Kemian Nobelin palkinto Na +, K + -ATPaasin ja ATP-syntaasin tutkijoille. Moshe Finel ja Tuomas Haltia

Transkriptio

1 NRO 24 PÄÄKIRJOIUS 1997 Kemian Nobelin palkinto Na, K -aasin ja -syntaasin tutkijoille Moshe Finel ja uomas Haltia Vuoden 1997 Nobelin kemian palkinnon saajat vasemmalta tanskalainen Jens Skou, englantilainen John Walker ja yhdysvaltalainen Paul Boyer. (Kuva: Lehtikuva Oy) Solun yleisen energiavaluutan adenosiinitrifosfaatin (:n) ja sen keskeisen aineenvaihdunnan tutkijat jakoivat vuoden 1997 Nobelin kemian palkinnon. Na,K --aasin löytäjä tanskalainen Jens Skou (s. 1918) sai puolet palkinnosta ja -syntaasin tutkijat yhdysvaltalainen Paul Boyer (s. 1918) ja englantilainen John Walker (s. 1941) jakoivat toisen puolen. Aktiivinen ihminen tuottaa massansa verran :tä päivässä, ja -molekyylin keskimääräinen elinikä solussa on alle yhden minuutin. Yli 80 % elimistön aerobisissa oloissa tuottamasta :stä syntyy mitokondrion sisäkalvolla syntaasin katalysoimassa reaktiossa energiaa ADP P i H 2 O. Elävissä soluissa -syntaasi pitää tämän reaktion kaukana tasapainotilasta. Siten hydrolyysin entsymaattinen kytkeminen johonkin toiseen reaktioon, kuten ionien kuljetukseen, saa sen etenemään suuntaan, johon se ei muuten etenisi. ähän perustuu :n käyttö solun energiavaluuttana. Boyer ja Walker ovat selvittäneet -syntaasin katalyyttistä mekanismia ja rakennetta. syntaasi koostuu kahdesta osasta F 1 ja F o, jotka taas koostuvat yhteensä vähintään kahdeksasta Duodecim 113: ,

2 Kalvopotentiaali Na, K -aasi 5070 mv P 3 Na ADP P i 2 K Solulima [K ] = 140 mμ [Na ] = 12 mμ Solukalvo Solun ulkopuolinen [K ] = 4 mμ tila [Na ] = 145 mμ K u v a 1. Skoun v löytämän Na,K -aasin toiminta solukalvossa. Entsyymi pumppaa jokaista hydrolysoimaansa -molekyyliä kohden kolme Na -ionia solusta ulos ja kaksi K -ionia solun sisään. Katalyysin aikana :n terminaalinen fosfaatti sitoutuu kovalenttisesti Na,K -A- Paasin aspartaattitähteeseen. yypillisen solun kalvopotentiaali ja elektrolyyttipitoisuudet ovat kuvan mukaiset. erilaisesta aminohappoketjusta (Boyer 1989). F 1 on liukoinen proteiinikompleksi ja -synteesin päänäyttämö. F o on integraalinen kalvoproteiini, jonka välityksellä F 1 -osa kiinnittyy kalvoon ja jonka kautta F 1 saa -synteesin vaatiman energian. Skou (1957) puolestaan keksi kalvoentsyymin, joka on tärkein yksittäinen :n käyttäjä: Na,K -aasi kuluttaa noin 25 % levossa olevan ihmisen :stä elektrolyyttitasapainon ylläpitoon. Kutakin ADP:ksi hydrolysoitunutta molekyyliä kohden aasi pumppaa kolme Na - ionia solusta ulos ja kaksi K -ionia solun sisälle. Kumpikin ioni kulkeutuu pienemmästä pitoisuudesta suurempaan, mikä ilman tapahtumaan kytkeytyvää :n hydrolyysiä olisi energeettisesti mahdotonta. Myös kuljetuksen elektrogeenisuus vaatii energiaa: jokainen kuljetussykli siirtää yhden nettovarauksen kalvon yli ja vaikuttaa kalvopotentiaalin syntymiseen (kuva 1). Skoun tulkinta ioneja kuljettavasta aasista oli aikaansa edellä, sillä kalvoproteiineista ei 1950-luvulla tiedetty juuri mitään: vallitseva käsitys oli, että solukalvo