SUOMI-FINLAND 0 KUULUTUSJULKAISU UTLÄGGNINGSSKRIFt Kv. lk./int. Cl. C 1 2 k 7/00 Lk./KI. 30 h 6 CO Patentti myönnetty 11 11971 Patent meddetat Patenttihakemus Patentansökning 2099/66 Hakemispkiivä Ansökningsdag 11 VIII 1966 Alkupäivä Giltighetsdag O Tullut julkiseksi Blivit offentlig 1 VII 1968 Patentti- ja rekisterihallitus e Pantu nähtäväksi Utlagd 1 X 1970 Patent- och registerstyrelsen Pyydetty etuoikeus Begärd prioritet 13 VIII 1965 USA 479653 (71) Merck & Co. Inc., Rahway, New Jersey, USA (72) Keksijät Uppfinnare: Eugene B. Buynak, Gwynedd View Road, North Wales, Pennsylvania, Maurice R. hilleman, 4107 Fields Drive, Lafayette Hill, Pennsylvania, USA Asiamies Ombud: 0/Y Kolster A/B (54)Menetelmä elävän sikotautiviruksen valmistamiseksi käytettäväksi vasta-aineena rokotteessa - Förfarande för framställning av levande påssjukevirus för användning som antikroppar i ett vaccin. Tämä keksintö koskee menetelmää elävän sikotautiviruksen valmistamiseksi käytettäväksi vasta-aineena rokotteessa. Sikotautia, samoin kuin tuhkarokkoa, pidetään tavallisesti lasten eräänä pienimmistä sairauksista. Tavallisessa kliinisessä infektiossa tämä pitää paikkansa. Erikoisissa tapauksissa kuitenkin virusinfektion kliininen seuraus voi aiheuttaa vakavan jälkitilan, joka voi olla vaarallinen. Sikotaudin tavallisessa tapauksessa akuuttinen kuumevaihe seuraa 18-21 päivän itämisajan jälkeen. Pääasialliset kliiniset ilmenemismuodot ovat kuume sekä yksipuolinen tai kaksipuolinen korvasylkirauhasen paisuminen, toisinaan myös leuanalus- ja kielenalussylkirauhasten paisuminen. Sikotautivirusta voi tavallisesti seurata useiden elimien tai elinsysteemien infektio. Näihin elimiin voivat kuulua lisäkives, eturauhanen, munasarjat, maksa, haima, perna, kilpirauhanen, munuainen, korvasokkelo, silmät, kateenkorva, sydänlihas, sisärauhanen ja keskushermojärjestelmä. Yleisimmin esiintyvät sairaudet ovat aivotulehdus,
2 päänsärky, naamahermotulehdus, kolmois- tai näköhermojen tulehdus, aivo-selkäydinkalvotulehdus (0,5-10 % tapauksista), kovakalvon tulehdus, haimatulehdus johtaen sokeritautiin, ja kivestulehdus tai munasarjatulehdus johtaen toisinaan surkastumiseen ja steriliteettiin. Vakavia komplikaatioita esiintyy usein lasten keskuudessa. Erikoisen vakavana esiintyy infektio täysikasvuisilla, jotka lapsuudessaan ovat välttyneet tältä taudilta. Sikotauti ilman lisätautejakin aikaansaa lapsissa heikentymistä, vanhempien rasittumista ja luonnollisesti pitkäaikaista poissaoloa koulusta. Sikotauti lapsella tai täysikasvuisella voi aikaansaada lieviä lisätauteja, jotka täydellisesti parantuvat tai lisätauteja, jotka johtavat elinten surkastumiseen tai toimintakyvyttömyyteen, joiden seurauksena voi olla pitkäaikainen raajarikkoisuus tai kuolema. Keksinnön mukaiselle menetelmälle elävän sikotautiviruksen valmistamiseksi käytettäväksi vasta-aineena rokotteessa, joka muodostaa ihmisessä vasta-ainetta elinvoimaista sikotautivirusta vastaan aiheuttamatta taudin vakavia kliinisiä ilmaisumuotoja, on tunnusomaista se, että virusta viljellään ainakin 10 erillisellä sarjaviljelyllä hedelmöityneissä kananmunissa ja sen jälkeen saatetaan lisääntymään kananpojan alkiokudosviljelyssä 30-38 C:ssa, joka viljely sisältää 9-11 päivän vanhojen kananpoikien alkioiden kudosta. Aikaisemmin on tutkittu elävän sikotautiviruksen heikentämistä hedelmöityneissä kananmunissa ja kananpojan alkiokudosviljelyssä. Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 107, 804-807 (1961) kuvaa sikotautiviruksen kykyä aiheuttaa sytopatogeenisiä vaikutuksia tietyissä soluviljelyjärjestelmissä. Käytetty virus oli Enders-kanta ja suoritettiin kaikkiaan 53 sarjaviljelyä. Kirjoituksessa ei mainita kuitenkaan mitään siitä, että saatu aine muodostaisi tyydyttävän rokotteen sikotautia vastaan. Edelleen Rhodes et al. Textbook of Virology, 4. painos (1962), s. 250-251, määrittelee selvästi, että rokote voidaan valmistaa toistetuilla sarjaviljelyillä kananpojan alkioviljelyssä, mutta esittää että sikotautivirus kasvaa hitaasti munassa ja että primäärisessä eristyksessä vain panoksen harvoissa munissa voidaan todeta infektiota. Valmistettua rokotetta käytettiin yksinomaan kokeita varten ja siitä ei kehitetty myytävää sikotautirokotetta. Keksinnön mukainen menetelmä käsittää ainakin 10 sarjaviljelyä hedelmöittyneessä kananmunassa, jota seuraa sarjaviljely kananpojan alkiokudosviljelyssä, joita molempia vaiheita tarvitaan varman ja tehokkaan rokotteen kaupallista valmistusta varten. Rokotteen valmistus A. Elinvo5.maisen viruksen eristäminen ja mukauttaminen.
3 Sikotautivirus eristettiin kanan hedelmöittyneisiin muniin kliinisesta aineesta, so. sikotautia sairastavista henkilöistä ja viljeltiin ainakin 10 erillisellä sarjaviljelyllä. B. Heikennetyn sikotautiviruksen rokotteen kehittäminen. Saatu sikotautivirus lisättiin lasipulloihin, jotka sisälsivät kananpoikasen alkiokudosviljelyjä, jotka oli valmistettu leikatuista ja trypsinoiduista suunnilleen 10 päivän vanhoista kananpojan alkioista. Viljelyväliaine voi olla mikä tahansa, joka ylläpitää solun kasvua ja se voi olla esim. tunnettu elatusaine 199, (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 13,1-8, (1950), johon on lisätty vasikan veriheraa. Viruksen lisäämisen jälkeen infektoituja soluviljelyjä inkuboitiin perättäisissä sarjaviljelyissä 30-38 C:ssa eripituisia aikoja, jona aikana virus heikentyi. Virusta sisältävät nesteet otettiin sen jälkeen talteen ja varastoitiin jäähdytettyinä tai alhaisessa lämpötilassa niin että aineen infektoimiskyky säilyi. Edellä mainitut erilliset sarjaviljelyt suoritettiin käyttäen laimennettua ymppiä ja satoja otettiin talteen eri aikavälein. Infektiokykytitraukset suoritettiin HeLa:ssa (HeLa tarkoittaa ensimmäisenä jatkuvasti viljellyn syöpä-kannan soluja) apinamunuaiskudos- tai kananpoikasalkiokudosviljelyissä. C. Rokotteen valmistaminen. Talteenotettujen sikotautivirusten todettiin olevan ei-patogeenisia apinoille