12.10. Kromatografian perusteet 740151P Biokemian menetelmät I 2.10. ja 9.10. Juha Kerätär / BMTK Päivän aiheet Mitä on kromatografia? Taso- ja pylväskromatografian yleiset sovellukset biokemiassa. Opiskelija tietää ja osaa kertoa, mitä tarkoittavat kromatografiset menetelmät. Opiskelija ymmärtää kromatografisten menetelmien biokemiallisen taustan, ja osaa kertoa, mihin niitä voidaan käyttää. Kromatografiset menetelmät kromatografia Laboratoriotekniikoita, joilla seoksen aineet saadaan eroteltua toisistaan jonkin niiden ominaisuuden perusteella. Preparatiiviset kromatografiamenetelmät: aineiden erottelu toisistaan uusia kokeita varten. Analyyttiset kromatografiamenetelmät: aineiden erottelua jonkin ominaisuuden perusteella käytetään aineiden tutkimisen välineenä. Molekyylin tunnistaminen vertailemalla tuntematonta ainetta standardinäytteeseen. Eivät sulje toisiaan pois menetelmässä, jossa erotellaan seoksen aineet toisistaan ja kerätään ne talteen, voidaan saada myös analyyttista tietoa. 1
12.10. Esimerkki: proteiinin puhdistus kromatografialla Tutkittavaa proteiinia on tuotettu yhdistelmä- DNA:n avulla bakteerisoluissa. Bakteerisoluissa on tuotetun proteiinin lisäksi tuhansia erilaisia proteiineja. Rekombinanttiproteiinissa usein merkkihäntä (esim. His-tag) Proteiinit ominaisuuksiltaan yksilöitä: Aminohapposekvenssi, koko Kolmiulotteinen rakenne Pintavaraus ja sen riippuvuus liuoksen ph:sta Hydrofobisuus tai hydrofiilisyys Kyky tarttua spesifisesti kohdemolekyyliin (substraatti, toinen proteiini) Proteiinit toimivat usein komplekseina muiden proteiinien kanssa. Kullekin proteiinille on etsittävä yhdistelmä erilaisia (kromatografisia) menetelmiä, joilla muut proteiinit saadaan erotettua ja puhdistettava proteiini pysymään aktiivisena. Viimeisen puhdistusvaiheen jälkeen proteiinin tulee olla riittävän puhdas siihen käyttöön mihin se on tuotettu, ja sitä on oltava riittävästi tätä käyttöä varten. Esimerkiksi proteiinin tuotossa rakennetutkimukseen (kiteytykseen ja röntgenkristallografiaan): vähintään 10 mg erittäin puhdasta proteiinia. Kromatografian yleinen periaate Kromatografiassa tutkittava näyte on vuorovaikutuksessa kahden fysikaalisesti erilaisen materiaalin kanssa samanaikaisesti. Liikkuva faasi (mobile phase) Stationäärifaasi (stationary phase) eli paikallaan pysyvä faasi Tutkittava näyte lisätään liikkuvaan faasiin. Liikkuva faasi kuljettaa näytettä stationäärifaasin läheisyydessä. Kromatografian yleinen periaate Näytemolekyylien erilaiset vuorovaikutukset stationäärifaasin ja liikkuvan faasin kanssa ovat kromatografian perusta. Näytteen eri molekyyleillä voi olla erilainen affiniteetti stationäärifaasiin. (Affiniteetti = molekyylien taipumus olla vuorovaikutuksessa stationäärifaasin kanssa.) Jos molekyyli vuorovaikuttaa voimakkaasti stationäärifaasin kanssa liike kromatografiasysteemin läpi hidastuu. Jos molekyylin vuorovaikutus stationäärifaasin kanssa on heikko poistuu kromatografiasysteemistä eli eluoituu nopeammin. 2
