SUO M 1-FI N LAN D 0 KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT 43624 Kv. lk./int. Cl. A 61 k 23/02 C 12 k 5/00 30 h 6 Pat.hak. peruutettu Pat.ans. återtagen 3 V 1971 Patenttihakemus Patentansökning 1977/67 Hakemispäivä Ansökningsdag 18 VII 1 967 Alkupäivä Giltighetsdag Tullut julkiseksi Blivit offentlig 23 XI 1968 Pantu nähtäväksi Utlagd 1 II 1971 Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen @ Pyydetty etuoikeus Begärd prioritet 22 V 1967 USA 640341 (71) 1:erck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, USA (72) Keksijät-Uppfinnare: Eugene Bernard Buynak, Gwynedd View Road, North T.,!ales, Pennsylvania, l'''aurice Ralph Hilleman, 4107 Fields Drive, Lafayette Hill, Pennsylvania, USA Asiamies -Ombud: 0/Y Kolster A/B (54)Menetelmä vihurirokkorokotteen valmistamiseksi - Förfarande för framställning av ett rubellavaccin. Tämä keksintö koskee vihurirokkoviruksen kasvattamista injektoituneesta ihmisestä erillään ja erikoisesti keksintö koskee vihurirokkoviruksen viljelyä synteettisessä keinotekoisessa ympäristössä. Tämä keksintö tekee mandolliseksi kasvattaa vihurirokkovirusta laboratorio- tai tehdasolosuhteissa, niin että voidaan saada heikennettyä virusta, jota voidaan käyttää rokotteen valmistuksessa. Tähän saakka tämän viruksen kasvatusta on haitannut viruksen hidas lisääntyminen tai poikkeuksellisen väliaineen luonne, jossa virusta on kasvatettu. Tämä keksintö tekee mandolliseksi käyttää tavanomaisempaa kananpoikaa ravintolähteenä viruksen kasvulle. Ennen tätä keksintöä on luultu, että kananpojat, tai tarkemmin niiden munat, eivät ole sopivia vihurirokkoviruksen lisääntymiselle. Vihurirokkoviruksen sarjaviljely on jo ennaltatunnettua kanin munuaiskudosviljelyssä suoritettuna (suom. hak. 2788/67) sekä myös apinan munuaiskudosviljelyssä (New. Eng. J.Med. 275 (1966) 569-580) sekä ankan alkiosoluviljelmissä (Stokes et al: First Internat. Conf. on Vaccines Against Viral and Rickettsial Infections, Washington Pan Amer. Health Org., Scient. Publ. 147, May 1967).
2 43624 Vihurirokkoviruksen laboratorio- tai tehdaskasvatus on tärkeätä immunoivan rokotteen valmistuksessa. Vihurirokko on tavallisesti lievä lastentauti, vaikka komplikaatioita, kuten aivokuumetta, niveltulehdusta tai hermotulehdusta saattaa esiintyä. Pysyvä mentaalinen huononeminen on vähemmän usein tapahtuva kuin tavallisella tuhkarokolla (rubeola). Taudin vakavuus ilmenee täysikasvuisena naisten saadessa tartunnan raskauden ensimmäisen kolmikuukautisjakson aikana. Virus vaikuttaa sikiöön tuloksen ollessa väärä sikiön kehitys, johon liittyy pienipäisyyttä, kuuromykkyyttä, silmävahinkoja, sydämen epämuodostumista ja hampaitten epänormaalisuutta. Niin todellinen on vihurirokon vaara sikiölle raskauden ensimmäisten kanden kolmen kuukauden aikana, että on ehdotettu, että nuoret tytöt alistettaisiin tautiin, niin että heillä olisi ollut se ennen sukukypsyyttä. Viruksen kasvatus esillä olevan keksinnön mukaisesti tekee mandolliseksi rokotteen valmistuksen immunointia varten tunnetulla tavalla. Yleisesti sanoen keksintö koskee vihurirokkoviruksen mukauttamista ja kasvattamista kudosviljelmissä, jotka on valmistettu hedelmöitettyjen kanojen munista. Erikoisesti tämä keksintö kohdistuu elävää heikennettyä vihurirokkovirusta sisältävän rokotteen kehittämiseen sarjasiirrostamalla sitä kananpoika-alkion kudosviljelmässä. Tämä menetelmä sisältää seuraavat vaiheet: A, elinvoimaisen viruksen eristäminen viljelmän joistain soluista, ja sen sopeuttaminen kananpoika-alkion kudosviljelmään; B, heikennetyn