen soluseinää sitovan alueen. pfro01:stä peräisin oleva 3,7 kep:n EcRI-PstI-fragmentti liitettiin tähän vektoriin odottaen sen kooditta-. van proteiini A - FNBP -fuusioproteiinia, josta saatu lukemisrakenne oli korrekti.. Tämä oli itsestään selvä tapaus, koska plasmidi, jota kutsutaan pfro13, on testeissä 30 sekä proteiini A- että FNBP-positiivinen. :-. : I. Plasmidia pfro13 käsiteltiin eksonukleaasilla Ba131 tarkoituksella identifioida alue, joka on 3,7 kep liitosta pienempi, ja koodaa fibronektiiniä sitovaa toimintaa. Plasmidi pilkottiin EcoRI:lla tai Pstl:llä (koodaavan alueen 5'- ja 3'-päässä vastaavasti), käsiteltiin useita kertoja Ba131:11ä ja ligatoitiin uudelleen. Ligatoinnin aikana. '. 35 lisättiin 20-kertainen ylimäärä EcoRI-liittäjää EcoRI-paikkojen viemiseksi uusiin asemiin. Kuvio 3(C) esittää deleetioita, jotka saatiin joko 3'- tai 5'-päähän ja vastaa-

8 101552 vaa fibronektiiniä sitovaa toimintaa. Noin 700 ep geenialue, joka koodaa sitovaa toimintaa sijaitsee deleetionumeron 56 (deleetio 5'-päästä) ja -numeron 22 (deleetio 3'-päästä) päätepisteiden välissä. Deleetioplasmidista numero 56 subkloonattiin 900 ep alue, joka on peräisin äskettäin PvuII-paikkaan viedystä EcoRI-paikasta. Tämä 5 fragmentti kloonattiin puc18:ssa EcoRI:llä ja SmaI:llä pilkottuna. Tulokseksi saatu plasmidi, joka koodittaa fuusioproteiinia, jossa on sekä P-galaktosidaasia ja fibronektiiniä sitovaa toimintaa, nimitettiin pfro15:ksi. Fragmentti voidaan uudelleenkloonata pfro15:stä EcoRI- ja BamHI-pilkonnalla, koska puc18:ssa on multiliittäjä. 10 Restriktiofragmentit subkloonattiin myös kuten kuviossa 3(B) on osoitettu. EcoRI- PstI- ja EcoRI-ClaI-fragmenttien tapauksessa käytettiin proteiini A:n ilmentymisvektoria prit3. Fragmentit BalI-PvuII ja BalI-HincII subkloonattiin ja ilmennettiin puc18:ssa. Kaikissa tapauksissa, paitsi EcoRI-ClaI-fragmentin, saatiin talteen fuusioproteiineja, joilla on fibronektiiniä sitova toiminta. Negatiivinen tulos ClaI-ClaI- 15 subkloonin tapauksessa voi johtua liitoksesta, joka on väärässä lukemisjäijestyksessä. Fuusioproteiinin ZZ-FR valmistaminen ja luonnehdinta 165 kd:n proteiinin saanto (kuvio 2), joka on peräisin E. coli HB101 -solujen lysaatista, jossa on plasmidia pfro01, oli noin 40 pg per litra viljelyväliaineessa. Vaikka 20 esiintyi katoja, jotka johtuivat korkean molekyylipainon yhdisteen degradaatiosta puhdistuksen aikana, kaikki tosiasiat osoittivat, että fnbp-geeni, jossa on endogeeninen promoottori, ilmentyy heikosti E. colissa. Ilmentymistason parantamiseksi käytettiin äskettäin kehitettyä ilmentämisjärjestelmää, joka sallii heterologisten pro- s : : teiinien sekreetion E. colin kasvuväliaineeseen (16). Käytetty plasmidivektori 1 : : 25 pezz318 sisältää geenin kaksi synteettistä, hieman modifioitua IgG:tä sitovaa domeenia stafylokokkiproteiinia A varten, joita edeltää saman geenin promoottori ja signaalisekvenssi. fnbp-geenin noin 600 ep BalI-Pvull-fragmentti (kuvio 3(B)), joka. on kloonattu puc18:ssa, kloonattiin uudelleen pezz318:ssa, joka on pilkottu. EcoRI:llä ja HindIII:11a. Ligatoinnin ja transformaation jälkeen eristettiin pezz-fr.. : 30 Tämä plasmidi koodittaa fuusioproteiinia, joka koostuu IgG:tä sitovasta tuotteesta ZZ ja FNBP:n fibronektiiniä sitovasta alueesta. ZZ-FR-proteiinin valmistamiseksi E. coli -lajia HB101, jossa on plasmidia pezz- FR, viljeltiin yön yli Trypticase Soy Brothissa. Bakteerit poistettiin sentrifugoimalla ja viljelyväliaine vietiin IgG-Sepharose Fast Flow -pylvään läpi. Pylvään TST- 35 puskurilla (50 mm Tris-HC1, ph 7,4, 150 mm NaC1, 0,05 % Tween R 20) pese-

