Mittausaallonpituuden optimointi Johdanto Biokemiallisia mittauksia tehdään usein spektrofotometrillä. Laitteen avulla voidaan mitata pitoisuuksia, sekä määrittää tuotteen puhtautta. Spektrofotometrillä mitataan sähkömagneettista säteilyä, esimerkiksi näkyvää valoa. Optinen säteily jakautuu ultraviolettivaloon (UV), näkyvään valoon sekä infrapuna- eli lämpösäteilyyn. Perinteisesti spektrofotometrimittauksia tehdään erikokoisissa mittakyveteissä, joiden liuostilavuus on useimmiten muutama millilitra. Kalliiden reagenssien ja mikromittakaavan myötä nykyisin tehdään paljon analyysejä myös huomattavasti pienemmissä tilavuuksissa, esimerkiksi noin kämmenen kokoisilla 96- kuoppalevyillä. Yhden 96-kuopan maksimitilavuus on noin 300 µl (kuva 1). Kuva 1 Kuvassa on perinteinen spektrofotometrissä käytettävä mittakyvetti ja uudempaa mittausmaailmaa edustava 96-kuoppalevy. BCA-mittauksessa väri on punertava ja Bradford-määrityksessä siniruskea. Monissa kuoppalevyjä mittaavissa spektrofotometreissä ja monileimalaskimissa on kiinteät suotimet (engl. filter) eli kaikkien aallonpituuksien mittaaminen ei ole mahdollista. Yleisiä suodatinarvoja ovat mm. 260, 280, 405, 492 ja 590 nm. Tämän rajoitteen takia määrityksiä ei aina tehdä optimaalisesti, vaan lähimpänä optimialuetta olevalla yleisellä suodattimella. Mittauksen optimaalinen aallonpituus on kuitenkin helppo tarkistaa jos käytettävissä olevilla laitteilla voi tehdä aallonpituusskannauksen (laiteessa on monokromaattori). Vastaavasti samalla tavalla voit mitata kuinka paljon epäherkemmän tuloksen saat jos sinulla ei ole käytettävissä työohjeessa mainittua suodinta. Suotimien ostohinta on usein sadasta eurosta ylöspäin. Kuvissa 2 ja 3 on kuoppalevylukijan esimerkkitulokset Bradford- ja BCA-proteiinimääritysten mittausaallonpituuden optimointyöstä. Useimmilla spektrofotometreillä onnistuu mittaus aallonpituudella 590. Bradford-määrityksessä tämä mittausaallonpituus on optimaalinen, mutta BCA-menetelmässä optimiaallonpituus on noin 560. Jos tätä aallonpituutta ei ole laitteessa käytettävissä, niin kannattaa käyttää pienempää aallonpituutta, koska optimiaallonpituus pienenee melko jyrkästi aallonpituuden kasvaessa (kts. kuvan 3 siniset nuolet). 1
Kuva 2 Bradford-proteiinimääritysten mittausaallonpituuden optimointi. Kuva 3 BCA-proteiinimääritysten mittausaallonpituuden optimointi. 2
Laboratoriotyö: Optimaalisen mittausalueen määritys Esimerkki on tehty Bradford-proteiinimittauksesta (kts. Laboratoriotyö: proteiinimääritys ja lineaarisen mittausalueen määritys), joka on nopea perusmääritys biolaboratoriossa. Määrityksessä sekoitetaan proteiinia tai näytettä ja Bradfordreagenssia. Mittaus suoritetaan yleensä aallonpituudella 590 tai 595 nm. Huomioi työturvallisuus ja jätteiden käsittely jos teet työn vaihtoehtoisesti esim. BCAmenetelmällä (työskentely vetokaapissa) Taustan mittaus Reagoineen reagenssin mittaus Kuvaajan laadinta Tuloksen selvittäminen! Muista työturvallisuus, Bradford-reagenssi on happoliuos. 1. Skannaa (engl. wave scan = termi spectra) spektrofotometrillä halutulta aallonpituusalueelta esim. 300-700 nm 0-kontrolli eli tausta kyvetissä, jossa on näytteenä esim. 0,05 ml vettä ja Bradfordreagenssia 1,5 ml. Näin saadaan selville kuinka paljon pelkkä reagenssi, vesi ja mitta-astia eli tausta vaikuttavat tulokseen. Skaalaa seossuhteita tarvittaessa jos 1,55 ml ei riitä mittaukseen tai sitä on turhan paljon. Huomioi mittauksessa käytettävät aallonpituudet ja käytä näillä alueilla toimivia kyvettejä. Pyyhkäise kyvetin mittauspinnat ennen mittausta pehmopaperilla. Jos käytettävissä on pienoisspektrofotometri niin voit toki mitata samat tulokset myös sillä ja näin voit verrata eri laitteiden tuloksia keskenään. 