ajosuunta 12.10. Kromatografian tyypit Kromatografisia menetelmiä voidaan luokitella useilla eri perusteilla: Stationääri- ja liikkuvan faasin fysikaalinen olomuoto esim. este-neste, kiinteä-neste, neste-kaasu Erottumisen periaate adsorptio, partitio Stationääri- ja liikkuvan faasin kemialliset ominaisuudet esim. polaarinen, pooliton Stationäärifaasin muoto esim. taso, pylväs Menetelmän tarkoitus preparatiivinen, analyyttinen Stationäärifaasin fysikaalinen tai kemiallinen luonne ominaisuus, johon näytteen erottuminen perustuu Sama menetelmä voidaan luokitella usealla eri tavalla. Tällä kurssilla pääpaino taso- ja pylväskromatografiassa, sekä pylväskromatografian eri muotoihin stationäärifaasin ominaisuuksien perusteella jaoteltuna. Tasokromatografia (planar chromatography) Tyypillisesti paperi- ja ohutlevykromatografiaa (thin layer chromatography, TLC). Perustuu partitioon eli molekyylien väliseen sitoutumisvuorovaikutukseen. Molekyylit erottuvat, koska eri molekyyleillä on eri jakautumisperuste liikkuvan ja stationäärifaasin välillä. Näytemolekyylit jakautuvat kahden liuosfaasin välillä: stationäärifaasi on päällystetty nestemäisellä adsorbentilla. Paperikromatografiassa stationäärifaasina on selluloosaan sitoutunut vesi. Ohutlevykromatografiassa stationäärifaasina on liuos, jota on käytetty pintamateriaalin valmistukseen (usein vesi). Liikkuvan faasin polaariset molekyylit voivat sitoutua stationäärifaasiin. Näytteiden erottuminen perustuu niiden liukoisuuteen stationäärifaasin ja nestemäisen liikkuvan faasin välillä. https://youtu.be/qdmkgskcyh8 Paperi- ja ohutlevykromatografian suoritus Tyypillisesti silikageelillä päällystetty lasilevy. Levylle voi piirtää lyijykynällä apuviivan ja pisteet pipetoimiseen noin 2 cm levyn alareunasta. Käsittele ohutlevyä suojakäsineet kädessä ja vain reunoihin koskien! Näyte on yleensä liuotettu helposti haihtuvaan liuottimeen. Pipetoidaan pieni määrä kerrallaan levyn alareunaan, annetaan liuottimen haihtua lisäysten välissä. Erotuskyky paras, kun näyte mahdollisimman pienellä alueella. Liikkuvia faaseja (ajoliuoksia) on olemassa useita erilaisia. Käytettävän ajoastian tulee olla tarpeeksi tiivis, jotta kaasuuntuva ajoliuos kyllästää ilman astian sisällä. Ajoastian pohjalla ei saa olla niin paljon ajoliuosta, että se koskettaisi (= liuottaisi) näytepisteet. 3
12.10. R f = ajoliuoksen kulkema matka näytepisteiden kulkemat matkat näytepisteen kulkema matka ajoliuoksen kulkema matka Ajoliuos kulkee ylöspäin ohutlevyllä kapillaari-ilmiön avulla. Erilaiset näytepisteeseen pipetoidut molekyylit liikkuvat eri nopeudella ohutlevyllä, riippuen levyn materiaalista ja ajoliuoksesta (= stationääri- ja liikkuvasta faasista) Ajo täytyy lopettaa ennen kuin ajoliuos saavuttaa ohutlevyn huipun. Merkitse ajoliuksen kulkema matka heti levylle. Jos näytemolekyylit eivät ole värillisiä, ohutlevy täytyy värjätä tai muuten visualisoida tutkittavat molekyylit (esim. lipidejä tutkittaessa kuivuneen levyn värjäys jodikammiossa). Ohutlevyllä kulkeutuneille näytepisteille lasketaan suhteellinen liikkuvuus R f (relative mobility, myös retention factor ): pisteen keskikohdasta laskettu kuljettu matka jaettuna ajoliuksen kulkemalla matkalla. Mihin paperi- ja ohutlevykromatografiaa käytetään? Tuntemattomien molekyylien