9 101552 misen jälkeen proteiini eluoitiin 0,5 M etikkahapolla titrattuna ph:hon 2,8 käyttämällä ammoniumasetaattia. Noin 50 mg proteiinia eluoitiin pylväästä per litra käytettyä viljelyväliainetta. Lyofilisoinnin jälkeen eluoitu materiaali analysoitiin SDS-PAGE:lla, joka ilmaisi 5 suuremman proteiininauhan olevan noin 63 kd (kuvio 4). Lisäksi esiintyi nauhoja, jotka vastasivat pienempiä fragmentteja, mikä johtuu ilmeisesti fuusioproteiinin proteolyyttisestä degradaatiosta. Intakti proteiini A, joka oli samalla geelillä, esiintyi 56 kd:n hajanaisena nauhana. Geelissä olevat proteiinit siirrostettiin elektroforeettisesti selluloosanitraattipaperiin ja tutkittiin 125I-merkityllä 29 kd:n fibronektiini- 10 fragmentilla. Kuviossa 4 kaistat C ja D osoittavat, että fuusioproteiini, mutta ei intakti proteiini A, sitoo radioaktiivisesti merkittyä fibronektiinifragmenttia. Lisätodiste ZZ-FR-fuusioproteiinin fibronektiiniä sitovasta kyvystä saatiin affiniteettikromatografian avulla Sepharose-pylväällä, joka oli substituoitu 29 kd:n fibronektiinifragmentilla. Fuusioproteiini sidottiin pylvääseen ja eluoitiin affiniteetti- 15 matriksista 6 M GuHC1:11ä (kuvio 5A). ZZ-FR-fuusioproteiinin fibronektiiniä sitova toiminta sijaitsi ilmeisesti FR-alueella, koska intakti proteiini A ei sitoutunut affiniteettimatriksiin (kuvio 5B). ZZ-FR-fuusioproteiinivalmisteen osa, joka ei sitoutunut affiniteettimatriksiin, koostui proteiineista, joissa Mr on alempi kuin intaktien fuusioproteiinien (kuvio 6, kaista A), kun taas materiaali, joka sitoutui pylvääseen,.. 20. koostui lähes puhtaasta intaktin 63 kd ZZ-FR-fuusioproteiinin valmisteesta (kuvio Oe 6, kaista B). Ol Sen määrittämiseksi, kuinka paljon stafylokokkisolujen fibronektiiniä sitovasta ky-. vystä voidaan pitää kloonatun FNBP:n ominaisuutena, mitattiin ZZ-FR-fuusiopro- teiinin inhibointitoiminta. Kuten kuviossa 7 on esitetty, inhiboi fuusioproteiini totaa- : 25 lisesti 125I-merkityn 29 kd fragmentin sitoutumisen sekä intaktin fibronektiinin. : sitoutumisen sekä S. aureus-lajien Newman että 8325-4 soluihin, proteiini A, jota. käytettiin kontrollina, ei inhiboinut sitoutumista (kuvio 7).. Kuuselan raportoitua (6), että S. aureus sitoutuu fibronektiiniin, on kohdistettu.. paljon työtä yrityksiin identifioida bakteerikomponentti (-komponentit), jotka ovat 30 vastuussa sitoutumisesta. Näiden tutkimusten perusteena on ollut, että patogeenisten bakteerien sitoutuminen fibronektiiniin voi edustaa kudoskiinnittymismekanismia, jolla on ratkaiseva merkitys infektion varhaisissa vaiheissa. Proteiinit, jotka on puhdistettu affiniteettikromatografialla immobilisoidun fibronektiinin päällä, ovat osallistuneet stafylokokkisolujen sitoutumiseen fibronektiiniin. Kuitenkin fibronek- 35 tiiniä sitovien proteiinien selostetut molekyylipainot vaihtelevat 18 kd:sta kauttaal-

