QuantiFERON -TB Gold (QFT ) ELISA -pakkausseloste 2 x 96 (luettelonro 0594-0201)

QuantiFERON -TB Gold (QFT ) ELISA -pakkausseloste 2 x 96 (luettelonro 0594-0201) 20 x 96 (luettelonro 0594-0501) Kokoveren IFN- -gammatestin mittausvasteet ESAT-6-, CFP-10- ja TB7.7(p4) -peptidiantigeeneille In vitro -diagnostiikkaan 0594-0201, 0594-0501 Cellestis, QIAGEN Company Level 2, Office Tower 2, Chadstone Centre 1341 Dandenong Road, Chadstone, Victoria, 3148 Australia Puhelin: (Australia) +613-9840-9800 QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1 40724 Hilden, SAKSA 1075115FI Ver. 01 www.quantiferon.com www.quantiferon.com

Sisältö 1. Käyttötarkoitus 4 2. Tiivistelmä ja testin kuvaus 4 Testin periaatteet 5 Testin suorittamiseen vaadittava aika 5 3. Komponentit ja säilytys 6 Tarvittavat materiaalit (jotka eivät kuulu toimitukseen) 7 Säilytys ja käsittely 7 4. Varoitukset ja huomautukset 8 In vitro -diagnostiikkaan 8 Varoitukset 8 Varotoimet 9 5. Näytteen ottaminen ja käsittely 10 6. Käyttöohjeet 12 Vaihe 1 Veren inkubointi ja plasman kerääminen 12 Vaihe 2 Ihmisen gammainterferonin (IFN-γ) ELISA 13 7. Laskennat ja testien tulkinta 18 Standardisuoran laatiminen 18 Testin laadunvarmistus 18 8. Rajoitukset 20 9. Suoritusarvot 21 Kliiniset tutkimukset 21 10. Teknisiä tietoja 23 Määrittämättömät tulokset 23 Hyytyneet plasmanäytteet 23 Ongelmien ratkaisu 24 11. Kirjallisuutta 26 12. Tekninen huolto 28 13. Testimenetelmä lyhyesti 29 Vaihe 1 veren inkubointi 29 Vaihe 2 IFN-γ ELISA 29 Merkittävät muutokset 30 QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013 3

1. Käyttötarkoitus QuantiFERON-TB Gold (QFT ) on in vitro -diagnostinen testi, jossa käytetään ESAT-6-, CFP-10-, ja TB7.7(p4) proteiineja muistuttavaa peptidiseosta heparinisoidun kokoveren solujen stimuloimiseen. Gammainterferonin (IFN-γ) havaitsemista entsyymivälitteisellä immunosorbenttimäärityksellä (ELISA) käytetään tunnistamaan in vitro -vasteet Mycobacterium tuberculosis -tartunnalle ominaisten peptidiantigeenien kanssa. QFT on epäsuora M. tuberculosis -infektion (mukaan lukien itse sairaus) testi, ja sitä käytetään yhdessä tartuntariskin arvioinnin, röntgenin ja muiden lääketieteellisten ja diagnostisten arvioiden kanssa. 2. Tiivistelmä ja testin kuvaus Tuberkuloosi on tarttuva sairaus, jonka aiheuttavat M. tuberculosis -ryhmän organismit (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum), jotka tyypillisesti leviävät uusiin isäntiin hengitysteiden tuberkuloosia sairastavien potilaiden hengittämien pisara-aerosolien välityksellä. Äskettäin tartunnan saanut henkilö saattaa sairastua tuberkuloosiin useiden viikkojen tai kuukausien kuluessa, mutta useimmat tartunnan saaneet henkilöt pysyvät terveinä. Joillekin jää latentti tuberkuloosi-infektio (LTBI), tarttumaton ja oireeton tila, ja he saattavat sairastua tuberkuloosiin useita kuukausia tai vuosia myöhemmin. LTBI:n diagnosoinnin päätarkoituksena on lääkinnällisen hoidon tarpeen harkinta tuberkuloosin ehkäisemiseksi. Viime aikoihin saakka latentin tuberkuloosi-infektion (LTBI) diagnosoimiseen oli käytettävissä vain ihon tuberkuliinitestejä (TST). Ihoherkkyys tuberkuliinille kehittyy 2 10 viikon kuluessa infektiosta. Jotkut infektoituneet henkilöt, muun muassa henkilöt, joilla on laaja-alaisia immuunitoimintoja estäviä sairauksia, sekä myös muut henkilöt, joilla ei ole näitä sairauksia, eivät kuitenkaan vastaa tuberkuliiniin. Sitä vastoin, jotkut henkilöt, joilla M. tuberculosis -infektio on epätodennäköinen, osoittavat herkkyyttä tuberkuliinille, ja heillä esiintyy muita positiivisia TST-tuloksia Calmette-Guérin (BCG) -bakteerirokotteen jälkeen, muiden mykobakteerien kuin M. tuberculosis -ryhmän lajien aiheuttama infektio tai muita määrittämättömiä tekijöitä. LTBI on erotettava tuberkuloosista, raportoitavasta sairaudesta, johon yleensä liittyy keuhkojen ja alempien hengitysteiden sairaus, joskin myös muissa elimissä voi olla oireita. Tuberkuloosi diagnosoidaan historiallisista, fyysisistä, radiologisista, histologisista ja mykobakteriologisista löydöksistä. QFT-testillä testataan soluvälitteistä immuunivastetta (CMI) mykobakteeriproteiineja jäljitteleville peptidiantigeeneille. ESAT-6-, CFP-10- ja TB7.7(p4) -proteiinit puuttuvat BCG-kannoista ja useimmista eituberkuliittisista mykobakteereista, joista poikkeuksena ovat M. kansasii, M. szulgai ja M. marinum.(1) Potilailla, joilla on M. tuberculosis -ryhmään kuuluvan organismin aiheuttama tartunta, on yleensä veressä lymfosyyttejä, joista voidaan tunnistaa nämä ja muut mykobakteeriset antigeenit. Tämä tunnistusprosessi koostuu sytokiinin, gammainterferonin (IFN-γ) muodostumisesta ja erittymisestä. Gammainterferonin (IFN-γ) havaitseminen ja sitä seuraava kvantifiointi muodostaa testin perustan. QFT-testissä käytetyt antigeenit muodostavat peptidiseoksen, joka jäljittelee ESAT-6-, CFP-10- ja TB7.7(p4) -proteiineja. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että nämä peptidiantigeenit stimuloivat IFN-γ -vasteen M. tuberculosis -infektion saaneiden henkilöiden T-soluissa, mutta näin ei yleensä tapahdu tartuntaa saamattomilla tai BCG-rokotuksen saaneilla henkilöillä, joilla ei ole sairautta tai LTBI:-riskiä.(1 32) Immuunitoimintaa heikentävät lääkinnälliset hoidot tai sairaudet saattavat kuitenkin heikentää IFN-γ-vastetta. Potilaat, joilla on muita mykobakteeritartuntoja, saattavat vastata myös ESAT-6-, CFP-10- ja TB7.7(p4) -proteiineihin, sillä näitä proteiineja koodaavat geenit ovat läsnä myös M. kansasii-, M. szulgai- ja M. marinum -bakteereissa.(1, 23) QFT-testiä käytetään sekä LTBI:n 4 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013

