LOPPURAPORTTI TYÖSUOJELURAHASTON HANKEESTA NRO

LOPPURAPORTTI TYÖSUOJELURAHASTON HANKEESTA NRO 107218 TUHKALISÄYKSEN VAIKUTUS TYÖNTEKIJÖILLE HAITALLISTEN RISKILUOKKIEN 2 JA 3 BAKTEERIEN MÄÄRÄÄN KOMPOSTOINNISSA (TURISK). Työryhmä: Helsingin yliopisto: Merja Kontro (os. Suutari), yliopistonlehtori HY, vastuuhenkilö Martin Romantschuk, professori HY ympäristöbiotekniikka Aija Rainisalo, väitöskirjatyöntekijä Jenni Ojala, pro gradu työ Kiertokapula Oy: Pentti Nevanperä Joakin Pyttynen YTV: Cristoph Gareis UPM-Kymmene: Markku R. Halonen JULKAISTU TYÖSUOJELURAHASTON AVUSTUKSELLA

1 Tausta Euroopan unionissa on saatettu vuoden 2005 alusta voimaan säännöt jätteiden käsittelystä, joiden mukaan jäsenmaiden täytyy tarkkaan rajoitaa ja kontrolloida jätteiden virtaa kaatopaikoille. Kotitaloudet joutuvat lajittelemaan jätteensä ja kaikki biologinen jäte kerätään hajoamaan yleisimmin kompostoimalla aerobisissa olosuhteissa. Sivutuoteasetuksessa määritetään muiden kuin ihmisravinnoksi tarkoitettujen eläimistä saatavien sivutuotteiden terveysperusteisia hygienisoitumisvaatimuksia (EU, 2002, 2006). Kompostointilaitoksilla on oltava suljettu kompostointireaktori, jota ei voida ohittaa ja jossa on laitteet lämpötilan seuraamiseksi tosiaikaisesti, tallentimet mittaustulosten tarvittaessa jatkuvaa kirjaamista varten, ja asianmukainen turvajäjestelmä joka estää liian alhaisen lämpötilan syntymisen. Muuntyyppisiä kompostointijärjestelmiä voidaan kuitenkin sallia, jos niillä taataan riittävät toimenpiteet tuholaisten torjumiseksi, niitä käytetään siten että kaikki järjestelmässä oleva aines savuttaa vaaditut aika- ja lämpötilaparametrit, parametreja seurataan tarvittaessa jatkuvasti, ja kompostointijärjestelmät täyttävät kaikki muut sivutuoteasetuksessa säädetyt vaatimukset. Kaksi yleisintä modernia kompostointiprosessia ovat rumpukompostointi ja tunnelikompostointi. Molemmissa tapauksissa biohajoava jäte sekoitetaan esimerkiksi puulastujen tai turpeen kanssa niin että saadaan sopiva kuiva-aineen määrä ja hiilen suhde typpeen. Seos laitetaan rumpuun joka pyörii säännöllisin aikajaksoin, tai ilmastettuun tunneliin jossa massa voidaan myös sekoittaa. Ensimmäisen aktiivisen vaiheen jälkeen puolikypsä kompostimassa usein siirretään vielä kypsymään aumaan. BIOTEHO 2 (prof. Martin Romantschuk ja työryhmä) hankkeessa havaittiin että tuhkalisäys vähensi hieman kompostin ph:ta alentavien maitohappobakteerieen määrää ja samalla lisäsi kompostoitumisen kannalta tärkeiden sädesienten määrää tuntuvasti. Tuhkalisäyksen jälkeen poistoilman hajupitoisuus oli noussut hieman rumpuvaiheessa ja laskenut huomattavasti tunnelivaiheessa, mikä viittaa siihen että hajua tuottavat vaiheet olivat aikaistuneet. Päästömittauksissa todettiin että prosessin alkuvaiheen tuottama kokonaishajumäärä oli selvästi vähentynyt, samalla kun kompostin orgaanisen aineksen hajoamisnopeutta kuvaava hiilidioksidin tuotto oli selvästi korkeampi tuhkalisäyksen saaneissa komposteissa kuin kontrollikompostiessa ilman tuhkalisäystä. Oikeanlainen puutuhka sopivasti annosteltuna tehosti merkittävästi biojätteen kompostoinnin alkuvaiheita ja vähensi samalla kompostointilaitosten hajupäästöjä. Suuren mittakaavan kompostointiyksiköistä tulee niiden hyvin toimiessakin huomattavia määriä erilaisia kaasuja, pölyä ja aerosoleja ilmaan, jotka johtavat helposti työntekijöiden terveysongelmiin ja myös erilaisiin haittoihin läheisillä asuinalueilla. Kompostointilaitoksilla on usein huomioitu huonosti työntekijöiden turvallisuus ilmapoistoin ja erilaisin teknisin ratkaisuin, ja työntekijät voivat varustautua ongelmatapauksissa esim. kaasunaamareilla. Työsujelurahaston projektissa 93020: Haihtuville orgaanisille yhdisteille altistumien jätteidenkäsittelyssä on arvioitu

