SUOMI FINLAND (F I) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyreisen (B]. KUULUTUSJULKAISU r 7 C UTLAGGNINGSSKRIFT 0 Patentti MY'jnr1.2'_ ty 10 Cl 193 (45) 1i (go) KvA?mit.a3 (21) Patenttlhakemus Patemensökning (n) HaltemispIllvi AmoöknIquelag (23) AlkuplIva GlItIshatudag C 07 G 7/00, A 61 K 39/104 770169 20.01.77 20.01.77 (41) Tullut julkiseksi allvit offentlls 06.08.77 (44) NilitIviltstpanon ja kuuljulkaleun pvm. 30.09.82 ~akan utlagd eeh utitkriften publkerad (32)(33)(31) Pridotty etuoikeus B*0rd priorttot 05.02.76 Japani -Japan(JP) 10838/76 (71) Shionogi & Co., Ltd., No. 12, 3-chome, Dosho-machi, Higashi-ku, Osaka, The Kitasato Institute, No. 5-9-1, Shirogane, Minato-ku, Tokyo Pref., Japani-Japan(JP) (72)Yuzuru Homma, Tokyo Pref., Kazuyuki Morihara, Osaka Pref., Japani-Japan(JP) (74) Leitzinger Oy (54) Menetelmä valmistaa proteaasitoksoidia, jota käytetään Pseudomonas aeruginosa- infekt.ion vastaisen kolmikomponenttirokotteen valmistamiseksi - Förfarande för framställning av proteastoxoid, som använ6's vid framställning av mot Pseudomonas aeruginosa-infektioner verkande trekomponentvacein Keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa proteaasitoksoidia, jota käytetään Pseudomonas-aeruginosa-infektion vastaisen kolmekomponenttirokotteen valmistamiseksi, jolla proteaasitoksoidilla on seuraavat ominaisuudet: 1) molekyylipaino: 63.000 (geelisuodatus), 2) UV-absorptiospektri: maksimi 280 mp (q3? = 9,27, 0,1 M KC1), minimi 250 mp, 3) isoelektrinen piste: ph 5,2 (fokaalinen elektroforeesi), 4) ulkonäkö: väritön jauhe, 5) aminohappokoostumus: aminohapporyhmät (g/100 q proteiinia); asparagiinihappo (15,6), treoniini (5,0), seriini (7,6), glutamiinihappo (9,5), proliini (2,1), glysiini (7,7), alaniini (8,5), valiini (5,0), isoleusiini (3,9), leusiini (R,7), tyrosiini (6,9), fenyylialaniini (5,9), lysiini (4,1), histidiini, (1,9), arginiini (2,3), tryptofaani (2,3), ammoniakki (1,4) (yhteensä 98,5 g), 6) proteaasiaktiivisuus: ei 7) antigeeniaktiivisuus: havaittu.
