Piristeiden toteaminen virtsasta Dilute and Shoot LC- QTOF -menetelmällä - menetelmänkehitys

Janne-Kristian Lilja Piristeiden toteaminen virtsasta Dilute and Shoot LC- QTOF -menetelmällä - menetelmänkehitys Metropolia Ammattikorkeakoulu Laboratorioanalyytikko (AMK) Opinnäytetyö 27.10.2017

Tiivistelmä Tekijä Otsikko Sivumäärä Aika Tutkinto Janne-Kristian Lilja Piristeiden toteaminen virtsasta dilute and shoot LC-QTOF - menetelmällä - menetelmänkehitys 44 sivua + 3 liitettä 27.10.2017 Laboratorioanalyytikko (AMK) Koulutusohjelma Ohjaajat Laboratorioalan koulutusohjelma Tieteellinen johtaja Tina Suominen Kemisti Laura Harju Vastuuasiantuntija Antti Leinonen Yliopettaja Jukka Niiranen Opinnäytetyö tehtiin Yhtyneet Medix Laboratoriot Oy:ssä huume-, lääkeaine- ja dopingosastolla dopinganalyyttisiin tarkoituksiin. Työn tavoitteena oli kehittää nestekromatografis-lentoaikamassaspektrometrinen (LC- QTOF) Dilute and Shoot -menetelmä humaanivirtsanäytteestä tehtävää piristeiden seulonta-analyysia varten. Menetelmäkehityksen tarkoituksena oli korvata laboratoriossa käytetty nykyinen piristeiden kaasukromatografinen (GC/NPD) seulontamenetelmä. Piristeet ovat dopingissa kiellettyjä kilpailutilanteissa, koska ne lisäävät vireystilaa ja vähentävät väsymyksen tunnetta keskushermoston kautta ja siten voivat parantaa urheilijan suorituskykyä. Yhdisteiden erotus tapahtui nestekromatografisesti (LC) ja identifiointi perustuu korkean resoluution lentoaikamassaspektrometriseen analysointiin (TOF), jossa sähkösumutukseen (ESI) perustuva ionisaatio tehdään positiivisella polariteetilla. Menetelmä validoitiin WADAn teknisten dokumenttien mukaan. Validoinnissa tutkittiin toistettavuutta, uusittavuutta, spesifisyyttä, matriisivaikutusta, säilyvyyttä ja mittausherkkyyttä. Opinnäytetyön tuloksena kehitettiin toimiva seulontamenetelmä hyvin usealle yhdisteelle, joka otetaan käyttöön Yhtyneet Medix Laboratoriot Oy:n huume-, lääkeaine- ja dopingosastolla myöhemmin. Avainsanat Piristeet, Dilute and Shoot, LC-QTOF, dopinganalytiikka

Abstract Author Title Number of Pages Date Degree Janne-Kristian Lilja Analysis of Stimulants from Human Urine with Dilute and Shoot LC-QTOF Method - Method Development 44 pages + 3 appendices 27 October 2017 Bachelor of Laboratory Services Degree Programme Instructors Laboratory Sciences Tina Suominen, Scientific Director Laura Harju, Scientist Antti Leinonen, Expert in charge Jukka Niiranen, Principal lecturer The study was made for United Medix Laboratories at the Drug-, Medicine- and Doping department for doping analysis. The purpose was to develop a liquid chromatographic time-of-flight mass spectrometric Dilute and Shoot method for determination of stimulants in human urine. The purpose of the method development was to replace the current gas chromatographic (GC/NPD) method used by the laboratory to screen stimulants. Stimulants increase an athlete s vitality and decrease the feeling of tiredness, and are thus prohibited in competition. Liquid chromatography (LC) was used to separate the compounds that were then identified using a high-resolution time-of-flight mass spectrometer TOF. The compounds were ionized using electrospray ionization (ESI). The method was validated according to technical documents of WADA. Characteristics researched in the validation were repeatability (in-batch and inter-batch), specificity, matrix effects, the shelf life of the compounds and sensitivity of the measurements. As result, the Laboratories obtained a working method for the analysis of many stimulants, which will be taken into use later at United Medix Laboratories Ltd., Drug-, Medicine- and Doping Department. Keywords Stimulants, Dilute and Shoot, LC-QTOF, doping analysis

1 Sisällys Lyhenteet 1 Johdanto 4 2 Dopinganalytiikka yleisesti 5 2.1 WADA, Maailman Antidopingtoimisto 5 2.1.1 Maailmanlaajuinen antidopingsäännöstö 5 2.1.2 Kiellettyjen aineiden ja menetelmien lista 5 2.1.3 Kansainvälinen laboratoriostandardi 8 2.2 Dopingtestauslaboratoriot 8 2.3 Dopingnäytteenotto 8 2.4 Dopingnäytteen laboratorioanalyysi 9 3 Kiellettyjen aineiden ryhmä S6: Piristeet 11 4 LC-QTOF toimintaperiaate 13 4.1 Nestekromatografi 14 4.2 Massaspektrometri 15 4.2.1 Sähkösumutus 15 4.2.2 Kvadrupoli 19 4.2.3 Lentoaika-analysaattori 20 4.2.4 Detektori 24 5 Kokeellinen osuus 25 5.1 Koejärjestely 26 5.1.1 Kemikaalit ja reagenssit 26 5.1.2 Laitteet ja ohjelmistot 26 5.2 Tutkittavat yhdisteet ja näytteiden valmistus 27 5.3 Kirjaston rakentaminen 30 5.4 Datan prosessointimenetelmän kehittäminen 31 5.4.1 Kvalitatiivinen datan prosessointimenetelmä 31 5.4.2 Kvantitatiivinen datan prosessointimenetelmä 31

2 5.5 Nestekromatografi/massaspektrometria 32 5.6 Validointi 34 5.6.1 Vertailumittaukset 34 5.6.2 Toistettavuus (sarjan sisällä) 34 5.6.3 Uusittavuus (sarjojen välillä) 35 5.6.4 Spesifisyys ja matriisivaikutukset 35 5.6.5 Säilyvyys 35 5.6.6 Mittauksen herkkyys ja toteamisraja 35 6 Tulokset 36 6.1 Vertailumittaukset 36 6.2 Toistettavuus 38 6.3 Uusittavuus 39 6.4 Spesifisyys ja matriisivaikutukset 39 6.5 Säilyvyys 41 6.6 Mittauksen herkkyys ja toteamisraja 41 7 Päätelmät 42 Lähteet 43 Liitteet Liite 1. Tulokset: Toistettavuus sarjan sisällä Liite 2. Tulokset: Uusittavuus sarjojen välillä Liite 2. Tulokset: Säilyvyys

3 Lyhenteet ADT Suomen antidopingtoimikunta, Finnish Anti-Doping Agency API Atmospheric pressure ionisation, ilmanpaineessa tapahtuva ionisaatio ESI Electrospray Ionisation, sähkösumutus EIC Extracted ion chromatogram, eristetty ionikromatogrammi GC/NPD Gas chromatography/nitrogen Phosphorous Detector, kaasukromatografi/typpiselektiivinen detektori HPLC High performance liquid chromatography, korkean suorituskyvyn nestekromatografi MRPL Minimum required performance level, vähimmäis raja-arvo QTOF High resolution time-of-flight mass spectrometer, korkean erotuskyvyn lentoaika massaspektrometri RBL Reagent blank, reagenssinolla SUEK Suomen urheilun eettinen keskus, Finnish Center for Integrity in Sports SIM Selective ion monitoring, selektiivinen ionien monitorointi SCAN Massaspektrin keräys koko mittausalueelta TOF Time-of-Flight, lentoaikamassa-analysaattori TIC Total ion current, kokonaisionivirtaus UBL Urine blank, lääkevapaa virtsanäyte WADA World Anti-Doping Agency, Maailman antidopingtoimisto

4 1 Johdanto Urheilussa mahdollisesti käytettävien dopingaineiden määrä ja kirjo kasvavat vuosi vuodelta lääkekehityksen myötä. Dopingtestauslaboratorioiden haasteena on pystyä toteamaan biologisista näytteistä kemiallisilta ominaisuuksiltaan hyvin erilaisia dopingaineita mahdollisimman herkästi ja kattavasti, pitämään yksittäisten analyysimenetelmien lukumäärä kohtuullisen pienenä sekä liittämään uudet yhdisteet analyysimenetelmiinsä mahdollisimman nopeasti. Opinnäytetyö toteutettiin Yhtyneet Medix Laboratoriot Oy:n huume-, lääkeaine- ja dopingosaston käyttöön dopinganalyyttisiin tarkoituksiin kevään 2017 aikana. Yhtyneet Medix Laboratoriot Oy on Maailman Antidopingtoimisto WADAn akkreditoima yksityisessä omistuksessa oleva kliininen kansainvälinen dopingtestauslaboratorio. Laboratoriolla on myös kansallisen akkreditointiviranomaisen myöntämä akkreditointi. Tämän opinnäytetyön tarkoituksena on selvittää, kehittää ja validoida uudentyyppisen nopean nestekromatografis/massaspektrometrisen analyysimenetelmän soveltuvuutta erilaisten dopingaineiden seulomiseen virtsanäytteestä. Virtsanäyte laimennetaan ja injektoidaan suoraan ("dilute and shoot") korkean suorituskyvyn nestekromatografiin (HPLC), joka on yhdistetty korkean erotuskyvyn lentoaikamassaspektrometriin (QTOF). Menetelmä rakennettiin jo laboratoriossa käytössä olevien samantapaisten analyysimenetelmien pohjalta. Nestekromatografinen erotus tehtiin bifenyyli kolonnilla käyttäen asetonitriili/metanoli/puskuri -gradienttieluutiota. Massaspektrometriset mittaukset tehtiin positiivi-ionipuolella käyttäen sähkösumutusionisaatiota (ESI). Yhdisteiden tunnistus perustuu niiden retentioaikaan ja tarkkaan massaan. Kehitetyllä menetelmällä tullaan mittaamaan molekyylikooltaan suhteellisen pieniä happamia, emäksisiä ja neutraaleja yhdisteitä kuten erilaiset nesteenpoistolääkkeet, huumaavat särkylääkkeet ja stimulantit, mutta tässä opinnäytetyössä menetelmään lisättiin vain tietyt piristeet.