että altistuminen homesieni-itiö ja bakteeripitoisuuksille jätteenkäsittelyssä oli laskennallisen arvion mukaan keskimäärin kaksi kertaluokkaa suurempaa kuin altistumien kotioloissa ja kaksi kertaluokkaa pienempää kuin suurin altistuminen maataloudessa. Biologisten organismien (bakteerit, homeet ja hiivat, virukset, alkueläimet) luokittelussa työntekijöiden turvallisuuden mukaan käytetään asteikkoa 1-4. Riskiluokkaan 1 kuuluvia biologisia eliöitä ei ole liitetty terveiden aikuisten ihmisten sairauksiin. Riskiryhmään 2 kuuluvat biologiset organismit voivat aiheuttaa sairauksia ihmisissä ja eläimissä, mutta normaaleissa olosuhteissa ja kohtuullisina pitoisuuksina eivät todennäköisesti aiheuta vakavia terveysongelmia niiden kanssa tekemisissä oleville ihmisille. Näiden opportunistisesti patogeenisten mikrobien haitallisuuteen vaikuttavat erityisesti altistuksen kesto ja mikrobipitoisuudet. Tähän ryhmään kuuluvat mm. Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Actinomyces spp. ja Campylobacter spp. Riskiryhmään 3 kuuluvat organismit aiheuttavat yleensä vakavia sairauksia ihmisille, mutta eivät leviä hetkellisessä kontaktissa ihmisten välillä ja sairauksia voidaan hoitaa antimikrobiaalisilla tai parasiittisillä lääkeaineilla. Riskiryhmän 3 bakteereita ovat mm. Salmonella typhi, useat mykobakteerit ja Yersinia pestis. Riskiryhmään 4 kuuluvat organismit aiheuttavat yleensä vakavia sairauksia joita ei aina voida hoitaa, ja jotka voivat levitä helposti ihmiseltä toiselle tai eläimeltä ihmiselle. Kompostissa ei ilmeisimmin esiinny riskiryhmään 4 kuuluvia biologisia organismia, mutta on riskiryhmiin 2 ja 3 kuuluvia mikroorganismeja Työsuojelurahaston hankkeen 103137 mukaan niin yleisesti että työntekijöiden tulee käsitellä kompostia kuten pilaantunutta materiaalia. Komposteille tuotava biohajoava jäte voi olla hyvin erilaista ja muuttuu enemmin yhdenmukaiseksi kompostointiprosessin edetessä. Euroopan yhteisön sivutuoteasetuksen mukaan terveydellisten riskien välttämiseksi kompostoinnin lopussa eläinperäisessä kompostissa ei saa olla salmonellaa / 25 g, ja lämpökäsitellyssä kaatopaikalle tai kompostointilaitokselle menevässä tuotteessa ei saa olla C. perfringensiä / g. Eschericichia colia tai Enterococcaceae ei saa olla yli 1000 pmy/g viidessä näytteessä, joista yhdessä saa olla 1000-5000 pmy/g (EC, 2002, 2006). Työsuojelurahaston hankkeessa 103137 Salmonellaa löytyi viljelemällä kolmelta kompostointilaitokselta neljästä siten että 26 % näytteistä sisälsi Salmonellaa. Prosessin lopussa aumasta löytyi Salmonellaa yhdeltä laitokselta. Reaali-aika PCR:n mukaan salmonelloja oli 52 % näytteistä kaikilla laitoksilla. C. perfringensiä löydettiin viljelemällä 30 % näytteistä, kahdelta laitokselta yhdestä näytteestä, ja yhdeltä lietelaitokselta 71 % näytteistä. Lämpökestoisia kolimuotoisia bakteereita tai Enterococcus kantoja esiintyi kaikilla kompostointilaitoksilla yli sivutuoteasetuksen lopputuotteen raja-arvojen ja yhdellä laitoksella nämä mikrobit eivät hygienisoituneet prosessin loppuun menessä. Työsuojelurahaston hankkeen 103137 tulosten tilastollisen korrelaatioanalyysin ja pääkomponenttianalyysin mukaan Salmonella spp. esiityivät usein samanaikaisesti sulfaattia pelkistävien klostridien ja B. cereuksen (viljely) kanssa. Kompostointilaitos C:llä Salmonella spp.

määrä korreloi myös log Yersinia spp.:n kanssa. Lisäksi alhainen ph ja lämpötila suosivat Salmonella spp. esiintymistä. Log Yersinia spp. ja B. cereus ryhmän bakteerien esiintyminen korreloi myös laktobasillien (viljely, fosfolipidien rasvahapot PLFA), sienien (viljely) ja gramnegatiivisten bakteerien (PLFA) kanssa, eli Yersinia spp. ja B. cereus esiintyivät kompostointilaitos C:n kompostimateriaalissa prosessin alkussa mesofiilisten bakteerien vaiheessa, jolloin maitohappobakteerien, gram-negatiivisten bakteerien ja myös sienien määrät olivat korkeita ja mikrobiologinen biomateriaalin hajotus aktiivisessa vaiheessa korkeine entsyymiaktiivisuuksineen. Tässä vaiheessa esiintyi myös runsaasti enterobakteereita. Yersinia spp. esiintyessä hehkutushävio oli korkea, päinvastoin kuin Campylobacter spp. jotka esiintyivät kompostointilaitos C:llä mesofiilisen vaiheen muuttuessa termofiiliseksi kun ph oli jo 7 tai korkeampi, ja hehkutushäviö ja hiilen määrä olivat alhaisia. Log Streptomyces spp. korreloivat kompostointilaitos C:llä kompostin toimiessa huonosti log B. cereus ryhmän (PCR) bakteerien kanssa. Koska Salmonella spp., B. cereus ryhmän bakteereiden, Yersinia spp:n, ja enterobakteerien esiintyminen kompostissa selvästi liittyi prosessin alkuun happokuoppavaiheeseen, tässä tutkimuksessa haluttiin määrittää voidaanko näiden haitallisten mikrobien hygienisoitumista kompostiprosessissa parantaa tuhkalisäyksellä, minkä on todettu vähentävän huomattavasti happokuopan esiintymistä ja kompostintilaitosten hajupäästöjä. Tutkimuksessa kerättiin näytteet Kiertokapula Oy:n, YTV:n ja UPM-Kymmenen kompostointikokeista, joissa lisättiin tuhkaa kompostoitavaan materiaaliin. Saatuja tuloksia verrattiin haitallisten mikrobien määriin kompostointiprosesseissa ilman tuhkalisäystä. Tuhkalisäys on jo käytössä Kiertokapulassa, ja sen käyttön mahdollisuutta tutkitaan samalla YTV:n Ämmänsuon kompostointilaitoksella. 2 Tavoitteet Hankkeen tavoitteena oli määrittää parantaako tuhkan lisääminen kompostin hygieniaa. Mikrobiryhmien hygienisoituminen tutkittiin seuraavassa järjestyksessä: I. Sivutuoteasetuksen mikrobit: Salmonellat, lämpökestoiset kolimuotoiset bakteerit (kuvaa parhaiten sivutuoteasetuksen E. colia), Enterococcus spp., C. perfringens (viljelemällä kaikki) II. Bacillus cereus ryhmä, Yersinia spp., Salmonella spp. (reaali-aika PCR) III. Campylobacter spp., Streptomyces spp. (reaali-aika PCR) Saatuja tuloksia verrataan kompostointikokeiden yhteydessä tehtyihin muihin mitattuihin parametreihin.