2 Sekä lääketieteessä että eläinlääketieteessä P. aeruginosa aiheuttaa erilaisia tärkeitä ongelmia tyypillisenä patogeenina opportunistisissa infektioissa, jotka ovat kiinnittäneet yhä enemmän huomiota lääketieteellisen hoidon edistyessä merkittävästi. P. aeruginosan aiheuttamia infektioita, erityisesti vakavalaatuisia, tapahtuu herkästi vastasyntyneessä lapsessa, kun immuniteetti on fysiologisesti riittämätöntä, potilaissa, joiden immuniteetti on pienentynyt syövän, leukemian, kudossiirrosten ja palovammojen johdosta, ja kun immuniteetti on heikentynyt lääkityksen johdosta. Eläinlääketieteessä P. aeruginosan aiheuttama verenvuotokeuhkokuume minkeillä ja P. aeruginosan aiheuttama utaretulehdus karjalla ovat vakava taloudellinen ongelma elintarviketeollisuudessa. Viime aikoina on kehitetty muutamia antibiootteja P. aeruginosaa vastaan, mutta ne voivat tuskin olla tehokkaita, kun immuniteeetti on riittämätöntä tai sen toiminta on pienentynyt elävässä ruumissa. Mitä taas tulee edellä mainitunlaisiin P. aeruginosan aiheuttamiin infektioihin eläinlääketieteessä, minkkejä on käytännössä mandotonta ja kaupallisesti kannattamatonta hoitaa antibiooteilla antamalla antibioottia useille tuhansille ja jopa useille kymmenille tuhansille eläimille. Utaretulehdus ongelma karjalla omaa melkein samanlaiset olosuhteet. Tämän vuoksi on mitä toivottavinta voida käyttää immunoterapiaa kemoterapian asemesta tai yhdistettyä hoitoa niillä. Immunoterapiassa on jo eristetty normaali antigeeni Original Endotoxin Protein, josta seuraavassa käytetään lyhennystä OEP, joka suojaa kaikkia P. aeruginosan aiheuttamia infektioita vastaan riippumatta serotyypin mukaisesta kannan laadusta (tällä hetkellä tunnetaan 13 laatua tai enemmän). Homma et al.on alkanut soveltaa tätä antigeenia käytäntöön (J. Y. Homma et al., Japan. J. Exp. Med., 45, 355-360 (1975); J.Y. Homma et al., Japan. J. Exp. Med., 42, 23-34 (1972); J. Y. Homma, Microbial Drug Resistance, Tokyo University Press, Tokyo, 267-279 (1975); J. Y. Homma, The Fourth International Congress of Animal, Plant and Microbial Toxins, Plenum Publisher, London (1975)).
3 Pseudomonas aeruginosa muodostaa proteaasia, elastaasia ja muita aineita bakterisolun ulkopuolelle. Näiden kanden entsyymin on osoitettu toimivan patogeenisina tekijöinä (K. Kawaharajo et al., Japan. J. Exp. Med., 45, 79-88 (1975); K. Kawaharajo et al., Japan. J. Exp. Med., 45, 515 (1975); K. Kawaharajo et al., Japan. J. Exp. Med., 44, 435-442 (1974); J. Y. Homma et al., Japan. J. Exp. Med., 46, 245-246 (1976)). Tämä käy riittävän hyvin ilmi siitä seikasta, että potilaiden, jotka kärsivät P. aeruginosan aiheuttamasta kroonisesta hengitysteiden infektiosta, ja karjan, joka kärsii P. aeruginosan aiheuttamasta utaretulehduksesta, seerumissa on todettu korkeat proteaasin ja elastaasin antigeeniarvot sekä OEP-arvot (J. Y. Homma, Japan. J. Exp. Med., 45, 361-366 (1975); Tomiyama et al., Japan. J. Exp. Med., 43, 185-189 (1973)). Eläinkokeilla on osoitettu, että hyvin pieni määrä proteaasia tai elastaasia voi aiheuttaa ihokuolioita ja sarveiskalvon haavaumia ja aiheuttaa huomattavia patogeenisia muutoksia sisäelimiin (K. Kawaharajo et al., Japan. J. Exp. Med., 45, 79-88 (1975); K. Kawaharajo et al., Japan. J. Exp. Med., 45, 515 (1975); K. Kawaharajo et al., Japan. J. Exp. Med., 44, 435-442 (1974); K. Kawaharajo et al., Japan. J. Exp. Med., 45, 89-100 (1975)). Edelleen on osoitettu, että kun bakteereita, jotka muodostavat proteaasia ja elastaasia, ja bakteereita, jotka eivät näitä entsvymejä muodosta, siirrostetaan hiiren sarveiskalvoon, edelliset bakteerit aiheuttavat haavaumien muodostumista, kun taas jälkimmäiset eivät tätä tee. Tämä osoittaa, että näiden kandenlaisten bakteereiden patogeenisissa ominaisuuksissa on ilmeinen ero (J. Y. Homma et al., Japan. J. Exp. Med., 45, 515 (1975). Samanlaisia tuloksia saadaan suolistoon kohdistuvissa vertailukokeissa. Sen vuoksi jotta immunoterapia olisi riittävän tehokasta, metaboliittien myrkyllinen vaikutus on neutraloitava ja bakteereiden kasvu on estettävä normaalilla infektiolta suojaavalla OEP antigeenilla. Tämän saavuttamiseksi immunisointi on suoritettava proteaasi- ja elastaasitoksoideilla.