koostui lipidikaksoiskerroksesta, jonka molemmille pinnoille proteiinit kiinnittyivät. Proteiinien ei katsottu voivan läpäistä kalvoa, ja lipidien oli esitetty kuljettavan ioneja. oisaalta ionipumpun on pakko olla yhteydessä vesifaaseihin kalvon kummallakin puolella. Vasta 1972 julkaistu biologisten kalvojen nestemosaiikkimalli (Singer ja Nicolson 1972) oli sopusoinnussa kalvopumppujen olemassaolon kanssa. Nestemosaiikkimallissa kalvoproteiinien rasvaliukoiset osat ovat kosketuksissa lipidikaksoiskerroksen öljymäisen ydinosan kanssa, kun taas proteiinien liukoiset osat ovat lipidikalvon kummallakin pinnalla. Näin integraaliset, kalvon läpäisevät membraaniproteiinit voivat tarjota vesiliukoisille substraateille, kuten Na - ja K -ioneille, säännellyn kulkureitin kalvon läpi. Skoun ensimmäistä julkaisua seurasivat raportit lukuisista laboratorioista, ja Århusin yliopistoon anskaan muodostui vilkas aasien tutkimukseen keskittynyt koulukunta (Skou ja Esmann 1992). Vuosien mittaan on osoittautunut, että suuri joukko kalvoproteiineja sekä eukaryooteissa että prokaryooteissa on sukua Na,K - aasille. ämä ionipumppuperhe tunnetaan nimellä P-tyypin aasit, koska katalyysissä :n terminaalinen fosfaatti sitoutuu kovalenttisesti entsyymin tiettyyn aspartaattitähteeseen. Yli sadan P-tyypin aasin aminohappojärjestykset tunnetaan, ja huomattavimpia ionipumppuperheen jäseniä ovat Ca 2 -aasi, H,K -A- Paasi, H -aasi ja Cu -aasi. Afrikassa nuolimyrkkynä käytetty kasvisteroidijohdos ouabaiini eli g-strofantiini on Na,K - aasien spesifinen estäjä. Muut digitalisalkaloidit vaikuttavat ouabaiinin tavoin sitoutumalla pumpun solun ulkoiseen osaan ja estävät entsyymin Na -aktivaation. Na,K -aasin esto aiheuttaa solunsisäisen Na -pitoisuuden kasvun, mistä seuraa Na /Ca 2 -vaihtokuljettajan aktivaatio ja kalsiumpitoisuuden suureneminen sydänlihassoluissa. ähän perustuu digitaliksen sydämen supistuskykyä lisäävä vaikutus (Skou ja Esman 1992). Mahalaukun happamuuden aiheuttaa Na,K -aasin lähisukulainen, parietaalisolun H,K -aasi. Yksi maailman eniten myytyjä reseptilääkkeitä on omepratsoli, mahalaukun 2504 M. Finel ja. Haltia

3 H,K -aasin estäjä, jota käytetään ulkus- ja refluksitaudin hoidossa sekä osana Helicobacter pylori -infektion hoitoa (Paakkari 1995). Lääketieteellisesti mielenkiintoisia ovat myös ihmisen kaksi kuparia kuljettavaa Cu -aasia, joita koodaavien geenien mutaatiot aiheuttavat Menkesin ja Wilsonin taudit (anzi ym. 1993). Huolimatta vuosikymmeniä kestäneen vilkkaan tutkimustyön tuloksena syntyneestä valtaisasta tietomäärästä yhdenkään P-tyypin aasin katalyyttistä mekanismia ei ymmärretä yksityiskohtaisesti. Keskeinen kysymys on, kuinka :n kemiallinen energia siirtyy entsyymin aspartaattitähteen fosforylaation kautta ionien pumppaukseen»ylämäkeen», pienemmästä pitoisuudesta suurempaan. ähän kysymykseen ei pystytä vastaamaan tyhjentävästi ilman kolmiulotteista suuren erotuskyvyn rakennemallia, jonka määrittäminen on yksi tulevaisuuden haasteista. Paul Boyer, Kalifornian yliopiston biokemian emeritusprofessori Los