3 Tehtävät ja menetelmät Kompostinäytteet haitallisten mikrobien määrittämiseksi prosessin eri vaihteista kerättiin Kompostointilaitos A:sta ja B:stä, joissa tutkittiin tuhkan käyttöä kompostin lisäaineena prosessin toiminnan tehostamiseksi ja hajupäästöjen vähentämiseksi. Tuhkakokeiden yhteydessä kompostimassasta mitattiin ph, lämpötila, tilavuuspaino, kuiva-aine, orgaaninen aines, tuhka, kokonaistyppi, ja -hiili, nitraatti- ja ammoniumtyppi, Rottegrad, raskasmetallipitoisuudet ja epäorgaaniset ionit jo käytössä olevilla menetelmillä. Kompostointilaitos A:ssa kompostoitiin biojätettä ensin rummussa 3-5 päivää (1. näyte), sitten tunnelissa 5-10 vrk (2. näyte), jonka jälkeen kompostimassa siittettiin ulos aumoihin jälkikypsymään noin vuodeksi. Tuhkan lisäksi kompostimassaan on sekoitettu puuhaketta, ja näytteet otettiin 40 cm syvyydeltä. Kompostointilaitos B:ssä kompostimassaan lisättiin tuhkan lisäksi kalkkia ja tukiaineeksi haketta. Näytteitä otettiin kahdesta tuhkallisesta ja kahdesta tuhkattomasta kompostista. Mikrobien määritysmenetelmät. Mikrobikasvatukset tehtiin Ramoboll Analytics Oy:ssä ostopalveluna. Salmonellan määritys perustui standardeihin NMKL 71 ja ISO 6579 (NMKL, Pohjoismainen Elintarvikkeiden Metodiikkakomitea); kolimuotoisten bakteerien (37 ºC) standardiin NMKL nro 44, 2001; lämpökestoiseen kolimuotoisten bakteerien standardiin NMKL nro 125, 1996; Enterobacteriaceae standardiin NMKL nro 144, 2000; Enterokokkien standardiin NMKL nro 68, 1992; Bacillus cereus standardiin NMKL nro 67, 1997; Clostridium perfringens standardiin NMKL nro 95, 1999; ha sulfiittia pelkistävien klostridien standardiin NMKL nro 56, 1994. DNA-perusteiset määritysmenetelmät. Bacillus spp. kantojen detektointiin käytettiin Schraft ja Griffiths (1995) alukkeita 5 -GAG TTA GAG AAC GGT ATT TAT GCT GC-3 ja 5 -CTA CTG CCG CTC CAT GAA TCC-3, jotka detektoivat cereolysin AB geeniä. Alukkeet tunnistavat Bacillus cereus ryhmän mikrobit Bacillus cereus, Bacillus mycoides ja Bacillus thuringiensis. Monistustuotteen koko on 409 bp. Alukkeita on käytetty mm. julkaisuissa Radhika et al., (2002), ja Zanardini et al., (1997). Sisäinen amplifikaatio kontrolli (IAC) standardi tehtiin seuraavilla alukkeilla käyttäen Lamda DNA:ta templaattina: 5 - GAG TTA GAG AAC GGT ATT TAT GCT GCA GTA TCA GCC GTA TCC CAT TCA GG-3 ja 5 -CTA CTG CCG CTC CAT GAA TCC ACC GCT CAG GCA TTT GCT-3 (lamda DNA:n paikka 13592-14061), ja monistustuotteen koko oli 517 bp. Campylobacter spp. kantojen detektointiin käytettiin Linton et al (1996) alukkeita 5 -GGA TGA CAC TTT TCG GAG C-3 ja 5 -CAT TGT AGC ACG TGT GTC-3, jotka detektoivat 16S rrna geeniä. Monistustuotteen koko on 816 bp. Alukkeita on käytetty mm. julkaisuissa Dep et al (2001), Inglis and Kalischuk (2003), Logan et al. (2001), Keramas et al. (2004), Maher et al. (2003), and Lund et al., (2003). Sisäinen amplifikaatio kontrolli (IAC) standardi tehtiin seuraavilla

alukkeilla käyttäen Lamda DNA:ta templaattina: 5 -GGA TGA CAC TTT TCG GAG CAC CCG GTA TGG ATG TGG CTT CG-3 ja 5 -CAT TGT AGC ACG TGT GTC ACC GCT CAG GCA TTT GCT-3 (lamda DNA:n paikka 13125-14061), ja monistustuotteen koko oli 974 bp. Salmonella spp. kantojen detektointiin käytettiin Rahn et al (1992) alukkeita (5 -GTG AAA TTA TCG CCA CG-3 ja 5 -TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C-3 ), jotka detektoivat InvA geeniä, jota tarvitaan eukarioottisoluja infektoitaessa. Monistustuotteen koko on 285 bp. Alukkeita on käytetty mm. julkaisuissa Carli et al (2001) ja Malorny et al. (2003). Sisäinen amplifikaatio kontrolli standardi tehtiin seuraavilla alukkeilla käyttäen Lamda DNA:ta templaattina: 5 -GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AAA AGA TAT GCA GAG TCT GGT C-3 ja 5 -TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC CAC CGC TCA GGC ATT TGC T-3 (lamda DNA:n paikka 13706-14061), ja monistustuotteen koko oli 395 bp. Yersinia spp. kantojen detektointiin käytettiin Trebesius et al. (1998) alukkeita (5 -GCG GCA GCG GGA AGT AGT TTA-3 ja 5 -TAC AGC GTG GAC TAC CAG GGT-3 ), jotka detektoivat 16S rrna geeniä. Alukkeet tunnistavat suvun Yersinia lukuunottamatta kantoja Y. frederiksenii, Y. mollaretii, ja muutamia Y. kristensenii kantoja. Monistustuotteen koko on 749 bp. Alukkeita on käytetty mm. julkaisuissa Lu et al. (2003) and McGarvey et al. (2004). Sisäinen amplifikaatio kontrolli standardi tehtiin seuraavilla alukkeilla käyttäen Lamda DNA:ta templaattina: 5 -GCG GCA GCG GGA AGT AGT TTA ACC CGG TAT GGA TGT GGC TTC-3 ja 5 -TAC AGC GTG GAC TAC CAG GGT ACC GCT CAG GCA TTT GCT-3 (lamda DNA:n paikka 13126-14061), ja monistustuotteen koko oli 978 bp. Steptomyces spp. kantojen detektointiin käytettiin Rintala et al:n (2001) alukkeita, jotka detektoivat 16S RNA:n geeniä (5 -ACA AGC CCT GGA AAC GGG GT-3 ja 5 -CAC CAG GAAT TCC GAT CT-3 ). Monistustuotteen koko on 519 bp. Alukkeita on käytetty ainakin julkaisussa Rintala et al., (2002) ja alukkeet on suunniteltu Työsuojelurahaston hankkeisiin 96028 ja 98103 liittyen. Sisäinen amplifikaatio kontrolli standardi tehtiin seuraavilla alukkeilla käyttäen Lamda DNA:ta templaattina: 5 -ACA AGC CCT GGA AAC GGG GTG CCA GCG TGG TGC TCT GGG A-3 ja 5 -CAC CAG GAA TTC CGA TCT ACC GCT CAG GCA TTT GCT-3 (lamda DNA:n paikka 13483-14061), ja monistustuotteen koko oli 617 bp. Sisäisiä amplifikaatiokontrolleja lisättiin kaikkiin PCR-reaktioihin detektioherkkyydestä riippuen 30-75 kopiota ja tulos kirjattiin negatiiviseksi vain jos IAC oli ekspressoitunut, mutta ei ollut muuta tuotetta (mikä osoitti että negatiivinen tulos ei johtunut inhiboivista PCR-olosuhteista). Positiivisissa kontrolleissa käytetty DNA tilattiin DSMZ:ltä (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH). DNA:t oli eristetty seuraavista kannoista: Bacillus cereus DSM 31; Campylobacter jejuni subsp. jejuni DSM 4688; Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica DSM 4780; ja Streptomyces griseus subsp. griseus DSM 40236. Salmonella DS88 DNA lisättiin kontrollinäytteisiin soluina. PCR-määrityksissä tehtiin jokaisesta näytteestä ainakin