testaukseen että edistetään M. tuberculosis -ryhmän aiheuttamien infektioiden diagnosointia sairailla potilailla. Positiivinen tulos tukee tuberkuloosin diagnosointia. Myös muiden mykobakteerien (esim. M. kansasii) aiheuttamat infektiot saattavat kuitenkin johtaa positiivisiin tuloksiin. Tällöin tuberkuloosin vahvistamiseen tai poissulkemiseen tarvitaan muita lääketieteellisiä ja diagnostisia arviointeja. Testin periaatteet QFT-järjestelmässä käytetään erityisiä verinäyteputkia, joihin kerätään kokoverta. Verta inkuboidaan putkissa 16 24 tunnin ajan, minkä jälkeen plasma kerätään ja siitä testataan gammainterferonin (IFN-γ) peptidiantigeeneille tuottama vaste. QFT-testi suoritetaan kahdessa vaiheessa. Ensin kokoverta kerätään kuhunkin QFT-verinäyteputkeen, nollavertailuputkeen, TB-antigeeniputkeen ja mitogeeniputkeen. Mitogeeniputkea voidaan käyttää QFT-testissä positiivisena kontrollina. Sitä suositellaan erityisesti, jos potilaan immuunistatuksesta ei ole varmuutta. Mitogeeniputken avulla voidaan myös valvoa veren asianmukaista käsittelyä ja inkubointia. Putket on inkuboitava 37 C:n lämpötilassa mahdollisimman pian ja 16 tunnin sisällä verinäytteen ottamisesta. 16 24 tunnin inkubointijakson jälkeen putket lingotaan, plasma erotetaan ja gammainterferonin (IFN-γ) (IU/ml) määrä mitataan ELISA-menetelmällä. Testi katsotaan positiiviseksi, jos TB-antigeeniputkessa saadaan IFN-γ-vaste, jonka IFN-γ IU/ml -arvo on huomattavasti suurempi kuin nolla. Jos käytetään mitogeeniputkea, plasmanäyte toimii gammainterferonin (IFN-γ) positiivisena kontrollina kussakin testatussa näytteessä. Matala mitogeenivaste (<0,5 IU/ml) viittaa epäselvään tulokseen, jos myös verinäytteessä on lisäksi negatiivinen vaste TBantigeeneille. Tämä malli saattaa ilmetä riittämättömien lymfosyyttien, näytteen epäasianmukaisen käsittelyn aiheuttaman vähentyneen lymfosyyttiaktiivisuuden, mitogeeniputken virheellisen täytön tai sekoittamisen tai potilaan gammainterferonien (IFN-γ) tuotantoon kykenemättömien lymfosyyttien vuoksi. Nollanäyte sopeutuu taustaan, heterofiilisiin vasta-ainevaikutuksiin tai verinäytteiden epäspesifisiin IFN-γ-tasoihin. Nollavertailuputken IFN-γ-taso vähennetään TB-antigeeniputken ja mitogeeniputken (jos käytössä) IFN-γ-tasosta. Testin suorittamiseen vaadittava aika QFT-testin suorittamiseen tarvittava aika on arvioitu jäljempänä. On kuvattu myös useiden näytteiden testaus erissä: verinäyteputkien inkubaatio 37 C:ssa: ELISA: 16 24 tuntia Noin kolme tuntia yhdelle ELISA-levylle (28 44 henkilöä) <1 työtunti Kutakin levyä kohti lisätään 10 15 minuuttia QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013 5

3. Komponentit ja säilytys Blood Collection Tubes (verinäyteputket)* 300 putkea 200 putkea 100 putkea Luettelonumero T0590-0301 0590-0201 T0593-0201 Preparaatioiden määrä 100 100 100 QuantiFERON Nil Tube (nollavertailuputki) (harmaa korkki, valkoinen rengas) 100 putkea 100 putkea QuantiFERON TB Antigen Tube (TB-antigeeniputki) (punainen korkki, valkoinen rengas) QuantiFERON Mitogen Tube (mitogeeniputki) (violetti korkki, valkoinen rengas) 100 putkea 100 putkea 100 putkea 100 putkea QFT-verinäyteputkien pakkausseloste 1 1 1 High Altitude (HA) Blood Collection Tubes (verinäyteputket suuria korkeuksia (HA) varten) (tarkoitettu käytettäväksi 1 020 1 875 metrin korkeudessa)* 300 putkea 100 putkea 100 putkea Luettelonumero T0590-0505 0590-0501 T0593-0501 QuantiFERON HA Nil Tube (HA-nollavertailuputki) (harmaa korkki, keltainen rengas) QuantiFERON HA TB Antigen Tube (HA TB -antigeeniputki) (punainen korkki, keltainen rengas) QuantiFERON HA Mitogen Tube (HA-mitogeeniputki) (violetti korkki, keltainen rengas) 100 putkea 100 putkea 100 putkea 100 putkea 100 putkea 100 putkea QFT-verinäyteputkien pakkausseloste 1 1 1 * Kaikki tuotekokoonpanot eivät ole saatavilla kaikissa maissa. Lisätietoja tilattavista kokoonpanoista saa ottamalla yhteyttä QIAGENin asiakaspalveluun (tiedot ovat osoitteessa www.qiagen.com). 6 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013

ELISA-komponentit 2 ELISA-levyn sarja Referenssilaboratoriopakkaus Luettelonumero 0594-0201 0594-0501 Hiiren monoklonaalisella anti-ihmis-ifn-γ-vastaaineella päällystetyt mikrolevyliuskat (12 x 8 kuoppaa) Human IFN-γ Standard, lyophilized (lyofilisoitu ihmisen gammainterferonistandardi IFN-γ) (sisältää ihmisen rekombinanttigammainterferonia (IFN-γ), lehmän kaseiinia, 0,01 % w/v timerosaalia) 2 sarjaa 12 x 8 kuopan mikrolevyliuskoja 1 x pullo (8 IU/ml uudelleenliuotettuna) 20 sarjaa 12 x 8 kuopan mikrolevyliuskoja 10 x pulloa (8 IU/ml uudelleenliuotettuna) Green Diluent (vihreä liuotusaine) (sisältää lehmän kaseiinia, normaalia hiiriseerumia, 0,01 % w/v timerosaalia) 1 x 30 ml 10 x 30 ml Conjugate 100X Concentrate, lyophilized (konjugaatti 100X tiiviste, lyofilisoitu) (hiiren antiihmis-ifn-γ HRP, sisältää 0,01 % w/v timerosaalia) 1 x 0,3 ml (uudelleenliuotettuna) 10 x 0,3 ml (uudelleenliuotettuna) Wash Buffer 20X Concentrate (pesupuskuri 20X tiiviste) (ph 7,2; sisältää 0,05 % v/v ProClin 300) Enzyme Substrate Solution (entsyymi-substraattiliuos) (sisältää H 2O 2, 3,3, 5,5 -tetrametyylibentsidiiniä) Enzyme Stopping Solution (entsyymin pysäytysliuos) (sisältää 0,5 M H 2SO 4) 1 x 100 ml 10 x 100 ml 1 x 30 ml 10 x 30 ml 1 x 15 ml 10 x 15 ml QFT ELISA -pakkausseloste 1 1 Sisältää rikkihappoa. Katso varotoimet sivulta 9. Tarvittavat materiaalit (jotka eivät kuulu toimitukseen) 37 C:n inkubaattori. Hiilidioksidia (CO 2) ei tarvita. Kalibroituja tilavuudeltaan vaihtelevia pipettejä 10 1 000 μl:n annosteluun, kertakäyttöiset kärjet. Kalibroituja monikanavaisia pipettejä, joilla voidaan annostella 50 μl ja 100 μl, kertakäyttöiset kärjet. Levyn ravistelija Deionisoitua tai tislattua vettä, 2 litraa. Levyn pesin (suosittelemme automaattista pesintä) Mikrolevyn lukulaite, johon on kiinnitetty 450 nm:n suodatin ja 620 650 nm:n referenssisuodatin. Säilytys ja käsittely Verinäyteputket Säilytä verinäyteputkia 4 25 C:n lämpötilassa. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013 7

Reagenssisarjat Reagenssisarjoja on säilytettävä jääkaapissa 2 8 C:n lämpötilassa. Suojaa entsyymisubstraattiliuos suoralta auringonvalolta. Käyttövalmiit ja käytetyt reagenssit Katso reagenssien uudelleenliuottamista koskevat ohjeet luvusta 6 (sivu 13). Uudelleenliuotettua standardisarjaa voidaan säilyttää enintään kolme kuukautta, jos säilytys tapahtuu 2 8 C:n lämpötilassa. Merkitse standardisarjan uudelleenliuotuspäivämäärä muistiin. Uudelleenliuotuksen jälkeen käyttämätöntä konjugaatti 100X tiiviste on säilytettävä 2 8 C:n lämpötilassa ja käytettävä kolmen kuukauden kuluessa. Merkitse konjugaatin uudelleenliuotuspäivä muistiin. Käyttöpitoinen konjugaatti on käytettävä kuuden tunnin kuluessa sen valmistuksesta. Käyttöpitoista pesupuskuria voidaan säilyttää huoneenlämpötilassa enintään kaksi viikkoa. 4. Varoitukset ja huomautukset In vitro -diagnostiikkaan Varoitukset Negatiivinen QFT-tulos ei sulje pois M. tuberculosis -infektion tai tuberkuloosin mahdollisuutta. Virheelliset negatiiviset tulokset voivat johtua infektiovaiheesta (esim. näyte on otettu ennen solutason immuunivasteen kehittymistä), immuunitoimintoihin vaikuttavista samanaikaisista sairauksista, verinäyteputkien virheellisestä käsittelystä laskimon avaamisen jälkeen, testin virheellisestä suorittamisesta tai muista immunologisista muuttujista. Positiivinen QFT-tulos ei saa olla ainoa tai ratkaiseva syy M. tuberculosis -infektion toteamiselle. Testin virheellinen suorittaminen saattaa aiheuttaa vääriä positiivisia tuloksia. Positiivisen QFT-tuloksen jälkeen on jatkettava lääketieteellistä ja diagnostista mahdollisen aktiivisen tuberkuloosin arviointia (esim. AFB-näyte ja viljely, rintakehän röntgenkuva). Koska ESAT-6-, CFP-10- ja TB7.7(p4) -proteiineja ei esiinny BCG-kannoissa eikä useimmissa ei-tuberkuloottisissa mykobakteereissa, on mahdollista, että positiivinen QFT johtuu M. kansasii-, M. szulgai- tai M. marinum -bakteerin aiheuttamasta infektiosta. Jos epäillään tällaisia infektioita, on suoritettava vaihtoehtoisia testejä. 8 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013