10 101552 taan 197 ja 210 kd:iin (11, 17). Pääsyynä molekyylikoon hetorogeeniuteen voi olla proteiinien proteolyyttinen degradaatio eristysmenetelmien aikana. Esillä olevassa selostuksessa esitetään geenin, joka koodaa S. aureus -lajista 8325-4 peräisin olevaa fibronektiiniä sitovaa proteiinia, kloonaaminen E. colissa. Kun fnbp- 5 geeni ilmennetään E. colissa endogeenisestä promoottorista, voidaan proteiini eristää periplasmasta osmoottisella shokilla. Tämä osoittaa, että promoottori ohella myös signaalipeptidi, on funktionaalinen E. colissa. Vaikka proteiineilla, jotka on koodattu kloonatulla fnbp-geenillä, on 165 ja 87 kd:n molekyylipaino (kuvio 2), joka on pienempi kuin FNBP:n molekyylipaino, joka 10 FNBP on eristetty S. aureus -lajista Newman (Mr = 210 kd) (12), niiden aminohappokoostumukset muistuttavat läheisesti luonnollisen proteiinin koostumuksia (taulukko 1). Lisäksi vasta-aineet, jotka on herätetty luontaista FNBP:tä vastaan, ristireagoivat 165 ja 87 kd:n proteiinien kanssa. Nämä tiedot osoittavat vahvasti, että proteiinien rakenne, jotka proteiinit on koodattu S. aureus -lajista 8325-4 peräi- 15 sin olevalla kloonatulla geenillä, muistuttaa S. aureus -lajista Newman peräisin olevaa luonnollisen FNBP:n rakennetta. 87 kd:n proteiini voi olla tulosta preterminaatiosta 165 kd:n proteiinin transkriptionaalisella tai translaationaalisella tasolla tai vaihtoehtoisesti proteolyyttisestä pilkkoutumisesta. Tällä hetkellä ei voida selittää, miksi 165 kd:n proteiini on yli kolmekymmentä kertaa aktiivisempi kuin 87 kd:n -. 20 proteiini fibronektiinin sitoutumisen S. aureus -soluihin inhiboinnissa.. t Deleetiokartoituksella käyttäen BaI31-pilkontaa ja subkloonaamalla restriktiofrag-,.. mentit fnbp-geenin alue, joka koodittaa fibronektiiniä sitovaa toimintaa, on paikal-.: listettu noin 300 ep:n alueelle (kuvio 3(B)). Noin 600 ep geenin fragmentti, joka 9 / : : kattaa nämä 350 ep, ligatoitiin suoraan proteiini A -geenin synteettisen IgG:tä si- 1 ; 25 tovan domeenin peräkkäin toistettuun sekvenssiin (zz), jota edeltää proteiini A. -promoottori ja signaalisekvenssi ilmentämisvektorissa pezz318 (16). Tulokseksi. saatu fuusioproteiini (ZZ-FR), jonka molekyylipaino on noin 63 kd määritettynä :.. SDS-PAGE11a (kuvio 4), sisältää ZZ-domeenin 126 aminohappoa, joita seuraa noin.. 200 aminohappoa, jotka on kooditettu 600 ep liitoksella, joka on peräisin fnbp-gee-., 30 nistä. Proteiinin C-terminaalinen pää koostuu aminohapoista, jotka ovat tulosta kaa-.,..., vion ulkopuolelta lukemisesta vektorin lacz'-geenin kautta, kun translaation pysäytyskodoni on saavutettu. Fuusioproteiini (ZZ-FR), joka on ilmentynyt korkealla ta- : solla ja sekretoitunut E. colin viljelyväliaineeseen, on helposti eristettävissä affini- teettikromatografialla käyttäen ZZ-domeenin IgG:tä sitovaa kykyä.

11 101552 ZZ-FR-proteiini sitoutui fibronektiinin 29 kd:n NH2-terminaaliseen domeeniin ja inhiboi täydellisesti intaktin fibronektiinin sitoumisen S. aureukseen (kuviot 5 ja 6). Nämä tiedot osoittavat, että inkubaatio-olosuhteissa käytetyt muut proteiinit, jotka tunnistavat domeenit, jotka ovat fibronektiinin 29 kd:n N-terminaalin ulkopuolella, 5 eivät ole ilmennettävissä stafylokokkisoluilla. Lisäksi FNBP:n fibronektiiniä sitova toiminta on paikallistettu proteiinin melko pieneen segmenttiin. Luontaisen 210 kd:n FNBP:n, joka oli eristetty S. aureus -lajista Newman, äskettäinen analyysi osoitti, että tämä proteiini on multivalentti ja yksi FNBP:n molekyyli kykenee sitomaan 6-9 fibronektiinimolekyyliä (12). Kloonattu fnbp-geeni on johdettu S. 10 aureus -lajista 8325-4. Jos S. aureus -lajien välillä ei olisi eroja, yksi voisi FR-aluetta lukuunottamatta sisältää useita toistavia sekvenssejä. Tähän kysymykseen on vastattu kloonatun fnbp-geenin sekvenssianalyysillä. FR-alueen sekvenssi, jolla on FNBP-ominaisuuksia, on annettu kuviossa 8. On syytä uskoa, että FR-sitova toiminta liittyy kuhunkin 38 aminohappotoistoon, 15 koska Bal 1 -Pvull-fragmentti koodittaa sitovaa toimintaa (ks. kuvio 3); koska Ball-HincII-fragmentti koodittaa sitovaa toimintaa; ja koska HincII-Pvull-fragmentti ei koodita sitovaa toimintaa. Lisäksi yksi ainoa 38 aminohapon toisto on funktionaalinen fibronektiinin sitomisessa, sillä syntetoidulla 38 aminohappoa pitkällä peptidillä (38(2)-toisto) on sitova kyky, kuten on esitetty kuviossa 9. Kukin kolmesta 38 20 aminohapon toistosta oli hyvin homologinen. Esimerkki 2.. Polypeptidin kemiallinen synteesi, joka perustuu nukleotidisekvenssiin, joka koodaa. 38 aminohapon (38(2)-toisto) fibronektiiniä sitovaa aluetta, suoritettiin rakentamalla. aminohapposekvenssi, joka vastaa sanottua nukleotidisekvenssiä alkaen C-terminaa-. ::. 25 lisesta histidiinistä, ja reagoittamalla vaiheittain sopivalla aminohapolla sekä lopuksi reagoittamalla glysiinin kanssa N-terminaalisessa päässä, kiintofaasisynteesillä K.B. Merrifieldin, J. Am. Chem. Soc. 86, s. 304, (1964) mukaisella menetelmällä. Täten.. syntetoitiin polypeptidi, joka vastaa toista aminohappotoistetta, samaten 3 muuta polypeptidiä, jotka ovat osia tästä 38-toistosta, nimittäin 1) polypeptidi, joka kattaa ;.. 30 aminohapot 1-19, 2) polypeptidi, joka kattaa aminohapot 9-30 ja 3) polypeptidi, joka kattaa aminohapot 20-38, syntetoituivat kaikki saman menetelmän mukaisesti. 0 8 II I. Täydellisen 38-toiston, samoin kuin 1-19 aminohappopolypeptidin, 9-30 aminohappopolypeptidin, 20-38 aminohappopolypeptidin sekä näiden kolmen pienemmän polypeptidin seoksen fibronektiiniä sitova kyky testattiin ja tulokset on annettu ku- 35 viossa 9. Täydellisen 38-toiston fragmentit syntetoitiin tarkoituksella tarkistaa, onko