5 2 Dopinganalytiikka yleisesti 2.1 WADA, Maailman Antidopingtoimisto Maailman Antidopingtoimisto WADA (World Anti-Doping Agency) on vuonna 1999 perustettu itsenäinen, kansainvälinen virasto, jonka tehtävänä on edistää, koordinoida ja valvoa maailmanlaajuisesti antidopingtyötä ja -sääntöjä, puolustaa urheilun eettisyyttä sekä taata urheilijan oikeusturva. WADAn akkredioimat laboratoriot noudattavat kolmea WADAn ylläpitämää asiakirjaa: maailmanlaajuista antidopingsäännöstöä (World Antidoping Code), kiellettyjen aineiden ja menetelmien listaa (List of Prohibited Substances and Methods), ja kansainvälinen laboratoriostandardia (International Standard for Laboratories). WADAn päätoimenpiteisiin kuuluu tieteellinen tutkimustyö, kouluttaminen, ja dopingtestauslaboratorioiden ja käytännön testauksesta vastaavien tahojen toiminnan koordinoiminen ja ohjeistaminen. [1; 2; 3.] 2.1.1 Maailmanlaajuinen antidopingsäännöstö Maailmanlaajuinen antidopingsäännöstö on asiakirja, jossa esitetään dopingin vastaiset säännöt ja periaatteet, koulutuksen ja tutkimuksen rooli dopinganalytiikassa, eri osakkaiden ja tahojen vastuut ja roolit, ja ohjeet täytäntöönpanosta, muutoksista ja noudattamisesta kaikille asiakirjan allekirjoittaneille. Antidopingsäännöstön tarkoituksena on turvata urheilijoille oikeus osallistua urheiluun, jossa ei käytetä dopingaineita, täten edistäen urheilijoiden terveyttä, oikeudenmukaisuutta ja tasavertaista kohtelua, sekä yhtenäistää ja koordinoida urheilun antidopingsääntöjä. Antidopingsäännöstö määrittelee dopingiksi yhden tai useamman säännöstössä määriteltyjen sääntöjen rikkomisen. Rikkomuksia ovat esimerkiksi kielletyn aineen tai sen metaboliitin esiintyminen urheilijan kehossa, kielletyn menetelmän harjoittaminen, kieltäytyminen tai näytteenoton laiminlyöminen, urheilijan ollessa saavuttamaton urheilun ulkopuolella suoritettavia testejä varten, kielletyn aineen tai menetelmän kauppaaminen, ja kiellettyjen menetelmien ja aineiden antaminen urheilijalle. [1.] 2.1.2 Kiellettyjen aineiden ja menetelmien lista WADA päivittää ja julkaisee vuosittain luettelon kaikista urheilussa kielletyistä aineista ja menetelmistä. Kiellettyjen aineiden ja menetelmien listan laatii WADAn nimeämä

6 asiantuntijaryhmä, joka kokoontuu kolmesti vuodessa. Kiellettyjen aineiden ja menetelmien listalle päätyvät aineet, joiden avulla voidaan eri urheilulajeissa edistää suorituskykyä. Useat listalla esiintyvistä aineista ovat sellaisia, että niiden kvalitatiivinen esiintyminen laboratorioon saapuvassa näytteessä riittää positiivisen tuloksen toteamiselle. Listalle on lisätty myös yhdisteitä, joille on määrätty treshold -pitoisuus eli kynnysarvo, jonka ylitettäessä laboratorio raportoi näytteen positiivisena. Taulukossa 1 on esitetty kooste vuoden 2017 kiellettyjen aineiden ja menetelmien listasta. [2.] Taulukko 1. Kooste WADAn kiellettyjen aineiden listasta 2017 [2.]. Ryhmä I. Kilpailujen aikana ja kilpailujen ulkopuolella kielletyt aineet ja menetelmät S0 Myyntiluvattomat lääkeaineet S1 Anaboliset aineet S1.1a Eksogeeniset anabolis-androgeeniset steroidit S1.1b Endogeeniset anabolis-androgeeniset steroidit S1.2 Muut anaboliset aineet S2 Peptidihormonit, kasvutekijät ja vastaavat aineet S3 β-agonistit S4 Hormonien ja metabolisten aineiden modulaattorit S5 Diureetit ja muut peiteaineet M1 Veren ja sen ainesosien manipulaatio M2 kemiallinen ja fysikaalinen manipulaatio M3 Geenidoping Ryhmä II. Kilpailun aikana kielletyt aineet ja menetelmät S6 Piristeet S7 Huumaavat kipulääkkeet S8 Kannabinoidit S9 Glukokortikosteroidit Rymä III. Tietyissä urheilulajeissa kielletyt aineet P1 Alkoholi P2 Beetasalpaajat Ryhmän I aineet ja menetelmät on kielletty sekä kilpailun ulkopuolella, että kilpailun aikana. Ryhmään kuuluvat myyntiluvattomat lääkkeet (S0), joilla ei ole terveysviranomaisen myöntämää voimassa olevaa hyväksyntää tai myyntilupaa missään valtiossa. Ryhmään kuuluvat myös aineet, joita ei ole mainittu muissa ryhmissä. [2.]

7 Anabolisten aineiden ryhmä (S1) on jaettu kolmeen alaryhmään, eksogeenisiin anabolis-androgeenisiin steroideihin, endogeenisiin anabolis-androgeenisiin steroideihin ja muihin anabolisiin aineisiin. Eksogeeniset yhdisteet ovat aineita, jotka eivät pysty muodostumaan elimistössä luonnostaan, kuten esimerkiksi oxabolone. Endogeeniset yhdisteet vastoin muodostuvat elimistössä itsestään, kuten esimerkiksi testosterooni. Muihin anaboolisiin ainesiin kuuluvat esimerkiksi tiboloni ja zeranoli. [2.] Alaryhmään S2 kuuluvat peptidihormonit, kasvutekijät ja vastaavat aineet, sekä miimiset aineet. Tähän ryhmään kuuluu esimerkiksi erytropoietiini (EPO), joka muodostuu munuaisissa ja edistää punasolutuotantoa. [2.] Alaryhmään S3 on jaoteltu β-agonistit. Ne stimuloivat hermoston β-reseptoreita, kuten esimerkiksi Fenoterol. [2.] S4 alaryhmään on jaoteltu hormoneihin ja metaboliaan vaikuttavat modulaattorit. Metaboliaan vaikuttavat modulaattorit kasvattavat lihaksia, polttavat rasvaa ja saavat aikaan samankaltaisia muutoksia kuin fyysinen rasitus, mutta ilman rasitusta. Esimerkki metaboolisesta modulaattorista on insuliini. [2.] Diureetit ja muut peiteaineet on jaoteltu alaryhmään S5. Diureettien ja muiden peiteaineiden avulla pyritään poistamaan elimistöstä nesteitä tai laimentamaan dopingnäytteitä muiden dopingaineiden peittämiseksi. Diureetteja on käytetty esimerkiksi painoluokkalajeissa painon pudotukseen. Peiteaineisiin kuuluu esimerkiksi hydroksyylitärkkelys, joka on plasmavolyymilaajentaja. [2.] Kilpailun aikana ja kilpailun ulkopuolella kiellettyihin menetelmiin kuuluvat veren ja sen ainesosien manipulaatio (M1), kuten esimerkiksi hapenkuljetuksen parantaminen, kemiallinen ja fysikaalinen manipulaatio (M2), kuten jonkin reagenssin lisääminen näytteeseen, sekä geenidoping (M3), kuten nukleiinihappoanalogien siirto. [2.] Ryhmään II on jaoteltu aineet, jotka ovat kiellettyjä ainoastaan kilpailun aikana. Alaryhmään S6 on jaoteltu piristeet, esimerkiksi amfetamiini ja crotetamide. Alaryhmään S7 on jaoteltu huumaavat kipulääkkeet, kuten morfiini. Alaryhmään S8 on jaoteltu kannabinoidit. Näihin kuuluvat kasviperäiset kannabinoidit, kuten kannabis, sekä synteettiset aineet, joilla on samankaltainen vaikutus kuin kannabiksella. Tämmöinen aine on esimerkiksi JWH-018. Alaryhmään S9 on jaoteltu glukokortikosteroidit. [2.]

8 Ryhmään III on jaoteltu tietyissä urheilulajeissa kielletyt yhdisteet, kuten alkoholi (P1) ja beetasalpaajat (P2). Näiden aineiden käyttö on kielletty esimerkiksi autourheilussa ja ammunnassa, koska niitä voidaan käyttää esimerkiksi vähentääkseen hermostuneisuutta tai parantamaan keskittymistä. [2.] 2.1.3 Kansainvälinen laboratoriostandardi Kansainvälinen laboratoriostandardi hyväksyttiin ja otettiin käytäntöön vuoden 2002 marraskuussa, jonka jälkeen WADA on muokannut sitä ajoittain. Kansainvälisen laboratoriostandardin päätavoite on varmistaa laboratoriotuotanto pätevien testitulosten ja todisteiden perusteella ja saavuttaa yhdenmukaiset ja harmonisoidut tulokset ja raportoinnit kaikilta akkreditoiduilta laboratorioilta. Laboratoriostandardi asettaa vaatimukset, joiden avulla laboratoriot voivat osoittaa olevansa päteviä ja pystyvät toimittamaan tehokkaasti laadukkaita ja oikeudellisesti päteviä tuloksia. WADA hyväksyy ja akkreditoi vaatimukset saavuttaneet laboratoriot. Akkreditointi on voimassa vuoden kerrallaan [3.] 2.2 Dopingtestauslaboratoriot Urheilijan virtsa- ja verinäytteet analysoidaan WADAn akkreditoimissa ja hyväksymissä testauslaboratorioissa. Laboratorioiden työskentelytavat, tietotaidot ja käytettyjen laitteistojen pitää täyttää WADAn asettaman kansainvälisen laboratoriostandardin laatuvaatimukset ja ISO 17025-standardin vaatimukset. WADA julkaisee myös ajoittain teknisiä dokumentteja ja suosituksia, joilla lisäksi ohjeistetaan laboratorioita. Laboratorioiden luotettavuutta ja laadun tasoa tarkkaillaan säännöllisesti laadunvalmistusnäytteillä, jotka WADA lähettää laboratorioon analysoitavaksi. WADAn hyväksymiä laboratorioita on tällä hetkellä maailmassa 32. [3.] 2.3 Dopingnäytteenotto Dopingvalvontaan sisältyvät näytteenotto ja näytteiden käsittely, testauksen suunnittelu, laboratorioanalyysi, saatujen tulosten käsittely ja mahdollisten seuraamusten määrääminen urheilijalle, sekä urheilijan mahdollisuus seuraamusten muutoksen hakuun. Dopingtestejä urheilijoista ottavat yleisesti kansalliset antidopingtoimistot ja eri urheilulajien liitot. Suomessa dopingvalvontaa organisoi Suomen urheilun eettinen keskus

