Kuka sen teki, mistä se tuli? Uusi jäljitysmenetelmä vesiä saastuttavien mikrobien alkuperän tunnistamiseen Erikoistutkija, Dos., FT Tarja Pitkänen 29.10.2016 Ympäristöterveyspäivät 2016 / Tarja Pitkänen 1
Vesivarojen saastuminen Järvet, joet, pohjavesi, meri Kemialliset yhdisteet, mikrobit Juomavesi, ruoantuotanto, virkistyskäyttö, ekosysteemien ravintoketjut Kansanterveys, luonnonsuojelu Sanitaatio tietopaketti (GWPP) http://www.waterpathogens.org/ Maailman terveysjärjestö (WHO) http://www.who.int/water_sanitation_health/en/ CONPAT-hanke (Suomen Akatemia) http://fi.opasnet.org/fi/conpat
Suolistoperäiset saastelähteet (kaupunki / maaseutu / metsä) Jätevesi Puhdistettu jätevesi Jätevesivuodot Haja-asutuksen jätevesijärjestelmät Eläinten ulosteet Karjatalous Luonnoneläimet Vesilinnut Hulevedet
Talous- ja luonnonvesiä saastuttavien mikrobien alkuperä voidaan tunnistaa THL, Vesi ja terveys yksikkö, Vesitalous 6/2015 Menetelmävalikoima vesivarojen mikrobiologisten saastumistapauksien selvittelyyn onko vesinäytteessä nautakarjasta, sioista, lokeista, siipikarjasta tai ihmisestä peräisin olevia suolistomikrobeita? Ns. isäntäspesifiset Bacteroidales ja Catellicoccus - bakteerit, sekä ihmis-spesifiset virukset ja paprikavirus (RT-)qPCR osoitus http://urn.fi/urn:isbn:978-952-302-517-2
Veden laadun hallinta ja vesimikrobiologia Viite: Roslev ja Bukh, Appl Microbiol Biotechnol (2011) 89:1341 1355 Valvontatutkimukset Käyttötarkkailu Veden laatua uhkaavat tekijät (riskit) Referenssimenetelmät Pikamittausmenetelmät Suolistoperäisten indikaattorimikrobien havaitseminen TASO 1 Taudinaiheuttaja -analytiikka Taudinaiheuttajien havaitseminen Mikrobiologinen riskinarviointi TASO 2 Saastelähteen jäljitysmenetelmät Saastelähteen tunnistaminen ja altistumisen arviointi Saastelähteen poistaminen TASO 3 29.10.2016 5
Varhaiset mikrobiologiset tekniikat saastelähteiden tunnistamiseen Geldreich ja Kenner (1969): Fekaaliset koliformit / fekaaliset streptokokit (FC/FS) Ongelmana epäspesifisyys, erot säilyvyydessä DNA-sormenjälkitekniikat ERIC-PCR, REP-PCR, BOX-PCR Ribotyyppaus, PFGE, AFLP Ongelmana kantakirjaston tarve, hitaus, käyttöalue vain viljellyt bakteerikannat Pitkänen et al, J Water Health, 2008
Isäntäspesifiset geneettiset markkerit Roslev ja Bukh, Appl Microbiol Biotechnol (2011) 89:1341 1355 Lähtökohtana runsas esiintyminen suolistossa ja tunnettujen suvun lajien esiintyminen vain tietyissä eläinlajeissa Molekulaariset markkerit voidaan jaotella: Prokaryoottimarkkerit 16S rrna; Bacteroidetes, Bifidobacterium Virusmarkkerit esim. F-spesifiset RNA faagit Eukaryoottimarkkerit esim. mitokondriaalisen DNA:n analyysit Saastelähteen karakterisointiin tarvitaan tarkasti mietitty markkerivalikoima (yksi markkeri ei riitä!) Verrataan esiintymistiheyksiä Maantieteelliset erot, spesifisyys, sensitiivisyys Boehm et al, 2013. Water Res. 47:6812-6828
Suolistobakteerien luokittelu isäntälajeissa esiintymisen mukaan McLellan and Eren, Trends in Microbiology, 2014 29.10.2016 8
Molekulaarista vesimikrobiologiaa Kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qpcr) Ribosomaalisen RNA:n geenit (DNA) Geenikopioiden kvantitointi Aktiiviset, lepotilaiset ja kuolleet solut Kohdesolujen elävyys/säilyvyys RNA-lähestymistapa: rrna kopioiden määrä riippu solun aktiivisuustasosta Solukalvon läpäisevyys: PMA-qPCR Kapoor, Pitkänen et al. 2015, AEM, 80(1): pp 91-99.