12 101552 fibronektiinisitovuus riippuvainen täydellisestä 38-toistosta, kuten on ennalta odotettu, vai rajoittuvatko fibronektiiniä sitovat ominaisuudet 38 aminohapposekvenssin jollekin pienemmälle alueelle. Kuten kuviosta 9 ilmenee, on fibronektiiniä sitova ominaisuus läsnä vain täydellisessä 38 aminohapon sekvenssissä. 5 Materiaalit ja menetelmät Bakteerilajit ja plasmidit Staphylococcus aureus -lajista 8325-4 peräisin olevan kromosomaalisen DNA:n pbr322:ssa oleva geenipankki, joka on kuvattu aikaisemmin (13):ssa seulottiin kloonien saamiseksi, jotka ilmentävät fibronektiiniä sitovaa toimintaa. Subkloonaus- 10 ja ilmentymiskokeissa käytettiin E. coli -lajeja HB102, (18) ja JM105 (19). Käytetyt plasmidivektorit olivat pbr322 (20), puc18 (21) ja proteiini A -vektorit prit3 (15) ja pezz318 (16). Fibronektiiniä sitovan proteiinin (FNBP) testeissä käytettiin S. aureus -lajeja Cowan I, Newman ja 8325-4. Mikro-organismien viljelyväliaine 15 E. coli -bakteerien viljelyssä käytettiin seuraavaa väliainetta. Annetut määrät koskevat litraa väliainetta. Trypton Soy Broth (Oxoid Ltd,. : Basingstoke, Hants, GB) 30 g : hiivauute (Oxoid) 10 g :.. 20 D-glukoosi 40 g NH4C1 2,5 g Na2HPO4.2H20 7,5 g KH2PO4 3,0 g. Na2SO4.10H20 2,5 g 25 MgSO4.7H20 0,2 g CaC12.2H20 0,5 g FeC13.6H20 16,7 mg ZnSO4.7H20 0,18 mg : CuSO4.5H20 0,16 mg 30 MnSO4.4H20 0,15 mg : CoC12 0,10 mg NaEDTA 20,1 mg

13 101552 Fibronektiiniä sitovan proteiinin (FNBP) analysointi Fibronektiinin sitoutumisen määrittäminen S. aureus -soluihin on kuvattu aikaisemmin (10). Jos muuta ei ole mainittu, 10 9 S. aureus Cowan I -solua inkuboitiin 125I-merkityllä fibronektiinillä tai fibronektiinin 29 kd NH2-terminaalisella frag- 5 mentilla PBS:ssä, joka sisältää 1 mg/ml naudan seerumialbumiinia kokonaismääränä 0,3 ml. 2 tunnin 22 C:ssa inkuboinnin jälkeen soluihin sitoutunut radioaktiivisuus mitattiin gammalaskijalla. E. coli -kloonien lysaatit, jotka valmistettiin Tris-HC1-puskurissa, ph 8,1, joka sisältää lysotsyymi-edta:a, kuten aikaisemmin on kuvattu (13):ssa, analysoitiin fib- 10 ronektiiniä sitovan toiminnan toteamiseksi mittaamalla niiden kyky kilpailla stafylokokkisolujen kanssa sitoutumisesta fibronektiinin 125I-merkittyihin 29 kd NH2- terminaalisiin fragmentteihin. FNBP:n määrä, joka kykenee inhiboimaan sitomista 50 %:iin, on ilmaistu yhtenä toiminnan yksikkönä. Osmoottista shokkimenetelmää käytettiin proteiinien vapauttamiseen E. colin solu- 15 limatilasta (14). FNBP:n puhdistaminen Puhdistaminen perustui affiniteettikromatografiaan fibronektiini-sepharosen päällä, jota seurasi ioninvaihtokromatografia.... Humaani-fibronektiini valmistettiin vanhentuneesta verestä tunnetulla menetelmällä ; :: 20 (22). Fibronektiini dialysoitiin vasten 20 mm Tris-HC1, ph 8,3, ja konsentroitiin. DEAE-pylväässä. Fibronektiinin kytkentä Sepharose SL-4B:hen tehtiin tunnetulla bromisyaaniaktivointimenetelmällä (23). E. coli -lysaatit pumpattiin affiniteettipylvääseen, jota pestiin 0,5 M ammoniumasetaatilla, kunnes perusviiva oli vakaa (noin neljä pylvään tilavuutta). Sitten FNBP... 25 eluoitiin 0,4 M etikkahapolla ja joko neutralisoitiin ammoniakilla tai lyofilisoitiin.. Sen jälkeen kun se oli dialysoitu vasten 10 mm ammoniumasetaattia, jonka ph on säädetty 7,6:een, jossa oli ammoniakkia, suoritettiin lisäfraktionointi ioninvaihto-. 0. kromatografialla Pharmacia FPLC -varusteilla käyttämällä mono Q-pylvästä. ' Nukleotidisekvenssianalyysi... :...: 30 Nukleotidisekvenssi määritettiin Maxam, A.M. et al.:n kuvaamien menetelmien mukaisesti.