9 SUEK ry, jonka tehtävänä on testaajaorganisaatioiden ylläpito, dopingtestien suunnittelu, näytteidenotto ja tulosten käsittely. SUEK käyttää antidopingtoiminnassaan myös nimeä Suomen antidopingtoimikunta ADT. SUEK sekä kouluttaa että valistaa urheilijoita ja urheilun parissa toimivia yhteisöjä. SUEK tekee yhteistyötä eri urheilujärjestöjen ja niiden jäsenien kanssa, jotka sitoutuvat noudattamaan sekä Suomen että Maailman antidopingsäännöstön ohjeita ja määräyksiä, joihin kuuluvat myös kiellettyjen aineiden lista ja menetelmät. Dopingvalvontaa ja antidopingtyötä tekevät myös eri lajiliitot. [4.] Dopingnäytteitä otetaan kilpailutilanteissa tai kilpailukauden ulkopuolella, niin sanotulla harjoittelukaudella. Kilpailuissa menestyneet urheilijat määrätään tai arvotaan heidän kilpailun sijoituksen perusteella testattavaksi. Kilpailukauden ulkopuolella urheilijat valitaan kohdennetusti tai arpomalla testattavaksi. Kohdennetulla testillä tarkoitetaan sitä, että testin tilannut dopingorganisaatio on nimennyt urheilijan etukäteen testiin. Kohdennettuja testejä tehdään pääasiassa maajoukkuekisoissa kilpaileville urheilijoille. [4; 5; 7, s. 41.] Dopingtestauksessa urheilijoilta otetaan joko verinäyte tai virtsanäyte tai molemmat. Yleisimmät kiellettyjen aineiden ja menetelmien listalla olevista aineista tutkitaan virtsanäytteestä. Verinäytteille tehdään tarvittaessa erilaisia erikoisanalyysejä, kuten esimerkiksi kasvuhormonien mittaus ja esimerkiksi verensiirron toteaminen. Testikutsun saatuaan urheilija ilmoittautuu dopingtestihenkilöstölle testausta varten mahdollisimman pian ja olla heidän valvonnassa, kunnes testi on analysoitu ja suoritettu loppuun. Urheilijan tulee pystyä todistamaan henkilöllisyytensä ja heillä saa olla mukanaan yksi oma edustaja. Näytteenotto tapahtuu valvotusti, jonka jälkeen näyte jaetaan A- ja B- pulloihin, jonka jälkeen pullot sinetöidään, koodataan ja toimitetaan mahdollisimman pikaisesti dopinglaboratorioon analysoitavaksi. [5.] 2.4 Dopingnäytteen laboratorioanalyysi Näytteenoton jälkeen näytteet kuljettavat laboratorioon sinetöidyssä kassissa testaushenkilöstön, postin tai kuriirin toimesta. Näytteen saavuttua laboratorioon sen kulku dokumentoidaan aina vastaanotosta tuloksen kirjaukseen ja näytteen hävitykseen asti. Dopingnäytteiden analysointi tehdään A-näytteestä ja se pääasiallisesti alkaa seulontatutkimuksilla. Seulonnan tarkoituksena on selvittää herkällä, yksinkertaisella ja nopealla

10 menetelmällä, mitkä näytteet ovat positiivisia jonkin kielletyn aineen suhteen. Seulontatutkimuksen tulisi olla niin herkkä, ettei virheellisiä negatiivisia löydöksiä tule, ja niin spesifinen, että virheellisten positiivisten seulontalöydösten määrä on kohtuullinen. Seulontamenetelminä yleensä käytetään kaasu- tai nestekromatografisia menetelmiä, joissa saadaan seulottua kerralla mahdollisimman useita aineita tai aineryhmiä. Seulontamenetelmissä on useita erilaisia näytteen esikäsittelytapoja, ja riippuen analyyttien fysikokemiallisita ominaisuuksista voi joissakin tapauksissa riittää esikäsittelyksi esimerkiksi pelkkä näytteen laimentaminen. Esimerkki dopingtestauslaboratorion käyttämistä seulontamenetelmistä on esitetty kuvassa 1. [5.] Kuva 1. Esimerkki dopingtestauslaboratorion käyttämästä seulontastrategiasta. Mahdolliset positiiviseksi seulotut näytteet varmistetaan varmistusanalyysien avulla. Näytteestä otetaan uusi erä, joka analysoidaan yhdisteelle spesifisemmällä menetelmällä. Näytteestä analysoidaan mahdollisuuksien mukaan useita kohdeyhdisteelle spesifisiä metaboliitteja, joita käytetään vahvistamaan löydöksen tulkintaa. Varmistusanalyysit tehdään lähes poikkeuksetta massaspektrometrisillä menetelmillä. WADA on asettanut identifiokriteerit kvalitatiiviselle kolonnikromatografismassaspektrometriselle tutkimukselle. Dopinganalytiikassa positiiviseksi löydökseksi yleensä riittää

11 kielletyn yhdisteen kvalitatiivinen osoittaminen näytteestä. Poikkeuksena on kuitenkin treshold -yhdisteet, jotka kvalitatiivisen tunnistuksen lisäksi kvantitoidaan. Sekä kaasu- että nestekromatografiassa analyytin retentioaika ei saa poiketa enempää kuin ±1 % tai ±0,1 minuuttia samassa erässä analysoidun referenssinäytteen sisältämän saman yhdisteen retentioajasta. Toisena vaihtoehtona voidaan käyttää yhdisteen suhteellista retentioaikaa, jolloin piikin retentioaika suhteutetaan kromatografisen referenssiyhdisteen retentioaikaan, ja tällöin suhteellinen retentioaika ei saa poiketa enempää kuin ±1 % referenssinäytteen suhteellisesta retentioajasta. [5; 6; 10.] Massaspektrometriseen tunnistukseen ja detektointiin voidaan käyttää normaalin tai korkean resoluution massaspektrometrejä tai tandemmassaspektrometrejä. Varmistusmittaukset voidaan tehdä keräten massaspektrejä (SCAN), valittujen ionien seurannalla (Selective ion monitoring, SIM) tai valittujen reaktioiden seurannalla (SRM). WADA on antanut tarkat ohjeet massaspektrien keräämiseen esimerkiksi spektrien puhtausvaatimuksista ja esimerkiksi, kuinka taustaspektri vähennetään. [5; 6.] Alustava dopingaineiden analyysi, mukaan lukien varmistusanalyysit, tehdään aina A- näytteestä. Analyysien valmistuttua laboratorio raportoi testin tilanneelle antidopingorganisaatiolle ja WADAlle testin tulokset. Jos näyte osoittautuu olevan positiivinen, niin testin tilannut antidopingorganisaatio arvioi, onko kyseessä dopingrikkomus. Positiivisen näytteen antaneelta urheilijalta pyydetään selvitys tilanteesta ja hänellä on oikeus tulla kuulluksi. Tämän jälkeen yleensä kyseisen lajin lajiliitto tekee päätöksen siitä, onko kyseessä dopingrikkomus. Urheilijalla on oikeus vaatia B-näytteen analysointia ja hänellä ja hänen edustajallaan on mahdollisuus halutessaan tulla seuraamaan B- näytteen analyysiä. [5.] 3 Kiellettyjen aineiden ryhmä S6: Piristeet Piristeet kuuluvat kilpailun aikana kiellettyihin aineisiin. Kielletyt dopingpiristeet on listattu kiellettyjen aineiden ja menetelmien listalla ryhmänä S6. Piristeet on lajiteltu kahteen alaryhmään, muut kuin erikseen määriteltyihin piristeisiin ja erikseen määriteltyihin piristeisiin. Piristeet lisäävät vireystilaa ja vähentävät väsymyksen tunnetta keskushermoston kautta ja ovat täten kiellettyjä urheilussa. Vapina, sydämen tykytykset ja verenpaineen nousu ovat yleisimpiä piristeiden haittavaikutuksia. Herkille yksilöille tai suuri-

12 na annoksina piristeet voivat aiheuttaa sekavuus- ja vainoharhatiloja, lämpöhalvauksen sekä vakavia sydämen rytmihäiriöitä. [8; 21.] Jotta WADAn akkreditoimat laboratoriot voivat raportoida kiellettyjä aineita ja niiden metaboliitteja yhtenäisesti, WADA on asettanut laboratorioille kiellettyjen aineiden identifioimiskriteerit erilaisten teknisten dokumenttien avulla. Laboratorioiden tulee pystyä määrittämään rutiininomaisesti yhdisteitä tietyillä vähimmäis pitoisuusraja-arvoilla. Näitä raja-arvoja kutsutaan MRPL-arvoiksi (minimum required performance level). Piristeiden MRPL-arvo on 100 ng/ml, jonka laboratorioiden tulee pystyä määrittää heidän käyttämällä analyysimenetelmällä. Poikkeuksena on oktopamiini, joka tulisi pystyä määrittämään 1000 ng/ml pitoisuudella. [9; 21.] Katiini, efedriini, methylefedriini ja pseudoefedriini kuuluvat piristeisiin, mutta ne on määritelty threshold -yhdisteiksi, jonka vasta ylittäessä tietyn threshold -arvon tulkitaan doping rikkomukseksi. Rajapitoisuudet on asetettu siten, etteivät tavanomaiset hoidolliset lääkeannokset johda rajapitoisuuden ylitykseen, mikäli lääkkeen viimeisestä käyttökerrasta on kulunut vähintään 24 tuntia. Taulukossa 2 on listattu kyseisten aineiden threshold -arvot. [8; 10.] Taulukko 2. Threshold -yhdisteiksi luokiteltujen piristeiden raja-arvot [10.]. Threshold yhdiste Katiini Ephedriini Methylephedriini Pseudoephedriini Raja-arvo 5.0 µg/ml 10 µg/ml 10 µg/ml 150 µg/ml Piristeitä analysoitaessa on tärkeätä kohdeyhdisteen lisäksi tutkia myös kyseisen aineen metaboliitteja. Monet piristeet eivät erity virtsassa pelkästään kantayhdisteinä, vain voivat erittyä myös kyseisen aineen metaboliitteina, esimerkiksi konjugaattina. Tämän takia kohdeyhdisteen lisäksi tutkitaan myös sen metaboliitit helpottaakseen positiivisen löydöksen toteamista. Pemoline on esimerkki piristeestä, joka erittyy virtsaan parenttiyhdisteenä sekä sulfaattikonjugaattina. Monet piristeet esiintyvät virtsassa myös metaboloituvat amfetamiiniksi; kuten esimerkiksi amphetaminiili, fentylliini, mefenorex ja prenylamiini esiintyvät kaikki virtsassa amfetamiinina. Tässä opinnäytetyös-

13 sä kehitettiin dilute and shoot -menetelmä, jossa näyte ainoastaan laimennetaan ennen varsinaista analysointia, joten kohdeyhdisteiden metabolia on tärkeä tietää. [20.] Piristeitä voidaan mitata laboratorioissa erilaisin tavoin. Esimerkiksi Yhtyneet Medix Laboratoriot Oy ovat seuloneet piristeitä virtsasta kaasukromatografilla, johon on liitetty typpiselektiivinen detektori (GC/NPD). Kyseisessä menetelmässä näyte esikäsiteltiin tekemällä näytteelle emäksinen liuotinuutto, jonka jälkeen näyte injektoitiin ja analysoitiin kaasukromatografisesti GC/NPD-laitteistolla. 4 LC-QTOF toimintaperiaate Menetelmäkehitykseen käytetty LC-QTOF-laitteisto (Liquid Chromatograph Time-of- Flight Mass Spectrometer) koostuu nestekromatografista, ionisaattorista, kvadrupolista, korkean erotuskyvyn lentoaika-analysaattorista ja detektorista. Yhdisteet erotetaan toisistaan nestekromatografissa, jonka jälkeen nestekromatografilta saatu neste ionisoidaan sähkösumutus (ESI) ionisaatiotekniikkaa käyttäen. Ionisoinnin jälkeen syntyneet ionit ohjataan kvadrupolin läpi korkean erotuskyvyn lentoaika-analysaattoriin, jossa ne erotellaan ionien massa/varaus suhteiden avulla toisistaan. Lopuksi ionit saapuvat detektorille. Kuvassa 2 on esitetty LC-QTOF:n massaspektrometri osan kaavakuva. [15.] Kuva 2. Kaavakuva LC-QTOF:in massaspektrometri osasta. [15.]

