POLYMORFI. ISSN: (pdf)

Transkriptio

1 POLYMORFI 2005 ISSN: (pdf)

2 Fysikaalisen farmasian XVI vuosittainen symposium: NIUKKALIUKOISET LÄÄKEAINEET Tuohilampi OHJELMA 9.30 Tero Närvänen symposiumin avaus 9.40 Martti Ovaska Niukkaliukoisuus tutkimuksen perspektiivistä Amie Kaukonen Niukkaliukoisten lääkeaineiden formulointi Vesa-Pekka Lehto & Mikko Koivisto Amorfisuuden määritysmenetelmät posteriesittelyt lounas Sabir Mirza Modification of erythromycin by solid dispersions and crystal engineering Tarja Toropainen Syklodekstriiniapuaineen käyttö inhaloitavissa lääkevalmisteissa kahvi Juha Juntunen Aihiolääkkeet kannabioidien liukoisuuden parantajina Hannele Eerikäinen Lääkenanohiukkaset: sovelluksia ja valmistusmenetelmiä symposiumin päätös FYSIKAALISEN FARMASIAN YHDISTYKSEN VUOSIKOKOUS vaihtoehtoisesti vapaata keskustelua, virvokkeita ja kotavisiitti halukkaille illallinen

3 POLYMORFI 2005 FYSIKAALISEN FARMASIAN YHDISTYKSEN JÄSENLEHTI XVI symposiumin ohjelma Sisällys Päätoimittajalta Esitysabstraktit Solubility in drug discovery Formulation of poorly soluble compounds Quantification of amorphous solids Modification of erythromycin by solid dispersions and crystal engineering Cyclodextrins in pulmonary drug delivery Water soluble prodrugs of cannabinoids Nanoparticles: applications and methods of manufacture Posteriabstraktit Characterization of potential non-erosive oral drug delivery systems: mesoporous MCM-41 and silicon powders Correlation between texture and tabletting properties of some pharmaceutical tablets.. 28 Development of new spraying system for microscale fluid bed granulator using electrostatic tomization Effect of electron withdrawing substituents on the acidity of p-vinylphenols through a vinylic double bond a comparison of calculated and experimental pk values a Hydrate screening application of cluster analysis to Raman spectra of nitrofurantoin crystals Mesoporous silicon microparticles enhanced solubility of poorly soluble drugs Oral controlled release of saccharides Raman spectroscopy for quantification of amphetamine in seized samples Ultrasound studies for starch acetate tablets Use of thermoanalytical methods in quantification of drug load in mesoporous silicon microparticles Osallistujat Päätoimittaja: Mikko Koivisto, Turun yliopisto [email protected] Julkaisija: Fysikaalisen farmasian yhdistys ry

4 POLYMORFI 2005 FYSIKAALISEN FARMASIAN YHDISTYKSEN JÄSENLEHTI Gradutiivistelmät Aseptisen valmistusmenetelmän validointi β-sitosterolin faasitransitioiden kinetiikan röntgendiffraktometrinen ja kalorimetrinen tutkimus Beta-sitosterolin kiteytyminen eri liuottimista Caco-2 solulinjan karakterisointi FDA:n malliyhdisteillä Ennustavat ja korreloivat laskennalliset menetelmät lääkevalmistekehityksessä: keinotekoiset neuroverkot, monimuuttuja-analyysit ja asiantuntijajärjestelmät In vitro -ihopermeaatiotutkimuksissa käytettävät mallimembraanit Isotermisen mikrokalorimetrin liukenemislaitteiston validointi ja mittauksia Jauheinhalaatiot ja niiden farmaseuttinen kehitys Karbamatsepiinin polymorfiasta Lääkevalmisteissa käytettävien biohajoavien polymeerien turvallisuuden tutkiminen.. 48 Nanopartikkelit lääkeaineiden kohdentajina N-heksaanin, 1-hekseenin, 1-heksyynin, 1-dekeenin ja undekyleenihapon soveltuvuus lääkeaineella ladatun huokoisen piin termiseen hydrosilylaatioon Nopeasti hajoavan tablettivalmisteen kehittäminen kahdelle suuriannoksiselle lääkeaineelle 51 Tablet disintegration: Effect of temperature and ph of aqueous disintegrating fluid and influence of properties of diluent on the behaviour of superdisintegrants The effect of different granulators on the properties of granules and tablets Uusien lääkeainemolekyylien imeytymisen arviointi ja oligopeptiditransportteri PepT1. 54 Virusten ja DNA-plasmidien annostelu nano- ja mikropartikkelien avulla Lisensiaatintutkimustiivistelmät Melting behaviour and quantification of low amorphous levels in sugars and sugar alcohols 57 Tablettien tekstuuritutkimus - uusia suuntauksia farmaseuttiseen fysiikkaan Väitöskirjatiivistelmät Increasing process understanding of wet granulation by spectroscopic methods and dimension reduction tools Role of exogenous and cell curface glycosaminoglycans in non-viral gene delivery Starch acetate as a coating polymer for oral extended release products film-forming ability, permeability and plasticization Starch-acetate films and microparticles degradation, erosion and drug release in vitro. 66 Artikkeli PAT ja fysikaalinen farmasia Fysikaalisen farmasian yhdistyksen tukijat Päätoimittaja: Mikko Koivisto [email protected] Julkaisija: Fysikaalisen farmasian yhdistys ry