Molekyylimikrobiologiset menetelmät suolistoperäisten bakteerien jäljitykseen THL, Vesi ja terveys yksikkö, Vesitalous 6/2015. Testikohde Menetelmä Käyttötarkoitus Yleinen Bacteroidales GenBac3 Suolistoperäisen saastumisen kokonaismäärän arviointi Ihmis-spesifinen Bacteroidales Lokki-spesifinen Catellicoccus Sorkkaeläin-spesifinen Bacteroidales HF183 Gull4 Rum-2-Bac Ihmisperäisten suolistobakteerien läsnäolon toteaminen ja määrän arviointi Lokkien aiheuttaman ulostesaastutuksen läsnäolon toteaminen ja määrän arviointi Nautakarjan ja muiden sorkkaeläinten suolistobakteerien läsnäolon toteaminen ja määrän arviointi Sika-spesifinen Bacteroidales Siipikarja-spesifinen Brevibacterium Pig-2-Bac CL Sikojen suolistobakteerien läsnäolon toteaminen ja määrän arviointi Siipikarjan suolistobakteerien läsnäolon toteaminen ja määrän arviointi Escherichia coli EC23S857 Pikamenetelmä E. coli -bakteerin geenikopioiden lukumäärän laskemiseksi Enterococcus spp. Entero1 Pikamenetelmä enterokokkien geenikopioiden lukumäärän määrittämiseksi Campylobacter spp. Camp2 Pikamenetelmä kampylobakteerien geenikopioiden lukumäärän määrittämiseksi
Kemialliset saastelähteiden markkerit Keinotekoiset makeutusaineet (Asesulfaami-K) Perfluoratut alkyylihapot (PFOS, PFOA) Kofeiini, antibiootit, ym. - Perkola, 2015, Fate of artificial sweeteners and perfluoroalkyl acids in aquatic environment, https://helda.helsinki.fi/handle/10138/136494 - Gourmelon M., et al. (2010). Water Res. 44 (16) 4812-4824.
Uusi menetelmä suuren tilavuuden vesinäytteenottoon mikrobiologisia analyysejä varten (DEUF) Näytteenotto (ultrasuodatus) 100 litraa vettä DEUF-patruunan läpi Jatkokäsittely laboratoriossa Patruunan eluointi (backflush) Eluaatin jatkokonsentrointi Polykarbonaatti-suodatus, mahdolliset viljelymenetelmät Virusten erottelu kooltaan isommista mikrobeista (bakteerit, sienet, arkit, alkueläimet) PEG-saostus Virusten jatkokonsentrointi Nukleiinihappojen eristäminen ja lähettäminen jatkoanalyysiin 29.10.2016 Anna-Maria Hokajärvi / Vesi ja Terveys-yksikkö 12
Esimerkki 1. Uimaveden enterokokkiongelma Yksi Suomen suosituimmista rantakohteista tällä hetkellä pilalla (Ilta-Sanomat, 27.7.2013) http://luontokohteet.geo.fi/; http://yle.fi/uutiset/
Esimerkki 2. Cryptosporidium talousveden raakavedessä Epäillyt saastelähteet: 1. Nautakarja (preeria) 2. Intiaanireservaatit Ruecker et al, 2013, Infect Genet Evol; http://www.calgary.ca/
Esimerkki 2. Cryptosporidium talousveden raakavedessä Saastelähde: Piisami (Ondatra zibethicus) http://www.fcps.edu/islandcreekes/ecology/muskrat.htm
1.9.2012 31.12.2016 Contamination scenarios Transport models Exposure models Economy models Social impacts Risk factors: hydrology, pollution load Risk of contamination Concentration Adverse health effects Economic impacts Time delay Dispersion Risk Management 29.10.2016 Esityksen nimi / Tekijä 16