elävän viruksen kehittäminen sarjasiirrostuksella kananpoika-alkiokudosviljelmässä; ja C, tämän heikennetyn elävän viruksen valmistaminen käytettäväksi rokotteena. Yksityiskohtaisesti määritettynä on keksinnön mukaiselle menetelmälle tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksessa. Menetelmän vaiheita selostetaan seuraavassa erikseen. A. Elinvoimaisen viruksen eristäminen ja sopeuttaminen. Vihurirokkoviruksen eristäminen ja sopeuttaminen voidaan suorittaa kananpoika-alkion kudosviljelmässä käyttäen kliinistä materiaalia tai virusta, jota on edeltäkäsin kasvatettu toisenlaisessa soluviljelmässä, kuten apinanmunuais- tai ankansikiökudosviljelmässä. Tartutettujen viljelmien inkubointi voidaan suorittaa 30-34 0C:ssa (optimi 32 C), tai 35-38 C:ssa (optimi 36 C). Edulliset eristysmenetelmät ovat seuraavat: Menetelmä 1. Vihurirokkovirus siirrostetaan grivettiapinan kudosviljelmään, jota seuraa peräkkäisiä siirtoja hedelmöitettyjen kanojen munissa, grivettiapinan munuaiskudosviljelmässä, ankansikiö-
3 43624 kudosviljelmässä ja kananpoikasikiökudosviljelmissä. Menetelmä 2. Vihurirokkovirusta siirrostetaan grivettiapinan munuaiskudosviljelmään, jota seuraa peräkkäisiä siirtoja grivettiapinan munuaiskudosviljelmissä ja kananpoika-alkion kudosviljelmässä. Menetelmä 3. Vihurirokkovirusta siirrostetaan kliinisestä materiaalista grivettiapinan munuaiskudosviljelmään, jota seuraa peräkkäisiä kulkuja ankansikiökudosviljelmässä ja kananpoika-alkion kudosviljelmässä. Menetelmä 4. Vihurirokkovirusta siirrostetaan ankansikiökudosviljelmään kliinisestä materiaalista, jota seuraa peräkkäisiä kulkuja ankansikiökudosviljelmässä ja kananpoika-alkion kudosviljelmässä. B. Heikennettyä elävää vihurirokkovirusta sisältävän rokotteen kehittäminen. Virus, jonka on vaiheessa A todettu olevan vihurirokkovirus, lisätään lasipulloihin, jotka sisältävät kananpoika-alkio-kudosviljelmää, joka on valmistettu hienoksihakatuista ja trypsinisoiduista, likimain 10 päivää vanhoista kananpoika-alkioista. Viljelmäväliaine voi olla mikä tahansa niistä, jotka suosivat solukasvua, ja tämä voi esimerkiksi olla tunnettu väliaine 199, (Morgan, J.F., Morton, H.J., ja Parker, R.C., Proc Soc. Exp. Biol. and Med., 73: 1-8, 1950), johon on lisätty vasikan seerumia. Viruksen lisäämisen jälkeen tartutetut soluviljelmät inkuboidaan peräkkäisissä sarjoissa 30-38 C:ssa ja edullisesti 30-34 C:ssa (optimi 32 C) ja 35-38 C:ssa (optimi 36 C) joko pyörittävällä, keinuttavalla tai paikallaan pysyvällä tavalla vaihtelevia ajanjaksoja, jonka aikana virus reprodusoituu suurissa määrissä ja tulee heikennetyksi. Edellä mainittu kulku suoritettiin käyttämällä laimentamatonta tai laimennettua istutusta ja monikertaisia satoja kerättiin vaihtelevin väliajoin. Titrauksia suoritettiin grivettiapinan munuaiskudosviljelmissä. Sopivin väliajoin viljelmiin lisättiin likimain 1000 TDID 50 Putkiviljelmät, jotka osoittivat viruksen poissaoloa solutautiopillisesti 3-4 päivää lisäyksen jälkeen, katsottiin vihurirokkoviruksen tartuttamiksi. Sitten virussato korjattiin ja säilytettiin jäädytettynä tai muussa alhaisessa lämpötilassa aineen injektiokyvyn säilyttämiseksi. C. Valmistus käyttöä varten. Vihurirokkovirussato, joka oli korjattu tämän toistetun sarjaviljelyn jälkeen, stabiloitiin sopivalla stabilointiaineella, kuten ruokosokeri, ihmisvalkuaisaine, glutamiini, fosfaatti ja niiden seokset. Kun viruksen voimakkuus oli todettu titraamalla, viruslähde jaet- virusta, joka osoitti interferenssiominaisuuksia (Bunyamwera jne.).