2. Mittaa reagenssin kanssa reagoinut proteiini. Pipetoi uuteen puhtaaseen kyvettiin 0,05 ml proteiiniliuosta (esim. BSA 2 mg/ml) ja 1,5 ml Bradford-reagenssia. Proteiinipitoisuudella ei ole nyt lopputuloksen kannalta merkitystä, koska lopputuloksen tulisi aina toki olla sama (kuva 4). 3. Kuvaajan laadinta. Siirrä tulokset taulukkolaskentaohjelmaan ja vähennä reagoineen reagenssin mittaustuloksista tausta. Lisää kaikki tuloskäyrät (3 kpl) kuvaajaan niin, että x-akselilla on aallonpituudet ja y-akselilla absorbanssiarvot. 4. Tuloksen selvittäminen. Optimiaallonpituuden voit määrittää kuvaajista piirtämällä tai käyttämällä taulukkolaskentaohjelman maksimi-funktiota. Kuva 4 Kuvassa vasemmalla olevassa kyvetissä on pelkkä Bradford-reagenssi ja vesi. Oikealla puolella olevassa kyvetissä on Bradford-reagenssi ja proteiiniliuos. 3
Tulosten käsittely Tallenna mittaamasi raakadata esim. USB-tikulle taulukkolaskentaohjelmalle sopivassa muodossa (xls, CSV, txt). Eri tallennusformaatteja on laboratoriolaitteissa usein runsaasti ja yleensä joku taulukkolaskentaohjelmissa toimiva tiedostomuoto löytyy myös. Jos mittalaitteessa ei ole tallennusmahdollisuutta niin kirjaa arvot esim. 10 nm välein ja tee näistä arvoista kuvaaja. Konvertoi data taulukkolaskentaohjelmassa ensin laskentaohjelmaan sopivaksi jos se ei valmiiksi ole laskentakelpoista. Jaa mahdollisesti samassa soluissa olevat luvut kiinteällä tai vakiomerkillä eri soluihin. Data on usein comma-separoitua eli pilkku (,) on erottava tekijä. Muuta mahdolliset US desimaalierottimet (.) eurooppa-asetuksilla varustetussa tietokoneessa pilkuiksi replace-komennon avulla. Paste-special ja transpose-komennolla saat tarvittaessa datan pystytasoon jos laite tallentaa luvut vaakatasoon peräkkäin. 4
Alla olevassa kuvassa 5 on esimerkkitulokset kyvettilaitteella mitattuna. Kuvaajien käyrästöt voivat hieman vaihdella eri proteiinipitoisuuksilla, mutta itse lopputuloksen tulisi toki olla aina sama. Normaalisti käytännössä mittaat niin, että laite poistaa taustan automaattisesti ja saat lopputuloksen suoraan mittalaitteelle. Näin meneteltäessä mittauksen signaali/tausta -suhde jää tosin helposti havaitsematta. Alla olevien spektrofotometritulosten perusteella voidaan todeta, että Bradford-määrityksen optimaalinen mittausaallonpituus on noin 590 nm. Kuva 5 Absorbanssiskannaus aallonpituusvälillä 300 700 nm. Kyvetin valotie on 1 cm. Kysymyksiä/tehtäviä 1. Selvitä missä sijaitsevat käyttämäsi spektrofotometrin/monileimalaskimen suotimet. Miten suotimia voi tarvittaessa vaihtaa vai voiko ollenkaan? 2. Spektrofotometrin lamppu on rikki tai sen intensiteetti on liian matala. Useimmissa laitteissa mittalaite testaa lamppujen kunnon ennen mittausta. Selvitä manuaalista miten lampunvaihto onnistuu. 3. Yhä enemmän käytetään myös 384-kuoppalevyjä määrityksissä. Selvitä 384-levyn kuoppatilavuus. 4. Taulukkolaskentaohjelmassa kaikki mittaustulokset tulevat samaan soluun ja kuvaajan tekeminen näin mahdotonta. Miten saat arvot jaettua eri soluihin? 5. Selvitä kuvien 2 ja 3 avulla BCA- ja Bradford-määrityksen signaali/tausta -suhde. 5