14 101552 Aminohappoanalyysi Aminohappokoostumus määritettiin käyttämällä Dunum D-500 -analysaattoria. Näytteitä hydrolysoitiin 6 M HC1:ssa, joka sisältää 2 mg/ml fenolia, 24 tuntia 110 C:ssa. Yksi näytteistä myös hapetettiin permuurahaishapolla kysteiinin ja 5 metioniinin määrittämiseksi. Norluesiinia lisättiin sisäisenä standardina. Proteiini määritettiin (24):n mukaisesti käyttämällä naudan seerumialbumiinia standardina. Elektroforeesi Jos muuta ei ole mainittu, suoritettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi 5-15-%:isissa gradienttigeeleissä. Geelit värjättiin Coomassie brilliant bluella, väri 10 poistettiin ja valokuvattiin. Sädetysimmuunitestimenetelmä Puhdistettu FNBP, jonka arvioitu molekyylipaino on 165 kd SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa, merkittiin 125I-odiinilla tunnetulla kloramiini-t-menetelmällä (25). Jodauksen jälkeen materiaali kromatografoitiin uudelleen fibro- 15 nektiini-sepharose-pylväässä. Inkubointiseokseen, joka sisälsi 125I-FNBP (3400 cpm 10 l:ssa), sekoitettiin erilaisia kaniantiseerumin (joka sisältää vasta-aineita, jotka on suunnattu S. aureus -lajia Newman vastaan) laimennoksia inkubointipuskurissa (PBS, 0,1 % Triton X-100 ja 0,02 % natriumatsidi) tilavuudessa 0,2 ml. Näytteitä inkuboitiin 2 tuntia 20 C:ssa antigeeni-vasta-ainereaktion mandollistamiseksi. 0,1 ml proteiini A - Sepharosen 10-%:ista suspensiota (paino/til.) PBS:ssä lisättiin ja seosta inkuboitiin toinen tunti. Inkubointi pysäytettiin lisäämällä toiset 1,7 ml inkubointipuskuria näytteisiin. Sentrifugoinnin 2000 rpm 3 niin jälkeen supernatantit imettiin pois. Pelletit pestiin kandesti inkubointipuskurissa ja radioaktiivisuus, joka liittyy proteiini A - Sepharoseen mitattiin gammalaskijalla. Restriktioendonukleaasit ja muut entsyymit Restriktioentsyymit, T4-DNA-ligaasi ja Ba131 hankittiin BRL:stä ja käytettiin heidän suositustensa mukaisesti. Muut menetelmät mukaanä lukien DNA-tekniikat olivat oleellisesti tunnettuja (26).

15 101552 Taulukko 1 E. colista pfroo1 eristettyjen fibronektiiniä sitovien proteiinien (87 ja 165 kd) aminohappokoostumusten ja luonnollisen S. aureus -lajista Newman eristetyn luontaisen FNBP:n (210 kd) vertailu. 5 Koostumus (mooli-%) Aminohappo 210 kda) 165 kd 87 kd 10 15. 20 ' asparagiinihappo/asparagiini 15,4 14,6 13,4 treoniini 9,7 10,7 10,3 seriini 7,4 6,5 8,0 glutamiinihappo/glutamiini 17,9 17,1 15,1 proliini 6,3 6,2 5,8 glysiini 8,9 7,9 8,4 alaniini 5,3 4,6 4,7 puoli-kystiini 0,1 0,2 n.d. valiini 7,2 7,8 8,6 metioniini 0,6 0,6 n.d. isoleusiini 4,3 4,7 3,8 leusiini 4,1 4,0 4,6 tyrosiini 2,1 2,3 4,1 fenyylialaniini 2,4 2,0 3,6 histidiini 1,0 3,2 3,0 lysiini 5,3 6,3 6,6 tryptofaani n.d. n.d. n.d. arginiini 1,9 1,2 a) Fröman et al.:sta (1987), (12).0 n.d = ei määritetty.. Esillä olevaa fibronektiiniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää immunointiin, jolloin ;'... 30 proteiini, edullisesti yhdistelmänä fuusioproteiinin kanssa suuren antigeenivasteen.... luomiseksi, injektoidaan annoksina, jotka aiheuttavat immuunireaktion isäntänisäk- käässä. Täten fibronektiiniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää märehtijöiden rokot- : tamiseen stafylokokki-infektioiden aiheuttamaa utaretulehdusta vastaan. Tämän kek-... sinnön fibronektiiniä sitova proteiini on osoittautunut muodostavan vasta-aineita 35 stafylokokkiperäistä nisätulehdusta vastaan hiirimallissa, kuten taulukossa on jäljempänä osoitettu.