kaksi DNA:n eristystä ja neljä erillistä PCR-ajoa. PCR-reaktioissa käytetyt reagenssit on esitetty Taulukossa 1 ja PCR-ajojen olosuhteet Taulukossa 2. Muut määritykset. Seulottua kompostimassaa mitattiin 50 ml ja lisättiin 200 ml tislattua vettä (1:4, vol/vol). Näyte sekoitettiin, annettiin liettyä 1h ja ph mitattiin (Mettler Delta 340, Halstead, England). Kompostimassan lämpötila mitattiin kompostointilaitoksella. Tilavuuspaino mitattiin ennen näytteiden seulomista punnitsemalla näyteämpärin massa ja laskemalla tilavuuspaino (g/l). Kuivapaino määritettiin punnitsemalla noin 20 g kompostia ja kuumentamalla 105 C lämpötilassa 24 h. Orgaanisen aineen ja tuhkan mittausta varten kuivapainomäärityksen upokasta hehkutettiin muhveliuunissa 30 min, 550 C. Kokonaistyppi ja hiili määritettiin LECOn malli 2000 CNS analysaattorilla (St. Joseph, MI, USA). Ammonium- ja nitraattityppi määritettiin standardien SFS 5505, SFS-EN ISO 10304-1 ja SFS-EN ISO 10304-2 mukaan Ramboll Analytics Oy:ssä käyttäen akkreditoituja menetelmiä (SFS-EN ISO/EC 17025). Epäorgaaniset alkuaineet määritettiin standardin ISO 11885 mukaan Ramboll Analytics Oy:ssä. Rottegrad-stabiilisuustestillä seurattiin kompostimassan lämmönkehitystä 11 päivän ajan. Näytettä punnittiin lämpöeristeisiin astioihin kolmena rinnakkaisena, ja lämpötilan kehitystä seeurattiin päivittäin. Kompostinäytteet jaettiin kyspsyysluokkiin maksimilämpötilan mukaan (luokka I, yli 60 C; II, 50-60 C; III 40-50 C; IV 30-40 C; V, 20-30 C; mitä suurempi luokka sitä kypsempi komposti). Taulukko 1. PCR-reaktioissa käytetyt reagenssit Reagenssi Salmonellat Yersinia spp. Bacillus Campylobac- Streptocereus group terium spp myces spp Templaatti 5 5 5 5 5 DNA, 1:10 (µl) IPC 30 kpl (µl) 5 40 kpl (µl) 5 60 kpl (µl) 5 75 kpl (µl) 5 5 Alukkeet 0,1 µmol (µl) 5 0,23 µmol (µl) 5 0,4 µmol (µl) 5 5 5 Sybr Green HS 15 15 15 15 15 Master mix (µl).

Taulukko 2. PCR olosuhteet, lämpötila T ja kestoaika t. Vaihe Salmonellat Yersinia spp. Bacillus Campylo- Strepto- T/t cereus ryhmä bacterium spp myces spp Alkudenatu- 95 / 15 95 / 15 95 / 15 95 / 15 95 / 15 raatio (ºC/min) Denaturaatio 94 / 10 94 / 60 94 / 10 94 / 60 95 / 60 (ºC/s) Alukkeiden 65 / 20 62 / 60 65,8 / 120 63 / 60 60 / 40 kiinnittyminen (ºC/s) PCR monistus 72 / 30 72 / 120 72 / 30 72 / 120 72 / 120 (ºC/s) Fluoresenssin 80 / 1 80 / 1 75,5 / 1 82 / 1 85,5 / 1 mittaus (ºC/s) Syklien lkm 36 40 37 40 50 Loppumonistus 72 / 7 72 / 7 72 / 7 72 / 7 72 / 7 (ºC/min) Sulamiskäyrä 65 95 ºC, mittaus 0,2 ºC välein jolloin lämpötila vakiona 1 s Säilytys (ºC) 4 4 4 4 4 4 Tulokset Kompostointilaitos A:n tuhkalisätystä kompostista kerättiin näytteitä 548 päivään saakka ja kontrollikompostista ilman tuhkaa otettiin näyte 578 päivän jälkeen. Rottergrad-määrityksen mukaan laitoksen A komposti oli kypsää 61 päivän jälkeen (Rottegrad 5). Kompostointilaitos B:ssä seuranta-aika oli pisimmillään 146 päivää, eli selvästi lyhyempi kuin laitos A:ssa. Kompostointilaitos B:stä tuli näytteitä kahdesta eri tuhkakompostista ja kahdesta kompostista ilman tuhkaa, eli laitoksella B voidaan arvioida kompostoinnin toistettavuutta. Rottegrad määrityksessä mitattiin Kompostointilaitos B:n kompostista korkeimmillaan arvo 4, eli laitoksella kompsoti ei ehtinyt tulla täysin kypsäksi tutkimusaikana. Saatuja tuloksia verrataan aikaisempiin kompostointilaitoksilta saatuihin tuloksiin (Komprisk I, Työsuojelurahaston hanke nro 103137). Hankkeet tulokset on koottu kuvaajina liitteisiin 1 ja 2, sekä taulukkomuodossa liitteisiin 3 ja 4.