5 PÄÄTOIMITTAJALTA Hyvät yhdistyksen jäsenet ja XVI symposiumin osallistujat Kädessäsi (tai ruudullasi) on erikoispaksu Fysikaalisen farmasian yhdistyksen jäsenlehti Polymorfi. Luettavanasi on seitsemänkymmentä sivua tiukkaa asiaa fysikaalisen farmasian eri osa-alueilta. Tämän Polymorfin paksuus johtuu siitä, että tästä numerosta päätettiin tehdä myös Fysikaalisen farmasian XVI vuosittaisen symposiumin abstraktikirja. Tavanomaisten gradu-, lisensiaatintutkimusja väitöskirjatiivistelmien lisäksi luettavanasi on myös symposiumissa kuultavien ja nähtävien esitysten ja posterien abstraktit. Onpa mukana myös yksi artikkelikin. Tämä Polymorfi tullaan symposiumin jälkeen julkaisemaan elektronisessa muodossa Fysikaalisen farmasian yhdistyksen kotisivuilla osoitteessa Elektronin versio on värillinen, ja lehdessä olevat verkko- ja sähköpostilinkit toimivat lisäksi sisällysluettelon otsikoita klikkaamalla pääsee suoraan ao. tiivistelmään. Tämänkertaisessa numerossa ei ole salasanasuojausta, vaan se on vapaasti kaikkien luettavissa. Siitä huolimatta muistakaa maksaa jäsenmaksunne. Yhdistyksen kotisivuja kannattaa muutenkin seurata aina välillä. Fysikaalisen farmasian symposium kokoaa vuosittain yhteen alan kotimaiset huippuosaajat. Symposiumin tieteellinen ohjelma koostuu eripituisista suullisista esityksistä sekä posterisessiosta. Ohjelman löydät tämän lehden toiselta sivulta. Muistakaa, että tieteellisen ohjelman lisäksi symposiumin epävirallisissa osuuksissa on loistavat mahdollisuudet keskusteluun sekä uusien kontaktien ja yhteistyökuvioiden luontiin. Vapaamuotoinen keskustelu ja rentoutuminenkaan ei missään nimessä ole kiellettyä. Tänä vuonna symposium järjestetään Orion Pharman tarjoamissa tiloissa Vihdin Tuohilammella. Tästä johtuen perinteinen illallisbuffet on vaihtunut ihan oikeaksi illalliseksi. Mutta ei hätää: virvokkeet eivät lopu tänäkään vuonna. Hyvää sympparia ja antoisia sekä opettavaisia lukuhetkiä! Turussa Mikko Koivisto 5