16 101552 Taulukko Kokeellinen hiiren nisätulehdus aiheutettiin S. aureus -lajilla SA 113(83A) annoksena 1,0x103 cfu. Immunointi arvioitiin käyttämällä 15 g proteiinia per hiiri fibronektiiniä sitovaa proteiinia, joka on ilmennetty E. colissa, joka sisältää plasmidia 5 pfro01, kuten tässä on identifioitu. 10 Hiiriryhmä Rokot. maitorauhasten määrä Vamman yhteistutkintatyyppi Tutkittujen Vamman mikroskooppinen tyyppi (%) (%) maitorauhasten määrä +++ ++ + 0 A B Cl C2 C3 15 Rokotetut (FNBP) 30 3 8 83 10 11 9 0 0 91 0 Kontrolli 38 50 16 32 3 8 38 0 25 38 0. :... 20 Nisätulehdus: +++ = voimakas; ++ = keskiasteinen; + = lieväasteinen; 0 = ei paljain silmin näkyviä muutoksia; A = yhdenmukaisesti ei-reaktiivinen, totaali nekroosi; B = pitkälle kehittyneitä re- e gressiivisiä muutoksia + lievä tulehdusreaktio; C 1 = levinnyt tulehdusreaktio + pai-. kallinen nekroosi; C2 = levinnyt tulehdusreaktio; C3 = paikallinen tulehdusreaktio; 25 0 = ei reaktiota. 1 Kuten edellä oleva taulukko osoittaa, yhdenmukainen immunointi saadaan aikaan käyttämällä FNBP:tä, joka on ilmennetty E. colilla, joka sisältää plasmidia FRO01. Lisäksi fibronektiiniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää estämään avoimen ihohaavan infektio käsittelemällä haavaa käyttämällä fibronektiiniä sitovaa proteiinia suspensiossa. Täten fibronektiiniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää haavojen hoitoon, esiin. proteiinireseptorien suojastukseen tai immunointiin (rokotus). Jälkimmäisessä tapauksessa isännän ruumis tuottaa spesifisiä vasta-aineita, jotka voivat suojella sitä bakteerilajien invaasiolta, jotka käsittävät tällaista fibronektiiniä sitovaa proteiinia.

17 101552 Täten vasta-aineet estävät bakteerilajien kiinnittymisen vahingoittuneeseen kudokseen. Esimerkkejä kudosvammojen kolonisoinnista ovat: a) ihohaavojen ja sidekudosten kolonisointi, jotka haavat johtuvat mekaanisista 5 vammoista, kemiallisista vammoista ja/tai kuumuudesta johtuvista vammoista; b) limakalvojen haavojen kolonisoinnista, kuten suuontelon, tai maitorauhasten, virtsaputken tai emättimen limakalvojen haavat; c) sidekudosproteiinien kolonisoinnista, jotka sidekudokset ovat altistuneet minimaalisille vammoille (vähäpätöinen vamma) yhteydessä epiteeliin ja endoteeliin 10 (nisätulehdus, sydänläpän infektio, lonkanvaihtokirurgia). Jos esillä olevaa FNBP:tä tai 38 aminohappopolypeptidiä käytetään nisäkkäiden, ihminen mukaan luettuna, immunointitarkoitukseen (rokotus), proteiini tai polypeptidi dispergoidaan steriiliin isotoniseen suolaliuokseen samalla kun optionaalisesti lisätään farmaseuttisesti hyväksyttävää dispergointiainetta. Lisäksi voidaan 15 käyttää erityyppisiä apuaineita kudokseen vapautumisen pitkittämiseksi ja siten proteiinin tai polypeptidin altistamiseksi pitemmäksi aikaa kehon immuunipuolustusjärjestelmälle... Sopiva annostus immunoinnin aikaansaamiseksi on 0,5-5 gg FNBP:tä tai polypep-. tidiä per ruuminpainokilo ja immunointi-injektio. Kestävän immunoinnin aikaan- :: 20 saamiseksi rokotus pitää suorittaa useamman kuin yhden peräkkäisen kerran 1-3 viikon aikana, edullisesti 3 kertaa. : : : Jos esillä olevaa FNBP:tä tai polypeptidiä käytetään ulkoisesti paikallisesti, proteiini : dispergoidaan isotoniseen suolaliuokseen 25-250 gg/1 pitoisuuteen. Haavoja käsitellään sitten vain sellaisella määrällä, joka kostuttaa täydellisesti haavan pinnan... 25 Keskimäärin käytetään haavoihin vain muutama millilitra liuosta tällä tavoin. Kä-. sittelyn käyttämällä proteiiniliuosta jälkeen haavat pestään soveltuvasti isotonisella suola- tai muulla sopivalla haavanhoitoliuoksella. 1 Lisäksi keksinnön mukaista fibronektiiniä sitovaa polypeptidiä samaten kuin mini-. maalista fibronektiiniä sitovaa paikkapolypeptidiä voidaan käyttää stafylokokkilajien 30 aiheuttamien bakteeri-infektioiden diagnosointiin, jolloin esillä olevan keksinnön.. mukainen fibronektiiniä sitova proteiini immobilisoidaan kiinteällä kantoaineella, kuten pienet lateksi- tai Sepharose -palloset, minkä jälkeen seerumien, jotka sisäl-