4.1 Kompostointilaitos A Kompostointilaitos A:n tuhkalisätyissä näytteissä ei esiintynyt lämpökestoisia kolimuotoisia bakteereita, eikä niitä löydetty 578 päivän jälkeen näytteistä ilman tuhkalisäystä (Liite 3). Kuitenkin Komprisk I prosessissa esiintyi lämpökestoisia kolimuotoisia bakteereita 0.3-3.8 x 10 6 pmy/g ka syötteessä ja rummun etuosassa, jonka jälkeen ne hygienisoituivat komantena päivänä alle detektiorajan (<10 pmy/g ka). Kompostointilaitos A:n tuhkalisätyissä kompostinäytteissä esiintyi kaikissa Enterococcus spp., mutta kaikkien näytteiden keskiarvomäärät olivat alle sivutuoteasetuksen raja-arvon 1000 pmy/g ka (Liite 1A, Liite 3). Kahden kuukauden jälkeen mitattiin kuitenkin yhdestä kolmesta rinnakkaisnäytteestä 1500 pmy/g ja 18 kk jälkeen yhdestä kolmesta rinnakkaisesta 1800 pmy/g ka. Vertailun vuoksi Komprisk I näytteissä ilman tuhkalisäystä Enterococcus spp. vähenivät syötteen ja rummun etuosan 0.4-8.9 x 10 6 pmy/g ka määrästä alle detektiorajan kolmannen päivän jälkeen, ja nyt määritetyssä kompostissa ilman tuhkalisäystä oli 578 päivän jälkeen Enterococcus spp. kerran 100 pmy/g ka ja kaksi kertaa alle detektiorajan (<100 pmy/g ka). Salmonella spp. ei löytynyt viljelemällä kompostointilaitos A:n tuhkalisätyistä näytteistä, eikä tuhkattomasta kompostista 578 päivän kompostoinnin jälkeen, mikä on sivutuoteasetuksen vaatimus (Liite 3). Reaali-aika PCR:llä kuitenkin detektoitiin Salmonella spp. 14, 61 ja 167 päivän näytteissä 1.5-5.0 x 10 3 kopiota/g ka tuhkalisätyssä kompostissa. Vertailuna Komprisk I komposteissa ilman tuhkalisäystä detektoitiin Salmonella spp. reaaliaika PCR:llä syötteestä (1.5 x 10 5 kopiota/g ka) ja rummun loppuosasta (8.7 x 10 4 kopiota/g ka) hyvin toimivassa prosessissa puuhakkeen ja sahajauhon ollessa tukiaineena, sekä huonosti toimivasta Kompostilaitos A:n neljästä näytteestä viidestä (1.3-3.9 x 10 4 kopiota/g ka), kun kompostin tukiaineena oli puuhake turpeen kanssa. Yersinia spp. tavattiin vain yhdestä tuhkalisätyn Kompostointilaitos A näytteestä 6.2 x 10 6 kopiota/g ka, mutta ei kompostista ilman tuhkaa 578 päivän jälkeen (Liite 3). Vertailun vuoksi Komprisk I:ssä tavattiin Yersinia spp. läpi koko prosessin sekä hyvin (0.55-16.9 x 10 5 kopiota/g ka, määrät pienenivät prosessin loppua kohti) että huonosti (0.53-7.1 x 10 5 kopiota/g ka) toimivissa komposteissa. Campylobacter spp. ei tavattu Kompostointilaitos A tuhkallisesta tai tuhkattomasta prosessista. Campylobacter spp. ei myöskään esiintynyt Komprisk I hyvin toimivassa prosessissa, mutta huonosti toimivassa turvetta kantaja-aineena sisältävässä prosessissa niitä oli 1.4-4.5 x 10 4 kopiota/g ka. Streptomyces spp. esiintyi melko tasaisesti läpi koko tuhkalisätyn kompostointiprosessin (1.2-6.1x10 7 kopiota/g ka, 14 päivän jälkeen 1.2x10 9 pmy/g ka) (Liite 3). Näitä sädesieniä esiintyi myös kontrollissa ilman tuhkalisäystä (1,3x10 8 kopiota/g ka), sekä komprisk I hyvin 12-846x10 6 kopiota/g ka) ja huonosti (0.12-56.4x10 8 kopiota/g ka) toimivissa komposteissa ilman tuhkaa.

Yleisinä trendeinä kompostointilaitos A:n tuhkakomposti prosessin aikana tilavuuspaino, hehkutuksen jäännös (Liite1C, Liite 3) ja nitraatti (Liite 1E, Liite 3) kasvoivat. Samanaikaisesti kuivapaino, orgaanisen aineen määrä (Liite1C, Liite 3), hiili, typpi, hiili/typpi-suhde (Liite 1D, Liite 3), ammonium, ja ammonium/nitraatti-suhde (Liite 1E, Liite 3) laskivat. Tuhkan haitallisten yhdisteiden osuus ei kuitenkaan noussut prosessin aikana yli sallitun rajan lukuun ottamatta kadmiumin määrää 548 päivän jälkeen (Maa- ja metsätalousministeriön raja-arvot, Liitteet 3 ja 4). Koska näytteet otettiin samasta kompostista, voi tämä yksittäinen kadmium-ylitys olla näyteestä riippuva paikallinen ominaisuus. Tuhkakompostikokeen 548 päivän aikana lämpötila vaihteli välillä 14-65 C ja ph välillä 6,6-8,9 (Liite 1F, Liite 3). 4.2 Kompostointilaitos B Kompostointilaitos B:ssa esiintyi lämpökestoisia kolimuotoisia bakteereita yli sivutuoteasetuksen rajan 1000 pmy/g tuhkalisätyissä komposteissa 7, 28, ja 146 päivän kohdalla, ja ilman tuhkaa 71 ja 140 päivän näytteissä (Liite 2A, Liite 4). Toisessa tuhkalisätyssä kompostissa ja molemmissa komposteissa ilman tuhkaa ensimmäiset määritykset lämpökestoisille kolimuotoisille bakteereille olivat 10 pmy/g, joten tämän ryhmän bakteerien määrät kasvoivat kompostin vanhetessa. Kuitenkin vain yhdessä näytteessä lämpökestoisten kolimuotoisten bakteerien määrä ylitti 5000 pmy/g. Myös Enterococcus kantojen määrät olivat usein yli sivutuoteasetuksen määrittämän rajan 1000 pmy/g ja kasvoivat prosessin loppua kohti sekä tuhkakomposteissa että ilman tuhkaa (Liite 2B, Liite 4). Vain tuhkalisätyssä kompostissa 26 päivän jälkeen ja tuhkattomassa kompostissa 20 päivän jälkeen Enterococcus spp. määrä oli 100 pmy/g, ja tuhkakompostissa 77 päivän jälkeen määrä alitti 5000 pmy/g raja-arvon. Salmonella spp. löydettiin viljelemällä toisen tuhkalisäyskompostin näytteestä 77 päivän jälkeen, ja reaali-aika PCR:lla saman tuhkakompostin kaikista näytteistä. Lisäksi Salmonella spp. tavattiin reaaliaika PCR:llä kompostista ilman tuhkaa viimeisestä näytteestä 140 päivän jälkeen (Liite 2C, Liite 4). Yersinia spp. esiintyi toisessa tuhkakompostissa 146 päivän jälkeen ja toisessa kompostissa ilman tuhkaa 71 ja 140 päivän jälkeen (Liite 2D, Liite 4). Campylobacter spp. ei esiintynyt kompostointilaitos B:ssa. Bacillus cereus (Liite 2F) ja Clostridium perfringens (Liite 2G) bakteereita esiintyi viljelyn mukaan tuhkalisätyissä komposteissa 77 päivään saakka samoissa näytteissä, eli sekä tuhkallisissa että tuhkattomissa komposteissa nämä bakteerit olivat hygienisoituneet 140 päivän jälkeen. Streptomyces spp. määrä oli 0,56-63,8 x 10 7 kopiota/g ka tuhkalisätyissä komposteissa, ja samalla tasolla tai hieman korkeampi 0.11-26,8 x 10 8 kopiota/g ka komposteissa ilman tuhkaa (Liite 2E, Liite 4).