Tutkimuskohteena Kokemäenjoen vesistö Näytteitä yhteensä 32 pisteestä vuosina 2012-2014: 76 näytettä puhdistetusta jätevedestä, 119 pintavesinäytettä ja 38 pohjavesinäytettä Eläintiheys / peltohehtaari: Erittäin Kohtalainen Suuri suuri Nautakarja: 2140 2440 8175 1076 Siat: 4 410 85 623 23 957 0 Kohtalainen 27 t 10 1 t 9 2 t 8 6 7 5 5 60 t 200 t 12 11 12 t 16 13 4 t 14 Ref: Happonen et al., STOTEN 2016 noin 100 km 29.10.2016 Tarja Pitkänen, PhD 17
Taudinaiheuttajien esiintyminen CONPAT tutkimusalueen pintavesikohteissa 2012-2014 Taudinaiheuttaja N havaittu N kaikki Esiintyvyys näytteissä (%) Lukumäärien vaihtelu (GC, genomikopiot; pmy, pesäkkeen muodostava yksikkö) Norovirus GI 18 119 15 <1 - n. 420 GC / L Norovirus GII 33 119 28 <1-530 GC / L Adenovirus 74 119 62 <1 - n. 6 300 GC / L Campylobacter spp. 100 119 84 <1-500 pmy / L Salmonella spp. 20 119 17 <1-1 pmy / L Legionella spp. 24 116 21 <10-1 700 pmy / L Mikrobit, joita todettiin kaikissa 16 pintavesikohteessa vähintään kerran: - norovirus GII, adenovirus ja kampylobakteeri 29.10.2016 18
Sikamarkkerin Pig-2-Bac määrä pintavesissä (GC / 100 ml) Järvialue Jokialue Sikojen lkm: 0 24 000 86 000 4 400 29.10.2016 Tarja Pitkänen, PhD 19
Sorkkaeläinmarkkerin Rum-2-Bac määrä pintavesissä (GC / 100 ml) Järvialue Jokialue Nautakarjan lkm: 920 100 1 100 8 200 2 400 2 100 29.10.2016 Tarja Pitkänen, PhD 20
Ihmisperäisen markkerin HF183 määrä pintavesissä (GC / 100 ml) Järvialue Jokialue Alueen väestö: 200 000 60 000 27 000 2 000 12 000 4 000 Jätevesipäästöt 29.10.2016 Tarja Pitkänen, PhD 21
Lokkimarkkerin Gull4 määrä pintavesissä (GC / 100 ml) Järvialue Jokialue Campylobacter lari: 29.10.2016 Tarja Pitkänen, PhD 22
Yhteenveto / Saastelähteiden jäljitys Ihmisperäinen saastuminen suurin infektioriski Saastumisen hallinta edellyttää saastelähteiden tunnistamista ja määrän arviointia Saadut tulokset linjassa vesistön jätevesikuormaan ja valumaalueiden eläintiheyteen rrna-pohjaisilla menetelmillä voidaan tunnistaa aktiivisten suolistobakteerien osuus vesinäytteessä Saastelähteiden jäljitys toimii myös Suomen olosuhteissa Soveltuu kontaminaatiotilanteiden selvittämiseen Käytetty Suomessa jo mm. Uimarantaveden enterokokkien lähteen todentamisessa Talousvesikaivon saastumistapauksen selvittämisessä Talous- ja uimavesiepidemioiden saastelähteiden selvittämisessä
Työryhmä ja yhteistyökumppanit Tarja Pitkänen, Anna-Maria Hokajärvi, Pia Räsänen, Ari Kauppinen, Jaana Kusnetsov, Sallamaari Siponen, Päivi Meriläinen, Balamuralikrishna Jayaprakash, Ilkka Miettinen, Laura Wessels, Rudolf Grootens, Jenniina Salonen, Katri Rankinen, Janne Juntunen, Noora Perkola, Timo Huttula, Marjaana Hakkinen, Henry Kuronen, Osmo Puurunen, Taina Korpiharju, Hodon Ryu, Michael Elk, Jorge W. Santo Domingo 29.10.2016 24
Kiitos mielenkiinnosta! Terveydensuojelun osasto, Vesi ja terveys -yksikkö Erikoistutkija, dos., FT, Tarja Pitkänen tarja.pitkanen@thl.fi, @TarjaPitkanen 29.10.2016 25