18 101552 tävät vasta-aineita, annetaan läpäistä ja reagoida FNBP:n kanssa, jolloin FNBP immobilisoituu. Agglutinaatio mitataan sitten tunnetuilla menetelmillä. Lisäksi FNBP:tä tai polypeptidiä voidaan käyttää ELISA-testissä (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay; E. Engvall, Med. Biol. 55, 193, (1977)). Polystyreenimik- 5 rotiitterilevyn kolot peitettiin FNBP:llä ja inkuboitiin yön yli 4 C:ssa. Levyt pestiin sitten perusteellisesti käyttämällä PBS:ää, joka sisältää 0,05 % TWEEN 20, ja kuivattiin. Potilaan seerumin sarjalaimennos tehtiin PBS-Tweenissä, lisättiin koloihin ja inkuboitiin 30 C:ssa 1,5 tuntia. Huuhtelun jälkeen antihumaani-igg:tä, joka oli konjugoitu entsyymiin, tai antinaudan-igg:tä, joka oli konjugoitu entsyymiin, 10 vastaavasti, piparjuuriperoksidaasia tai alkalista fosfataasia lisättiin koloihin ja inkuboitiin 30 C:ssa 1,5 tuntia, kunnes IgG oli sitoutunut siihen ja huuhtelemisen jälkeen lisättiin entsyymialusta, alkalisen fosfataasin tapauksessa p-nitrofosfaattia tai peroksidaasin ollessa kyseessä lisättiin ortofenyleenidiamiinisubstraattia (OPD) vastaavasti. Levyt, jotka käsittivät koloja, huuhdeltiin sitten käyttämällä sitraatti- 15 puskuria, joka sisältää 0,055 % OPD ja 0,005 % H202, ja inkuboitiin 30 C:ssa 10 min. Entsyymireaktio pysäytettiin lisäämällä H202:n 4 N liuosta kuhunkin koloon. Värinkehitys mitattiin käyttämällä spektrofotometria. Käytetystä entsyymialustasta riippuen voidaan käyttää yhtä hyvin fluorointimittausta. ' : 20 Toinen menetelmä stafylokki-infektioiden diagnoimiseksi on käyttää DNA-geenikoetinmenetelmää, joka perustuu FNBP-sekvenssiin tai 38 aminohappopolypeptidi- ' sekvenssiin. Tällöin luonnollinen tai synteettinen DNA-sekvenssi kiinnitetään kiin- II.. teään kantojaan, kuten edellä mainittu polystyreenilevy, esim lisäämällä maitoa pin-. nalle nisätulehdusta diagnosoitaessa. DNA-geenikoetin, joka on merkitty optionaa- 1.. 25 lisesti entsymaattisesti tai radioaktiivisella isotoopilla, lisätään sitten kiinteään oikot : : tasoon, joka käsittää DNA-sekvenssin, jolloin DNA-geenikoetin kiinnittyy sekvens- siin, jossa se on. Entsyymi tai radioaktiivinen isotooppi voidaan sitten helposti. määritellä tunnetuilla menetelmillä.. :. Edellä oleva termi "fibronektiiniä sitova proteiini" käsittää minkä tahansa 38 ami-. 30 nohappopolypeptidisekvenssin samoin kuin sen, jossa 38 aminohappopolypeptidi- sekvenssi muodostaa täydellisen proteiinin minimaalisen fibronektiiniä sitovan pai- : : : kan.

Viitteet 19 101552 8. Beachey, E.H. and Simpson, W.A(1982). Infection 10, 107-110. 5 20. Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heyneker, H:L., Boyer, H.W., Crosa, J.H. and Falkow, S. (1977). Gene, 2, 95-113. 18. Boyer, H.W. and Roulland - Dussoix, D. (1969). J. Mol.Biol: 41, 459-472. 10 9. Courtney, H.S., Ofek,I-, Simpson, W.A.,.Hasty,...D.L. and Beachey, E.H. (1986). Infect. Immun. 53, 454-459. 11. Espersen, F. and Clemmensen, I. (1982). Infect. Immun. 37, 526-531. 17. Fröman, G., Switalski, L.M., Guss, B., Lindberg, M., Höök, 15 M. and Wadström, T. (1986) In Lark, D.L. ed. Protein-Car- bohydrate Interactions in Biological Systems. Academic Press, London, pp. 263-268. 12. Fröman, G., Switalski, L.M., Speziale, P. and Hook, M. (1987) in press. J. Biol. Chem. 20 25. Hunter, W.M. (1978) Radioimmunoassay. In: Wier, K.M. ed. Handbook of Experimental Immunology. London Slackwell. 14.1-14.40... 1. Hynes, R.O. (1985) Annu. Rev. Cell Biol. 1, 67-90... 2. Hynes, R.O. (1986) Sci. Ann. 254, 42-51. 4,.25 6. Kuusela, P. (1978) Nature 276, 718-720. -. 24. Lowry, 0.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. and Randall, :.: R.J., Biol. -Chem. 193, 265=275. 13. Löfdahl, S., Guss 8., Uhlen, M., Philipson, L. and lind- 1:: berg, M. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 697-701.. 30 26. Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrok, J. (1982). Mole- cular cloning: a Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 23. March, S.C., Parikh, I. and Cuatrecasas, P. (1974). Ana- lyt. Biochem. 60, 149-152. 35 27, Maxam, A.M. and Gilbert, W., (1977),.Prcc. Natl. Acad. Sci., 1JSA, 74, 560. 28. Merrifield, K.B., J. Am. Chem. Soc., 86, oo.30 4, (1964) 19. Mess'in2, J. and Carlsson, J. (1984). J. Biotechnol. 1, 253-264.