4 Vaikkakin OEP-rokotetta pidetään tehokkaana suojana P. aeruginosan aiheuttamia infektioita vastaan, laajan tutkimuksen avulla on yritetty löytää tehokkaampi rokote. Tutkimuksen seurauksena on havaittu, että kolmikomponenttinen sekarokote, joka on valmistettu sekoittamalla P. aeruginosasta saatua OEP:tä P. aeruginosasta saadun elastaasitoksoidin ja P. aeruginosasta saadun proteaasitoksoidin kanssa, omaa merkittävän tehon estettäessä ja hoidettaessa P. aeruginosan aiheuttamia infektioita verrattuna yksinkertaiseen rokotteeseen, joka sisältää pelkästään OEP:tä. Tämä keksintp) perustuu edellä olevaan havaintoon. Oheisissa kokeissa käytetty infektiolta suojaava normaali antigeeni OEP on tunnettu. Tällaisen OEP:n fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet sekä valmistusmenetelmä on kuvattu seuraavassa kirjallisuudessa: Japanilainen patenttijulkaisu (ei-tutkittu) No. 40925/1973; J. Y. Homma et al., Japan. J. Exp. Med., 42, 23-34 (1972); J. Y. Homma, Microbial Drug Resistance, Tokyo University Press, 267-279 (1975); J. Y. Homma et al., Abstracts of Lectures at The 22nd Toxoid Symposium, 45-50 (1975). Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että Pseudomonas aeruginosa-proteaasi deaktivoidaan formaldehydillä tai oksimetaanisulfiinihapolla ja dialysoidaan ja lyofilisoidaan. Lähtöaineena käytetty proteaasi on tunnettu ja sen ominaisuuksia ja valmistusmenettelyä on kuvattu seuraavassa kirjallisuudessa: japanilainen patenttijulkaisu No. 27315/1965; K. Morihara et al., Biochem. Biophys., Acta, 73, 113-124, 125-131 (1963); K. Morihara et al., Biochem. Biophys. Acta, 92, 351-360, 361-366 (1964); K. Morihara et al., Arch. Biochem. Biophys., 114, 158-165 (1966); K. Morihara et al., Biochem. Biophys. Acta, 309, 414-429 (1973); K. Morihara et al., Agr. Biol. Chem., 38, (3), 621-626 (1974). Seuraavassa esimerkissä kuvataan proteaasitoksoidin valmistusta. Esimerkki P. aeruginosasta saatuja proteaasikiteitä (100 mg) liuotetaan
0,1 M Na 2HPO 4 liuokseen (noin 20 ml), joka sisältää 0,2 M lvsiiniä, ja tähän lisätään formaliinia tai vaihtoehtoisesti oksimetaanisulfiinihappoa tai sen suolaa niin, että lopulliseksi konsentraatioksi tulee noin 8 % (tilltil). Seoksen annetaan seistä paikallaan huoneen lämpötilassa 3 päivää tai enemmän ja sen jälkeen seosta dialysoidaan vettä vasten ja lopuksi lyofilisoidaan toksoidiksi. Seuraavissa esimerkeissä A ja B on havainnollistettu keksinnön mukaan valmistetun toksoidin käyttöä kolmikomponenttirokotteissa. Esimerkki A (1) Proteaasitoksoidin-potaska-alunaliuos: proteaasitoksoidia (100 mg) liuotetaan fosfaattipuskuroituun natriumkloridin vesiliuokseen (M/15, ph 