tunnistaminen. Ajetaan tuntematon näyte yhtä aikaa erilaisten standardimolekyylien kanssa. Verrataan saatuja R f-arvoja kirjallisuudesta saatuihin arvoihin samalla kromatografiamenetelmällä. Molekyylin eristäminen näyteseoksesta. Tasokromatografiamenetelmien etuja: Tarvittava näytemäärä on pieni. Analyysin tekeminen on halpaa ja nopeaa. Näytteiden havainnointi kromatogrammilta suoraviivaista. Pienten molekyylien tunnistamiseen: erityisesti aminohappojen, sokerien ja rasvahappojen erottelu ja tunnistaminen. BMTK:ssa käytetään lähinnä harjoitustöissä. Tyhjä gravity flow pylväs (Bio-Rad) Pylväskromatografia Superdexgeelisuodatuspylväs (GE) HisTrap FF IMAC-pylväs (GE) Pylväskromatografiassa kiinteä stationäärifaasi on pakattu lasi-, muovi- tai metallipylvääseen ja nestemäisen liikkuvan faasin annetaan virrata pylvään läpi. Menetelmä perustuu yleensä näytemolekyylin adsorptioon stationäärifaasiin, eli suhteellisen spesifisiin, reversiibeleihin vuorovaikutuksiin näytemolekyylin ja stationäärifaasin välillä. Biokemiassa usein käytettyjä pylväskromatografian sovelluksia: - Ioninvaihtokromatografia (ion-exchange) - Affiniteettikromatografia (affinity chromatography) - Immobilisoitu metalli-ioni affiniteettikromatografia (IMAC) - Hydrofobinen vuorovaikutus kromatografia (HIC) - Geelisuodatus (gel filtration) Stationäärifaasi koostuu huokoisista, pienikokoisista pallomaisista partikkeleista, joita kutsutaan matriksiksi. - Matriksilla suuri pinta-ala enemmän mahdollisuutta vuorovaikuttaa liikkuvan faasin kanssa. 4
12.10. Pylväskromatografian suoritus Pylvään pakkaaminen Voidaan pakata itse kaupallisesta matriksista. Tutkimuksessa käytetään usein valmiiksi pakattua, kaupallista pylvästä. Tasapainotus Pylväs tasapainotetaan valuttamalla käytettävää liikkuvaa faasia (eluenttia, eluointipuskuria) sen läpi. Näytteen lataaminen Konsentroitu näyte siirretään pylvään yläpäähän ja annetaan näytteen sekä eluentin vuorovaikuttaa matriksin eli stationäärifaasin kanssa. Pylvään pesu Matriksiin epäspesifisesti sitoutuneet molekyylit irtoavat liikkuvan faasin mukana. Voidaan käyttää myös ominaisuuksiltaan poikkeavaa pesupuskuria. Näytteen eluointi Näytteen molekyyleillä erilainen vuorovaikutus matriksiin ja eluenttiin voivat ajautua pois pylväästä eri hetkillä ja siten fraktioida pieniin eriin. HPLC-laitteisto (high performance liquid chromatography). Tietokoneen kautta hallittavassa järjestelmässä, jossa on esimerkiksi pumppu, spektrofotometri ja fraktionkerääjä voidaan käyttää erilaisia kaupallisia tai käsin pakattuja pylväitä. Eluentti voi virrata pylvään läpi joko painovoiman avulla, tai voidaan käyttää pumppujärjestelmää. Näytteiden eluointiin pylväästä on erilaisia tapoja: Jatkuva eluutio: eluointipuskuri on koko ajan sama. Portaittainen eluutio: puskurin jotain ominaisuutta (esim. ph tai, komponentin konsentraatio) muutetaan portaittain. Asteittainen eluutio (gradientti): kaksi eluointiliuosta, joista toisen suhteellinen osuus kasvaa lineaarisesti. Fraktiot kerätään fraktionkerääjällä tai käsin omiin putkiinsa. - Esimerkki: Pylväs on pakattu 20 ml:lla matriksia. Pylvääseen ladataan pumpulla 1 ml