4 43624 tiin osiin ja täytettiin ampulleihin käyttöä varten. Tuotetta voidaan varastoida ja dispensoida jäätyneenä tai edullisesti kuivattuna jäätyneestä tilasta ja pidettynä kosteusvapaana. Kun sen oli havaittu olevan ei-tautia synnyttävä apinoille ja jyrsijöille, se on käyttökelpoinen kokeiltavaksi ihmisessä sen immunogeenisten ominaisuuksien määrittämiseksi. Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä. Esimerkki 1 Alkuistutus on se, joka on saatu edelläkuvatusta menetelmästä 1. Yhdeksästä kymmeneen päivän vanhoja kananpoika-alkioita jauhetaan hienoksi pään ja raajojen poistamisen jälkeen aseptisissa olosuhteissa ja jauhettua kudosta pestään useita kertoja Hanks'BSS:11ä. Pesty kudos trypsinisoidaan 36 C:ssa käyttäen 0,25 % trypsiiniä (Difco 1:250) tris-suolapuskurissa kandesta kolmeen tuntia. Trypsiini-solususpensio korjataan talteen kaksinkertaisen juustokankaan läpi ja sentrifugoidaan nopeudella 1500 r/min 5 minuuttia. Yhteenpakkautuneet solut suspensoidaan uudelleen kasvuväliaineeseen laskemista varten. Kasvuväliaine käsitti väliainetta 199, joka sisälsi 2 % agamma-vasikkaseerumia (kuumennettuna 56 C - 3 minuuttia) ja 50 mcg/ml neomysiiniä. Pulloviljelmät viljellään väkevyydessä 350 000 näkyvää solua millilitrassa.kunoninkuboitu 36 C:ssa 48-96 tuntia, voidaan pulloviljelmää käyttää sarjaviljelyä tai rokotteen valmistusta varten. Kananpoika-alkiokudosviljelmiä valmistetaan lasipulloissa käyttäen väliainetta 199, joka sisälsi 2 % inaktivoitua agamma-vasikkaseerumia kasvuväliaineena. Kolme neljä päivää istuttamisen jälkeen kasvuväliaine nostetaan tai valutetaan pois aseptisesti ja pulloviljelmiä pestään neljä kertaa Hanks # BSS:11ä, 100 ml pesua kohti ja istutetaan 2-3 ml:11a yllämainittua vihurirokkosiemenvirusta pulloa kohti. 70-100 ml väliainetta 199, mikä sisältää 10 % sopivaa infektion stabilointiainetta, lisätään kuhunkin pulloviljelmään ja pulloja idätetään 30-34 o C:ssa. Neomysiiniä väkevyydessä 50 mcg/ml lisätään kasvu- ja ylläpitoväliaineeseen. Moninkertaisia satoja kerätään määräajoin ja pulloviljelmiin lisätään uudelleen tuoretta ylläpitoväliainetta, joka sisältää yllämainittua stabilointiainetta. Kunkin sadon infektiotitrauksia suoritetaan grivettiapinan munuaiskudosviljelmässä. Kukin sato kerätään aseptisesti steriiliin säiliöön, näytteitä otetaan mikrobiologista steriilisyystutkimusta varten ja jäännös kalvojäähdytetään kuivassa jää-alkoholi-hauteessa. Virusta sisältäviä nesteitä varastoidaan -70 C:ssa sähköisesti toimivassa jäädytysyksikössä ennen sadon tai satojen valintaa rokotteen valmistusta varten. Sopiva sato tai sopivia satoja valitaan infektiotitrausten loppuunsuorittamisen jälkeen.