14 4.1 Nestekromatografi LC-QTOF-laitteiston nestekromatografiosa koostuu injektorista, pumpusta, kolonnista ja detektorista. Näytteen komponenttien erottelu tapahtuu kolonnissa, jossa kaksi toisiinsa liukenematonta faasia ovat vuorovaikutuksessa toistensa kanssa. Näitä faaseja kutsutaan liikkuvaksi- ja stationäärifaasiksi. Näytettä injektoidaan injektorin kautta korkean paineen alaisena olevaan nestefaasiin. Näyte liikkuu eluentin mukana kolonniin, eli stationäärifaasiin, joka on pakattu pienikokoisilla partikkeleilla. Eluentti kulkee kolonnin läpi, joka mahdollistetaan pumpun avulla. Näyte jakaantuu komponenteikseen kulkiessaan kolonnin läpi eluentin mukana, jotka tulevat vuorotellen ulos kolonnista. Nopeasti etenevät aineet tarttuvat heikosti stationäärifaasiin niiden ollessa enimmäkseen liikkuvassa faasissa. Kolonnin läpi hitaasti kulkeutuvat yhdisteet taas ovat suurimmaksi osaksi sitoutuneet stationäärifaasiin ja liikkuvat hitaasti liikkuvan faasin mukana. Yhdisteen saavuttua detektorille kyseisen yhdisteen antama signaali mitataan ajan funktiona, jolloin saadaan muodostettua kromatogrammi. [11.] Korkean erotuskyvyn nestekromatografiassa liuotin pumpataan korkean paineen avulla kolonnista läpi, joka mahdollistaa yhdisteiden erottumisen korkealla resoluutiolla. Korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) voidaan käyttää epäorgaanisten sekä orgaanisten yhdisteiden analysoimiseen. Kuvassa 3 on esitetty HPLC-laitteiston kaavakuva. [11.] Kuva 3. HPLC-laitteisto [11.].

15 Bifenyylikolonnit ovat suosittuja nestekromatografin stationäärifaaseja, koska ne ovat erityisen taitavia erottelemaan yhdisteitä, jotka ovat vaikeasti eroteltavia tai jotka eluoituvat varhaisessa vaiheessa. Tämän seurauksena bifenyylikolonnit ovat erittäin hyödyllisiä nopeissa erotuksissa bioanalyyttisissä testaussovelluksissa, kuten lääke- tai metaboliittitutkimuksissa, erityisesti niissä, jotka vaativat massaspektrometriä. Bifenyylikolonnit rajoittavat ionisuppressiota ja lisäävät selektiivisyyttä auttaen poistamaan tarvetta komplekseille liikkuville faaseille, jotka muuten eivät sopisi massaspektrometrisiin analyyseihin. [12.] 4.2 Massaspektrometri Massaspektrometri koostuu ionilähteestä, massa-analysaattorista ja detektorista. Näyte ionisoidaan ensin ionisaattorissa, jonka jälkeen muodostuneet ionit erotellaan toisistaan niiden massa/varaus-suhteiden perusteella massa-analysaattorissa. Erotellut halutut ionit kulkeutuvat lopulta detektorille. 4.2.1 Sähkösumutus Sähkösumutus (ESI, electrospray ionisation) on yksi tärkeimmistä ionisaatiotekniikoista, jossa nestekromatografilta saapuva neste sumutetaan pieniksi pisaroiksi korkean jännitteen avulla. Se tapahtuu ilmanpaineessa (atmospheric pressure ionisation, API), jonka avulla nestekromatografi voidaan erinomaisesti kytkeä massaspektrometriin. ESI soveltuu poolisten, sekä pienten että suurten biomolekyylien analyysointiin, mutta sen ionisaatiotehokkuus ei välttämättä ole hyvä neutraaleille ja suhteellisen poolittomille yhdisteille. ESI on erittäin pehmeä ionisointimenetelmä, jossa ionien sisäinen energia ei kasva eikä fragmentoitumista siten juurikaan tapahdu. Ionit voidaan kuitenkin fragmentoida lisäämällä ionien kineettistä energiaa API-lähteen hiljaisella vyöhykkeellä, jolloin tutkittavan yhdisteen sisäinen energia kasvaa ionien ja neutraalimolekyylien kanssa törmätessä. ESI-ionilähde käsittää 0,1-0,2 mm levyisen teräskapilaarin ja API-lähteen, jonka avulla ionit kerätään massaspektrometriseen analyysiin. API-lähde on laitteiston pysyvä osa, jota ei vaihdeta. Sähkösumutuksessa teräskapillaari on asetettu toisen kapillaarin si-

16 sään ja kapillaarien välistä ajetaan inerttiä kaasua. Kaasuna käytetään tavallisimmin typpeä. Kaasuvirtauksen seurauksena kapilaarin päässä syntyy turbulenssi, joka avustaa pisaroiden muodostumista. Pooliseen tai keskipooliseen liuottimeen liuotettu näyte syötetään teräskapilaarin läpi. Kapilaarin kärkeen muodostuu korkea elektrostaattinen kenttä, jonka vaikutuksesta vastaionit (negatiiviset ionit tutkittaessa positiivisia ioneja) ajautuvata kapilaarin seinämille. Voimakkaan elektrostaattisen kentän johdosta positiiviset ionit kulkeutuvat kapilaarista eluentin pinnalle ja positiivisesti varautuneen eluentin pinnan virtausnopeus tulee suuremmaksi kuin virtausnopeus eluentin sisäosissa, minkä seurauksena muodostuu ns. Taylorin kartio, eli eluenttivyöhyke kapenee suppilomaisesti ilmatilassa. Tämän kapenemisen johdosta varausten repulsio kasvaa niin suureksi, että eluentista muodostuu positiivisesti varautuneita pisaroita. Kun positiivisesti varautuneet pisarat ovat muodostuneet, niistä haihtuu liuotinta ja varaustiheys pisaroiden pinnalla kasvaa. Myös repulsio kasvaa varaustiheyden kasvaessa. Kun varaustiheys saavuttaa Rayleighin raja-arvon (4,27) eli repulsiosta tulee suurempi kuin pisaran pintajännitys, pisara hajoaa pienemmiksi pisaroiksi. Pienemmistä pisaroista haihtuu jälleen liuotinta kunnes ne saavuttavat taas Rayleighin raja-arvon, jolloin pisarat hajoavat yhä pienemmiksi pisaroiksi. Prosessi toistuu kunnes pisara on niin pieni, että se kykenee tuottamaan kaasufaasiin yksittäisen kaasufaasi-ionin. Koko prosessi pisaran muodostumisesta kaasufaasi-ionin muodostumiseen tapahtuu ilmanpaineessa. Muodostuneet kaasufaasi-ionit kerätään API-lähteen avulla massaspektrometriin. Kuvissa 4 ja 5 on esitetty ESI-laitteisto ja analyytti-ionien synty ESI-tekniikkaa käyttäen. [13, s. 68-73.] Kuva 4. ESI-laitteisto [14.].

17 Kuva 5. Ionien muodostuminen ESI-tekniikalla [14.]. Ionisoitumistehokkuuteen ESI:ssä vaikuttavat monet kemialliset ja fysikaaliset tekijät. Tärkeimmät kemialliset tekijät liittyvät liuottimeen ja tutkittavaan yhdisteeseen. Liuottimen johtokyky, pintajännitys, haihtuvuus, poolisuus, ph ja elektrolyytin konsentraatio vaikuttavat ionisoitumiseen. Tutkittavan yhdisteen konsentraatio, pk a-arvo, protoniaffiniteetti, poolisuus ja moolimassa ovat myös ionisoitumistehokkuuteen vaikuttavia tekijöitä. Tärkeitä fysikaalisia tekijöitä ovat ESI-kapillaarin jännite ja ulkohalkaisija, kapilaarin etäisyys API-lähteestä, lämpötila ja virtausnopeus. [13, s. 75.] ESI:ssä käytettävän liuottimen tulisi olla sähkönjohtokyvyltään riittävän suuri, jotta elektrostaattinen kenttä voisi vaikuttaa eluenttiin kapillaarin kärjessä ja jotta vastaionit saataisiin siirrettyä liuottimesta kapilaarin seinämille. Parhaiten ESI:iin soveltuvat keskipooliset ja pooliset liuottimet. Parhaiten soveltuvat metanoli, asetonitriili ja vesi, tai näiden seokset. Keskipoolisina liuottimina voidaan käyttää esimerkiksi dikloorimetaania tai isopropanolia. Keskipoolisia liuottimia käytetään mm. lipidien analysoimiseen. [13, s. 75.] Liuottimen pintajännityksellä on selkeä vaikutus ionisoitumistehokkuuteen. Vesi, jolla on suuri pintajännitys, hajoaa pienemmiksi pisaroiksi hitaammin ja siten kaasufaasiionien tuottamiseen kykenevien pisaroiden määrä vähenee. Pisaran kokoon vaikuttaa myös liuottimen haihtuvuus. Vesi haihtuu varautuneesta pisarasta hitaammin kuin esimerkiksi metanolia ja asetonitriiliä käytettäessä. [13, s. 75.]

18 ESI:ssä käytetään vain haihtuvia puskureita, koska haihtumattomat yhdisteet likaavat nopeasti ionilähteen, jonka seurauksena herkkyys huononee ja signaali voi hävitä. Huonoja haihtumattomia puskureita ovat esimerkiksi fosfaatti- ja boraattipuskurit. Tavallisimmin ESI:ssä käytetty puskuri on ammoniumformaatti tai ammoniumasetaatti. Niiden konsentraatiot tulisivat olla alhaisia, koska liian korkeat puskurikonsentraatiot voivat huonontaa herkkyyttä. [13, s. 75.] ESI:ssä paras herkkyys saavutetaan, jos tutkittava yhdiste voidaan ionisoida jo liuosfaasissa. Tämä riippuu yhdisteen pk a-arvosta ja liuoksen ph:sta. Emäksiset yhdisteet analysoidaan yleensä positiivisina ioneina käyttäen hapanta tai neutraalia eluenttia. Happamat yhdisteet analysoidaan tavallisimmin negatiivisina ioneina käyttäen emäksistä tai neutraalia eluenttia. [13, s. 76.] Tutkittavan yhdisteen konsentraatio vaikuttaa myös ionisaatiotehokkuuteen. Konsentraation kasvaessa pisaran ulkopinta kyllästyy tutkittavan yhdisteen ioneista ja ylimääräiset ionit ajautuvat pisaran sisälle, jolloin niitä ei saada tehokkaasti siirrettyä kaasufaasiin. [13, s. 76.] Useimmiten paras herkkyys ESI:ssä saadaan, kun yhdiste on eluentissa ionisoituneessa muodossa. Jos eluentin ph on sama kuin yhdisteen pk a-arvo, yhdisteestä 50% on ionisoituneessa muodossa ja 50% neutraalimuodossa. Emäksisissä yhdisteissä, jos yhdisteen ph on yhden yksikön pienempi kuin yhdisteen pk a-arvo, niin yhdisteestä noin 90% on ionisoituneena. Vastaavasti hapan yhdiste, jonka ph on yhden yksikön suurempi kuin yhdisteen pk a-arvo, niin yhdisteestä noin 90% on ionisoituneena. [13, s. 76.] Yhdisteen poolisuus vaikuttaa suuresti vasteeseen. Hydrofobiset yhdisteet ovat tämän takia hyviä. Ne ovat yhdisteitä, jotka sisältävät paljon alifaattisia tai aromaattisia ryhmiä ja niillä samalla on hapan tai emäksinen ryhmä. Tällaisia yhdisteitä ovat esimerkiksi alifaattiset tai aromaattiset amiinit. Hydrofiiliset yhdisteet vastaavasti ovat herkkyydeltään huonoja ESI:llä. Näihin yhdisteisiin kuuluvat esimerkiksi sokerit. [13, s. 76.] Elektrostaattisen kentän voimakkuuden ESI-kapilaarin kärjessä täytyy olla riittävän suuri aiheuttaakseen tehokkaan ionisoitumisen. Kentän voimakkuus on riippuvainen yhtälön 1 mukaisesti jännitteestä, kapilaarin ulkohalkaisijasta ja kapillaarin kärjen etäisyydestä API-lähteeseen.