näytettä, ja sen jälkeen näyte eluoidaan 40 ml:lla eluointipuskuria. Eluointipuskuri kerätään 1 ml fraktioina (= 40 x 1 ml putkea). Fraktioista ei juuri koskaan näe paljaalla silmällä näytemolekyylejä. Kromatografian etenemistä on seurattava jollain tapaa, tai näyte on muuten visualisoitava fraktioista. Spektrofotometria: Fraktioista mitataan absorbanssi halutulla aallonpituudella, tai eluoituva neste voi kulkea ennen fraktiokeräystä spektrofotometrin läpi. Esimerkiksi proteiinin puhdistumisen seuranta aallonpituudella 280 nm. Geelielektroforeesi: Näytteet (kiinnostavista) fraktioista tutkitaan tarkemmin geelielektroforeesilla. Entsyymiaktiivisuus: Fraktiot, joissa esimerkiksi puhdistettava, aktiivinen entsyymi esiintyy voidaan tunnistaa. Paperi- tai ohutlevykromatografia. Jos tarvitaan vain pieni määrä (µg) puhdistettua näytettä, pylväskromatografia voidaan tehdä myös ns. batchpuhdistuksena eppendorf-putkessa. - Matriksia 10-200 µl. - Pesut ja eluutiot tehdään sentrifugoimalla. 5
12.10. Ioninvaihtokromatografia The Principle of Ion Exchange Chromatograpy (GE Life Sciences) https://youtu.be/q3fmqgt1do8 Adsorptiokromatografian muoto, joka soveltuu varauksellisten molekyylien puhdistamiseen. Pylvääseen pakattu stationäärifaasi on synteettista materiaalia, johon on kovalenttisesti liitetty ionisia toiminnallisia ryhmiä. Liikkuvan faasin ja näytteen varaukselliset molekyylit muodostavat reversiibeleitä elektrostaattisia vuorovaikutuksia varautuneen stationäärifaasin kanssa. - Erimerkkisten varausten väliset vuorovaikutukset. - Dipoliset vuorovaikutukset. Matriksi, jossa on negatiivisesti varautuneita ryhmiä, sitoo positiivisesti varautuneita molekyylejä eli kationeja = kationinvaihtaja. Ioninvaihtajan eli stationäärifaasin valitseminen Stationäärifaasin valinta on yksinkertaista, jos tutkittavassa molekyylissä on vain yhdenlaisia varauksellisia ryhmiä. Biologisissa molekyyleissä kuitenkin usein sekä positiivisesti että negatiivisesti varautuneita ryhmiä. Proteiinille voidaan laskea sen aminohapposekvenssin perusteella isoelektrinen piste (pi). Jos ph = pi, proteiinimolekyylin nettovaraus on nolla. Jos liuoksen ph > pi: proteiini on negatiivisesti varautunut sitoutuu anioninvaihtajaan. Jos liuoksen ph < pi: proteiini on positiivisesti varautunut sitoutuu kationinvaihtajaan. Huomioitava kuitenkin, että proteiini on stabiili vain tietyllä ph-alueella! Puskurin eli liikkuvan faasin valitseminen Näytettä matriksiin sitoessa puskurin ioneilla tulisi olla sama varaus kuin matriksilla, jotta ne eivät tartu matriksiin ja laske sen sitomiskapasiteettia. Puskurin ionivahvuus ei saa olla liian suuri, koska korkeat ionivahvuudet häiritsevät puhdistettavan molekyylin ja pylväsmateriaalin välisiä vuorovaikutuksia. Puskurin ph valitaan alueelta, jossa erotettava molekyyli, esimerkiksi proteiini, on stabiili ja varautunut niin, että se sitoutuu matriksiin. Eluointi tapahtuu häiritsemällä matriksin ja sitoutuneen molekyylin vuorovaikutusta: Puskurin suolapitoisuuden nosto toistettavin tapa. ph:n muuttaminen tapauskohtaista, stabiilius! Usein käytetään gradienttieluutiota. 6