Varotoimet Vain in vitro -diagnostiikkaan. Työskenneltäessä kemikaalien kanssa on aina käytettävä asianmukaista laboratoriotakkia, kertakäyttökäsineitä ja suojalaseja. Lisätietoa saa tuotekohtaisista käyttöturvatiedotteista. Ne ovat saatavilla kätevässä ja kompaktissa PDF-muodossa osoitteessa www.qiagen.com/safety, jossa voidaan tarkastella ja tulostaa kaikkien QIAGEN-sarjan ja sarjakomponentin käyttöturvallisuustiedotteet. HUOMIO: Käsittele ihmisverta mahdollisesti infektoituneena. Noudata asianmukaisia verenkäsittelyohjeita. Seuraavat vaaraa ja turvallisuustoimenpiteitä osoittavat lausekkeet koskevat QuantiFERON-TB Gold ELISA -komponentteja. QuantiFERON-entsyyminpysäytysliuos Xi Sisältää rikkihappoa: Ärsyttävä. Vaaraa ja turvallisuustoimenpiteitä osoittavat lausekkeet: R36/38, S26-36/37/39 Vihreä liuotusaine sisältää normaalia hiiriseerumia ja kaseiinia, jotka saattavat aiheuttaa allergisia reaktioita. Vältettävä ihokosketusta. Kemiallisen vaaran uhatessa aineen kaatumisen, vuotamisen tai onnettomuuden takia CHEMTRECin päivystykseen voi soittaa koska tahansa USA ja Kanada: 1-800-424-9300 Muut maat: +1-703-527-3887 (myös vastapuhelut) Lisätietoja Käyttöturvatiedotteet www.qiagen.com/safety QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA -pakkausselosteen ohjeista poikkeaminen saattaa tuottaa virheellisiä tuloksia. Lue ohjeet huolellisesti ennen käyttöä. Älä käytä sarjaa, jos missään reagenssipullossa on merkkejä vaurioista tai vuodosta ennen käyttöä. Älä sekoita tai käytä eri QFT-sarjaeristä peräisin olevia mikrolevyliuskoja, ihmisen gammainterferonistandardia (IFN-γ), vihreää liuotusainetta tai konjugaatti 100X tiivistettä. Muita eri sarjaeristä peräisin olevia reagensseja (pesupuskuri 20X konsentraatti, entsyymi-substraattiliuos ja entsyymin pysäytysliuos) voidaan käyttää yhdessä edellyttäen, että reagenssien viimeinen käyttöpäivämäärä ei ole umpeutunut ja että erän tiedot on merkitty muistiin. Hävitä käyttämättömät reagenssit ja biologiset näytteet paikallisen viranomaismääräysten mukaisesti. R36/38: Ärsyttää silmiä ja ihoa, S26: Roiskeet silmistä huuhdeltava välittömästi runsaalla vedellä ja mentävä lääkäriin, S36/37/39: Käytettävä sopivaa suojavaatetusta, suojakäsineitä ja silmien- tai kasvonsuojainta. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013 9

Verinäyteputkia tai ELISA-sarjaa ei saa käyttää viimeisen käyttöpäivämäärän jälkeen. Varmista, että laboratoriovälineet, kuten levyn pesimet ja levyn lukulaitteet on kalibroitu/hyväksytty käyttöön. 5. Näytteen ottaminen ja käsittely QFT-testissä käytetään seuraavia näytteenottoputkia: 1. QuantiFERON-nollavertailuputket (harmaa korkki valkoisella renkaalla; käytetään merenpinnan tasolta 810 metrin korkeuteen). 2. TB-antigeeniputket (punainen korkki valkoisella renkaalla; käytetään merenpinnan tasolta 810 metrin korkeuteen). 3. QuantiFERON-mitogeeniputket (violetti korkki valkoisella renkaalla; käytetään merenpinnan tasolta 810 metrin korkeuteen). High Altitude (HA) -putket suuria korkeuksia varten: 4. QuantiFERON HA nollavertailuputket (harmaa korkki keltaisella renkaalla; käytetään 1 020 1 875 metrin korkeudessa) 5. HA TB -antigeeniputket (punainen korkki keltaisella renkaalla; käytetään 1 020 1 875 metrin korkeudessa) 6. QuantiFERON HA -mitogeeniputket (violetti korkki keltaisella renkaalla; käytetään 1 020 1 875 metrin korkeudessa). Antigeenit on kuivattu verinäyteputkien sisäseinämille, joten on erittäin tärkeää, että putkien sisältö sekoitetaan huolellisesti veren kanssa. Putket on siirrettävä inkubaattoriin 37 C:n lämpötilaan mahdollisimman pian ja 16 tunnin sisällä näytteen keräämisestä. Seuraavia toimenpideohjeita on noudatettava optimaalisten tulosten saavuttamiseksi: 1. Kerää kultakin potilaalta 1 ml verta laskimopistoksella suoraan jokaiseen QFT-testin verinäyteputkeen. Tämä toimenpide on annettava flebotomiaan erikoistuneen pätevän henkilön suoritettavaksi. QFT-standardiverinäyteputkia on käytettävä enintään 810 metrin korkeudella merenpinnasta. Suuriin korkeuksiin tarkoitettuja (HA) QFT-verinäyteputkia on käytettävä 1 020 1 875 metrin korkeudella merenpinnasta. Jos QFT-verinäyteputkia käytetään näiden korkeusrajojen ulkopuolella tai jos verta kertyy vain vähän, verinäyte voidaan imeä ruiskulla ja 1 ml verta voidaan siirtää kuhunkin kolmesta näyteputkesta. Turvallisuussyistä tämä on paras tehdä irrottamalla ruiskun neula noudattaen riittäviä varotoimia, irrottamalla kunkin kolmen QFT-verinäyteputken korkit ja lisäämällä 1 ml verta kuhunkin näyteputkeen (putken sivulla olevan mustan merkinnän tasolle). Laita korkit tiukasti takaisin paikoilleen ja sekoita alla kuvatulla tavalla. Koska 1 ml verta kertyy suhteellisen hitaasti, putkea on pidettävä neulassa 2 3 sekunnin ajan, kunnes putki näyttää täyttyneen kokonaan, jotta voidaan varmistaa riittävä näytemäärä. Putken sivulla oleva musta merkki osoittaa 1 ml:n täyttömäärän. QFT-verinäyteputket on hyväksytty 0,8 1,2 ml:n tilavuuksille. Jos verimäärä ei jossain putkessa ole lähellä merkkiviivaa, suosittelemme uuden näytteen ottamista. 10 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013