7,4) (PBS) (24,8 ml) ja tähän lisätään 10 %:sta potaska-alunan [K 2Al 2 (SO 4 ) 4 24H 2 0] liuosta (2,5 ml). Saatuun liuokseen lisätään edelleen 20 %:sta Na 2 HPO 4 '12H 2 0 liuosta (2,5 ml) ja ph säädetään A,5:een täydellistä saostumista varten. Lopuksi tähän lisätään antiseptisena aineena 1 %:sta timerosaliliuosta (0,3 ml) (1 mg proteaasitoksoidia /0,3 ml). (2) Elastaasitoksoidi-potaska-alunaliuos: valmistus suoritetaan samalla tavoin kuin edellä, mutta proteaasitoksoidin asemesta käytetään elastaasitoksoidia. (3) OEP-potaska-alunaliuos: OEP:tä (100 mg) liuotetaan 0,01 N NaOHliuoksen (5 ml) ja tähän lisätään PBS:ä (28 ml). Saatuun liuokseen lisätään peräkkäin 10 %:sta potaska-alunaliuosta (3,3 ml) ja 20 %:sta Na 2 HPO 4 liuosta (3,3 ml) ja lopuksi lisätään 1 %:sta timerosaliliuosta (0,4 ml) (1 mg OEP/0,4 ml). (4) Välittömästi ennen käyttöä sekoitetaan keskenään edellä valmistettu proteaasitoksoidi-potaska-alunaliuos, elastaasitoksoidi-potaskaalunaliuos ja OEP-potaska-alunaliuos. 0,5 ml tätä yhdistettyä liuosta sisältää 500y proteaasitoksoidia, 500y elastaasitoksoidia ja 500, OEP:tä.
Esimerkki 13 6 Esimerkissä A kuvatulla tavalla valmistetaan käyttämällä 10 %:sen potaska-alunaliuoksen asemesta 10 %:sta alumiinihydroksidiliuosta proteaasitoksoidi-alumiinihydroksidiliuosta, elastaasitoksoidialumiinihydroksidiliuosta ja OEP-alumiinihydroksidiliuosta. Edellä valmistetut kolme liuosta sekoitetaan yhteen välittömästi ennen käyttöä. Jäljempänä esitettyjen kokeiden tulosten perusteella on ilmeistä, että keksinnön mukainen kolmikomponenttinen sekarokote ehkäisee paljon tehokkaammin P. aeruginosan aiheuttamia infektioita kuin yksinkertainen rokote, joka sisältää vain OEP:tä. Koe I PHA (passiivinen hemaglutinaatio) arvo minkkien seerumissa, kun minkit on immunisoitu yksinkertaisella rokotteella, joka sisältää pelkästään OEP:tä, tai kolmikomponenttisella sekarokotteella, joka sisältää OEP:tä, proteaasitoksoidia ja elastaasitoksoidia, sekä suojaamisteho infektiota vastaan: (1) Menetelmä: Eläimet: 5-6 kuukautta vanhoja naarasminkkejä (safiiri). Rokotteen antamistapa: Ihonalainen tai lihaksensisäinen injektio. Rasituskoe: käytetään P. aeruginosan kantaa n:o 5, joka tuottaa sekä proteaasia että elastaasia. Infektoiminen elävillä bakteereilla suoritetaan kaatamalla bakteeriliuosta (0,5 ml) nenäonteloon vinyyliputken kautta eetterinukutuksessa. PHA-arvon määrittäminen: proteaasi PHA-arvo ja elastaasi PHA-arvo mitataan J. Y. Homman et al. kuvaamalla menetelmällä Japan. J. Exp. Med., 45, 361-365 (1975). OEP-PHA arvo mitataan T. Tomiyaman et al. kuvaamalla menetelmällä Japan. J. Exp. Med., 43, 185-189 (1973).