19 E c = 2V [r c ln ( 4d r c ). ] (1) E c on Kentän voimakkuus V on jännite r c on kapillaarin ulkohalkaisija d on kärjen etäisyys API-lähteestä Yhtälön mukaan elektrostaattinen kenttä kasvaa jännitteen kasvaessa, kapilaarin ulkohalkaisijan pienentyessä ja kapilaarin kärjen etäisyyden API-lähteestä pienentyessä. Myös ionisuppressio voi vaikuttaa ionisoitumistehokkuuteen nestekromatografilta ensimmäisenä eluoituviin yhdisteisiin. Ionisuppressiolla tarkoitetaan, kun kaksi yhdistettä eluoituvat nestekromatografiin lähes samaan aikaan, jolloin toinen aineista suppressoi toista yhdistettä. Tämän seurauksena suppressoitu aineen ionisoituminen vaikeutuu. [13, s. 76.] 4.2.2 Kvadrupoli Kvadrupolit ovat suodattimia, jotka päästävät ioneja lävitseen niiden massa/varaussuhteen (m/z) perusteella käyttäen hyväkseen sekä tasa- että vaihtojännitettä. Se on nykyisin yksi yleisimpiä analysaattorityyppejä sen edullisuuden, luotettavuuden ja suorituskyvyn takia. Kvadrupoli soveltuu myös hyvin rutiinikäyttöön. Kvadrupoleja voidaan helposti yhdistää muihin analysaattoreihin ja niitä käytetään laajasti eri yhdistelmämassaspektrometrilaitteistoissa, kuten kvadrupoli-lentoaikamassaspektrometreissä. Kvadrupoli koostuu neljästä yhdensuuntaisesta elektrodisauvasta, joiden väliin muodostetaan sähkökenttä elektrodeihin johdetulla jännitteellä. Ionit kulkeutuvat kvadrupolisauvojen väliin, josta halutut ionit jatkavat kvadrupolin läpi detektoriin. [13, s. 27-28.] Ionit johdetaan massa-analysaattoriin erilaisten sähköisten linssien ja skimmereiden lävitse. Ionien saapuessa elektrodisauvojen väliin ne joutuvat sähkökentän vaikutuksesta niiden kulkusuunnalle kohtisuoraan värähdysliikkeeseen. Ionien värähtelyn ollessa liian laajaa, ne törmäävät elektrodisauvoihin eivätkä pääse jatkamaan kvadrupolin läpi detektorille. Elektrodeihin voidaan asettaa tietyt jännitteet, jolloin vain tietyn m/z-

20 suhteen omaavat ionit pääsevät kvadrupolista läpi. Jos jännitettä muutetaan, muuttuu myös kvadrupolin läpi pääsevien ionien m/z-suhde ja halutut ionit saadaan vuoron perään detektorille ja näin mitattua. Kuvassa 6 on esitetty kvadrupolimassaspektrometrin rakenne ja miten resonoivat ionit kulkeutuvat kvadrupolin läpi detektoriin. Kvadrupolin jälkeen ionit kulkeutuvat törmäyskammioon, jossa ne törmäytetään törmäyskaasun (yleisimmin typen tai argonin) kanssa eri törmäysenergioilla. Törmätessään kaasun kanssa ionit fragmentoituvat, jonka seurauksena osa lähdeioneista hajoaa tuoteioneiksi. Tuoteionit ja lähdeionit kulkeutuvat lopulta lentoaika-analysaattoriin. [13, s. 28.] Kuva 6. Kvadrupolimassaspektrometrin rakenne [13, s. 28.]. 4.2.3 Lentoaika-analysaattori Lentoaika-analysaattorit (TOF, Time-of-flight) ovat nykyään yksi tärkeimmistä massaspektrometrien analysaattoreita sen hyvän herkkyyden ja sen melko yksinkertaisen mekaanisen rakenteen takia, jonka seurauksena TOF voidaan helposti liittää muihin massa-analysaattoreihin, kuten esimerkiksi kvadrupoliin. Periaatteessa TOF-laitteen massa-alue on rajaton ja siksi se yhdistetään usein pehmeisiin ionisaatiotekniikoihin, jolloin voidaan mitata isojakin molekyyli-ioneja. [13, s. 39-40.] Lineaarisella lentoaikamassa-analysaattorilla ionit poistetaan ionilähteestä paketteina, jotka on luotu sähkösumutuksella (ESI). Ionit kiihdytetään sähköisellä potentiaalilla, jonka jälkeen ne kulkeutuvat kentättömän alueen läpi ennen kuin saapuvat detektorille.

21 Lineaarisen TOF:n suurin haitta on sen huono massaresoluutio, joka johtuu samanmassaisten ionien lentoaikojen jakaumasta. [13, s. 39-40.] Massaresoluutiota voidaan parantaa käyttämällä sähköstaattista ioniheijastinta (reflectron, ion mirror). Ioniheijastin koostuu useasta peräkkäisistä hiloista ja rengaselektrodeista, joiden väliset potentiaalit muodostavat hidastavan sähköisen kentän. Ioniheijastimeen saapumisen jälkeen ionien nopeus laskee, kunnes ionit lopulta kääntyvät takaisin tulosuuntaansa ja kohti detektoria. Ioniheijastimen käyttö kaventaa kineettisen energian jakaumaa, koska suuren kineettisen energian omaavat ionit lentävät pitemmälle ioniheijastimeen kuin pienen kineettisen energian omaavat ionit. Tällöin pienienergiset ionit lentävät lyhyemmän matkan kuin suurienergiset ionit, jolloin molemmat ionit saapuvat detektorille yhtä aikaan. Täten ioniheijastimella voidaan saavuttaa korkea massaresoluutio, toisaalta ioniheijastimen käyttö heikentää herkkyyttä ja rajoittaa mitattavan massa-alueen ylärajaa. [13, s. 40.] Epälineaariset lentoaikamassa-analysaattorit käyttävät hyväkseen toroidinmuotoisia tai sylinterimäisiä elektrostaattisia kenttiä erimassaisten mutta saman energisten ionien detektointiin. Sylinterinmuotoisten sähköisen sektorin fokusoivia ominaisuuksia voidaan muuttaa liittämällä sen päihin levyt, joihin on kohdistettu jännitteet. Tämän avulla pieneen tilaan saadaan helposti synnytettyä pitkä optinen matka, jonka seurauksena TOF laitteiston resoluutio kasvaa. Tällöin ionitilassa on kuitenkin oltava korkea vakuumi, koska ionien keskimääräisen vapaan matkan on oltava riittävän pitkä. [13, s. 40-41.] Ortogonaalisesti kiihdytetty lentoaikamassa-analysaattorissa jatkuvatoimisesta ionilähteestä tulevaan ionisuihkuun kohdistetaan pulssimainen sähkökenttä, joka on kohtisuorassa suihkun kulkusuuntaa vastaan. Kohtisuoran sähkökentän vaikutuksesta poistolevyn kohdalla olevat ionit muuttavat lentorataansa detektorin suuntaan. Riippuen ionien massasta ja sähkökentän jännitteestä ionit etenevät detektorille eri kulmissa. Fokusoivalla linssistöllä korjataan ja fokusoidaan ionisuihku oikeaan paikkaan ennen lentoputkea. Kuvassa 7 on esitetty kaaviokuva ortogonaalisesti kiihdytetystä lineaarisesta lentoaikamassa-analysaattorista. [13, s. 41-42.]

22 Kuva 7. Ortogonaalisesti kiihdytetty lentoaikamassa-analysaattorin kaaviokuva (lineaarinen malli). Ionit saapuvat ionilähteestä lentoputkeen, jossa pulssimainen sähkökenttä muuttaa ionien lentoradan detektorin suuntaan. [15.] Ortogonaalisesti kiihdytetyn lentoaikamassa-analysaattorin etuja ovat hyvä transmissiotehokkuus varsinkin suurilla massoilla, ionien nopeus- ja tilajakaumien samanaikainen korjaus, selvä parempi resoluutio kuin perinteisellä TOF:lla ja erittäin pieni pulssauksesta johtuva aikajakauma. Ortogonaalisesti kiihdytetty lentoaikamassaanalysaattori sopii parhaiten käytettäväksi jatkuvaa ionivirtaa tuottaviin lähteiden, kuten ESI:n kanssa. [13, s. 41-42.] Ioniheijastimella tai kvadrupolilla varustetulla TOF-laitteella voidaan tehdä myös tandemmassaspektrometrisiä mittauksia, jossa käytetään lineaarista sekä ionihejastinmoodia kahdella erilaisella detektorilla. Ionilähteen jälkeen ionille tapahtuu ionin hajoamista (post-source decay fragmentation). Lähtöionilla, tuoteionilla ja neutraalipalalla on sama nopeus, mutta eri massa ja siten eri kineettinen energia. Lineaaridetektorilla havaitaan tällöin vain yksi ioni, jonka lentoaika vastaa lähtöionin lentoaikaa ja m/zarvoa. Ionihejastinta käytettäessä tuoteionit, joiden kineettinen energia on pienempi kuin lähtöionin, tulevat ulos ioniheijastimesta aikaisemmin kuin lähtöionit, jolloin myös ne voidaan havaita ja niiden m/z-arvot voidaan määrittää lentoajan perusteella. Näin pystytään määrittämään tietyn lähtöionin kautta syntyvät tuoteionit. Kuvassa 8 esitetään ortogonaalisesti kiihdytetyn lentoaikamassa-analysaattorin kaaviokuva. [13, s. 41-42.]

