SUOM I FIN LAN D i1 KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT 45864 Kv. Ik./Int. Cl. C' 12 k 7/00 30 h 6 rilyöanettw Patent weddelut 10 X 1.972 Patenttittakemus Patentansäkning 853/69 Hakemispäivä Ansäkningsdag 24.3.1969 Alkupäivä Giltighetsdag 24.3.1969 Patentti - ja rekisterihallitus Patent - och registerstyrelsen Tullut julkiseksi Blivit offentlig 3.10.1969 @ Pantu nähtäväksi Utlagd 30.6.1972 Pyydetty etuoikeus Begärd prioritet 2.4.1968 USA 718190 (71) Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey 07065, USA (72) Keksijät-Uppfinnares William Joseph MoAleer, 717 Marietta Drive, Ambler, Pennsylvania, Edward Henry Wasmuth, 25 Church Street, Telford, Pennsylvania, USA Asiami es-ombuds Oy Kol st er Ab (54)Menetelmä myksoviruksön eristämiseksi kasvualustasta - Förfarande för isolering av ett myxovirus ur kulturmedium. Tämä keksintö koskee menetelmää steriilin, sedimentoidun mykseviruksen, kuten influenssaviruksen saamiseksi viljelyväliaineena käytetystä kananmunan allantoisontelossa olevasta nesteestä. Keksinnön mukaisesti voidaan myksovirus talteenottaa kasvuväliaineesta oleellisesti puhtaassa muodossa ja suurin saannoin. Myksoviruksia ovat influenssa -,para-influenssa-, tuhkarokko- ja sikot autivirukset. Ne aiheuttavat ihmisessä sekä ankaria että lievän akuuttisia sairauksia. Näiden sairausten vähentämiseksi on saatavissa rokotteita, jotka on valmistettu tapetuista viruksista, mutta niiden haittana on, että ne ovat kalliita valmistaa hyvin puhdistettuina. Rokotteen valmistuksessa käytettyjä viruksia viljellään elävissä soluissa, kuten munien alkion rakkokalvosoluissa tai viljelyväliaineissa, jotka sisältävät eläinten kudossoluja, ja sen jälkeen täytyy virukset ottaa talteen mahdollisimman puhtaassa muodossa, vapaana viljelysoluista ja niiden aineosista. Aikaisemmat rokotteet on tähän asti saatu vain hyvin epäpuhtaassa tilassa ja nämä epäpuhtaudet (kuten munan proteiini) voivat aiheuttaa voimakkaan reaktion henkilöissä, jotka ovat herkkiä näille aineille. Aikaisemmat menetelmät suhteellisen puhtaiden virusten talteen-
45864 ottamiseksi ovat olleet pääasiassa jaksottaisia menetelmiä, jotka käsittävät vaivalloisia ja monimutkaisia käsin suoritettavia käsittelyjä. Aikaisemmat menetelmät eivät sitäpaitsi poista epesifiseati mikrobiaalisia epäpuhtauksia. Eräässä tunnetussa menetelmässä käytetään abaorptio-desorptiomenetelmiä ja vaikkakin se tuottaa verraten puhdasta virusmateriaalia suhteellisen korkean saannon, on menetelmä aikaavievä ja sen vuoksi on tuloksena kallis tuote. Tunnetaan myöskin menetelmiä, joissa käytetään yhdistettyä suodatusta ja sentrifugointia (kta. esim. suom.pat. 41.428, s. 2, A 61 k 23/00, per.hak. 2241/66, A 61 k 23/b2, suom.kuul.julk. 43.766, C 12 k 5/00, Rhodes- van Rooyen: Textbook of Virology 1968, 49-51, US pat. 2.355.676, 167-78, 2.854.143, 210-335), mutta puhtaan virusvalmisteen saaminen on tähän asti ollut hankalaa ja kallista, kun on ollut kysymys vaikeasti suodatettavaata muna-allantoisnesteestä. Puhdistetun virustuotteen kustannusten alentaminen on toivottavaa, koska se suurentaa niitten henkilöiden lukumäärää, joilla on varaa rokotteen ostoon, mikä rokote on tärkeä heidän terveydelleen. Keksinnön mukainen menetelmä käsittää oleellisesti jatkuvia operaatiovaiheita ja nämä operaatiot voidaan helposti suorittaa