5 43624 Valikoitu materiaali poistetaan jäähdyttäjästä ja sulatetaan. Yksi näyte otetaan kontrollia ja varmuustestausta varten. Stabilointiainetta lisätään vielä jäljelle jäävään nesteeseen. Sitten materiaali selkeytetään ja yksi näyte otetaan apinalla suoritettavaa varmuustestausta varten. Nesteet jaetaan yksityisiin pulloihin ja kuivataan. Kuivauksen jälkeen pullot korkitetaan ja sinetöidään ja säilytetään rokotteeksi muodostamista varten, mikä tapahtuu lisäämällä steriiliä vettä. Tuotteen vaikutuksen arviointi perustuu tarttuvuuden toteamiseen soluviljelmillä. Esimerkki 2 Esimerkin 1 menetelmä suoritetaan vihurirokkoviruksen inkuboinnin tapahtuessa alueella 35-38 C ja lähellä 36 C. Enemmän kuin 10 viruksen perättäistä kulkua kananpoika-alkion kudosviljelmässä voidaan tehdä viruksen edelleen heikentämiseksi. Myös voivat sarjaviljelyt sisältää inkuboinnin grivettiapinan munuaisviljelmissä tai hedelmöitettyjen kanojen munissa. Tätä valaistaan seuraavissa esimerkeissä, joissa GMK tarkoittaa grivettiapinan munuaiskudosviljelmää EAM tarkoittaa hedelmöitettyjen kanojen munia CEF tarkoittaa kananpoika-alkiokudosviljelmää DEF tarkoittaa ankansikiökudosviljelmää. Esimerkki 3 2 GMK - 1 EAM - 9 GMK - 5 DEF (35-38 C) - 26 DEF (30-34 C) - CEF (30-34 C). Esimerkki 4 5 GMK - CEF (30-34 0C; 35-38 C). Esimerkki 5 77 GMK - 3 DEF - CEF - (30-34 C). Esimerkki 6 Kliinistä materiaalia (kurkkupesunäytteitä) - DEF-CEF (30-34 C). Esimerkki 7 5 GMK - 1 CEF - 2 DEF - CEF (30-34 C). Keksintöä on kuvattu erikoisesti käyttämällä 10 sarjakulkua CEF:n läpi viruksen heikentämiseksi, mutta on ymmärrettävää, että vähempi lukumäärä voi riittää. Täten keksintö koskee yksinkertaista inkubointia CEF:ssä sellaisen virulenssin saavuttamiseksi, mikä aiheuttaa vihurirokon vasta-ainereaktion ihmisissä vähentäen taudin muuten vakavia oireita. Peräkkäisten sarjojen ensimmäisen kasvatuksen CEF:ssä jälkeen voidaan olettaa heikentävän virulenssia edelleen.
6 Patenttivaatimus: 43621 Menetelmä vihurirokkorokotteen valmistamiseksi, joka aiheuttaa ihmisessä vasta -ainereaktion virusta vastaan aiheuttamatta vakavia kliinisiä taudin osoituksia, t u n n e t t u siitä, että se käsittää vaiheet: (1) vihurirokkoviruksen eristäminen kliinisestä materiaalista istuttamalla sitä joko kananpoika-alkion kudosviljelmään tai grivettiapinan kudosviljelmään ja inkuboimalla mainittua viljelmää 30-38 C:ssa; ja (2) mainitun viruksen heikentäminen sarjasiirrostamalla elatusaineessa riittävän monta kertaa (a) ainakin kymmenen mainituista siirroista tapahtuessa väliaineessa, joka käsittää hienoksijauhetun ja trypsinisoidun, yhdeksästä kymmeneen päivää vanhan, päättömän ja raajattoman kananpoika-alkion kudosta 30-38 C:ssa, (b) kutakin siirtoa seuraa infektiotitraukset satonäytteille, jotka on otettu 2-14 päivän väliajoin, mainittujen satojen ollessa jäädytettyinä testaukseen saakka ja jolloin ne uudelleenistutetaan ravintoväliaineeseen, jos ne ovat liian elinvoimaisia. (3) itse rokotteen valmistuksen heikennetyistä viruksista sinänsä tunnettuun tapaan.
7 43624 Patentkrav: Förfarande för framställning av ett rubellavaccin, som hos manniskan framkallar en antikroppsresponse gentemot viruset utan att orsaka de allvarliga kliniska yttringarna av sjukdomen, k ä n n e- t e c k n a t därav, att följande steg utföres: (1) isolering av rubellavirus från kliniskt material genom inokulering av detta antingen i kycklingembryovävnadskultur eller i vävnadskultur från grivettapan och inkubation av nämnda kultur vid 30-38 C; och (2) försvagning av nämnda virus genom seriepassage genom kulturmedium ett tillräckligt antal gånger, varvid (a) åtminstone tio av de nämnda passagerna sker i ett medium, som består av finmalen och trypsiniserad, nio till tio dagar gammal, halshuggen och amputerad kycklingembryovävnad vid 30-38 C. (b) var och en av passagerna följes av infektivitetstitreringar på provskördar, tagna vid 2-14 dagars mellanrum, varvid skördarna fryses tills de testas och inokuleras åter i ett kulturmedium om de är för virulenta, (3) framställning av själva vaccinet av försvagat virus på i och för sig känt sätt. Viitejulkaisuja-Anförda publikationer