ja jyrsijöille, aiheuttavan vain vähän tai ei mitään kliinistä reaktiota ihmisissä ja kehittävän huomattavan vasta-ainepitoisuuden. Virustartuntakyky stabiloitiin sopivalla stabiloimisaineella kuten sakkaroosilla, ihmisalbumiinilla, glutamiinilla, fosfaatilla tai niiden seoksilla. Titrauksen jälkeen sen vaikutusvoiman säilyttämiseksi virusneste jaettiin osiin ja täytettiin ampulleihin käyttöä varten. Tuotetta voidaan varastoida ja annostella jäähdytettynä tai edullisesti jäädytetystä tilasta kuivattuna ja säilytettynä kosteudelta vapaana. Seuraavat kuvaavat esimerkit esitetään. Esimerkki I Menetelmän A mukaan saatu ymppi kuvataan seuraavassa. 9-11 päivän vanhoja kananpoikasalkioita, sen jälkeen kun pää ja raajat oli poistettu, jauhettiin hienoksi aseptisissä olosuhteissa ja leikattu kudos pestiin useita kertoja käyttäen Hanks' BSS (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 31, 196-200, (1949). Pesty kudos trypsinoitiin 36 o C:ssa käyttäen 0,25 % trypsiiniä (Difco 1:250) tris-salin-puskurissa (puskurijärjestelmä, jossa puskuriaineena 2-amino-2-hydroksimetyy - li-1,3-propaanidioli) 2-3 tunnin aikana. Trypsinoitu suspensio otet-
4 tiin talteen steriilin kaksinkertaisen juustokankaan lävitse ja sentrifugoitiin 5 min. kierrosnopeuden ollessa 1500 kierrosta minuutissa. Solut suspensoitiin uudelleen viljelyväliaineeseen laskemista varten. Viljelyväliaine käsitti elatusaineen 199 ja sisälsi 2 % agammavasikan veriheraa (kuumennettu 56 C:ssa 30 minuuttia (agamma-vasikan verihera tarkoittaa vasikan veriheraa, josta gamma-globuliini-proteiini-fraktiot on poistettu) ja 50 mcg/ml neomysiiniä. Pulloviljelyt laimennettiin väkevyyteen 350 000 elävää solua/ml. Viljelyn jälkeen 36 C:ssa 48-72 tunnin ajan pulloviljelyä voidaan käyttää sarjaviljelyä varten tai rokotteen valmistusta varten. Kananpoikasalkiokudosviljelyt valmistettiin lasipulloissa käyttäen elatusainetta 199, joka sisälsi 2 % inaktivoitua vasikan veriheraa viljelyväliaineena. 3-4 päivän kuluttua viljelyväliaine poistettiin aseptisesti ja pulloviljelyt pestiin neljästi käyttäen 100 ml Hanks' BSS pesukertaa kohti ja ympättiin pulloa kohti 2,5 ml:11a laimennettua sikotautivirusta. 70 ml elatusainetta 199, joka sisälsi 10 % sopivaa viruksen tartuntakykyä stabiloivaa ainetta, lisättiin jokaiseen pulloviljelyyn ja pulloja viljeltiin 30-34 C:ssa. Neomysiiniä lisättiin 50 mcg/ml viljelyväliaineeseen. Useita satoja otettiin talteen 2-4 päivän väliajoin ja pulloviljelyjä huuhdottiin tuoreella väliaineella, joka sisälsi edellä mainittua stabiloimisainetta. Suoritettiin 10 perättäistä sarjaviljelmää lämpötilan ollessa kaikkien kohdalla noin 32 C. Jokaisesta sadosta suoritettiin tartuntakykytitraukset HeLa:ssa tai apinanmunuaiskudosviljelyissä. Jokainen sato otettiin talteen aseptisesti steriiliin säiliöön, josta otettiin näytteitä mikrobiologista steriliteettikoetta varten ja loppuosa siitä jäähdytettiin kuivassa jää-alkoholihauteessa. Virusta sisältävät nesteet