suuressa mittakaavassa toimivissa tehdaskaaviojärjestelmissä. Tällöin ei saada vain erittäin puhtaita viruksia, vaan niitä saadaan myöskin suurina saantoina verraten lyhyessä ajassa ja tämän johdosta voidaan valmistaa halpaa rokotetta. Keksinnön muka~ menetelmä4 käsittää seuraavat vaiheet: A. Sentrifugoinnin kiihtyvyyden ollessa noin 15 000 g, B. noin 1,5 liiran viljelyväliainemäärän syötön 100 cm 2 suodatinpintaalaa kohti virtausnopeuden ollessa 100-150 ml/min/100 cm 2 suodatinpinta-alaa perättäisesti suodatinlevyjen läpi, jotka koostuvat (1) karkeasta suodatusaineesta, kuten selluloosasta, piimaasta tai lasivillasta, joiden huokoakoko on yli 2 mikronia, (2) suodatusaineesta, jonka huokoset ovat 0,8-2,0 mikronia, edullisesti 1,2 mikronia, ja (3) suodatusaineesta, jonka huokoset ovat 0,22-0,6 mikronia, edullisesti 0,45 mikronia, C. ja suodoksen sentrifugoinnin kiihtyvyyden ollessa 50 000-89 000 g. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään tavanomaista ultrasentrifugia, esim. sellaista, joka toimii keskipakoiskiihtyvyyden ollessa yli 50 000 g, mutta keksinnön piirteenä on suodatusvaiheiden käyttäminen juuri ennen tätä ultrasentrifugointia sellaisten epäpuhtauksien poistamiseksi, jotka ovat suurempia kuin virus ja pääasiallisesti mikrobiaaliset epäpuhtaudet. Nämä esikäsittelyt ennen ultrasentrifugaalista sedimentaatiota tekevät mandolliseksi erittäin puhtaiden, steriilien rokotteiden valmistamisen suoraan sentrifugoiduista tuotteeista ilman jälkikäsittelyjä. Aikaisemmin käytetyt aluksi sedimen-
45864 toidut rokotteet ovat huomattavasti vähemmän puhtaita ja ei -steriilejä. Ennen esillä olevaa keksintöä otaksuttiin, että oli mandotonta käyttää viruksia sisältävän viljelyväliaineen alustavaa suodatusta ennen sentrifugoin - tia siitä syystä, että suodatuslevyt (filter pads) tukkeutuisivat nopeasti ja estäisivät virusten läpikulun. Lisäksi otaksuttiin, että joo käytetään suuri - huokoisia suodatuslevyjä, jotta vältettäisiin virusten jääminen levyihin, pääsisi liian paljon karkeita epäpuhtauksia kulkemaan suodattimen läpi. Keksinnön mukaisesti huokossuuruudeltaan määrätynlaisten suodattimien peräkkäinen käyttäminen, niiden suuri pinta-ala ja niiden läpi tapahtuvan virtauksen nopeuden säätö tuottavat nesteen, joka sisältää miltei kaikki virukset ja joka on käytännöllisesti katsoen vapaa kasvuväliaineesta peräisin olevista epäpuhtauksista. Tämä suodos johdetaan suoraan ultrasentrifugiin virusten saamiseksi konsentroidusaa muodossa. Tätä konsentroitua virusainetta voidaan käyttää rokotteen valmistamiseen suspendoimalla se uudelleen tavanomaiseen tapaan injektoitavaan neeteeseen, kuten fysiologiseen fosfaattipuskuriliuokseen. Ennen suodatusoperaatiota voidaan suorittaa tavanomainen kirkastuskäsit - tely. Tämän alustavan kirkastamisen tehtävänä on poistaa verraten suuret vilje - lyväliaineen osaset, kuten solukimput alkion rakkokaivonesteestä, jossa viruksia viljeltiin. Tähän tarkoitukseen on sopiva nopeudeltaan keskinkertainen, kiekkotyyppinen sentrifugi (kuten esimerkiksi DeLaval malli PX), joka toimii tavallisella 15 000 g:n suuruisella keskipakoiskiihtyvyydellä. Tämän keksinnön mukaiset suodatuskäsittelyt ovat erityisesti tarkoitetut poistamaan perättäisesti yhä pienempiä ja pienempiä mikrobiaalisia ja muita epäpuhtaushiukkasia, niin että suodos on steriiliä