7 OEP-rokote: 0,01 N natriumhydroksidiliuokseen, johon oli liuotettu OEP:ta lisättiin M/15 fosfaattipuskuria (ph 7,4). 10 %:sta KA1(SO 4 ) 2 '12H 20-liuosta lisättiin 10: - tilavuussuhteessa ja tämän jälkeen lisättiin 20 %:sta Na 2HP0-liuosta kunnes kokonaisliuoksen ph oli 6,5. Proteaasi- ja elastaasitoksoidien rokotteet: molempien toksoidien M/15 fosfaattipuskuriliuoksiin lisättiin 10 %:sta KA1(S0) - 12H 20- liuosta ja tämän jälkeen 20 %:sta Na ; kunnes liu- oksen lopullinen ph oli 6,5. Sekarokotteita valmistettiin sekoittamalla OEP-liuosta elastaasitoksoidiliuoksen ja proteaasitoksoidiliuoksen kanssa. Seuraavassa taulukossa 1 on annettu immunointiaika, käytetyt annokset, infektointiaika ja ruumiinavausaika. Taulukko I Eläin Antigeeni Immunisointipäivä Infektointi päivä Ryhmä A OEP 10% KA1(SO 4 ) 2 200 300y 500y Ryhmä B Proteaasitoksoidi 1 % KA1(SO 4 ) 2 200 300$' 500y Ryhmä C Elastaasitoksoidi 1 % KA1(SO 4 ) 2 200y 300 500' Ryhmä D OEP Proteaasitoksoidi Elastaasitoksoidi 1 % KA1(s0 4 ) 2 Ruumiinavaus 9/8 23/8 9/9 21/9 4/10 200y 200$' 200y 300$' 300 309, sooy 500y 500$' Ryhmä E 1% KA1(SO 4 ) 2 4 ml 1 ml 1 ml Ryhmä F Immunoimaton uoa NIR u Tuu TosTunimuT uos Tam T TA WRATcl ZI 14 päivää viimeisen infekt io innin j älkeen -------
Kokeiden tulokset: 12 päivän kuluttua viimeisestä immunoinnista suoritettiin infektointikannalla n:o 5 käyttämällä bakteeripitoisuuksia välillä 10 3-10 10. Tulokset on esitetty taulukossa II. Taulukko II Rokotetut ryhmät Bakteerien määrä (elävien solujen lukumäärä) OEP vien solujen PHA-arvo* Minkkien lukumäärä. LD50 elä- 1 Proteaasitoksoidi infektoituja jääneet luku- määrä 1,5 x 10 6 768 < 80 5 2 A 1,5 x 10 7 1024 < 80 5 3 (OEP) 1,5 x 10 8 1280 < 80 5 0 57,5 x 10 1,5 x 10 9 2560 < 80 4 0 1,5 x 10 10 4095 < 80 5 0 1,5 x 104 144 2304 5 5 1,5 x 10 5 64 1408 5 5 B 1,5 x 10 6 40 1792 5 5?1,2 x 10 9 (Proteaa- 1,5 x 10 7 32 1400 5 5 sitoksoi- 1,5 x 10 8 < 40 1536 5 4 di) 1,5 x 10 9 < 40 4096 5 3 1,5 x 10 4 160 < 80 5 5 1,5 x 10 5 80 < 32 5 5 C 1,5 x 10 6 80 <= 80 5 4** (Elastaa- 1,5 x 10 7 64 < 80 5 5,..7,5 x lo sitoksoi- 1,5 x 108 < 80 < 80 5 4 di) 1,5 x 10 9 < 80 < 80 5 2 D 1,5 x 10 6 288 1280 5 4 (OEP, 1,5 x 10 7 384 1920 5 4 Proteaasi & 1,5 x 10 8 1088 1664 5 3 51,9 x 10 8 Elastaasi- 1,5 x 109 2304 1792 4 1 toksoidi 1,5 x 1010 2304 4352 5 0 1,5 x 10 3 32 < 80 5 4** E 1,5 x 104 < 80 < 80 5 1 (Potaska- 1,5 x 10 5 < 80 < 80 5 1 51,2 x 10 4 aluna) 1,5 x 10 6 < 80 < 80 5 1 1,5 x 10 7 < 80 < 80 5 0 1,5 x 10 3 112 < 80 5 1 F 1,5 x 104 < 80 < 80 5 2 (Immunoi- 1,5 x 10 5 < 80 < 80 5 2...7,5 x 10 3 maton) 1,5 x 10 6 < 80 < 80 5 1 1,5 x 10 7 < 80 < 80 5 0 * PHA-arvo minkkiseerumissa ennen infektointia ** Yksi viidestä minkistä kuoli ilman verenvuotoja. P. aeruginosaa ei voitu viljellä kuolleiden minkkien veressä. Elastaasitoksoidin PHA-arvoja ei mitattu