Kuivapaino laski myös kompostointilaitos B:ssa prosessin aikana (Liite 3H), vaikka aivan alussa kuivapaino saattoi nousta molemmissa kompostointilaitoksissa. Kompostintilaitos B:ssa orgaanisen aineen määrä oli viimeisissä näytteissä aina alhaisempi kuin ainakin toisessa aikaisemmassa, vaikka vaihelua esiintyikin jonkin verran (Liite 3I). Tuhkakäsitellyissä komposteissa tilavuuspaino pysyi samana tai kasvoi, kun taas komposteissa ilman tuhkalisäystä viimeinen määritetty tilavuuspaino oli aina pienempi kuin aikaisemmassa näytteessä (Liite 3J). Hiilen ja typen määrä oli korkeampi tuhkattomissa komposteissa kuin tuhkallisissa (Liite 3K ja 3L). Hiilen määrä laski tuhkattomissa komposteissa Kompostointilaitos B:ssa, mutta pysyi melko samana tuhkallisissa komposteissa (Liite 3K). Typen määrä nousi hieman prosessin aikana (Liite 3L), ja hiili/typpi suhde laski kompostointilaitos B:ssa (Liite 3M). Nitraatin määrä nousi tuhkakompostissa, mutta laski tai pysyi lähes samana tuhkattomissa komposteissa (Liite 3N). Liukoisen ammoniumin määrä laski tuhkattomissa komposteissa mutta nousi tuhkakompostissa (Liite 3O) ja seurauksena ammonium/typpi suhde laski (Liite 3P). Kompostin ph vaihteli välissä 6.4-8.7 ja oli korkeampi tuhkallisissa komposteissa kuin tuhkattomissa (Liite 3Q). Raskasmetallien määrä ei noussut kompostoinnin aikana yli sallitun raja-arvon (Maa- ja metsätalousministeriön rajaarvot, Liitteet 3 ja 4). 5 Tiedotus ja muu hyödyntäminen Tuloksista on tiedotettu kompostointilaitoksille ja tuhkan toimittaneelle yrityksille. Jenni Ojalan pro gradu työ on valmistunut aiheesta. Tieteellisesti kiinnostava osuus tuloksista julkaistaan vielä kansainvälisellä tasolla julkaisuna. 6 Hankeen toteuttamiseen osallistuneet henkilöt ja heidän toteutuneet työpanoksensa Henkilö Toteutunut työpanos Kontro Merja 4.0 viikkoa Romantschuk Martin viikkoa Nevanperä Pentti 0.5 viikkoa Gareis Christoph 0.5 Ojala Jenni 3.0 kk ja gradun kirjoitusaika Rainisalo Aija 4.0 viikkoa Tuhkan toimitus 0.5 viikkoa

7 Pohdinta ja johtopäätökset Kompostointilaitos A täytti sivutuoteasetuksen mukaiset vaatimukset lämpökestoisten kolimuotoisten bakteerien (sisältää alaryhmänä Escherichia colin), Enterococcus spp., ja Salmonella spp. (viljely) osalta. Kuitenkin tuhkalisätystä prosessista detektoitiin reaaliaika PCR:llä Salmonella spp. 14, 61 ja 167 päivän näytteissä, joista 167 päivänä löydettiin myös Yersinia spp. Reaaliaika PCR detektoi myös solut jotka eivät lähde kasvamaan viljelyssä, mikä selittää suuremman detektiofrekvenssin Salmonella spp. kannoille. Streptomyces spp. esiintyi läpi koko prosessin yleisimmin määrinä 1.2-6.1 x 10 7 pmy/g. Maasta on löydetty tyypillisesti 0.3-x10 6 pmy/g ka Streptomyces spp. (Conn and Leci, 1998), ja on hyvä huomata että reaaliaika PCR:n detektoi myös solut joita ei voi viljellä ja joiden osuus helposti nostaa mikrobien määrää yhden 10 kertaluokan viljelyyn verrattuna. Kompostointilaitos B:ssä lämpökestoisten kolimuotoisten bakteerien, Enterococcus spp. Salmonella spp., ja C. perfringens ylittivät sivutuoteasetuksessa sallitut määrät kompostoinnissa. Näiden mikrobiryhmien kohonneet määrät näyttäisivät liittyvän huonompaan kompostointitehokkuuteen, sillä laitos B:n prosesseissa Rottergrad ei saavuttanut arvoa 5. Vielä lopputuotteestakin 140-146 päivän jälkeen löytyi Enterococcus spp. ja lämpökestoisia kolimuotoisia bakteereita viljelemällä, sekä Salmonella spp. ja Yersinia spp. reaaliaika-pcr:llä. Laitos B:ssä näytti esiintyvän haitallisten mikrobien lisääntymistä kompostoimisprosessin aikana. Kompostin seuranta-aika oli laitos B:ssä (140-146 päivää) lyhyempi kuin laitos A:ssa (548-578 päivää), mikä voi osittain selittää huonompaa haitallisten mikrobien häviämistä. Kompostointilaitos A:ssa havaittiin myös reaaliaika PCR:llä Salmonella spp. ja Yersinia spp. 167 päivän jälkeen. Hyvin toimivassa kompostointilaitos A:ssa tuhkan vaikutus haitallisten mikrobien määrään oli vähäinen Streptomyces spp. lukuunottamatta. Laitoksessa A esiintyi yleisesti ottaen melko vähän haitallisisa mikrobeja prosessin aikana ja lopputuotetta voidaan pitää hygienisoituneena sivutuoteasetuksen raja-arvojen puitteissa. Kuitenkin hyvin toimivasta prosessistakin voitiin joistakin näytteistä määrittää haitallisia mikrobeja. Huonommin toimivassa kompostointilaitos B:n prosessissa tuhka näytti alentavan Streptomyces spp. määrää noin yhdellä kertaluokalla 1.0x10 9 kopiota/g keskiarvomäärästä 1.9x10 8 kopiota/g määrään. Samansuuntainen kymmenen kertaluokan ero Streptomyces spp. määrissä on myös nähtävissä kompostointilaitos A:n 548 (tuhka, 2.9x10 7 kopiota/g) ja 578 (ei tuhkaa, 1.3x10 8 kopiota/g) päivän näytteiden välillä, ja Komprisk I tuloksissa Streptomyces spp. määrän keskiarvo oli 2.3x10 8 kopiota/g tuhkattomissa komposteissa. Ero Streptomyces spp. määrissä ei ilmeisesti kuitenkaan ollut syy prosessin huonompaan toimivuuteen laitoksessa B verrattuna laitos A:han, koska Rottegrad arvot olivat lähes samat prosesseissa ilman tuhkaa ja sen kanssa laitoksessa B ja ero havaittiin myös hyvin toimivassa laitos A:ssa. Streptomyces spp. ovat kompostin normaalia mikrobistoa ja niitä ei ilmeisimmin saada kompostista