nestettä, joka sisältää ainoastaan virushiukkasia. Tässä suodatuksesaa käytetään seuraavia suodattimia perättäisesti: a. Verraten suurihuokoinen esisuodatin, kuten selluloosalevyt, piimaa tai kehrätty lasi. b. edullisesti 1,2 mikronin suodatinlevy, mutta huokoskoko voi olla välillä 0,8-2,0 mikronia. c. edullisesti 0,45 mikronin suodatinlevy, mutta huokoskoko voi olla välillä 0,22-0,6 mikronia. On tärkeitä, että jokaista suodatusvaihetta varten suodatuslevyn pintaala on noin 100 cm 2 jokaista 1-1,5 litran suuruista nestemäärää kohti ja että jokaista 100 cm 2 kohti virtausnopeus on suuruusluokkaa 1-1,5 litraa 10 minuutissa. Tämän virtausnopeuden ylläpitämiseksi voidaan tämän suodatusoperaation jouduttamiseksi käyttää paine-
4 45864 ilmaa yhdessä tai kaikissa kolmessa suodatusvaiheessa. Nestetilavuuden tullessa mainittuja raja-arvoja suuremmaksi voi tapahtua suodattimen tukkeutumista ja tästä voi olla seurauksena, että osa viruksista ei kulje suodattimen läpi, On tärkeätä, että suodatuspinta-ala on suhteellisen suuri, kuten edellä on määritelty, koska muuten operaatio muuttuu hitaaksi, täydellistä suodatusta ei saavuteta jokaisessa vaiheessa ja tapahtuu virushäviöitä suodatinlevyillä. Näistä vaiheista saadun lopullisen suodoksen todetaan olevan kirkasta ja steriiliä ja sisältävän alkuperäisen viruskasvun miltei kokonaan. Tässä suodoksessa olevien virushiukkasten sedimentoimiseksi käytetään suurella nopeudella toimivaa sentrifugia ja tämän keskipakoisvoiman aiheuttama kiihtyvyys voi olla 50 000-80 000 g. Sopiva laite on Sharples Co. Inc:n Model T-1P Presurtite. Tämä sakeuttaa virukset paksuksi lietteeksi ja tämä operaatio on suoritettava jatkuvana. Kaupallista tuotantoa varten saattaa olla edullista käyttää vyöhyketyyppistä ultrasentrifugia, kuten Spince Co:n Md L-4-vyöhyke-sentrifugia tai Oak Ridge Inc:n Kll-vyöhykesentrifugia. Tätä sentrifugista saatua lopullista konsentroitua virusmateriaalia voidaan käyttää heti rokotteen valmistamiseen lisäämällä sitä injektoitavaan nesteeseen sopivaan laimennukseen, tai lietettä voidaan säilyttää steriilissä muodossa, haluttaessa lyofilisoinnin jälkeen, myöhemmin tapahtuvaa uudelleen suspendoimista varten. Virukset voidaan tappaa missä operaation vaiheessa tahansa. Tämä voi tapahtua ennen alkukirkastusta, jos sellaista käytetään, jonkin suodatusvaiheen aikana tai ultrasentrifugoinnin jälkeen. Voidaan käyttää tunnettuja inaktivointiaineita, kuten formaliinia, jolloin määrä ja konsentraatio ovat vakiintuneiden standardien mukaiset. Seuraavassa on esitetty kuvaavia esimerkkejä. Esimerkki 1 450 hedelmöitettyä kananmunaa infektoitiin influenssavirus-a 2 - kannalla (JAP 170) ja pidettiin 37 C:ssa 40 tuntia. Alkion allantoisontelossa olevat nesteet, jotka sisälsivät lisääntyneet virukset, poistettiin munista imulla ja yhdistettiin noin 4500 ml:n seokseksi. Nestettä käsiteltiin sen jälkeen paraformaldehydillä käyttäen sitä 1/400 tilavuusosaa 35 :ssa 24 tuntia virusten inaktivoimiseksi. Koko nestemäärä johdettiin nopeudella 300 ml/minuuttia DeLaval- Gyro-tester'in tai sen tapaisen sentrifugin läpi, joka toimii nopeudella 12 000 kierrosta minuutissa (noin 15 000 g) ja kirkastettu liuos otettiin talteen. Sentrifugilla kirkastettu liuos johdettiin ensiksi 500 cm 2 :n suuruisen kehrätystä lasista valmistetun esisuodattimen, kuten esim.