12.10. Ioninvaihtokromatografian periaate: anioninvaihtaja 1. Positiivisesti varautuneeseen matriksiin sitoutunut puskuriliuoksen negatiivisesti varautuneita ioneja. 2. Näyte ladataan pylvääseen. Näytteen molekyylit varautuneet positiivisesti, neutraalisti ja negatiivisesti. Varaus riippuu olosuhteista, mm. ph:sta. 3. Molekyylit, joilla on vastakkainen varaus matriksin kanssa, sitoutuvat stationäärifaasiin. Sitoutumisen voimakkuus riippuu varauksen suuruudesta. Neutraalit ja saman varauksen omaavat eivät sitoudu, vaan eluoituvat. Epäspesifisesti tai heikosti sitoutuneet molekyylit pestään pois. 4. Matriksi pestään puskurilla, jossa on suurempi ionivahvuus tai eri ph kuin näytettä sidottaessa. 5. Molekyylit, joiden varaus on nyt suurempi, syrjäyttävät sitoutuneen molekyylin matriksissa. Affiniteettikromatografia The Principle of Affinity Chromatograpy (GE Life Sciences) https://youtu.be/fuaqkjkt99y Affiniteettikromatografiassa molekyylien erottelu perustuu spesifisiin vuorovaikutuksiin stationäärifaasin ja näytemolekyylin välillä. Käytetään stationäärifaasia, johon puhdistettavan molekyylin ligandi on kovalenttisesti sidottu eli immobilisoitu. Jos molekyyli B saa molekyyli A:han spesifisesti sitoutuessaan aikaan biologisen vasteen sanotaan biokemiassa että molekyyli B on molekyyli A:n ligandi. (A + B A:B biologinen vaste) Käytetään mm. nukleiinihappojen ja erilaisten proteiinien (entsyymien, vastaaineiden, rekombinanttiproteiinien) eristämiseen ja puhdistamiseen. Pylväät tyypillisesti melko pieniä näytteen kokoon verrattuna vain murto-osa näytteen molekyyleistä sitoutuu pylvääseen. Affiniteettimatriksin valinta Affiniteettikromatografiassa käytetään kaupallisia matrikseja, joissa Valmis ligandi TAI Aktiivinen toiminnallinen ryhmä, johon oma ligandi voidaan liittää. Eivät sido epäspesifisiä molekyylejä. Fysikaalisesti ja kemiallisesti stabiileja erilaisissa olosuhteissa. Ligandi voidaan valita vasta kun tiedetään jotain tutkittavasta molekyylistä! Vuorovaikutuksen on oltava voimakas ja spesifinen, mutta reversiibeli tutkittavaan molekyyliin. Sisältää reaktiivisen ryhmän, joka voidaan sitoa matriksiin. Esimerkkejä: Vasta-aine + antigeeni Entsyymi + substraatti, inhibiittori, kofaktori tai substraattianalogi Lähetti-RNA + oligo (dt) 25 7
12.10. Ligandi ja siihen sitoutunut molekyyli vuorovaikuttavat vetysidosten sekä hydrofobisten ja kovalenttisten vuorovaikutusten kautta. Ligandin ja sitoutuneen molekyylin välisiä vuorovaikutuksia häiritään eluoinnin aikana: Epäspesifinen eluutio: ph:n muutos Ionivahvuuden muutos Molekyylin heikko denaturointi Spesifinen eluutio: Eluutiopuskuriin lisätään molekyyliä, joka kilpailee ligandin kanssa näytemolekyyliin sitoutumisesta tai näytemolekyylin kanssa ligandiin sitoutumisesta. Eluointi affiniteettipylväästä Affiniteettikromatografian suoritus 1. Ligandi sidotaan stationäärifaasiin 2. Molekyyli ladataan ja se sitoutuu ligandiinsa. 