pois. Tuhkalisäyksellä niiden määrä voidaan ehkä kuitenkin saada lähemmäksi luonnossa normaalisti esiintyviä määriä. Tuhka muutti kompostoitia. Kompostointiprosessissa helposti esiintyvää happokuoppaa ei näy tämän tutkimuksen tuloksissa, ja tuhka nosti hieman kompostin ph-tasoa laitoksen B tulosten perusteella. Tuhkalisäys nosti kuivapainoa ja laski hiilen ja typen määrää kompostissa laitoksella B. Ammoniumin ja nitraatin määrät olivat korkeammat tuhkallisessa prosessissa kuin ilman tuhkaa laitoksessa B. Lisäksi kompostissa lisääntyi erityisesti kaliumin, kalsiumin ja magnesiumin määrä tuhkalisäyksen myötä, mutta raskasmetallien määrät pysyivät sallituissa rajoissa (Maa- ja metsätalousministeriön raja-arvot, Liitteet 3 ja 4). 8 Kirjallisuus Carli, K.T., Unal, C.B., Caner, V. and Eyigor, A. (2001). Detection of salmonellae in chicken feces by a combination of tetrathionate broth enrichment, capillary PCR, and capillary gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol., 2001, 1971-1876. Conn, K.L. & Leci, E. A quantitative method for determining soil populations of Streptomyces and differentiating potential scab-inducing strains. Plant Dis. 82, 631-638 (1998). Dep, M.S., Mendz, G.L., Trend, M.A., Coloe, P.J., Fry, B.N. and Korolik, V. (2001). Differentiation between Campylobacter hyoilei and Campylobacter coli using genotypic and phenotypic analyses. Int. J. syst. Evol. Microb. 51, 819-826. European Parliament and of the Council Regulations (EC) (2002) Health rules concerning animal by-products not intended for human consumption. Official Journal of the European Communities 10 October 2002, No 1774/2002, L 273/1-95. European Parliament and of the Council Commision regulations (EC) (2006) Amending annexes VI and VIII to regulations (EC) No 1774/2002 as regards processing standards for biogas and composting plants and requirements for manure. Official Journal of the European Communities 8 February 2006, No 208/2006, L 36/25-31.

Inglis, G.D, and Kalischuk, L.D. (2003) Use of PCR for direct detection of Campylobacter species in bovine feces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 3435-3447. ISO 11885. Water quality. Determination of 33 elements by inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy. Finnish Standard Association, Helsinki, Finland, 1996. Keramas, G., Bang, D.D., Lund, M., Madsen, M., Bunkenborg, H., Telleman, P. and Christensen, C.B.V. (2004) Use of culture, PCR analysis, and DNA microarrays for detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from chicken feces. J. Clin. Microbiol. 42, 3985-3991. Linton, D., Owen. R.J. and Stanley, J. (1996) Rapid identification by PCR of the genus Campylobacter and of five Campylobacter species enteropathogenic for man and animals. Res. Microbiol. 147, 707-718. Logan, J.M.J., Edwards, K.J., Saunders, N.A. and Stanley, J. (2001) Rapid identification of Campylobacter spp. by melting peak analysis of biprobes in real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 2227-2232. Lu, J., Sanchez, S., Hofacre, C., Maurer, J.J., Harmon, B.G. and Lee, M.D. (2003). Evaluation of broiler litter with reference to them microbial composition as assessed by using 16S rrna and functional gene markers. Appl. Environ. Microbiol. 69, 901-908. Lund, M., Wedderkopp, A., Waino, M., Nordentoft, S., Bang, D.D., Pedersen, K., Madsen, M. (2003). Evaluation of PCR for detection of Campylobacter in a national broiler surveillance programme in Denmark. J. Appl. Microbiol., 94, 929-935. Maher, M., Finnegan, C., Collins, E., Ward, B., Carroll, C. and Cormigan, M. (2003) Evaluation of culture methods and a DNA probe-based PCR assay for detection of Campylobacter species in clinical specimens of feces. J Clin Microbiol 41, 2980-2986. Malorny, B., Hoofar, J., Hugas, M., Heuvelink, A., Fach, P., Ellerborek, L., Bunge, C., Dorn, C., Helmuth, R. 2003. Interlaboratory diagnostic accuracy of a Salmonella specific PCR-based method. Int. J. Food Microbiol. 89, 241-249.

McGarvey, J.A., Miller, W.G., Santchez, S. and Stanker L. (2004) Identification of bacterial populations in dairy wastewaters by use of 16S rrna gene sequences and other genetic markers. Appl. Environ. Microbiol. 70: 4267-4275. Radhika, B., Padmapriya, B.P., Chandrashekar, A., Keshava, N., and Varadaraj, M.C. (2002). Detection of Bacillus cereus in foods by colony hybridization using PCR-generated probe and characterization of isolated for toxins by PCR. Int. J. Food Microbiol. 74, 131-138. Rahn K, De Grandis SA, Clarke RC, Mc Ewen SA, Galán JE, Ginacchio C, et al. 1992. Amplification of an inva gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella. Mol. Cell. Probes 6: 271-279. Rintala H, Nevalainen A, Rönkä E and Suutari M (2001) PCR primers targeting the 16S rrna gene for the specific detection of streptomycetes. Mol Cell Probes 15: 337-347. Schraft, H., and M. W. Griffits. 1995. Spesific oligonucleotide primers for detection of lecithinasepositive Bacillus spp. by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 61: 98-102 SFS 5505. Determination of inorganic and organic nitrogen in waste water. Modified Kjeldahl method. Finnish Standards Association SFS, Helsinki, Finland, 1988. [in Finnish] SFS-EN ISO 10304-1. Water quality. Determination of dissolved fluoride, chloride, nitrite, orthophosphate, bromide, nitrate and sulphate ions, using liquid chromatography of ions. Part 1: Method for water with low contamination. Finnish Standards Association SFS, Helsinki, Finland, 1995. SFS-EN ISO 10304-2. Water quality. Determination of dissolved anions by liquid chromatography of ions. Part 2: Determination of bromide, chloride, nitrate, nitrite, orthophosphate and sulphate in waste water. Finnish Standards Association SFS, Helsinki, Finland, 1997. SFS-EN ISO/IEC 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. Finnish Standards Association SFS, Helsinki, Finland, 2005.