9 Suoritettujen kokeiden tulokset osoittavat, että immunoimattomassa ryhmässä F ja potaska-alunalla immunoidussa ryhmässä E LD 50-arvo oli noin 7,5 x 10 3 ja 1,2 x 10 4. OEP-liuoksella rokotetussa ryhmässä A LD 50 -arvo oli pienempi kuin 7,5 x 10 6 ja näin ollen selvästi eroaa edellä mainituista vertailuryhmistä. E ja F. Ryhmissä B ja C, joissa immunointiin käytetään pelkästään joko proteaasitoksoidia tai elastaasitoksoidia, LD 50 -arvo oli suurempi kuin 1,2 x 10 9 tai suurempi kuin 7,5 x 10 8. Ryhmässä D, jossa käytettiin kolmikomponenttirokotetta LD 50 -arvo oli alle 1,9 x 10 8. Näin voidaan siis sanoa, että ryhmien B, C ja D LD 50 -arvot ovat suurinpiirtein saman suuruisia ja arvot olivat huomattavasti suurempia kuin ryhmän A arvo, jossa siis käytetään pelkästään OEP-rokotetta. Koe 2 Hiirten sarveiskalvoinfektion hoito antiseerumilla ja 3',4'-dideoksikanamysiini B:llä (DKB): (i) Menetelmä: Antiseerumi: Erilaisia antiseerumeja saadaan käyttämällä kaniineja. Käytettyjen antiseerumien laadut ja PHA-arvot on esitetty taulukossa 3. Taulukko 3 Antiseerumi OEP-PHA Proteaasi-PHA OEP-seerumi 2560 - Proteaasitoksoidiseerumi 32 5120 Normaali kaniinin seerumi - - Infektio: Liuosta (0,01 ml), joka sisältää 10 5 elävää Pseudomonas aeruginosa bakteeria, tiputetaan haavalliseen sarveiskalvoon.
Antiseerumin ja DKB:n antaminen: 10 Pelkästään DKB:tä: DKB-liuosta, jonka konsentraatio vaihtelee (800-12,5 y/0,2 ml), injektoidaan (0,2 ml) lihaksensisäisesti jokaiseen hiireen (6 viikon vanhoja, naaraita) välittömästi ennen infektiota. DKB antiseerumi: Antiseerumia (0,1 ml) injektoidaan ihonalaisesti jokaiseen hiireen 18 tuntia ennen infektiota. Senjälkeen DKB liuosta (0,2 ml), jonka konsentraatio vaihtelee, injektoidaan lihaksensisäisesti välittömästi ennen infektiota. Vertailuryhmässä käytetään natriumkloridin vesiliuosta DKB:n ja antiseerumin asemesta. Sarveiskalvon tarkkailu: Infektion aiheuttamaa sarveiskalvon vahingoittumista tarkkaillaan 6 päivän ajan injektoinnin jälkeen. Arviointi suoritetaan sarveiskalvon opasiteetin ja tulehduspesäkkeen ja haavauman muodostumisasteen perusteella. (ii) Tulokset: Esitetty taulukossa 4.
Taulukko 4 Sarveiskalvon infektion hoito hiirillä antiseerumilla ja DKR:llä: Infektoitu aine DKB:n ED50 ( y /hiiri) DKB DKB + normaali kaniinin seerumi tehokkuussuhde *) DKB + antiproteaasitoksoidi- seerumi DKB + anti- OEP seerumi DKB + yhdistetty anti- 90 3,00 1,80 0,88 0,80 seerumi, joka sisältää anti-oep-seerumia, antiproteaasitoksoidiseerumia ja anti-elastaasitoksoidiseerumia DKB + anti-oep-seerumi 175 1,71 1,31 0,45 DKB + anti-proteaasitoksoidiseerumi 185 1,69 1,00 DKB + normaalin kaniinin seerumi 400 0,73 DKB yksinään 620 Huomio: *) Suuremmat luvut kuin 1 osoittavat positiivista tehokkuutta.