Jos veren keräämiseen käytetään ns. perhosneulaa, on käytettävä puristusputkea, jotta varmistetaan, että putki on täyttynyt verellä ennen QFT-putkien käyttöä. Verinäyte voidaan ottaa vaihtoehtoisesti myös yksittäisellä geneerisellä verinäyteputkella, joka sisältää antikoagulanttina litiumhepariinia, ja siirtää se sitten AFT-putkiin. Käytä veren hyytymisen estoaineena ainoastaan litiumhepariinia, sillä muut antikoagulantit aiheuttavat testissä häiriöitä. Täytä verinäytteen keräysputki (vähimmäistilavuus 5 ml) ja sekoita varovasti kääntelemällä putkea useita kertoja, jotta hepariini liukenee. Verinäytettä on säilytettävä huoneenlämpötilassa (22 C ± 5 C) ennen sen siirtämistä QFT-putkiin, mikä on aloitettava 16 tunnin kuluessa verinäytteen ottamisesta. 2. Putkia sekoitetaan heti täytön jälkeen kymmenen (10) kertaa juuri niin voimakkaasti, että voidaan varmistaa, että putken koko sisäpinta on peittynyt verellä. Näin putken seinämien antigeenit voidaan liuottaa. Putkien lämpötilan pitäisi olla täytön aikana 17 25 C. Liian voimakas sekoittaminen saattaa aiheuttaa geelin vaurioitumisen ja johtaa poikkeaviin tuloksiin. Jos verinäyte on otettu hepariiniputkeen, näytteet on sekoitettava tasaisesti ennen niiden siirtämistä QFT-putkiin. Varmista juuri ennen siirtoa varovasti kääntelemällä, että veri on sekoittunut hyvin. Annostele 1,0 ml alikvoottia (yksi jokaista QFT-putkea kohti) asianmukaiseen nollavertailu-, TB-antigeeni- ja mitogeeniputkeen. Tämä on parasta suorittaa aseptisesti varmistaen, että noudatetaan asianmukaisia turvatoimenpiteitä. Poista korkit kolmesta QFT-putkesta ja lisää 1 ml verta jokaiseen putkeen (putken etiketin sivulla olevaan mustaan merkkiin saakka). Kiinnitä putkien korkit tiukasti paikalleen ja sekoita edellä kuvatulla tavalla. 3. Putket on merkittävä asianmukaisesti. Varmista, että jokainen putki (nollavertailu-, TB-antigeeni- ja mitogeeniputki) tunnistetaan etiketistä tai muulla tavoin korkin poistamisen jälkeen. 4. Täytön, ravistelun ja merkitsemisen jälkeen putket on siirrettävä inkubaattoriin 37 C ± 1 C:n lämpötilaan mahdollisimman pian ja 16 tunnin sisällä näytteen ottamisesta. Pidä putkia huoneenlämpötilassa ennen inkubointia (22 C ± 5 C). Verinäytteitä ei saa viedä jääkaappiin tai pakastaa. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013 11

6. Käyttöohjeet Vaihe 1 Veren inkubointi ja plasman kerääminen Toimitetut materiaalit QFT-verinäyteputket (katso luku 3). Tarvittavat materiaalit (jotka eivät kuulu toimitukseen) Katso luku 3. Toimenpide 1. Jos verta ei inkuboida välittömästi keräämiseen jälkeen, putket on sekoitettava heti uudelleen kääntämällä ne kymmenen kertaa ylösalaisin ennen inkubointia. 2. Inkuboi putkia PYSTYASENNOSSA 37 C ± 1 C:n lämpötilassa 16 24 tuntia. Inkubaattorissa ei tarvita hiilidioksidia (CO 2) tai kostutusta. 3. Kun inkubointi on suoritettu 37 C:n lämpötilassa, verinäyteputkia voidaan säilyttää enintään kolme vuorokautta 4 27 C:n lämpötilassa ennen linkousta. 4. Kun putkia on inkuboitu 37 C:n lämpötilassa, plasman keräämistä edistetään linkoamalla putkia 15 minuutin ajan 2 000 3 000 RCF:n (g) voimalla. Geelitulppa erottelee solut plasmasta. Jos niin ei tapahdu, putket on lingottava uudelleen suuremmalla nopeudella. Plasman talteenotto on mahdollista ilman linkoamista, mutta tällöin plasman keräämisessä on oltava erityisen huolellinen, etteivät solut rikkoudu. 5. Plasmanäytteitä voidaan kerätä ainoastaan pipetin avulla. Kun linkous on tehty, varo pipetin ylös ja alas suuntautuvaa liikettä tai plasman sekoittumista millään tavoin ennen sen talteenottoa. Varo aina rikkomasta geelin pinnalla olevaa materiaalia. Plasmanäytteet voidaan ladata suoraan lingotuista verinäyteputkista QFT ELISA -levylle myös silloin, kun käytetään automatisoituja ELISA-työasemia. Plasmanäytteitä voidaan säilyttää enintään 28 vuorokautta 2 8 C:n lämpötilassa, tai keräämisen jälkeen pitkiä aikoja alle -20 C:n lämpötilassa. Jotta testinäytteet ovat riittävät, kerää vähintään 150 µl plasmaa. 12 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013

Vaihe 2 Ihmisen gammainterferonin (IFN-γ) ELISA Toimitetut materiaalit QFT ELISA -sarja (katso luku 3). Tarvittavat materiaalit (jotka eivät kuulu toimitukseen) Katso luku 3. Toimenpide 1. Kaikki plasmanäytteet ja reagenssit, paitsi konjugaatti 100X tiiviste, on tuotava huoneenlämpötilaan (22 C ± 5 C) ennen käyttöä. Tasaantumiselle on jätettävä aikaa vähintään 60 minuuttia. 2. Irrota ylimääräiset liuskat kehyksestä, sulje ne takaisin foliopussiin ja vie jääkaappiin myöhempää tarvetta varten. QFT-standardeille tarvitaan vähintään yksi liuska ja riittävä määrä liuskoja kutakin testattavaa potilasta kohti (katso kuvat 2A ja 2B 3-putken ja 2-putken osalta). Palauta kehys ja kansi käytön jälkeen jäljellä olevien liuskojen käyttöön. 3. Liuota pakastekuivattu standardisarja uudelleen deionisoidulla tai tislatulla vedellä standarditestin pulloon merkityllä määrällä Vähennä vaahtoaminen minimiin ja varmista täydellinen liukeneminen sekoittamalla varovasti. Standardisarjan liuottaminen uudelleen merkittyyn tilavuuteen aikaan saa liuoksen, jonka pitoisuus on 8,0 IU/ml. Huomautus: Standardisarjan uudelleenliuotustilavuus vaihtelee erän mukaan. Uudelleenliuotettua standardisarjaa käytetään IFN-γ 1/4 -liuotussarjojen muodostamiseen vihreällä liuotusaineella (GD) (katso kuva 1). S1 (standardi 1) sisältää 4 IU/ml, S2 (standardi 2) sisältää 1 IU/ml, S3 (standardi 3) sisältää 0,25 IU/ml ja S4 (standardi 4) sisältää 0 IU/ml (vain vihreää liuotusainetta). Standarditestit on testattava vähintään kahtena otoksena. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013 13

Toistotestisarjan suositeltu toimintatapa a. Merkitään neljä putkea, S1, S2, S3 ja S4. b. Lisätään 150 µl vihreää liuotusainetta putkeen S1, S2, S3 ja S4. c. Lisätään 150 µl standardisarjaa putkeen S1 ja sekoitetaan huolellisesti. d. Siirretään 50 µl putkesta S1 putkeen S2 ja sekoitetaan huolellisesti. e. Siirretään 50 µl putkesta S2 putkeen S3 ja sekoitetaan huolellisesti. f. Pelkkä vihreä laimennusliuos toimii nollastandardina (S4). Kolmen toistotestisarjan suositeltu toimintatapa a. Merkitään neljä putkea, S1, S2, S3 ja S4. b. Lisätään 150 µl vihreää liuotusainetta putkeen S1. c. Lisätään 210 µl vihreää liuotusainetta putkeen S2, S3 ja S4. d. Lisätään 150 µl standardisarjaa putkeen S1 ja sekoitetaan huolellisesti. e. Siirretään 70 µl putkesta S1 putkeen S2 ja sekoitetaan huolellisesti. f. Siirretään 70 µl putkesta S2 putkeen S3 ja sekoitetaan huolellisesti. g. Pelkkä vihreä laimennusliuos toimii nollastandardina (S4). 150 µl 50 µl 50 µl Uudelleenliuotettu standardisarja Standardi 1 4,0 IU/ml Standardi 2 1,0 IU/ml Standardi 3 0,25 IU/ml Standardi 4 0 IU/ml (Vihreä laimennusliuos) Kuva 1. Standardisuoran valmistelu. Valmistele kutakin ELISA-testiä varten standardisarjasta vasta laimennetut liuokset. 4. Pakastekuivattua konjugaatti 100X tiivistettä sekoitetaan uudelleen 0,3 ml:aan deionisoitua tai tislattua vettä. Sekoitetaan varovasti vaahtoamisen minimoimiseksi ja konjugaatin täydellisen liukenemisen varmistamiseksi. Käyttöpitoinen konjugaatti valmistetaan laimentamalla tarvittava määrä uudelleen sekoitettua konjugaatti 100X tiivistettä vihreään liuotusaineeseen, kuten on kuvattu taulukossa 1 Konjugaatin valmistaminen. 14 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013