Trebesius, K., Harmsen, D., Rakin, A., Schmelz, J. and Heesemann, J. (1998) Development of rrna-targeted PCR and in situ hybridisation with fluoresently labelled oligonucleotides for detection of Yersinia species. J. Clin. Microbiol. 36: 2557-2564. Zanardini, E., Andreoni, V., Borin, S., Cappitelli, F., Daffonchio, D., Talotta, P., Sorlini, C., Ranalli, G., Bruni, S. and Cariati, F. (1997). Lead-resistant microorganisms from red stains of marble of the Certosa of Pavia, Italy and us of nucleic acid-based techniques for their detection. International Biodeterioration & Biodegradation, 40_171-182.

Liite 1. Kompostointilaitos A:n kuvaajat. (A) Enterococcus spp. tuhkalisätyssä kompostissa ja kontrollissa ilman tuhkaa, sekä Komprisk I:n hvin toimivassa kompostissa (tukiaine puuhake ja sahajauho). (B) Streptomyces spp. tuhkalisätyssä kompostissa ja kontrollissa ilman tuhkaa, sekä Komprisk I:n hyvin ja huonosti (tukiaine puuhake ja turve) toimivissa komposteissa. (C) Tuhkan (% kuivapainosta), kuivapainon (% märkäpainosta), orgaanisen aineen (% kuiva-aineesta), ja tilavuuspainon muutokset prosessin aikana. (D) Hiilen (% kuiva-aineesta), typen (% kuiva-aineesta) ja hiili/typpi suhteen muutokset tuhkakompostoinnin aikana ja kontrolleissa ilman tuhkaa. (E) Ammoniumin (mg/g kuiva-aine), nitraatin (mg/g kuiva-aine) ja ammonium/nitraatti suhteen muutokset tuhkakompstissa ja kontrolleissa ilman tuhkaa. (F) Lämpötilan ja ph:n muutkoset kompostointiprosessin aikana. 10 log (pmy/g ka) 8 7 6 5 4 (%) 3 2 1 8 7 6 5 4 3 2 1 0 (A) Enterococcus spp. (viljely) Tuhka Ei tuhkaa, hyvä Ei tuhkaa, kontr 0 100 200 300 400 500 600 (C) Hehk. jäännös (% ka), Kuivapaino (% mp), Org. Aines (% ka), Tilavuuspaino (p-% vol) Tuhka, hehkutusjäännös Ei tuhkaa, hehkutusjäännös Tuhka, kp Ei tuhkaa, kp Tuhka, org aines Ei tuhkaa, org aines Tuhka, p-% vol Ei tuhkaa, p-% vol 0 100 200 300 400 500 600 % kuiva-aineesta 10log (kopiota/g ka) (B) Streptomyces spp. (PCR) 12 10 (D) Hiili (% ka), typpi (% ka), 35.0 C/N 3 25.0 2 15.0 1 5.0 8 6 4 2 0 Tuhka Ei tuhkaa, hyvä Ei tuhkaa, huono Ei tuhkaa, kontr 0 100 200 300 400 500 600 Tuhka, hiili Ei tuhkaa, hiili Tuhka, typpi Ei tuhkaa, typpi Tuhka, C/N Ei tuhkaa, C/N 0 100 200 300 400 500 600 Ammonium / nitraatti (mg/g ka 700 600 500 400 300 200 100 0 (E) Ammonium, nitraatti, ammonium/nitraatti suhde Tuhka, nitraatti Ei tuhkaa, nitraatti Tuhka, ammonium Ei tuhkaa, ammonium Tuhka, NH4/NO3 Ei tuhkaa, NH4/NO3 0 200 400 600 800 Lämpötila (C) 7 6 5 4 3 2 1 (F) Lämpötila, ph Lämpötila ph 0 100 200 300 400 500 600 700 14.0 1 1 8.0 6.0 4.0 ph

Liite 2. Kompostintilaitos B:n mikrobiologiset tulokset tuhkalisätyissä komposteissa (mustat symbolit), sekä komposteissa ilman tuhkaa (avoimet symbolit). (A) Lämpökestoiset kolimuotoiset bakteerit (viljely), (B) Enterococcus spp. (viljely), (C) Salmonella spp. (reaaliaika PCR), (D) Yersinia spp (reaaliaika PCR), (E) Streptomyces spp. (reaaliaika PCR), (F) Bacillus cereus (viljely), (G) Clostridium perfringens (viljely). (pmy/g ka) 6.0 5.0 4.0 3.0 1.0 (A) Lämpkestoiset kolimuotoiset bakteerit (viljely) (pmy/g ka) 6.0 5.0 4.0 3.0 1.0 (B) Enterococcus spp. (viljely) (kopiota/g ka) 5.0 4.0 3.0 1.0 (C) Salmonella spp. (reaali-aika PCR) (kopiota/g ka) 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 (D) Yersinia spp. (reaali-aika PCR) 4.0 3.0 1.0 0 20 40 60 80 100 120 Ei 140 tuhkaa 2 160 (kopiota/g ka) 1 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 1.0 (E) Streptomyces spp. (reaali-aika PCR) (pmy/g ka) 6.0 5.0 4.0 3.0 1.0 (F) Bacillus cereus (viljely) (pmy/g ka) 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 1.5 1.0 0.5 (G) Clostridium perfringens (viljely)

Liite 2 jatkuu. Kompostointilaitos B:n fysikaalis-kemialliset tulokset. (H) kuivapaino (% märkäpainosta), (I) orgaaninen aines (% kuiva-aineesta), (J) tilavuuspaino (g/l), (K) hiili (% kuivaaineeesta), (L) typpi (% kuiva-aineesta), (M) hiili/typpi suhde, (N) nitraatti (mg/kg kuiva-ainetta), (O) ammonium (mg/kg kuiva-ainetta), (P) ammonium/nitraatti, (Q) ph. 9 (H) Kuivapaino 8 7 6 5 4 3 2 1 (% mp) (g/l) (%/ka) 70 60 50 40 30 (J) Tilavuuspaino 20 10 0 20 40 60 80 100 120 140 160 3.5 3.0 2.5 1.5 1.0 0.5 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 (mg/kg ka) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 (Ammonium/Nitraatti (L) Typpi (N) Nitraatti (P) Ammonium/Nitraatti (% ka) 9 8 7 6 5 4 3 (I) Orgaaninen aines 2 1 45.0 (K) Hiili 4 35.0 3 25.0 2 15.0 1 5.0 (%/ka) (%/ka) 16.0 14.0 1 1 8.0 6.0 (M) Hiili/Typpi 4.0 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 (mg/kg ka) (ph) 1 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 1.0 (O) Ammonium (Q) ph

Liite 3. Kompostointilaitos A:n mitatut tulokset.

Liite 4. Kompostointilaitos B:n mitatut tulokset.