Angelesista, julkaisi luvulla ensimmäiset tutkimuksensa mitokondrioiden -synteesistä (Boyer ym. 1954). Jo näissä töissä Boyerilla oli käytössään oivalliseksi osoittautunut työväline: isotoopit, erityisesti 18 hapella merkityt fosfaatti ja vesi. Isotooppitutkimuksiin antoi virikkeen yhdysvaltalaisen Mildred Cohnin (1953) havainto soluhengityksen katalysoimasta epäorgaanisen fosfaatin ja veden happimolekyylien vaihtoreaktiosta. Näin alkoi elegantti tutkimuslinja, jonka tuloksena hahmottui vähitellen kuva -syntaasin katalyysin olennaisista ja osin ainutlaatuisista piirteistä. Boyer aloitti työnsä ennen kuin britti Peter Mitchell oli esittänyt soluhengityksen yleistä mekanismia koskevan kemiosmoottisen teoriansa v Mitchellin mukaan ravintomolekyyleistä saadut pelkistävät ekvivalentit kulkeutuvat hengitysketjussa hapelle, joka pelkistyy vedeksi. Hengityskompleksit käyttävät osan vapautuvasta energiasta vetyionien (protonien) siirtämiseen lipidikalvon yli; tuloksena on protonien sähkökemiallinen potentiaaliero, protonimotorinen voima. Protonit palaavat kalvon sisäpuolelle -syntaasin kautta, joka käyttää protonien sähkökemiallista energiaa -synteesiin. Mitchellin teoria tuli yleisesti hyväksytyksi 1970-luvun loppuun mennessä ja Mitchell sai Nobelin kemian palkinnon Boyerin pitkän uran intellektuaalisesti hedelmällisin jakso alkoi 1970-luvulla, jolloin hän pystyi kokoamaan ennen kaikkea omien tutkimustensa mutta myös muiden kokeellisten töiden tulokset kattavaksi hypoteesiksi -syntaasin mekanismista (Boyer 1989). Boyer on muotoillut seuraavat kolme syntaasiin liittyvää käsitettä: 1) -synteesissä energiaa vaativa askel ei ole :n muodostuminen syntaasin aktiivisessa keskuksessa, vaan :n vapautuminen (Boyer ym. 1973). 2) syntetisoituu vuorottelevissa aktiivisissa keskuksissa (Kayalar ym. 1977). Kohdat 1 ja 2 yhdessä tunnetaan nimellä»binding change mechanism», jonka mukaan synteesi tapahtuu kolmessa eritilaisessa keskuksessa (kuva 2 A). Näistä yksi sitoo -molekyylin tiukasti, toinen ADP:n ja fosfaatin ja kolmas on tyhjä. Kaksi ensimmäistä voivat muuttua toisikseen ilman ulkoa tulevaa energiaa, mutta siirtyy liuokseen vain ulkopuolisesta energiasta riippuvan konformaatiomuutoksen jälkeen. Katalyysissä kukin keskus käy läpi kaikki kolme tilaa. 3) 1980-luvun alussa Boyer esitti ns. rotaatiokatalyysihypoteesin: kukin aktiivinen keskus muuttuu toiseksi 120 asteen kiertoliikkeessä, jonka saa aikaan protonimotorinen voima. Jokainen keskus tuottaa vuorollaan molekyylin (kuvat 2 A ja B). ämän hypoteesin osoittaminen ratkaisemalla F 1 -osan kolmiulotteinen rakenne toi Nobelin palkinnon John Walkerille. Medical Research Councilin molekyylibiologian laboratoriossa Cambridgessä Englannissa työskentelevä Walker on nuorin palkituista. Hän aloitti suoraviivaisesti -syntaasin tutkimisen uusimpia molekyylibiologisia ja proteiinikemiallisia menetelmiä käyttäen ja 1980-lukujen taitteessa. Hänen laboratorionsa määritti ensimmäisenä E. coli -bakteerin -syntaasin geenien emäsjärjestyksen. ässä työssä oli keskeisesti mukana suomalainen Matti Saraste (Walker ym. 1984). Rinnan molekyylibiologisen työn kanssa Walkerin laboratoriossa haaveiltiin jo yli viisitoista vuotta sitten -syntaasin kiteyttämisestä sen kolmiulotteisen rakenteen määrittämiseksi. Saraste aloitti -syntaasin kiteytyskokeet kesällä Yritykset eivät kuitenkaan useisiin vuosiin tuottaneet tarpeeksi järjestyneitä ja kookkaita ki- Vuoden kemian Nobelin palkinto Na, K -aasin ja -syntaasin tutkijoille 2505