varastoitiin -70 C:ssa sähköllä toimivassa jäähdytysyksikössä ennenkuin niitä käytettiin rokotteen valmistamista varten. Sato tai sadot valikoitiin tartuntakykytitrausten tulosten perusteella. Sopivaksi katsottu materiaali poistettiin jäähdytyslaitteesta ja sulatettiin. Näyte poistettiin kontrollia ja varmuuskoetta varten. Jäljellä oleva neste kirkastettiin ja siitä otettiin näyte varmuuskoetta varten käyttäen apinaa. Lisää stabiloimisainetta lisättiin jäljellä olevaan nesteeseen. Nesteet jaettiin erillisiin pulloihin ja kuivattiin. Kuivauskäsittelyn jälkeen pullot suljettiin, tiivistettiin ja säilytettiin rokotteen valmistamiseksi lisäämällä steriiliä vettä. Kokeet ihmisillä. Noin 150 lasta, joilla aikaisemmin ei ole ollut sikotauti-
5 infektiota, sai annoksen heikennettyä sikotautivirusrokotetta parenteraalisesti. Melkein kaikille lapsille muodostui huomattava vasta-ainetiitteri kuukauden sisällä rokotteen antamisesta. Lapsille kehittyi vähän tai ei ollenkaan kliinisiä reaktioita riippuen sikotautiviruksen kannasta ja suoritetusta sarjaviljelystä kanan alkiovaiheisissa muna- tai kananpojan alkiokudosviljelyissä. Esimerkki II Esimerkin I mukainen menettely suoritettiin, mutta sikotautivirukset viljeltiin 35-38 C:ssa ja viljely lopetettiin 36 C:ssa. Voitiin tehdä useita peräkkäisiä sarjaviljelyjä kananpojan alkiokudosviljelyssä viruksen heikentamiseksi. Tätä voi myös edeltää sarjaviljely kanan alkiovaiheissa olevien munien avulla. Tätä kuvataan seuraavassa. UM edustaa kanan alkiovaiheisia munia. CET edustaa kananpojan alkiokudosviljelyä. Esimerkki III 10 UM 30-3 8 C:ssa + 10 CET 30-38 C:ssa. Esimerkki IV 10 EAM 30-38 C:ssa + 2 CET 30-38 Cssea. Esimerkki V 15 EAM 30-38 C:ssa + 2 CET 30-38 C:aea. Esimerkki VI 20 EAM 30-38 C:ssa + 2 CET 30-38 C:ssa.
6 Patenttivaatimus: Menetelmä elävän sikotautiviruksen valmistamiseksi käytettäväksi vasta-aineena rokotteessa, joka muodostaa ihmisessä vasta-ainetta elinvoimaista sikotautivirusta vastaan aiheuttamatta taudin vakavia kliinisiä ilmaisumuotoja, t u n n e t t u siitä, että virusta viljellään ainakin 10 erillisellä sarjaviljelyllä hedelmöityneissä kananmunissa ja sen jälkeen saatetaan lisääntymään kananpojan alkiokudosviljelyssä 30-38 C:ssa, joka viljely sisältää 9-11 päivän vanhojen kananpoikien alkioiden kudosta. Patentkrav: Förfarande för framställning av levande påssjukevirus för användning som antikroppar i ett vaccin, som hos människan framkallar antikroppar mot det virulenta påssjukeviruset utan att förorsaka sjukdomens allvarliga kliniska yttringar, k ä n n e t e c k- n a t därav, att viruset kultiveras i med minst 10 olika seriekulturer befruktade hönsägg och bringas därefter att föröka sig i vävnadskultur av kycklingembryo vid 30-38 C, vilken kultur innehåller vävnader av 9-11 dagar gamla kycklingembryon. Viitejulkaisuja Anförda Dublikationer Gresser I et al, Proc. Soc. Exp. Biol. and Med UI (1961) 804-807. Rhodes et al, Textbook of Virology, 4 ed. 1962, 250-251