Taulukko 1. Konjugaatin valmistaminen Liuskojen määrä Konjugaatti 100X tiivisteen määrä Vihreän liuotusaineen määrä 2 10 µl 1,0 ml 3 15 µl 1,5 ml 4 20 µl 2,0 ml 5 25 µl 2,5 ml 6 30 µl 3,0 ml 7 35 µl 3,5 ml 8 40 µl 4,0 ml 9 45 µl 4,5 ml 10 50 µl 5,0 ml 11 55 µl 5,5 ml 12 60 µl 6,0 ml Sekoita huolellisesti, mutta varo vaahtoamista. Palauta käyttämätön Conjugate 100X Concentrate (konjugaatti 100X tiiviste) välittömästi käytön jälkeen 2 8 C:n lämpötilaan. Käytä vain vihreää laimenninta. 5. Verinäyteputkista kootut plasmanäytteet, jotka on myöhemmin pakastettu tai joita on säilytetty yli 24 tuntia ennen testiä, on sekoitettava huolellisesti ennen niiden lisäämistä ELISA-kuoppaan. Jos plasmanäytteet lisätään suoraan lingotuista QFT-putkista, plasman sekoittumista on vältettävä. 6. Lisää 50 μl tuoretta käyttöpitoista konjugaattia vaadittuihin ELISA-kuoppiin monikanavaisen pipetin avulla. 7. Lisää 50 μl testiplasmanäytettä asianmukaisiin kuoppiin monikanavapipeteillä (katso. alla suositeltu levyasettelu sivulla 16, kuva 2A ja 2B). Lisää lopuksi 50 μl standardeista 1 4. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013 15

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1N 1A 1M S1 S1 S1 13N 13A 13M 21N 21A 21M B 2N 2A 2M S2 S2 S2 14N 14A 14M 22N 22A 22M C 3N 3A 3M S3 S3 S3 15N 15A 15M 23N 23A 23M D 4N 4A 4M S4 S4 S4 16N 16A 16M 24N 24A 24M E 5N 5A 5M 9N 9A 9M 17N 17A 17M 25N 25A 25M F 6N 6A 6M 10N 10A 10M 18N 18A 18M 26N 26A 26M G 7N 7A 7M 11N 11A 11M 19N 19A 19M 27N 27A 27M H 8N 8A 8M 12N 12A 12M 20N 20A 20M 28N 28A 28M Kuva 2A. Suositeltu näyteasettelu nollavertailu-, TB-antigeeni- ja mitogeeni putkille (28 testiä levyä kohti). S1 (standardi 1), S2 (standardi 2), S3 (standardi 3), S4 (standardi 4) 1N (näyte 1. Nollavertailuplasma), 1A (näyte 1. TB-antigeeniplasma), 1M (näyte 1. Mitogeeniplasma) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1N 5N 9N 13N 17N S1 S1 25N 29N 33N 37N 41N B 1A 5A 9A 13A 17A S2 S2 25A 29A 33A 37A 41A C 2N 6N 10N 14N 18N S3 S3 26N 30N 34N 38N 42N D 2A 6A 10A 14A 18A S4 S4 26A 30A 34A 38A 42A E 3N 7N 11N 15N 19N 21N 23N 27N 31N 35N 39N 43N F 3A 7A 11A 15A 19A 21A 23A 27A 31A 35A 39A 43A G 4N 8N 12N 16N 20N 22N 24N 28N 32N 36N 40N 44N H 4A 8A 12A 16A 20A 22A 24A 28A 32A 36A 40A 44A Kuva 2B. Suositeltu näyteasettelu nollavertailu- ja TB-antigeeniputkille (44 testiä levyä kohti). S1 (standardi 1), S2 (standardi 2), S3 (standardi 3), S4 (standardi 4) 1N (näyte 1. Nollavertailuplasma), 1A (näyte 1. TB-antigeeniplasma) 8. Sekoita konjugaattia ja plasmanäytteitä/standardeja huolellisesti mikrolevyn ravistelijalla yhden minuutin ajan. 9. Peitä jokainen levy kannella ja inkuboi huoneenlämpötilassa (22 C ± 5 C) 120 ± 5 minuutin ajan. Levyt eivät saa olla suorassa auringonvalossa inkuboinnin aikana. 16 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013

10. Laimenna inkuboinnin aikana yksi osa pesupuskurin 20X konsentraattia 19 osaan deionisoitua tai tislattua vettä ja sekoita huolellisesti. Pesupuskuri 20X konsentraattia on toimitettu riittävä määrä, jotta voidaan valmistaa kaksi litraa käyttöpitoista pesupuskuria. Pese kuoppia 400 µl:lla käyttöpitoista pesupuskuria vähintään kuuden jakson ajan. Suosittelemme automaattista levyn pesintä. Huolellinen peseminen on erittäin tärkeää testin onnistumisen kannalta. Varmista, että jokainen kuoppa täytetään kokonaan pesupuskurilla kuopan yläreunaan saakka kunkin pesujakson aikana. Kunkin jakson välillä suositellaan suoritettavaksi vähintään viiden sekunnin liuotusjakso. Jätevesisäiliöön on lisättävä laboratoriodesinfiointiainetta, ja vakiintuneita käytäntöjä on noudatettava mahdollisesti infektoivan materiaalin dekontaminaatiossa. 11. Taputa levyjä alaspäin imukykyisellä nukkaamattomalla liinalla pesupuskurijäämien poistamiseksi. Lisää 100 μl entsyymisubstraattiliuosta kuhunkin kuoppaan ja sekoita huolellisesti mikrolevyn ravistelijalla. 12. Peitä jokainen kuoppa kannella ja inkuboi huoneenlämpötilassa (22 C ± 5 C) 30 minuutin ajan. Levyt eivät saa olla suorassa auringonvalossa inkuboinnin aikana. 13. Lisää 30 minuutin inkuboinnin jälkeen jokaiseen kuoppaan 50 μl entsyymin pysäytysliuosta ja sekoita. Entsyymin pysäytysliuosta on lisättävä kuoppiin samassa järjestyksessä ja arviolta samalla nopeudella kuin liuosta vaiheessa 11. 14. Mittaa kunkin kuopan optinen tiheys (OD) viiden minuutin kuluessa reaktion pysäytyksestä mikrolevyn lukulaitteella, johon on asennettu 450 nm:n suodatin ja 620 650 nm:n referenssisuodatin. Optisen tiheyden arvoja käytetään tulosten laskennassa. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013 17

7. Laskennat ja testien tulkinta QFT-analyysiohjelmistoa käytetään raakadatan analysointiin ja tulosten laskentaan. Se on saatavilla osoitteesta www.quantiferon.com. Varmista, että käytetään ohjelmiston uusinta versiota. Ohjelmisto suorittaa testin laadunvarmistusarvion, luo standardisuoran ja antaa kunkin potilaan testituloksen Tulosten tulkinta -luvussa kuvatulla tavalla. Vaihtoehtona QFT-analyysiohjelmistolla tehtävälle analyysille tulokset voidaan määrittää seuraavan menetelmän mukaisesti. Standardisuoran laatiminen (jos QFT-analyysiohjelmistoa ei käytetä) Määritetään standardisarjojen toisintojen optisen tiheyden arvot kussakin levyssä. Laaditaan log (e)-log (e) standardisuora muodostamalla keskiarvoisen optisen tiheyden (y-akseli) log (e) suhteessa standardien IFN-γ konsentraatioon IU/ml:ina (x-akseli) log (e) jättäen nollastandardi pois näistä laskelmista. Laske standardisuora regressioanalyysilla. Standardisuoraa käytetään määritettäessä IFN-γ-konsentraatiopitoisuutta (IU/ml) kussakin testiplasmanäytteessä käyttämällä apuna kunkin näytteen optisen tiheyden arvoa. Nämä laskelmat voidaan tehdä mikrolevyn lukulaitteiden mukana toimitettavilla ohjelmistoilla tai esimerkiksi standarditaulukkolaskennalla tai tilastointiohjelmistolla (esim. Microsoft Excel ). Suosituksena on, että näitä ohjelmistoja käytetään regressioanalyysin, standardien variaatiokerrointen (%CV) ja standardisuoran korrelaatiokertoimen (r) laskentaan. Testin laadunvarmistus Testin tarkkuus riippuu standardisuoran tarkkuudesta. Tästä syystä standardeista saadut tulokset on tarkastettava ennen kuin testituloksia voidaan tulkita. ELISA:a koskee seuraava: Standardin 1 keskimääräisen optisen tiheyden on oltava 0,600. Standardin 1 ja 2 toistettujen optisten tiheyksien arvojen %CV on oltava 15 %. Standardien 3 ja 4 rinnakkaisotosten optisten tiheyksien arvo ei saa poiketa yli 0,040 optisen tiheyden yksikköä niiden keskiarvosta. Keskimääräisistä imeytymisarvoista laskettujen korrelaatiokerrointen (r) on oltava 0,98. QFT-analyysiohjelmisto laskee ja raportoi nämä laadunvalvontaparametrit. Jos edellä mainittuja kriteerejä ei täytetä, testierä on virheellinen, ja se on uusittava. Nollastandardin (vihreän liuotusaineen) keskimääräisen optisen tiheyden on oltava 0,150. Jos keskimääräinen optisen tiheyden arvo on > 0,150 levyjen pesuprosessi on tarkastettava. 18 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013