23 Kuva 8. Kaaviokuva ortogonaalisesti kiihdytetystä lentoaikamassa-analysaattorista ja ionien lentoradasta sen sisällä [16, s. 27.]. Lineaarisella TOF:lla analysoitavan ionin m/z-arvo voidaan määrittää ajasta, joka ionilla kestää kulkeutuessa kentättömän alueen läpi ionilähteestä detektorille. Ioni, jonka massa on m ja kokonaisvaraus q = ze, kineettinen energia on mv 2 2 = qv s = zev s = E k (2) V s on sähköinen potentiaali d on kentätön matka m on massa q on kokonaisvaraus z on varaus e on alkeisvaraus E k on kineettinen energia Lentoaika t, jonka ionilla kuluu matkaan d, on

24 t = d v (3) t on lentoaika d on kentätön matka v on varautuneen partikkelin kiihtyvyys Korvaamalla v yhtälöstä 2 yhtälöön 3 saadaan t 2 = m z ( d2 2V s e ) (4) t on lentoaika m on massa z on varausluku d on kentätön matka V s on sähköinen potentiaali e on alkeisvaraus Yhtälöstä 4 perusteella ionin m/z-arvo voidaan laskea suoraan mittaamalla lentoaika t, koska suluissa oleva termi on vakio. Tästä seuraa myös se, että pienimassaiset ionit saapuvat detektorille aikaisemmin kuin suurimassaiset ionit. Massatarkkuus voidaan ilmaista tuloksissa millidalttoneina (mda) tai ppm:nä (parts per million). [13, s. 39-40.] 4.2.4 Detektori Detektori muuntaa massa-analysaattorilta saapuvan ionisuihkun käyttökelpoiseksi signaaliksi. Lentoaikamassaspektrometrissä käytetään yleisesti detektorina elektronimonistinta, johon ionit fokusoituvat massaluku kerrallaan. Kun riittävän energian omaava ioni osuu levyyn, joka on rei itetty monien mikroskooppisten putkien avulla, vapautuu yksi tai useampi elektroni. Jokainen putki toimii elektronimonistimena. Elektroneita monistuu jokaista yksittäistä ionia kohden noin 10 kappaletta. Elektronit kiihdytetään tuikeaineeseen, joka elektronin siihen osuessa emittoi fotonin. Fotonit fokusoidaan optis-

25 ten linssien avulla fotonimonistinputkeen, joka vahvistaa fotonien määrää ja tuottaa sähkösignaalin, joka on verrannollinen fotonien määrään. [15.] 5 Kokeellinen osuus Työn tavoitteena oli kehittää ja validoida nestekromatografis-lentoaikamassaspektrometrinen Dilute and Shoot -menetelmä virtsanäytteestä tehtävään dopingpiristeiden seulonta-analyysia varten. Menetelmäkehityksen tarkoituksena oli korvata Yhtyneet Medix Laboratoriot Oy:n nykyinen piristeiden kaasukromatografinen (GC/NPD) seulontamenetelmä. Menetelmän tulisi olla myös kromatografiselta erotukseltaan ja massaspektrometriselta havainnoinniltaan niin joustava, että menetelmään voisi lisätä tutkittavia yhdisteitä myöhemmin. Menetelmä rakennettiin jo laboratoriossa käytössä olevien samantapaisten analyysimenetelmien pohjalta. Yhdisteiden erotus tapahtui nestekromatografisesti (HPLC) ja identifiointi perustui korkean resoluution lentoaikamassaspektrometriseen analysointiin (TOF), jossa sähkösumutukseen (ESI) perustuva ionisaatio tehdään positiivisella polariteetilla. Yhdisteiden identifiointi perustuu tarkkaan massaan sekä retentioaikaan. Menetelmässä virtsanäytteen esikäsittely on hyvin vähäistä, sillä se ainoastaan laimennetaan puskuriliuoksella ennen analyysia, jolloin näytteeseen lisätään myös sisäinen standardi. Tavoitteena on pystyä identifioimaan kaikki yhdisteet riittävällä spesifisyydellä vähintään WADAn asettamalla ½ x MRPL-tasolla (Minimun Required Performance Level 100 ng/ml) eli 50 ng/ml. [9.]

26 5.1 Koejärjestely Tässä osassa käydään läpi kokeellisen osan koejärjestely. 5.1.1 Kemikaalit ja reagenssit Menetelmässä käytettiin seuraavia reagensseja: Metanoli, LC-MS Ultra CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën, CAS 67-56-1 Acetonitriili, CHROMASOLV, 99.9%, for LC-MS, Honeywell Riedel-de Haën, CAS 75-05-8 Ammoniumformaatti Muurahaishappo Ionivaihdettu vesi, Millipore (Damnstadt, Saksa) 5.1.2 Laitteet ja ohjelmistot Menetelmässä käytettiin seuraavia laitteita ja ohjelmistoja: Agilent 6550 ifunnel Q-TOF LC/MS -laitteisto Qalle 1290 Infinity II Nestekromatografi (Agilent Technologies) 6550 ifunnel Q-TOF LC/MS Massaselektiivinen ilmaisin (Agilent Technologies) 1290 Infinity II Automaattinen näytteensyöttäjä (Agilent Technologies) Restek Raptor Biphenyl 3.0 x 50 mm (2.7 µm) kolonni Restek Raptor C18 EXP Guard Column Cartridge 3.0 x 5 mm (2.7 μm) -esikolonni Sentrifuugi Vortex-sekoittaja Agilent MassHunter WorkStation - Qualitative Analysis for GC/MS B.07.00 -ohjelmisto Agilent MassHunter Quantitative Analysis (for QTOF) B.07.00 -ohjelmisto

27 Agilent MassHunter PCDL-Manager for Forensics and Toxicology - ohjelmisto 5.2 Tutkittavat yhdisteet ja näytteiden valmistus Taulukkoihin 3 ja 4 on listattu tässä opinnäytetyössä tutkitut ja menetelmään lisätyt piristeyhdisteet. Taulukon 3 yhdisteet ovat muut kuin erikseen määriteltyjen piristeiden kohdeyhdisteitä. Kohdeyhdisteet piristeille ovat määritelty niiden metabolian mukaan. Esimerkiksi kokaiini metabolisoituu suurimmaksi osaksi benzoylecgoninena virtsaan, joten menetelmään lisättiin benzoylecognine. Taulukon 4 yhdisteet ovat erikseen määriteltyjen piristeiden kohdeyhdisteitä. Taulukko 3. Menetelmään lisätyt muut kuin erikseen määriteltyjen piristeiden kohdeyhdisteet [2.]. Ryhmä S6 (Prohibited list 2017): Muut kuin erikseen määriteltyjen piristeiden kohdeyhdisteet Kohdeyhdiste Molekyylikaava Moolimassa Valmistaja Amfepramone C13H19NO 205.14666 Amphetamine C9H13N 135.1048 Ph.Nord./Yliopiston Apteekki Amiphenazole C9H9N3S 191.05172 Alfa Aesar Benfluorex C19H20F3NO2 351.14461 Sigma Benzylpiperazine C11H16N2 176.13135 NMI 6-Hydroxybromantan C16H20BrNO 321.07283 NMI Benzoylecgonine C16H19NO4 289.13141 Lipomed Cropropamide C13H24N2O2 240.18378 LGC Crotethamide C12H22N2O2 226.16813 Toronto Research Chemicals Inc. Fencamine C20H28N6O2 384.22737 NMI Fenfluramine C12H16F3N 231.12348 DR. Ehrenstorfer Carphedon C12H14N2O2 218.10553 VEN Mephentermine C11H17N 163.1361 Wyeth Mesocarb C18H18N4O2 322.14298 p-hydroxymesocarb C18H18N4O3 338.13789 Helsingin Yliopisto Methamphetamine C10H15N 149.12045 Aldrich 4-Methylamphetamine C10H15N 149.12045 NMI Norfenfluramine C10H12F3N 203.09218 LGC Phendimetrazine C12H17NO 191.13101 Toronto Research Chemicals Inc. Prolintane C15H23N 217.18305 LGC Phentermine C10H15N 149.12045 Lipomed

28 Taulukko 4. Menetelmään lisätyt erikseen määriteltyjen piristeiden kohdeyhdisteet [2.]. Erikseen määriteltyjen piristeiden kohdeyhdisteet Kohdeyhdiste Molekyylikaava Moolimassa Valmistaja Methylhexanamine C7H17N 115.1361 Cerilliant Cathine C9H13NO 151.09971 NMI Cathinone C9H11NO 149.08406 Cerilliant Cyclazodone C12H12N2O2 216.08988 NMI Dimethylamphetamine C11H17N 163.1361 NMI Dobutamine C18H23NO3 301.16779 Sigma Ephedrine C10H15NO 165.11536 Aldrich Ethamivan C12H17NO3 223.12084 Chemie Linz AG Amphetamine (N-ethyl) C11H17N 163.1361 Cerilliant Etilefrin C10H15NO2 181.11028 Ph.Eur. Famprofazone C24H31N3O 377.24671 Sigma Fenbutrazate C23H29NO3 367.21474 NMI Fencamfamin C15H21N 215.1674 THC Pharm Heptaminol C8H19NO 145.14666 Cerillant p-hydroxyamphetamine C9H13NO 151.09971 THC Pharm Isometheptene C9H19N 141.15175 THC Pharm Methedrone C11H15NO2 193.11028 Keskusrikospoliisi MDMA C11H15NO2 193.11028 LGC Methoxyphenamine C11H17NO 179.13101 Star Methylephedrine C11H17NO 179.13101 Fluka Methylphenidate C14H19NO2 233.14158 Sigma Nikethamide C10H14N2O 178.11061 Sigma Norfenefrine C8H11NO2 153.07898 THC Pharm Ortetamine C10H15N 149.12045 NMI Oxilofrine C10H15NO2 181.11028 NMI Pemoline C9H8N2O2 176.05858 Sigma Pentetrazol C6H10N4 138.09055 Phenmetrazine C11H15NO 177.11536 Phenpromethamine C10H15N 149.12045 Pholedrine C10H15NO 165.11536 Knoll Pipradrol C18H21NO 267.16231 Toronto Research Chemicals Inc. Propylhexedrine C10H21N 155.1674 Knoll Pseudoephedrine C10H15NO 165.11536 LGC Desmethylsibutramine C16H24ClN 265.15973 LGC Strychnine C21H22N2O2 334.16813 Ph.Nord./Yliopiston Apteekki MDA C10H13NO2 179.09463 LGC Puhdasainemittauksia ja retentioaikojen selvittämistä varten valmistettiin 1 μg/ml pitoisuustason puhdasainenäytteet. Puhdasainekantaliuokset valmistettiin punnitsemalla