4 L O ADP P i ADP P i L O Protonimotorinen voima ADPP i L O H 2 O L O A H 2 O ADP P i F 1 γ Kiertoliike F 0 Kalvo B 34 H C K u v a 2. A) -syntaasin»binding change mechanism» (Boyer 1989), jonka mukaan jokainen syntaasin kolmessa - alayksikössä olevista aktiivisista keskuksista käy katalyysin aikana läpi kolme eri tilaa: O (»open» eli tyhjä keskus), L (»loose» eli substraatit ADP:n ja P i :n löyhästi sitova) sekä (»tight», tiukasti :n sitova). :n irtoaminen eli aktiivisen keskuksen muutos tilasta tilaan O vaatii energiaa (protonien sähkökemiallisen potentiaalieron eli protonimotorisen voiman muodossa). Entsyymiin sitoutuneen ADP:n ja P i :n muuttuminen :ksi silloin, kun jälkimmäinen pysyy entsyymiin sitoutuneena, ei vaadi energiaa. Kunakin hetkenä voi vapautua liuokseen vain yhdestä keskuksesta. B) -syntaasin rakenne ja pyörimiskatalyysi. -syntaasi koostuu liukoisesta osasta (F 1 ) ja kalvon läpäisevästä osasta (F o ), joista jälkimmäinen muuntaa protonimotorisen voiman γ-alayksikön pyörimisliikkeen välityksellä -alayksikköjen aktiivisten keskusten konformaatiomuutoksiksi. γ-alayksikön kulloinenkin asento määrää kunkin aktiivisen keskuksen tilan (O, L tai ). Yhden -molekyylin synteesi vaatii kolmen tai neljän protonin kulkua F o :n läpi ja tästä seuraavaa γ-alayksikön 120 asteen kiertoliikettä. C) F 1 -osan kolmiulotteinen rakenne (Abrahams ym. 1994). -alayksiköt on esitetty punaisina, :t keltaisina ja keskellä oleva kierteinen γ sinisenä. F o sitoutuu γ:n alaspäin osoittaviin kierteisiin, eli kalvon taso on kuvan alareunassa paperin tasoon nähden kohtisuorassa. Syntaasin kolme aktiivista keskusta ovat -alayksiköissä lähellä rajapintaa. -synteesissä γ pyörii ja välittää protonimotorisen voiman energian kuhunkin aktiiviseen keskukseen. Entsyymiin sitoutuneet nukleotidit on esitetty pallo- ja tikkumalleilla. Kuva: John E. Walker M. Finel ja. Haltia

5 teitä. Vasta 1980-luvun lopulla hollantilaisen Rene Lutterin useiden vuosien sitkeä yritys alkoi tuottaa tulosta. Silti vielä kesällä 1992 John Walkerin esitelmöidessä Helsingissä kiteiden käyttökelpoisuus oli epävarmaa. Läpimurto seurasi pian tämän jälkeen: 1993 Walker työtovereineen aiheutti kohahduksen tiedeyhteisössä julkaisemalla liukoisen osan rakennemallin, jonka erotuskyky oli 6.5 Å (Abrahams ym. 1993) ja runsasta vuotta myöhemmin suuren erotuskyvyn (2.8 Å) rakennemallin (Abrahams ym. 1994) (kuva 2 C), joka oli julkaisemisen aikaan suurin tunnettu epäsymmetrinen molekyylirakenne (molekyylipaino 371 kd). Rakenne todentaa kauniisti Boyerin postulaatit: kaikki kolme aktiivista keskusta ovat eri tilassa. Yksi on tyhjä, toisessa on sitoutuneena