Tulosten tulkinta QFT-tulokset tulkitaan seuraavien kriteerien mukaisesti: Huomautus: Tuberkuloosin diagnosoiminen tai poissulkeminen ja latentin tuberkuloosin todennäköisyyden arviointi vaatii epidemiologisia, historiallisia, lääketieteellisiä ja diagnostisia löydöksiä, jotka on otettava huomioon QFT-testin tuloksia tulkittaessa (taulukko 2 ja 3). Taulukko 2. Kun käytetään nollavertailu-, TB-antigeeni- ja mitogeeniputkia Nolla (IU/ml) 8,0 TB-antigeeni miinus nolla (IU/ml) Mitogeeni miinus nolla (IU/ml)* QFT-tulos Raportti/tulkinta < 0,35 0,5 Negatiivinen M. tuberculosis -infektio EI ole todennäköinen 0,35 ja < 25 % nolla-arvosta 0,35 ja 25 % nolla-arvosta 0,5 Negatiivinen Mikä tahansa Positiivinen < 0,35 < 0,5 Määrittämätön 0,35 ja < 25 % nolla-arvosta < 0,5 Määrittämätön M. tuberculosis -infektio EI ole todennäköinen M. tuberculosis -infektio on todennäköinen Tulokset ovat riittämättömiä TB-antigeenivasteen määrittämiseen Tulokset ovat riittämättömiä TB-antigeenivasteen määrittämiseen > 8,0 Mikä tahansa Mikä tahansa Määrittämätön Tulokset ovat riittämättömiä TB-antigeenivasteen määrittämiseen * Vasteet mitogeenin positiiviseen vertailuun (ja toisinaan myös TB-antigeeniin) ovat usein mikrolevyn lukulaitteen alueen ulkopuolella. Tällä ei ole vaikutusta testituloksiin. Silloin, kun M. tuberculosis -infektiota ei epäillä, alustavat positiiviset tulokset voidaan vahvistaa testaamalla alkuperäiset plasmanäytteet uudelleen toisintoina QFT ELISA -menetelmällä. Jos toistetun testin yksi tai molemmat toisinnot ovat positiivisia, henkilön testitulos on katsottava positiiviseksi. Mahdollisia syitä on Vianmääritys-luvussa. Kliinisissä tutkimuksissa alle 0,25 prosentilla potilaista oli > 8,0 IU/ml IFN-γ-tasoja nollakontrollissa. Mitatulla IFN-γ-tason voimakkuudella ei voida korreloida infektion vaihetta tai astetta, immuunivasteen tasoa tai aktiivisen sairauden etenemisen mahdollisuutta. Tulkinta Ei TB-antigeeni nolla 0,35 IU/ml Kyllä Ei TB-antigeeni nolla 25 % IU/ml:n nolla-arvosta Kyllä Vahvistus Mitogeeni nolla < 0,50 IU/ml ja/tai nolla > 8,0 IU/ml Kyllä Määrittämätön Ei Nolla 8,0 IU/ml Ei Kyllä Negatiivinen Positiivinen Kuva 3. Tulkintavaihekaavio, kun käytössä ovat nollavertailu-, TB-antigeeni- ja mitogeeniputket QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013 19

Taulukko 3. Kun käytetään vain QuantiFERON-nollavertailuputkia ja TB-antigeeniputkia Nolla (IU/ml) 8,0 TB-antigeeni miinus nolla (IU/ml) QFT-tulos Raportti/tulkinta < 0,35 Negatiivinen M. tuberculosis -infektio EI ole todennäköinen 0,35 ja < 25 % nolla-arvosta Negatiivinen M. tuberculosis -infektio EI ole todennäköinen 0,35 ja 25 % nolla-arvosta Positiivinen* M. tuberculosis -infektio on todennäköinen > 8,0 Mikä tahansa Määrittämätön Tulokset ovat riittämättömiä TB-antigeenivasteen määrittämiseen * Silloin, kun M. tuberculosis -infektiota ei epäillä, alustavat positiiviset tulokset voidaan vahvistaa testaamalla alkuperäiset plasmanäytteet uudelleen toisintoina QFT ELISA -menetelmällä. Jos toistetun testin yksi tai molemmat toisinnot ovat positiivisia, henkilön testitulos on katsottava positiiviseksi. Kliinisissä tutkimuksissa alle 0,25 prosentilla potilaista oli > 8,0 IU/ml IFN-γ-tasoja nollakontrollissa. Mahdollisia syitä on Vianmääritys-luvussa. Mitatulla IFN-γ tason voimakkuudella ei voida korreloida infektion vaihetta tai astetta, immuunivasteen tasoa tai aktiivisen sairauden etenemisen mahdollisuutta. Tulkinta Ei TB-antigeeni nolla 0,35 IU/ml Kyllä Ei TB-antigeeni nolla 25 % IU/ml:n nolla-arvosta Kyllä Vahvistus Määrittämätön Ei Nolla 8,0 IU/ml Kyllä Negatiivinen Positiivinen Kuva 4. Tulkintavaihekaavio, kun käytössä ovat nollavertailu- ja TB-antigeeniputket 8. Rajoitukset QFT-testissä saatuja tuloksia on käytettävä yhdessä kunkin henkilön epidemiologisen historian, nykyisen lääketieteellisen tilan ja muiden diagnostisten arviointien kanssa. Henkilöt, joiden nolla-arvot ovat suuremmat kuin 8 IU/ml, luokitellaan määrittämättömiksi, koska 25 % korkeampi vaste TB-antigeeneihin saattaa olla testin mittausalueen ulkopuolella. Epäluotettavat tai määrittelemättömät tulokset voivat johtua seuraavasta: poikkeaminen QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA -pakkausselosteessa kuvatusta toimenpiteestä verenkierrossa on liian suuria määriä gammainterferonia (IFN-γ), tai kehossa on heterofiilisia vasta-aineita verinäytteen ottamisesta on kulunut yli 16 tuntia ennen inkubointia 37 C:n lämpötilassa. 20 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013

9. Suoritusarvot Kliiniset tutkimukset Koska latentille tuberkuloosi-infektiolle (LTBI) ei ole ehdotonta standardia, QFT-testin herkkyyden ja spesifisyyden tarkkuutta ei voida käytännössä arvioida. QFT-testin spesifisyys keskiarvoistettiin arvioimalla virheellisiä positiivisia lukemia henkilöillä, joilla on matala tuberkuloosi-infektion riski (ei tunnettuja riskitekijöitä). Herkkyys keskiarvoistettiin arvioimalla potilasryhmiä, joilla oli viljelyllä vahvistettu aktiivinen tuberkuloosi. Spesifisyys Yhdysvaltalaisessa tutkimuksessa, johon osallistui 866 vapaaehtoista koehenkilöä, otettin verta QFTtestiä varten samaan aikaan kun suoritettiin ihotestejä (TST). Demografiset tiedot ja tuberkuloosin riskikertoimet määritettiin testiajankohtaan standarditutkimuksena. Vapaaehtoisista, joista 432 henkilöllä ei ollut tunnettuja riskitekijöitä sairastua M. tuberculosis -infektioon, saatiin QFTja TST-tulokset 391 henkilöltä. Kukaan ei ollut saanut BCG-rokotetta. Toinen spesifinen tutkimus suoritettiin Japanissa QFT-testillä matalan riskin henkilöillä, joista noin 90 % oli saanut BCGrokotteen. Näiden kahden spesifisyystutkimuksen tulokset on esitetty taulukossa 4. Taulukko 4. QFT-spesifisyys: Testitulokset henkilöillä, joilla ei ollut raportoitu M. tuberculosis -infektion riskiä Tutkimus Yhdysvallat (julkaisematon) BCG-tila (% rokotettu) Testattuja yhteensä QFT määrittämätön, lkm QFTpositiivisten / hyväksyttyjen testien lkm QFTspesifisyys (95 % CI) 0 % 391 1 3/390 99,2% (98 100) TSTpositiivisten / testattujen lkm TST*- spesifisyys (95 % CI) 6/391 98,5% (97 99) Japani (15) ~90 % 168 6 2/162 98,8% (95 100) Kertynyt 559 7/559 (1,3 %) 5/552 99,1% (98 100) * Käytettäessä 10 mm:n TST cut-off-arvoa BCG-rokottamattomassa väestössä. TST-testin spesifisyysarvio on 99,1 %, jos käytetään 15 mm:n cut-off-arvoa. Herkkyys aktiiviselle tuberkuloosille Yhdysvaltalaisia, australialaisia ja japanilaisia henkilöitä, joiden epäiltiin sairastavan tuberkuloosia ja joiden M. tuberculosis -infektio myöhemmin vahvistettiin viljelytestillä, testattiin QFT-testin herkkyyden arvioimiseksi. Koska latentille tuberkuloosi-infektiolle (LTBI) ei ole ehdotonta standarditestiä, sopivana korvaavana testinä käytettiin M. tuberculosis -bakteerin mikrobiologista viljelyä, koska sairastuneet potilaat ovat määritelmän mukaan infektoituneita. Potilaille oli annettu hoitoa alle kahdeksan päivän ajan, ennen kuin heiltä otettiin verinäyte QFT-testiä varten. Taulukossa 5 on tiivistetty löydökset kolmesta M. tuberculosis -viljelyssä positiivisten potilaiden ryhmästä. QFT-testin kokonaisherkkyys aktiivisen tuberkuloosin osalta oli 89 % (157/177). QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013 21