5 45864 n:o 142 Millipore-suodattimen, läpi, sen jälkeen 500 cm 2 :n suuruisen suodatinlevyn (huokossuuruus 1,2 mikronia) ja lopuksi 500 cm 2 :n suuruisen suodatinlevyn (huokossuuruus 0,45 mikronia) läpi. Jokaisessa vaiheessa käytettiin noin 1,4 kg/cm 2 ilmanpainetta ja koko suodatusaika oli 8 minuuttia. Rokotteen talteensaanti tässä vaiheessa on 86 % laskettuna CCA-standardikokeilla. (Lyhennyksellä CCA tarkoitetaan kananpojan soluagglutiniinia). Rokotteen lopullinen konsentrointi suoritettiin sedimentoimalla suurella nopeudella toimivassa sentrifugissa, joka pyörii 50000 kierrosta minuutissa nesteen virtausmäärän ollessa noin 1,0 litraa tuntia kohti. Sedimentoituja viruksia käytetään rokotteen valmistamiseen. Esimerkki 2 3500 hedelmöitettyä kananmunaa infektoitiin influenssavirus-brodulla (B/mass) ja pidettiin 37 C:ssa 40 tuntia. Allantoisontelossa olevat nesteet poistettiin munista imulla ja yhdistettiin noin 35 000 ml:n seokseksi. Nestettä käsiteltiin formaldehydillä käyttäen tätä 1/4000 tilavuusosaa 35 C:ssa 24 tuntia. Koko nestemäärä johdettiin nopeudella 300 ml/minuutti sentrifugin, kuten DeLaval Gyro-tester'in läpi, jonka kierrosluku oli 12 000 kierrosta minuutissa. Paineilmaa käytettiin nesteen pakottamiseksi kulkemaan sentrifugin läpi ja nopeutta tarkkailtiin virtausmittarin avulla nopeuden säilyttämiseksi suunnilleen samana. Kirkastettu neste koottiin paineastiaan. Tämä sentrifugilla kirkastettu neste pakotettiin ensiksi kulkemaan 3100 cm 2 :n suuruisen esisuodatuslevyn (joka sijaitsee monilevyisessä suodatinpitimessä) läpi, jota seurasi 3100 cm 2 :n suuruinen suodatinlevy (huokossuuruus 1,2 p) ja lopuksi 2300 cm 2 :n suuruisen suodatuslevyn (huokossuuruus 0,45 p) läpi. Suodatuksessa käytetty ilmanpaine oli 1,4 kg/cm 2 ja suodatuksen kokonaisaika oli 15 minuuttia. Tässä vaiheessa talteenotetun rokotteen määrä on 84 % laskettuna CCAstandardikokeen avulla. Rokotteen lopullinen konsentroiminen suoritettiin Sharples Hi- Speed-sentrifugissa, joka pyörii 50 000 kierrosta minuutissa ja nesteen virtausmäärä oli 1,5 litraa/tunti. Sedimentoituja viruksia käytetään rokotteen valmistukseen.
Patenttivaatimukset: 45864 Menetelmä steriilin, sedimentoidun myksoviruksen, kuten influenssaviruksen, saamiseksi viljelyväliaineena käytetystä kananmunan allantoisontelossa olevasta nesteestä, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: A. sentrifugoinnin kiihtyvyyden ollessa noin 15 000 g, B. noin 1,5 litran viljelyväliainemäärän syötön 100 cm 2 suodatinpintaalaa kohti virtausnopeuden ollessa 100-150 ml/min/100 cm 2 suodatinpinta-alaa perättäisesti suodatinlevyjen läpi, jotka koostuvat (1) karkeasta suodatusaineesta, kuten selluloosasta, piimaasta tai lasivillasta, joiden huokoskoko on yli 2 mikronia, (2) suodatusaineesta, jonka huokoset ovat 0,8-2,0 mikronia, edullisesti 1,2 mikronia, ja (3) suodatusaineesta, jonka huokoset ovat 0,22-0,6 mikronia, edullisesti 0,45 mikronia, C. ja suodoksen aentrifugoinnin kiihtyvyyden ollessa 50 000-89 000 g. Patentkrav: Förfarande för erhållande av ett sterilt, sedimenterat myxovirus, såsom ett influensavirus, ur en såsom kulturmedium använd, i allantoishåligheten av ägg befintlig vätska, k ä n n e t e c k n a t därav, att det omfatter följande steg: A. centrifugering vid en acceleration på ungefär 15 000 g, B. inledning av kulturmedium i en mängd på ungefär 1,5 1/100 cm 2 filteryta med en strömningshastighet på 100-150 ml/min/100 cm 2 filteryta succeasivt genom filterskivor, vilka består av (1) ett grovfiltreringsämne, såsom cellulosa, kiselgur eller glasull med en porstorlek överstigande 2 mikroner, mikroner, och (2) ett filterämne, vilkets porer är 0,8-2,0 mikroner, lämpligen 1,2 (3) ett filterämne, vilkets porer är 0,22-0,6 mikroner, lämpligen 0,45 mikroner, och C. centrifugering av filtratet under 50 000-89 000 g acceleration. Viitejulkai 1311j a-anförda publikationer Julkisia suomalaisiapatenttihakemuksia:-offentliga finska patentansölcningar: 2241/66 (A 61 k 23/02) Kuulutusjulkaisuja:-Utläggningsskrifter: Suomi-Finland 43766 (C 12 k 5/00) Patenttijulkaisuja:-Patentskrifter: Suomi-Finland 41428 (A 61 k 23/00). USA 2355676 (167-78), 2854143 (210-335) Muita julkaisuja:-andra publikationer: Rhodes-van Rooyen: Textbook of Virology 1968, p. 49-51