3. Molekyyli irrotetaan ligandista sitoutumisesta kilpailevalla molekyylillä. Affiniteettimatriksi (stationäärifaasi) pakataan pylvääksi (tai käytetään valmiiksi pakattua, kaupallista pylvästä). Näyte ladataan pylvääseen ja ajetaan sen läpi. Matriksin ligandien kanssa vuorovaikuttavat molekyylit sitoutuvat pylvääseen. Muut molekyylit tulevat ulos pylväästä. Pylvääseen kiinnittynyt molekyyli eluoidaan pylväästä häiritsemällä ligandin ja sitoutuneen molekyylin välisiä vuorovaikutuksia lisäämällä molekyyli, joka kilpailee ligandeista tai näytemolekyylistä. 6xHis Immobilisoitu metalliioni-affiniteettikromatografia (IMAC) PDB-rakenne 2BV9 rekombinanttiproteiinista, jossa histidiinihäntä. (Clostridium thermocellumin lichenaasi-entsymi). Affiniteettikromatografian alatyyppi, jossa proteiinija tai peptideitä erotellaan niiden erilaisen metalli-ioniin kohdistuvan affiniteetin perusteella. Kahdenarvoisia metalli-ioneja (Ni 2 +, Zn 2 +, Cu 2 +, jne.) immobilisoidaan pylvääseen kelaation avulla. Tietyt aminohapot (histidiini, kysteiini, tryptofaani) voivat muodostaa komplekseja kelatoitujen metalli-ionien kanssa neutraalissa ph:ssa. Proteiini eluoidaan laskemalla ph:ta, lisäämällä sitoutumisen kanssa kilpailevan molekyylin konsentraatiota, tai lisäämällä EDTA:ta. https://www.thermofisher.com/fi/en/home/life-science/proteinbiology/protein-biology-learning-center/protein-biologyresource-library/pierce-protein-methods/his-tagged-proteinsproduction-purification.html 8
12.10. IMAC:n käyttö IMAC:iaa käytetään yleisesti etenkin histidiinihännän sisältävien rekombinanttiproteiinien puhdistamisessa. Neljä nikkeli-ionin kuudesta sitoutumiskohdasta sitoutuneina matriksimateriaaliin. Jäljelle jäävät kaksi ovat vapaita sitoutumaan rekombinanttiproteiinin histidiinihäntään. Proteiinin eluointi: Imidatsolin lisääminen: natiivi eluointi, imidatsoli kilpailee sitoutumisesta histidiinin kanssa. ph:n lasku: denaturoiva eluointi Hydrofobinen vuorovaikutus kromatografia (HIC) The Principle of Hydrophobic Interaction Chromatograpy (GE Life Sciences) https://youtu.be/v6spk6zovga Hydrofobinen vuorovaikutuskromatografia (hydrophobic interaction chromatography) perustuu molekyylien, yleensä proteiinin, erotteluun hydrofobisten eli vesipakoisten vuorovaikutusten perusteella. Laskostuneen proteiinin pinnan rakenteet ovat tyypillisesti hydrofiilisiä (pääasiassa solulimassa olevat proteiinit ts. ei kalvoproteiinit). Niiden pinnalla on kuitenkin myös joitain hydrofobisia ryhmiä, ja HIC perustuu niiden vuorovaikutukseen matriksiin sidottujen hydrofobisten ryhmien kanssa. Proteiinin pinnan hydrofobiset alueet johtuvat ei-polaarisista aminohapoista (Ala, Phe, Val, Trp, Leu, Ile, Met), niiden määrä ja luonne on kullekin proteiinille ominainen. HIC:n käyttö Proteiininäyte laitetaan pylvääseen korkeassa suolapitoisuudessa (vertaa miten ioninvaihtokromatografiassa!). Korkea suolapitoisuus (esim. Na 2 SO 4, NaCl tai (NH 4 ) 2 SO 4 ) syrjäyttää proteiinin hydrofobisten alueiden ja matriksin hydrofobisten ryhmien ympärillä järjestyneitä vesimolekyylejä, kasvattaen hydrofobisia vuorovaikutuksia. Proteiinit eluoidaan pylväästä: Laskemalla suolapitoisuutta Muuttamalla jollain muulla tavalla liikkuvan faasin polaarisuutta (detergentit, orgaaniset liuottimet) Muuttamalla ph:ta HIC on mieto puhdistusmenetelmä proteiini säilyy natiivimuodossaan. Käytetään usein rekombinanttiproteiinien puhdistamisessa rakennetutkimuksia varten. 9