Taulukko 5. QFT: Potilaat, joilla on viljelyllä vahvistettu M. tuberculosis -infektio Tutkimus QFT-positiivisten / hyväksyttyjen testien lkm QFT-herkkyys (95 % CI) Japanilaiset TB-potilaat (15) 86/92 93 % (86 97 %) Australialaiset 24/27 89% (70 97 %) Yhdysvaltalaiset 47/58 81% (68 90%) Kertynyt 157/177 89% (83 93%) LTBI-diagnosointi On julkaistu useita tutkimuksia, joissa kuvataan QFT-testin suorittamista eri väestöryhmillä, joilla on LTBI-riski. Joidenkin valittujen tutkimusten pääasialliset löydökset on esitetty taulukossa 6. Taulukko 6. Valikoima julkaistuja tutkimuksia QFT-testistä väestöryhmissä, joilla on LTBI-riski Tutkimus Healthcare workers in India (Pai, et al 2005) (26) Danish HIV+ patients (Brock, et al 2006) (5) Hospitalized children in India (Dogra, et al 2006) (10) Contact investigations in Germany (Diel, et al 2006) (9) Testattuja yhteensä Tulokset ja löydökset 726 Lähtökohtana erittäin korkeat TB-luvut. 40 % QFT-positiivisia verrattuna 41 prosenttiin TST-positiivisia, cut-off 10 mm. Erittäin suuri korrelaatio TST:n kanssa, BCG-rokotteella ei vaikutusta kummallakaan puolella. Molemmissa testeissä otettiin huomioon iän ja terveydenhuoltoalalla työskentelyn ajan aiheuttamat riskitekijät. 590 LTBI:n kokonaislevinneisyys QFT-testillä oli 4,6 % (27/590) HIV-positiivisista henkilöistä. Positiiviset tulokset yhdistettiin TB-riskeihin. Kahdella QFT-testissä positiivisella potilaalla sairaus eteni aktiiviseksi tuberkuloosiksi yhden vuoden aikana. Määrittämättömiä vasteita (n=20, 3,4 %) yhdistettiin huomattavassa määrin CD4-lukemaan < 100/μl. 105 Lapsia, joiden epäiltiin sairastavan tuberkuloosia tai joilla oli tuberkuloositartuntahistoria, testattiin QFT- ja TST-testeillä. 10,5 % QFT-positiivisia verrattuna 9,5 prosenttiin TST-positiivisia, cut-off 10 mm. Testien välinen vastaavuus oli kokonaisuudessaan 95,2 % ja 100 % potilailla, jotka eivät olleet saaneet BCG-rokotetta. 309 Testattiin lähikontaktit 15 eri indeksitapauksessa: 51 % oli saanut BCGrokotteen, 27 % oli syntyperältään ulkomaalaisia. 70 % BCG-rokotetuista ja 18 % rokottamattomista oli TST-positiivisia (5 mm), kun taas 9 % ja 11 % oli QFT-testissä positiivisia. QFT yhdistettiin TB-riskiin. TST-testi yhdistettiin ainoastaan BCG-rokotukseen. Monissa muissa julkaisuissa kuvataan QuantiFERON-TB Gold -testin (QFT-testin edeltäjä) ja QFT-testin vähemmän herkkien antigeeniliuosten suorituskykyä. Näissä tutkimuksissa on käsitelty testien käyttöä muun muassa seuraavien kontaktien suhteen: aktiiviset TB-tapaukset (9, 11, 19, 25), lapset (6 10, 25, 28), HIV-positiiviset potilaat (2, 5, 20), terveydenhuoltoalan työntekijät (13, 26, 32), henkilöt, joiden immuniteetti on heikentynyt (3, 4, 22, 23, 27, 30, 31), henkilöt, joiden epäillään sairastavan tuberkuloosia (7, 8, 10, 18) sekä matalan riskin henkilöt (15). 22 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013

Toistettavuus ja TST-testin vaikutus myöhemmissä QFT-testeissä Osana Yhdysvaltoja koskenutta spesifisyystutkimusta osa vapaaehtoisista testattiin uudelleen neljän ja viiden viikon kuluttua alkuperäisestä QFT- ja TST-testistä. 260 vapaaehtoisen koehenkilön QFT-testitulokset olivat saatavilla molempina ajankohtina, ja yhteneväisyysprosentti oli 99,6 % (259/260). Aiempi TST-testi ei johtanut positiivisiin QFT-vasteisiin. 10. Teknisiä tietoja Määrittämättömät tulokset Määrittämättömien tulosten pitäisi olla epätavallisia, ja ne saattavat johtua testattavan henkilön immunologisesta tilasta mutta saattavat liittyä myös useisiin teknisiin tekijöihin: verinäytteen ottamisesta on kulunut yli 16 tuntia ennen inkubointia 37 C:n lämpötilassa verta säilytetään suositellun lämpötila-alueen (17 27 C) ulkopuolella verinäyteputkien sekoittaminen on riittämätöntä ELISA-levyä ei ole pesty kyllin huolellisesti. Jos epäillään teknisiä ongelmia verinäytteiden ottamisessa tai käsittelyssä, koko QFT-testi on toistettava uudella verinäytteellä. Stimuloidun plasman ELISA-testaus voidaan toistaa, jos epäillään riittämätöntä pesua tai muuta poikkeamaa ELISA-testin toimenpiteistä. Matalista mitogeeniarvoista tai korkeista nolla-arvoista aiheutuvien määrittämättömien tulosten ei voi odottaa muuttuvan toistamalla testi, jos ELISA-testissä ei ole tapahtunut virhettä. Määrittämättömät tulokset on raportoitava sellaisenaan. Lääkäri voi ottaa uuden näytteen tai suorittaa muita toimenpiteitä tarpeen mukaan. Hyytyneet plasmanäytteet Jos plasmanäytteitä kauan säilytettäessä syntyy fibriinihyytymiä, näytteet on lingottava hyytyneen aineksen saostamiseksi ja plasman pipetoinnin helpottamiseksi. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013 23