ADP ja kolmannessa hydrolysoitumaton -analogi, jota käytettiin kiteytyksen aikana kaikkien entsyymimolekyylien saamiseksi samaan tilaan. Rakennemäärityksen valmistuttua oli myös ilmeistä, että Boyerin rotaatiokatalyysimalli ei ole ristiriidassa rakenteen kanssa. Päinvastoin rakenne viittasi vahvasti siihen, että protonimotorisen voiman indusoima γ-alayksikön pyörimisliike muuttaa protonien sähkökemiallisen energian :n kemialliseksi energiaksi (kuvat 2 B ja C). Kuluneiden kolmen vuoden aikana useat tutkimusryhmät ovat Walkerin rakennemallia hyväksikäyttäen eri menetelmin vahvistaneet :n hydrolyysin aiheuttaman katalyyttisen osan ja γ-alayksikön välisen pyörimisliikkeen -syntaasissa, ja rotaatiokatalyysimekanismia voidaan pitää toteen näytettynä. Miten protonimotorinen voima saa aikaan γ- alayksikön pyörimisliikkeen? Mikä on kalvossa olevan F o -osan rakenne? Ainakin nämä kaksi -syntaasiin liittyvää perusluonteista kysymystä odottavat yhä vastaustaan. Vastausten antaja voi olla vahvoilla, kun tulevia Nobelin palkintoja jaetaan. Kirjallisuutta Abrahams J P, Leslie A G W, Lutter R, Walker J E: Structure at 2.8 of F 1 -ase from bovine heart mitochondria. Nature 370: , 1994 Abrahams J P, Lutter R, odd R J, ym.: Inherent asymmetry of the structure of F 1 -ase from bovine heart mitochondria at 6.5 Å resolution. EMBO J 12: , 1993 Boyer P D: A perspective of the binding change mechanism for synthesis. Faseb J 3: , 1989 Boyer P D, Cross R L, Momsen W: A new concept for energy coupling in oxidative phosphorylation based on a molecular explanation of the oxygen exchange reactions. Proc Natl Acad Sci USA 70: , 1973 Boyer P D, Falcone A B, Harrison W H: Reversal and mechanism of oxidative phosphorylation. Nature 174: , 1954 Cohn M: A study of oxidative phosphorylation with O 18 -labeled inorganic phosphate. J Biol Chem 201: , 1953 Kayalar C, Rosing J, Boyer P D: An alternating site sequence for oxidative phosphorylation suggested by measurement of substrate binding patterns and exchange reaction inhibitions. J Biol Chem 252: , 1977 Paakkari I: Ruuansulatuskanavan toimintaan vaikuttavat lääkeaineet. Kirjassa: Pelkonen O, Ruskoaho H: Farmakologia ja toksikologia, s Duodecim, Helsinki 1995 Singer S J, Nicolson G L: he fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science 175: , 1972 Skou J C: he influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves. Biochim Biophys Acta 23: , 1957 Skou J C, Esmann M: he Na, K-ase. J Bioenerg Biomembr 24: , 1992 anzi R E, Petrukhin K, Chernov I, ym.: he Wilson disease gene is a copper transporting ase with homology to the Menkes disease gene. Nature Genet 5: , 1993 Walker J E, Saraste M, Gay N J: he unc operon. Nucleotide sequence, regulation and structure of -synthase. Biochim Biophys Acta 768: , 1984 MOSHE FINEL, dosentti, assistentti UOMAS HALIA, dosentti, Suomen Akatemian nuorempi tutkija Helsingin yliopiston biolääketieteen laitos, lääketieteellisen kemian osasto Siltavuorenpenger Helsingin yliopisto Vuoden kemian Nobelin palkinto Na, K -aasin ja -syntaasin tutkijoille 2507