12 Taulukon 4 perusteella on ilmeista, että proteaasitoksoidi, elastaasitoksoidi ja OEP antiseerumi ovat paljon tehokkaampia kuin DKB yksinään. Edellä esitetystä havaitaan, että keksinnön mukaan valmistettu proteaasitoksoidi soveltuu erityisen hyvin kolmikomponenttisen sekarokotteen valmistamiseksi. Liuotin voi olla mikä tahansa liuotin, joka sopii ihmisten ja eläinten rokotteisiin. Esimerkkejä ovat tislattu vesi, fysiologinen natriumkloridiliuos, fosfaattipuskuroitu natriumkloridiliuos jne.. Apuaineena voidaan käyttää mitä tahansa tavanomaista apuainetta kuten alumiinihydroksidia, alumiinifosfaattia, kalsiumfosfaattia, alunaa tai Freundin epätäydellistä apuainetta. Apuaineen määrä voidaan valita sopivalla tavalla niin, että se riittää immunoaktiivisuuden lisäämiseen. Antiseptinen aine voi olla myös mikä tahansa tavanomainen aine kuten esimerkiksi timerosali, fenoli, karbolihappo tai formaliini. Kolmikomponenttisen sekarokotteen komponenttien suhdetta voidaan halutulla tavalla muuttaa tehokkaalla alueella sen suojaavan tehon lisäämiseksi rokotteena. Kunkin komponentin tehokas määrä vaihtelee suuresti riippuen immunisointikertojen määrästä ja immunisointivälistä. Se vaihtelee myös rokotteen käyttötarkoituksesta riippuen (s.o. ehkäisevä käyttö tai terapeuttinen käyttö). Seuraavassa on annettu joitakin esimerkkejä antigeenien suositelluista annoksista ja suhteista: (i) Käyttö ihmisillä (myös karjalla): Kun immunisointi suoritetaan 2-3 kertaa viikossa (ilman apuainetta) seuraavia suhteita suositellaan: OEP, 0,1 ji/paino-kg - 10 y/paino-kg: proteaasitoksoidi, 1 1/paino-kg - 50 ylpaino-kg: elastaasitoksoidi, 1 I/paino-kg - 50 p/paino-kg. Immunisointiasteesta riippuen määriä voidaan sopivalla tavalla lisätä.
(ii) Käyttö minkeillä: a) Ehkäisevä rokote 13 Kun immunisointi suoritetaan kaksi kertaa (käyttämällä apuainetta), seuraava suhde on suositeltu: OEP, 10 k/eläin - 2000 y/eläin; proteaasitoksoidi, 10 k/eläin - 2000 ji/eläin; elastaasitoksoidi, 10 k/eläin - 2000 fr /eläin. Kun immunisointi suoritetaan yhdellä kertaa seuraava suhde on suositeltu: OEP, 500»eläin - 2000 k/eläin; proteaasitoksoidi, 500 J'/eläin - 4000 y/eläin; elastaasitoksoidi, 500 fr/eläin - 4000 y/eläin. b) terapeuttinen rokote: Kun immunisointi suoritetaan kaksi - kolme kertaa yhden viikon välein (käyttämällä apuainetta tai ilman) seuraavaa suhdetta suositellaan: OEP, 0,1 Y/eläin - 100 k/eläin; proteaasitoksoidi, 10 k/eläin - 12 k/eläin; elastaasitoksoidi, 10 y/eläin - 2000 i//eläin. Kolmikomponenttinen sekarokote voidaan antaa eläimille ja ihmisille lihaksen sisäisesti, ihonalaisesti tai ihonsisäisesti. Kolmikomponenttisen sekarokotteen komponenttien toksisuudet ovat seuraavat: OEP:n toksisuus: intraperitoneaalinen injektio hiirille annoksina 100 mg/kg aiheuttaa väliaikaista heikkoutta, mutta eläimet eivät kuole. OEP:n kuumetta aiheuttava ominaisuus: tavallisessa kuumekokes,;a kaniineilla havaitaan positiivinen vaikutus annoksella 0,3 mg/kg. Yleisesti sanoen OEP:n toksisuus endotoksiinina on erittäin pieni verrattuna LPS-(lipopolysakkaridi) ja OEP-LPS kompleksiin. Elastaasitoksoidin ja proteaasitoksoidin ja toksisuus: intraperitoneaalinen antaminen hiirille annoksena 1 mg/hiiri ei aiheuta akuuttia toksisuutta, pienin tappava proteaasiannos on 0,2 mg/hiiri (i.p.) ja pienin tappava elastaasiannos on 0,125 mg/hiiri (i.p.).