29 tutkittavia yhdisteitä omiin mittapulloihinsa, jotka täytettiin merkkiin metanolilla. Kantaliuoksien pitoisuustaso oli 1 mg/ml. Kantaliuoksista valmistettiin 100 μg/ml pitoisuustason välilaimennokset pipetoimalla automaattipipetillä 50 μl kantaliuosta ja 450 μl metanolia HPLC-vialeihin. Kantaliuokset ja välilaimennokset säilytettiin pakkaslämpötilassa. Puhdasainenäytteet valmistettiin välilaimennoksista pipetoimalla 2 μl välilaimennosta ja 198 μl A-ajoliuosta sisäputkellisiin HPLC-vialeihin. Puhdasainenäytteet valmistettiin juuri ennen tai 1-4 päivää ennen ajoa, jolloin ne säilytettiin jääkaappilämpötilassa. Sisäinen standardi valmistettiin pipetoimalla 100 μl Amphetamine-D8 ja Buprenorphine- D4 yhdisteitä 10 ml mittapulloon, joka täytettiin metanolilla. Näyteanalyysejä varten valmistettiin yhdisteiden seokset pipetoimalla tiettyjä puhdasainevälilaimennoksia HPLC-vialeihin. Seoksia valmistettiin yhteensä 6 kappaletta, joissa kaikissa 9-10 eri yhdistettä. Jokaisen seokseen lisätyn yhdisteen pitoisuus oli 10 μg/ml. Yhdisteet lajiteltiin eri seoksiin niiden retentioaikojen ja molekyylipainon mukaan, jotta melkein saman retentioajan ja/tai saman molekyylipainon omaavat yhdisteet eivät eluoituisi samaan aikaan. Seoksista valmistettiin 100 ng/ml (MRPL taso) pitoisuuden omaavat virtsanäyte kantaliuokset pipetoimalla 100 μl jokaisesta yksittäistä seosta omaan 10 ml mittapulloonsa, joka täytettiin lääkevapaalla virtsalla. Virtsanäyte kantaliuoksista valmistettiin 50 ng/ml (½ x MRPL) pitoisuuden virtsanäyte välilaimennokset pipetoimalla 4 ml virtsanäyte kantaliuosta ja 4 ml lääkevapaata virtsaa mittapulloon. Virtsanäyte kantaliuokset ja välilaimennokset säilytettiin jääkaappilämpötiloissa. Kaikki humaanivirtsanäytteet näyteanalyyseja varten valmistettiin pipetoimalla eppendorfputkiin 90 μl virtsanäyte välilaimennosta, 10 μl sisäistä standardia ja 100 μl A- ajoliuosta. Näytteitä valmistettiin kuusi kappaletta, joissa kaikkiin on pipetoitu eri humaanivirtsavälilaimennoksesta. Näytteet vorteksoitiin ja sentrifugoitiin 5 min 16000 rcf (relative centrifugal force). Lopuksi näytteiden supernatanttia pipetoitiin 150 μl sisäputkellisiin HPLC-vialeihin. Jokaista näytesarjaa varten valmistettiin myös negatiivinen kontrolli (UBL) pipetoimalla lääkevapaata virtsaa näytematriisina ja reagenssinolla näyte (puhdistettu vesi) samaan tapaan kuin humaanivirtsanäytteet. Kuvassa 9 on havainnollistettu liuoksien ja näytteiden valmistaminen.

30 Kuva 9. Valmistetut liuokset ja näytteet 5.3 Kirjaston rakentaminen Kirjasto rakennettiin helpottaakseen LC-QTOF-laitteistolta saadun datan käsittelyä sekä mahdollisia varmistusanalyysejä varten. Kirjastosta löytyy jokaisen tutkittavan yhdisteen nimet, spektri, molekyylikaava ja retentioaika. Lisäksi kirjasto sisältää yhdisteiden CAS-numerot ja rakennekaava. Kirjasto rakennettiin Agilentin MassHunter PCDL-Manager for Forensics and Toxicology -ohjelmistoa käyttäen. Yhdisteiden tiedot lisättiin kirjastoon Agilentin tarjoamasta

31 laajasta yhdistekirjastosta, joka sisältää mm. useimpien urheilussa kiellettyjen yhdisteiden tiedot. Tätä työtä varten tutkittavien yhdisteiden retentioajat selvitettiin ja ne lisättiin kirjastoon retentioaikamittauksista saatujen tuloksien perusteella. Tietyiltä yhdisteiltä puuttui myös spektrit, jotka selvitettiin ja lisättiin kirjastoon yksittäisillä puhdasaineanalyyseillä, jossa valittiin tarkan massan avulla protonoitunut molekyyli, joka törmäytettiin kolmella eri törmäysenergialla (10, 20 ja 40 V). [17.] 5.4 Datan prosessointimenetelmän kehittäminen Datan prosessoimiseksi kehitettiin kvalitatiivinen sekä kvantitatiivinen datan prosessointimenetelmä. 5.4.1 Kvalitatiivinen datan prosessointimenetelmä Kvalitatiinvinen datan prosessointimenetelmä rakennettiin Agilentin MassHunter WorkStation - Qualitative Analysis for GC/MS -ohjelmistoa käyttäen. Ohjelmisto analysoi yhdisteet käyttäen Find by Formula algoritmiä. Ensiksi ohjelmisto luo eristetyn ionikromatogrammin (extracted ion chromatogram, EIC) jokaisen yhdisteen tarkan massan perusteella yhdisteen oletetun retentioajan kohdalle. Seuraavaksi se integroi EIC kromatogrammin ja noutaa spektrin kirjastosta alueen piikin päälle, jos piikki ylittää vähimmäis pinta-ala threshold -arvon. Lopuksi ohjelmisto vertaa saatua spektriä teoreettisiin arvoihin kyseiselle yhdisteelle. [18.] Ohjelmistolla on kuitenkin vaikea selvittää hyvin pieniä pitoisuuksia koska se havaitsee vain pinta-ala treshold -arvon ylittävät piikit. Dopinganalytiikassa hyvin pienetkin pitoisuudet voidaan raportoida positiivisena, joten kvalitatiivisen datan prosessointimenetlemän sijaan data prosessoitiin kvantitaviivisella datan prosessointimenetelmällä. [18.] 5.4.2 Kvantitatiivinen datan prosessointimenetelmä Kvantitatiivinen datan prosessointimenetelmä rakennettiin Agilentin Mass Hunter Quantitative Analysis (for QTOF) -ohjelmistoa käyttäen. Ohjelmistolla voidaan tehdä datan prosessointimenetelmä, jossa on kaikkien menetelmään lisättyjen kohdeyhdisteiden eristetyt ionikromatogrammit (EIC). Ohjelmistolla saadaan näkyviin myös ne EIC:t, joita ei ole tunnistettu tai löydetty. Ohjelmistolla voidaan myös verrata kohdeyhdistettä nega-

32 tiivisen nollavirtsanäytteen aiheuttamaan taustaan ja siten havaita myös todella pienet pitoisuudet tai yhdiste, jonka massatarkkuus on heikompi kuin mikä menetelmään on määritelty. [19.] Kvantitatiivinen datan prosessointimenetelmä on päämenetelmä, jolla tässä opinnäytetyössä kehitetyllä seulontamenetelmällä tullaan prosessoimaan saatu data, mutta ohjelmiston teknisistä ominaisuuksista johtuen massatarkkuus saadaan kvantitatiivisella ohjelmistolla ainoastaan ppm-yksiköissä. Tämän takia käytettiin kvalitatiivista datan prosessointimenetelmää, jotta saataisiin massatarkkuus myös mda-yksikössä, joka usein soveltuu pienille molekyyleille paremmin kuvaamaan massatarkkuutta. [19.] 5.5 Nestekromatografi/massaspektrometria Menetelmän kehitys, optimointi ja menetelmän validointi tehtiin Agilent 6550 ifunnel Q- TOF LC/MS Qalle -laitteistoa käyttäen. Nestekromatografinen mittaus tehtiin Restek Raptor Biphenyl 3.0 x 50 mm (2.7 µm) kolonnilla. Esikolonnina käytettiin Restek Raptor C18 EXP Guard Column Cartridge 3.0 x 5 mm (2.7 μm) esikolonnia. Näytettä injektoitiin 1 μl ja kolonnin lämpötila oli asetettu 40 C:een. Virtausnopeudeksi oli asetettu 400 μl/min. Analyysi tehtiin vesi-metanoli-asetonitriili-gradienttiajona, jossa vesipohjainen ajoliuos A sisälsi 2,5 mm ammoniumformiaattia ja 0,1 % muurahaishappoa. Ajoliuos B sisälsi 2,5 mm ammoniumformiaattia ja 0,1 % muurahaishappoa metanoli ja asetonitriili seoksessa (4:1). Gradientti on esitetty taulukossa 5. Analyysiaika oli 11 minuuttia. Taulukko 5. Työssä käytetyn menetelmän gradientti. Aika (min) A (%) B (%) 0.0 95 5 0.5 95 5 3 75 25 7.5 0 100 10 0 100 11 95 5

33 Taulukossa 6 on esitetty menetelmässä käytetyt massaspektrometriset ajoparametrit. Kvadrupolin läpi päästettiin kaikki ionilähteeltä saapuvat ionit, joista osa fragmentoitiin törmäyskammiossa 0, 20 ja 40 V törmäysenergioilla. Törmäyskaasuna käytettiin typpeä. Syntyneet lähde- ja tuoteionit eroteltiin toisistaan ortogonaalisesti kiihdytetyssä lentoaikamassa-analysaattorissa, jonka jälkeen ne saapuivat detektorille. Taulukko 6. Menetelmässä käytetyt massaspektrometriset ajoparametrit. Kuivauskaasu 150 C flow 20 l/min Verhokaasu 350 C flow 12 l/min Ionilähde Dual AJS ESI positiivinen polariteetti Fragmentoija 400 V Kapilaarin jännite 4500 Suuttimen jännite 500 V Skimmer 1 65 Octopole RF 750 V Acquisition m/z 500-1000 10 spectra/s 100 ms/spectrum Törmäys energia 0, 20 ja 40 V Menetelmän kehitykseen, optimointiin ja validointiin käytetty nestekromatografi/lentoaikamassaspektrometrilaitteisto on esitetty kuvassa 10. Lentoaikamassaspektrometri kalibroitiin joka ajoa ennen tune-viritystä käyttäen. Kalibroinnissa seurattiin 922 m/z ja 122 m/z ioneja.