20 101552 22. Miekka, S.I., Ingham, K.C. and Menache, D. (1982). Thromb Res. 27, 1-14. 15. Nilsson, B., Abrahamsdn, L. and Uhlen, M. (1985). EMBO J. 4, 1075-1080. 5 16. Nilsson, B., Moks, T., Jansson, B., Abrahamsen, L., Elm- blad, A., Holmgren, E., Henrichson, L., Jones, T.A. and Uhlen, M. (1986). Protein Engineering, In press. 21. Norrander, J., Kempe, T. and Messing, J: (1983). Gene, 26, 101-106. 10 14. Nossal, N.G. and Heppel, L.A. (1965). J. Biol. Chem. 241, 3055-3062. 3. Ruoslahti, E. and Pierschbacher, M.D. (1986). Cell, 44, 517-518. 10. Ryden, C., Rubin, K., Speziale, P., Höök, M., Lindberg, 15 M. and Wadström, T. (1983), J. Biol. Chem. 258, 3396-3401. 7. Wadström, T., Switalski, L., Spezi -ale, P., Rubin, K., Ryden, C., Fröman, G., Faris, A., Lindberg, M., Höök, M., (1985), In Jackson, G.J. (ed), Pathogenesis of Infection. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, 20 193-207., 4. Woods, A., Couchman, J.R., Johansson, S., and Höök, M. (1986), EMBO J. 5, 665-670. -.. 5. Yamada, K.M. (1983), Annu. Rev. Biochem. 52, 761-799... :

Patenttivaatimukset 21 101552 1. Hybridi-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se käsittää yhden tai useamman seuraavista nukleotidisekvensseistä: GGC CAA AAT AGC GGT AAC CAG TCA TTC GAG GAA GAC ACA GAA GAA 5 GAC AAA CCT AAA TAT GAA CAA GGT GGC AAT ATC GTA GAT ATC GAT TTT GAT AGT GTA CCT CAA ATT CAT GGT CAA AAT AAA GGT AAT CAG TCA TTC GAG GAA GAT ACA GAA AAA GAC AAA CCT AAG TAT GAA CAT GGC GGT AAC ATC ATT GAT ATC GAC TTC GAC AGT GTG CCA CAT ATT CAC 10 GGA TTC AAT AAG CAC ACT GAA ATT ATT GAA GAA GAT ACA AAT AAA GAT AAA CCA AGT TAT CAA TTC GGT GGA CAC AAT AGT GTT GAC TTT GAA GAA GAT ACA CTT CCA AAA GTA 2. Menetelmä proteiinin valmistamiseksi, jolla on kyky sitoa fibronektiiniä, 15 tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 1 mukaisella hybridi-dna-molekyylillä transformoitua mikro-organismia, ja muodostunut proteiini eristetään. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sanottua transformoitua mikro-organismia viljellään kasvua edistävässä väliaineessa, ja täten muodostunut proteiini eristetään affiniteettikromatografian avulla kolonnissa,.. 20 jossa fibronektiini on sitoutunut liukenemattomaan kantoaineeseen, mitä seuraa.. ioninvaihtokromatografia. 4. Plasmidi pfroo1 sisällytettynä E. coli -kantaan 259, jonka talletusnumero on DSM 4124.

Patentkrav 22 101552 1. Hybrid-DNA-molekyl, kännetecknad av att den omfattar en eller flera av följande nukleotidsekvenser: GGC CAA AAT AGC GGT AAC CAG TCA TTC GAG GAA GAC ACA GAA GAA 5 GAC AAA CCT AAA TAT GAA CAA GGT GGC AAT ATC GTA GAT ATC GAT TTT GAT AGT GTA CCT CAA ATT CAT GGT CAA AAT AAA GGT AAT CAG TCA TTC GAG GAA GAT ACA GAA AAA GAC AAA CCT AAG TAT GAA CAT GGC GGT AAC ATC ATT GAT ATC GAC TTC GAC AGT GTG CCA CAT ATT CAC 10 GGA TTC AAT AAG CAC ACT GAA ATT ATT GAA GAA GAT ACA AAT AAA GAT AAA CCA AGT TAT CAA TTC GGT GGA CAC AAT AGT GTT GAC TTT GAA GAA GAT ACA CTT CCA AAA GTA 2. Förfarande för framställning av protein som förmår binda fibronektin, kän- 15 netecknat av att man utför odling med en mikroorganism transformerad med hybrid-dna-molekylen enligt patentkrav 1, och proteinet som bildas isoleras. 3. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat av att nämnda transformerade mikroorganism odlas i ett växtfrämjande medium, och det protein som sålunda bildas isoleras med affinitetskromatografi i en kolonn, i vilken fibronektinet bun- : 20 dits vid en olöslig bärare, varefter följer jonutbyteskromatografi. 4. Plasmid pfroo1 ingående i E. coli-stammen 259, vars depositionsnummer är DSM 4124.