Patenttivaatimus 14 Menetelmä valmistaa proteaasitoksoidia, jota käytetään Pseudomonas aeruginosa-infektion vastaisen kolmikomponenttirokotteen valmistamiseksi, jolla proteaasitoksoidilla on seuraavat ominaisuudet: 1) molekyylipaino: 63.000 (geelisuodatus), 2) UV-absorptiospektri: maksimi 280 mp (q. 8? = 9,27, 0,1 M KC1), minimi 250 mp, 3) isoelektrinen piste: ph 5,2 (fokaalinen elektroforeesi), 4) ulkonäkö: väritön jauhe, 5) aminohappokoostumus: aminohapporyhmät (g/100 g proteiinia); asparagiinihappo (15,6), treoniini (5,0), seriini (7,6), qlutamiinihappo (9,5), proliini (2,1), glysiini (7,7), alaniini (8,5), valiini (5,0), isoleusiini (3,9), leusiini (8,7), tyrosiini (6,9), fenyylialaniini (5,9), lysiini (4,1), histidiini, (1,9), arginiini (2,3), tryptofaani (2,3), ammoniakki (1,4) (yhteensä 98,5 g), 6) proteaasiaktiivisuus: ei 7) antigeeniaktiivisuus: havaittu. tunnettu siitä, että Pseudomonas aeruginosa-proteaasi deaktivoidaan formaldehydillä tai oksimetaanisulfiinihapolla ja dialysoidaan ja lyofilisoidaan.
Patentkrav 15 Förfarande för framställning av proteastoxoid, som anvrnds vid framställning av mot Pseudomonas aeruginosa-infektioner verkande trekomponentvaccin vilken proteastoxoid har följande egenskaper: 1) molekylvikten: 63.000 (gelfiltrering) 2) UV-absorptionsspektrum: maximum 280 mp (EP? = 9,27, 0,1 M KC1), minimum 250 mp 3) isoelektrisk punkt: ph 5,2 (fokal elektrofores) 4) utseende: färglöst pulver, 5) aminosyrasammansättning: aminosyragrupperna (g/100 g protein); asparaginsyra (15,6), treonin (5,0), serin (7,6), glutaminsyra (9,5), prolin (2,1), glycin (7,7) alanin (8,5), valin (5,0), isoleucin (8,7), leucin (8,7), tyrocin (6,9), fenylalanin (5,9), lysin (4,1), histadin (1,9), arginin (2,3), tryptofan (2,3), ammoniak (1,4) (tillsammans 98,5), 6) proteasaktivitet: ingen 7) antigenaktivitet: observerad k ä n n e t e c k n a t därav, att Pseudomonas aeruginosa-proteas deaktiveras med formaldehyd eller oximetansulfinsyra och dialyseras och lyofiliseras. Viitejulkaisuja-Anförda publikationer Patenttijulkaisuja:-Patentskrifter: Ranska-Frankrike(FR) Brevet d'invention 2 111 719 (A 61 k 27/00). Muita julkaisuja:-andra publikationer: Vet. Bull. 41(3), 169-177 (1971), J. Hyg. 67 (1969), 241-247, J. Inf. Dis. 128(4), 520-526 (1973).