34 Kuva 10. Nestekromatografi/lentoaikamassaspektrometri Agilent 6550 ifunnel Q-TOF LC/MS Qalle. 5.6 Validointi Validoinnin tarkoituksena on määrittää tutkittavan menetelmän soveltuvuus aiottuun käyttötarkoitukseen. Menetelmä validoitiin Yhtyneet Medix Laboratoriot Oy:n ohjeiden ja WADAn asettamien vaatimusten mukaisesti. Menetelmä validoitiin ½ x MRPL-tason (50 ng/ml) näytteillä. 5.6.1 Vertailumittaukset Menetelmän toimivuutta tutkittiin analysoimalla laboratorioon aiemmin tulleita laaduntarkkailunäytteitä, joiden tiedettiin sisältävän menetelmään kuuluvia analyyttejä. 5.6.2 Toistettavuus (sarjan sisällä) Sarjan sisäinen toistettavuus tutkittiin 50 ng/ml pitoisuuden (½ x MRPL-taso) samassa sarjassa käsitellyillä ja samalla laitteella analysoiduilla rinnakkaisnäytteillä. Tutkittavina parametreina ovat retentioaika, kromatografisen piikin pinta-ala sekä massatarkkuus (ppm). Yhdisteiden identifioinnissa massatarkkuus saa erota enintään ±10 ppm. Lisäksi todettiin toistettavasti löydetyt fragmentit jokaiselle yhdisteelle. Toistettavuus määritetään laskemalla tuloksista suhteellinen keskihajonta (RSD%). Tutkittavat parametrit

35 toistettavuudelle olivat retentioajan, massatarkkuuden, piikkien pinta-alojen ja pintaala/sisäisen standardin suhteiden toistettavuus. 5.6.3 Uusittavuus (sarjojen välillä) Sarjojen välistä uusittavuutta tutkittiin viidessä eri sarjassa. Uusittavuus määriteltiin laskemalla tuloksista suhteellinen keskihajonta (RSD%). Tutkittavina parametreinä olivat retentioajan, massatarkkuuden (ppm), piikkien pinta-alojen ja pinta-ala/sisäisen standardin suhteiden toistettavuus. 5.6.4 Spesifisyys ja matriisivaikutukset Spesifisyys ja matriisivaikutukset mitattiin näytteen esikäsittelyyn käytettyjen reagenssien (RBL) ja mitattavan matriisin (5 negatiivista naisvirtsaa ja 5 negatiivista miesvirtsaa) suhteen. Negatiiviset nais- ja miesvirtsanäytteet kerättiin vapaaehtoisilta henkilöiltä. Analyyseistä tutkittiin jokaisen kohdeyhdisteen mahdollisesti aiheuttama häiriö samalla retentioajalla eluoituviin toisiin kohdeyhdisteisiin. Lisäksi tutkittiin ionisuppression mahdollista vaikutusta. Ionilähteen aiheuttama ionisupressio tutkittiin koejärjestelyllä, jossa norfenefrineä (ensimmäisenä eluoituva yhdiste) suorasyötettiin massaspektrometriin samalla kun sinne injektoitiin negatiivinen kontrolli (UBL). Supressio arvioitiin seuraamalla taustaspektrin pohjaviivan tasaisuutta. 5.6.5 Säilyvyys Analyyttinen säilyvyys valmistetussa näytteessä tutkitaan uusintakokeiden yhteydessä mittaamalla yhden analyysisarjan näytteet heti esikäsittelyn jälkeen sekä 14 vuorokauden kuluttua. Uusintamittauksissa saatuja mittaustuloksia verrattiin ensimmäisiin mittaustuloksiin. Näytteiden uusinta-ajo oli tarkoitus suorittaa 4 vuorokauden kuluttua, mutta LC-QTOF-laitteiston epäkunnon takia näytteet voitiin ajaa vasta myöhemmin. Näytteitä säilytettiin ajojen välissä jääkaapissa, valolta suojattuna. 5.6.6 Mittauksen herkkyys ja toteamisraja Mittauksen herkkyys ja toteamisraja määritettiin viitenä rinnakkaisena näytesarjana käyttäen kriteerinä tunnistusta S/N (signal-to-noise) > 3 tasolla ½ x MRPL. Tunnistuk-

36 sen kriteerinä käytetään pinta-alojen, retentioaikojen ja massatarkkuuden toistettavuutta. [6.] 6 Tulokset 6.1 Vertailumittaukset Taulukossa 7 on listattu ulkoisten laadunarviointinäytteiden tulokset kehitetyllä menetelmällä. Taulukko 7. Ulkoisten laadunarviointinäytteiden tulokset kehitetyllä menetelmällä. Näyte / koodi Näytteen sisältämä yhdiste Löydös kehitetyllä menetelmällä HSK10698 benzylpiperazine 192.5 ng/ml Benzylpiperazine WAADS 2006 QA-1, 1C Pseudoephedrine Cathine Ephedrine Norephedrine* Methylephedrine Pseudoefedriini Katiini Efedriini Metyyliefedriini RC219 Pseudoephedrine erityskoe Pseudoefedriini, katiini HSK8348 Methylhexenamine 3.1 mg/ml Methylhexenamine RC220 Nikethamide Niketamidi RC36 Methylphenidate Metyylifenidaatti RC27 Propylhexedrine Propyyliheksedriini RC16 Crotethamide crotethamide RC23 Etamivan nd** HSK9589 6-hydroxybromantan 721.3 ng/ml nd*** * ei sisälly menetelmään ** erittyy todennäköisesti sulfaattikonjugaattina, kts kuva 11 *** erittyy todennäköisesti glukuronidikonjugaattina, kts kuva 12 Ulkoisissa laaduntarkkailunäytteiden sisältämät yhdisteet voitiin todeta helposti menetelmällä, muutamia poikkeuksia lukuun ottamatta. Etamivaania ei todettu lainkaan RC23-erityskoenäytteestä, mutta m/z 304.08493 (etamivaanin sulfaattikonjugaatti), näkyy mahdollinen piikki kromatogrammissa (rt 4.83 min, kts. kuva 11). Myös sillä perusteella, että samalla retentioajalla näkyy m/z 224.12812 (etamivaani) sekä m/z

37 151.03897 (fragmentti, jossa etamivaanin amidisidos katkennut) perusteella rt 4.83 min voisi olla etamivaanisulfaatin piikki. 6b-OH-bromantaania ei myöskään todettu erityskoenäytteestä, mutta 6b-OHbromantaaniglukuronidia vastaava piikki havaitiin kromatogrammeissa, m/z 498.11219 retentioajalla 7.04 min. Myös bromi-isotooppiin sopiva vastaava piikki, m/z 500.110144, havaitaan samalla retentioajalla. Etamivaanisulfaatin ja 6β-OH-bromantanen rakennekaavat on esitetty kuvassa 10. HO O S O O O O N HO HO HO OH O O O H N Br Kuva 11. Etamivaanisulfaatin ja 6β-OH-bromantanen rakennekaavat. Kuva 12. RC23-näyte (ylempi kuvaruutu): EIC:it massoista m/z 304.08493, 224.12812 sekä 151.03897 (m/z 144.16229 on sisäinen standardi, d8-amfetamiini). Alempi kuvaruutu: UBL (nollavirtsa), samat EIC:t.

38 Kuva 13. HSK9589-erityskoenäyte: EIC:it massoista m/z 498.11219 ja m/z 500.110144 (m/z 144.16229 on sisäinen standardi, d8-amfetamiini). Alempi kuvaruutu: UBL (nollavirtsa), samat EIC:t. 6.2 Toistettavuus Retentioajat sarjan sisällä olivat hyvin toistettavia suhteellisen keskihajonnan ollessa alle 2 %. Myös identifiointikriteereiden toistettavuudet olivat hyviä. Pinta-alojen suhteellisen keskihajonnan sekä ilman sisäistä standardia että sisäiseen standardiin suhteutettuina olivat alle 10 %. Poikkeuksena norfenefrine (RSD % 30), johtuen siitä, että norfenefrine eluoituu ensimmäisenä (RT 0.9 min), jolloin ionisuppressio vaikuttaa toistettavuuteen. Massatarkkuusero oli alle 10 ppm suurimalle osalle yhdisteistä; poikkeuksena norfenefrine (ionisuppressio vaikuttaa myös massatarkkuuteen) sekä pemoline, jonka kohdalla piikin intensiteetti ½ x MRPL-tasolla ei ole kovin suuri (S/N-suhde on hyvä, mutta piikki on aika pieni ja piikin malli siksi heikonlainen. Suurimmalle osalle yhdisteitä löytyi myös ainakin yksi toistettava fragmentti. Sarjan sisäiset toistettavuustulokset ovat esitetty liitteessä 1.

39 6.3 Uusittavuus Retentioajat sarjojen välillä olivat erittäin toistettavia suhteellisen keskihajonnan ollessa alle 3 %. Myös vasteiden (pinta-alan sekä pinta-ala/ sisäisen standardi-suhteiden) toistettavuudet olivat hyviä suhteellisen keskihajonnan ollessa alle 15 % suurimmalle osalle yhdisteitä. Poikkeuksena joitakin yhdisteitä: norfenefrinelle RSD oli 30 % ionisuppression takia). Dobutamiinille sarjojen välinen toistettavuus oli huono, joka johtunee siitä, ettei dobutamiini säily jääkaapissa vesiliuoksessa kovin kauaa. Massatarkkuusero oli alle 10 ppm suurimalle osalle yhdisteistä, poikkeuksina jälleen norfenefrine sekä pemoline. Päivien väliset toistettavuustulokset ovat esitetty liitteessä 2. 6.4 Spesifisyys ja matriisivaikutukset Menetelmän todettiin olevan spesifinen validoitujen yhdisteiden suhteen, koska näytteissä ei esiintynyt positiivisiksi löydöksiksi tulkittavia yhdisteitä. Tutkittavat yhdisteet olivat jaettu seoksiin (seokset 1-6), ja tutkimalla kaikki seokset kaikkien yhdisteiden osalta, todettiin etteivät yhdisteet aiheuta vääriä positiivisia löydöksiä. Metamfetamiinilla, 4-metyyliamfetamiinilla, phenterminella, ortetaminella ja phenpromethaminella on kaikilla sama molekyylikaava, C 10H 15N, mutta yhdisteet eroavat kromatografisesti toisistaan ja voidaan siten tunnistaa retentioajan perusteella (kuva 13). Myös katiini ja 4- hydroksiamfetamiinilla on sama molekyylikaava (C 9H 13NO), mutta myös nämä yhdisteet eroavat kromatografisesti toisistaan, ja lisäksi yhdisteiden spektrit eroavat toisistaan siten, että yhden fragmentin avulla ne voidaan erottaa toisistaan. Mefenterminella, dimetyyliamfetamiinilla ja etyyliamfetamiinilla on kaikilla sama molekyylikaava (C 11H 17N), dimetyyliamfetamiini eroaa muista kromatografisesti, mutta mephentermine ja etyyliamfetamiini eluoituvat lähes samanaikaisesti (kuva 14). Myös efedriinillä, foledriinillä ja pseudoefedriinillä on sama kaava C 10H 15NO, mutta nekin eroavat kromatografisesti toisistaan. Tämä tarkoittaa sitä, että menetelmällä on mahdollista suoraan erottaa efedriini ja sen enantiomeeri, pseudoefedriini, toisistaan (kuva 15). Etilefriinillä ja oksilofriinilla on sama kaava (C 10H 15NO 2), samoin MDMA:lla ja methedronella (C 11H 15NO 2), mutta nämäkin eroavat kromatografisesti toisistaan. Amiphenazole ei näkynyt tarpeeksi suurella S/N suhteella virtsanäytteissä, joten se päätettiin jättää pois menetelmästä.

40 Kuva 14. EIC:t m/z 150.12770: Metamfetamiini (rt 4.02 min, pinkki), 4-metyyliamfetamiinin (rt 4.65 min, punainen), phenterminen (rt 4.23 min, keltainen), ortetaminea (rt 4.47, vihreä) ja phenpromethaminella (rt 3.87, liila). Kuva 15. EIC m/z 164.14340: Dimetyyliamfetamiini (rt 4.41, sininen), etyyliamfetamiini (rt 4.48, pinkki) ja mephentermine (rt 4.50, punainen). Kuva 16. EIC m/z 166.12264: Ephedrine (rt 3.11, ruskea), pseudoefedriini (rt 3.26, vihreä) ja pholedrine (rt 2.35, sininen).