Ongelmien ratkaisu Tämä ongelmien ratkaisuopas voi auttaa mahdollisissa esiin tulevissa ongelmissa. Lisätietoja on myös seuraavassa osoitteessa olevissa teknisissä tiedoissa: www.quantiferon.com. Katso yhteystiedot takakannesta. ELISA:n ongelmien ratkaisu Epämääräinen värin kehittyminen Mahdollinen syy a) Levyä ei ole pesty riittävän hyvin. b) ELISA-kuoppien ristikontaminaatio c) Sarjan / komponenttien viimeinen käyttöpäivämäärä on umpeutunut. d) Entsyymi-substraattiliuos on kontaminoitunut. e) Plasman sekoittaminen QFTputkissa ennen sen keräämistä Ratkaisu Pese levy pesupuskurilla 400 μl / kuoppa vähintään kuusi kertaa. Käytettävän pesimen mukaan saatetaan tarvita enemmän kuin kuusi pesujaksoa. Jokaisen pesujakson välissä on suoritettava vähintään viiden sekunnin liuotusjakso. Pipetoinnissa ja näytteen sekoituksessa on oltava huolellinen riskin vähentämiseksi minimiin. Varmista, että sarja käytetään ennen viimeistä käyttöpäivää. Varmista, että standardi ja konjugaatti 100X tiiviste käytetään kolmen kuukauden kuluessa uudelleenliuotuspäivämäärästä. Heitä substraatti pois, jos sinistä väriä on havaittavissa. Varmista, että käytössä olevat reagenssisäiliöt ovat puhtaat. Kun linkous on tehty, varo pipetin ylös ja alas suuntautuvaa liikettä tai plasman sekoittumista millään tavoin ennen sen talteenottoa. Varo aina rikkomasta geelin pinnalla olevaa materiaalia. Standardien lukemien alhainen optinen tiheys Mahdollinen syy Ratkaisu a) Standardin liuotusvirhe Varmista, että standardisarjan liuokset valmistetaan oikein QFT ELISA -pakkausselosteen mukaisesti. b) Pipetointivirhe Varmista, että pipetit on kalibroitu ja niitä käytetään valmistajan ohjeiden mukaan. c) Inkubointilämpötila on liian alhainen. ELISA-testin inkubointi on suoritettava huoneenlämpötilassa (22 C ± 5 C). d) Inkubointiaika on liian lyhyt. Konjugaatin, standardit ja näytteet sisältävän levyn inkubointiajan on oltava 120 ± 5 minuuttia. Entsyymi-substraattiliuosta inkuboidaan levyssä 30 minuutin ajan. e) On käytetty virheellistä levyn lukulaitteen suodatinta. Levy on luettava 450 nm:n suodattimella, ja referenssisuodattimen on oltava 620 650 nm. f) Reagenssit ovat liian kylmiä. Kaikki reagenssit lukuun ottamatta Conjugate 100X Concentrate (konjugaatti 100X tiiviste) -reagenssia on tuotava huoneenlämpöön ennen testin aloittamista. Tähän menee aikaan noin yksi tunti. g) Sarjan / komponenttien viimeinen käyttöpäivämäärä on umpeutunut. Varmista, että sarja käytetään ennen viimeistä käyttöpäivää. Varmista, että standardi ja konjugaatti 100X tiiviste käytetään kolmen kuukauden kuluessa uudelleenliuotuspäivämäärästä. 24 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013

ELISA:n ongelmien ratkaisu Korkea tausta Mahdollinen syy a) Levyä ei ole pesty riittävän hyvin. b) Inkubointilämpötila on liian korkea. c) Sarjan / komponenttien viimeinen käyttöpäivämäärä on umpeutunut. d) Entsyymi-substraattiliuos on kontaminoitunut. Ratkaisu Pese levy pesupuskurilla 400 μl / kuoppa vähintään kuusi kertaa. Käytettävän pesimen mukaan saatetaan tarvita enemmän kuin kuusi pesujaksoa. Jokaisen pesujakson välissä on suoritettava vähintään viiden sekunnin liuotusjakso. ELISA-testin inkubointi on suoritettava huoneenlämpötilassa (22 C ± 5 C). Varmista, että sarja käytetään ennen viimeistä käyttöpäivää. Varmista, että standardi ja konjugaatti 100X tiiviste käytetään kolmen kuukauden kuluessa uudelleenliuotuspäivämäärästä. Heitä substraatti pois, jos sinistä väriä on havaittavissa. Varmista, että käytössä olevat reagenssisäiliöt ovat puhtaat. Epälineaarinen standardisuora ja rinnakkaisotoksen vaihtelu Mahdollinen syy a) Levyä ei ole pesty riittävän hyvin. Ratkaisu Pese levy pesupuskurilla 400 μl / kuoppa vähintään kuusi kertaa. Käytettävän pesimen mukaan saatetaan tarvita enemmän kuin kuusi pesujaksoa. Jokaisen pesujakson välissä on suoritettava vähintään viiden sekunnin liuotusjakso. b) Standardin liuotusvirhe Varmista, että standardiliuokset valmistetaan oikein QFT ELISA -pakkausselosteen mukaisesti. c) Huono sekoitus Sekoita reagenssit huolellisesti kääntelemällä putkia tai pyöräyttämällä niitä kevyesti ennen niiden lisäämistä levylle. d) Epäjohdonmukainen pipetointitekniikka tai keskeytys testin suorituksessa Näytteen ja standardin lisääminen on suoritettava yhtäjaksoisesti. Kaikki reagenssit on valmistettava ennen testin aloittamista. Testimenetelmävideo ja useimpien teknisten ongelmien ratkaisut ovat saatavilla Gnowee - viiteoppaasta rekisteröitymällä verkkokäyttäjäksi suoraan osoitteessa www.gnowee.net. Tuotetiedot ja tekniset oppaat ovat saatavilla veloituksetta QIAGEN-yhtiöltä jälleenmyyjän välityksellä tai vierailemalla osoitteessa www.quantiferon.com. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013 25

11. Kirjallisuutta Täydellinen luettelo QFT-viitteistä on QuantiFERON-viitekirjastossa (Gnowee), joka on saatavilla osoitteessa www.gnowee.net. 1. Andersen, P. et al. (2000) Specific immune-based diagnosis of tuberculosis. Lancet 356, 1099. 2. Balcells, M.E. et al. (2008) A comparative study of two different methods for the detection of latent tuberculosis in HIV-positive individuals in Chile. Int. J. Infect. Dis. 12, 645. 3. Bartalesi, F. et al. (2009) QuantiFERON-TB Gold and TST are both useful for latent TB screening in autoimmune diseases. Eur. Respir. J. 33, 586. 4. Bocchino, M. et al. (2008) Performance of two commercial blood IFN-gamma release assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis infection in patient candidates for anti-tnf-alpha treatment. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27,907. 5. Brock, I. et al. (2006) Latent tuberculosis in HIV positive, diagnosed by the M. tuberculosis specific interferon-gamma test. Respir. Res. 7, 56. 6. Chun, J.K. et al. (2008) The role of a whole blood interferon gamma assay for the detection of latent tuberculosis infection in bacille Calmette-Guerin vaccinated children. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 62, 389. 7. Connell, T.G. et al. (2008) A three-way comparison of tuberculin skin testing, QuantiFERON-TB gold and T-SPOT.TB in children. PLoS ONE 3, e2624. doi: 10.1371/journal.pone.0002624. 8. Detjen, A.K. et al. (2007) Interferon-gamma release assays improve the diagnosis of tuberculosis and nontuberculous mycobacterial disease in children in a country with a low incidence of tuberculosis. Clin. Infect. Dis. 45, 322. 9. Diel, R. et al. (2009) Comparative performance of tuberculin skin test, QuantiFERON-TB-Gold In-Tube assay, and T-Spot.TB test in contact investigations for tuberculosis. Chest 135, 1010. 10. Diel, R. et al. (2008) Predictive value of a whole-blood IFN-γ assay for the development of active TB disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177, 1164. 11. Diel, R. et al. (2006) Tuberculosis contact investigation with a new, specific blood test in a low-incidence population containing a high proportion of BCG-vaccinated persons. Respir. Res. 7, 77. 12. Dogra, S. et al. (2007) Comparison of a whole blood interferon-gamma assay with tuberculin skin testing for the detection of tuberculosis infection in hospitalized children in rural India. J. Infect. 54, 267. 13. Drobniewski, F. et al. (2007) Rates of latent tuberculosis in health care staff in Russia. PLoS Med. 4, e55. 14. Gerogianni, I. et al. (2008) Whole-blood interferon-gamma assay for the diagnosis of tuberculosis infection in an unselected Greek population. Respirology 13, 270. 15. Harada, N. et al. (2008) Comparison of the sensitivity and specificity of two whole blood interferongamma assays for M. tuberculosis infection. J. Infect. 56, 348. 16. Higuchi, K. et al. (2009) Comparison of performance in two diagnostic methods for tuberculosis infection. Med. Microbiol. Immunol. 198, 33. 17. Kang, Y.A. et al. (2005) Discrepancy between the tuberculin skin test and the whole-blood interferon gamma assay for the diagnosis of latent tuberculosis infection in an intermediate tuberculosis-burden country. JAMA 293, 2756. 18. Katiyar, S.K. et al. (2008) Use of the QuantiFERON-TB Gold In-Tube test to monitor treatment efficacy in active pulmonary tuberculosis. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 12, 1146. 19. Kipfer, B. et al. (2008) Tuberculosis in a Swiss army training camp: contact investigation using an Interferon gamma release assay. Swiss. Med. Wkly. 138, 267. 26 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA -pakkausseloste 07/2013