12.10. Geelisuodatuskromatografia poikkeaa muista kromatografiamenetelmistä siinä, että näytteen molekyylien erottelu perustuu ainoastaan niiden kokoon. The Principle of Gel Filtration Chromatography (GE Life Sciences) https://youtu.be/ov5vb5ko3tq Ei biokemiallisia vuorovaikutuksia molekyylien, liikkuvan faasin ja stationäärifaasin välillä. Kirjallisuudessa useita nimiä: gel filtration, gel exclusion, molecular sieve, gel permeation chromatography (GPC). Soveltuu laajalle kirjolle erikokoisia molekyylejä kymmenistä useisiin miljooniin Da. Voidaan käyttää proteiinien, nukleiinihappojen, polysakkaridien ja muiden biomolekyylien puhdistamiseen. Geelisuodatuskromatografia Geelisuodatuksen suoritus Stationäärifaasi koostuu pienistä, inerteistä varauksettomista partikkeleista, joissa on kontrolloidun kokoisia reikiä. Mikroskooppikuvassa näyttävät pesusieneltä. Liikkuva faasi on koko ajan samanlainen, eikä kromatografiassa ole pesuvaihetta. Liikkuvan faasin ainoa tehtävä on kuljettaa näyte pylvään läpi. Molekyylien eluutiotilavuus (missä eluutiopuskurin tilavuudessa ne tulevat ulos pylväästä) on suoraan suhteessa niiden molekyylipainoon ja muotoon. Molekyylit, joiden koko on suurempi kuin partikkelien reiät, kulkeutuvat nopeammin pylvään läpi, ja siten niiden eluutiotilavuus on pienempi. Pienemmät molekyylit pääsevät matriksin partikkelin sisään, mikä hidastaa niiden kulkeutumista, jolloin niiden eluutiotilavuus on suurempi. Geelisuodatuksen käyttötarkoituksia Suolan poisto (desalting). Geelisuodatuksella voidaan poistaa näytteessä olevat epäorgaaniset suolot, orgaaniset liuottimet tai muut pienet molekyylit. Voivat esimerkiksi haitata seuraavaa työvaihetta tai jatkotutkimuksia. Voidaan käyttää valmiiksi pakattuja, pieniä pylväitä, joiden läpi näyte eluoidaan painovoimalla tai sentrifugilla. Biomolekyylien puhdistaminen Käytetyin geelisuodatuksen sovellutus. Usein proteiinien puhdistuksen viimeinen vaihe, jolla saadaan homogeeninen näyte esimerkiksi rakennetutkimukseen (esim. dimeerisen proteiinin aktiivinen muoto). 10
12.10. A) hemoglobiini 64000 Da B) ovalbumiini 44000 Da C) kymotrypsinogeeni 25000 Da D) myoglobiini 17000 Da E) sytokromi c 12400 Da Standardit eluoidaan pylväästä. Jakaantumiskertoimen avulla piirretty standardisuora Eluutiotilavuus vs molekyylipaino Molekyylipainon (M r) määrittäminen: Molekyylin eluutiotilavuus on suhteessa vain molekyylin kokoon. Standardimolekyylit ajetaan ensin pylvään läpi, jolloin saadaan eluutiotilavuudet V e tietyn kokoisille molekyyleille. Blue dextraanin (M w=2 MDa) avulla määritetään pylvään tyhjätilavuus V 0. Pylvään kokonaistilavuus V t lasketaan matemaattisesti. Kunkin standardimolekyylin eluutiotilavuudelle määritetään jakaantumiskerroin K: K = (V e-v 0)/(V t-v 0) Jakaantumiskerroin K kuvaa sitä osuutta matriksista, jonka sisällä näytemolekyyli kykenee liikkumaan. Standardimolekyylien jakaantumiskertoimien ja molekyylikokojen perusteella piirretään standardikuvaaja, jolta voi määrittää tutkittavan näytteen eluutiotilavuutta vastaavan jakautumiskertoimen perusteella sen molekyylikoon. 11