6 ESITYSABSTRAKTIT 6

7 SOLUBILITY IN DRUG DISCOVERY Martti Ovaska Orion Pharma, P.O. Box 65, FI Espoo, Finland Solubility is one of the basic properties of compounds which deserve careful attention during the discovery process of new drug candidates. The thermodynamic solubility of a solid compound is the amount of the compound in a saturated aqueous solution in equilibrium with the most stable crystal form of the material. It is represented usually as log(s), where S is the concentration in mol/l. It is important to make a difference between solubility and rate of dissolution. For a solid, the thermodynamic solubility reflects the true solubility of the most stable crystal form; therefore, the solubility is not affected by the crystal form. Different crystal forms may have considerably different dissolution rates. Experimental solubility may depend strongly on ph, temperature and the purity of the sample. The equation (1) of Meylan and Howard [1] correlates the solubility with the octanol/water partition coefficient log(p o/w ) and the molecular weight MW of the compound. The term Σf i is a sum of structure dependent correction factors. log(s) = log(p o/w ) MW + Σf i (1) Equation (1) shows that both increasing the lipophilicity log(p o/w ) of a compound by one unit and increasing the molecular weight by 100 decreases solubility by about 0.8 log unit. Analysis of marketed oral drugs and oral drugs in different clinical development phases (data up to January 2000) gave two main results [2]. Firstly, the mean molecular weight of orally administered drugs in development decreases gradually on passing through each of the different clinical phases (MW(PI) > MW(PII) > MW(PIII) > MW(marketed drugs)). Secondly, the compounds discontinued from a particular phase have higher log(p) than compounds progressed into the next phase of development. It has been also estimated that the average molecular weight and lipophilicity of the screening compounds in drug discovery phase have increased. The commonly used new technologies such as parallel and combinatorial chemistry and extensive use of commercial screening compound libraries in the discovery phase have contributed to this trend. Typical solubility range of marketed oral drugs in log units is between -1 and -5 (from 30 mg/ml to 3 µg/ml when molecular weight is 300). The solubility, permeability and potency are interrelated. Figure 1 depicts graphically a rule of thumb for the minimum acceptable solubility as a function of clinical potency (projected dose) and intestinal permeability [3]. Figure 1. Minimum acceptable solubility (in µg/ml). The bars show the minimum solubility for low, medium, and high permeability (Ka) at a clinical dose. The middle three bars are for a 1 mg/kg dose. With medium permeability, a solubility of 52 µg/ml is required (from reference [3]). 7

8 During the drug discovery process the properties of the compounds under development, such as solubility, absorption, metabolism, potency and safety, must be optimised simultaneously. As these properties are mainly independent of each other the task is to find the common structural space where each of the properties is optimal. This is shown schematically in Figure 2. Figure 2. The optimal properties cover different areas of the structural space. During compound optimisation the overlapping area, as denoted here by a star, is search for. Computational models are used to predict the general drug-likeness of compounds. Typical models include Lipinski rule-of-five, solubility models, membrane permeability models, blood-brain barrier penetration models, metabolic stability models (e.g. CYP s and glucuronidation) and safety models (e.g. HERG and potentially toxic fragments). There is a number of solubility models reported in the literature. The most commonly used commercially available solubility prediction software include QikProp (Schrödinger), ACD/Solubility (ACD/Labs) and DS Accord for Excel ADME add-on (Accelrys Ltd.). One can expect an average accuracy of about one log unit with any of these models. In early discovery phases computational models are used in the design of the first screening libraries which may be purchased or synthesised in-house. In the hit-to-lead optimisation process models are used in parallel with experimental studies in the simultaneous optimisation of both the druglikeness and potency. A good lead is amenable to easy formulation and has good chances to survive through the later preclinical and clinical phases of development. REFERENCES [1] W.M. Meylan and P.H. Howard, Perspect. Drug Discov. Des. 19 (2000) [2] M.C. Wenlock, R.P. Austin, P. Barton, A.M. Davis, and P.D. Leeson, J. Med. Chem. 46 (2003) [3] C. Lipinski, Aqueous Solubility in Discovery, Chemistry, and Assay Changes. In Drug Bioavailability: Estimation of Solubility, Permeability, Absorption and Bioavailability. Ed. H. van de Waterbeemd, H. Lennemas, and P. Artursson. Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2003, p

9 FORMULATION OF POORLY SOLUBLE COMPOUNDS Ann Marie (Amie) Kaukonen Viikki Drug Discovery Technology Center, Division of Pharmaceutical Technology, Faculty of Pharmacy, University of Helsinki Due to the present hit-to-lead selection process the formulator is likely to meet increasing numbers of candidate drugs with poor aqueous solubility hence running the risk of poor oral bioavailability. Classically compounds have been regarded poorly soluble when their aqueous solubility has been less than 100 µg/ml. There is, however, not one particular limiting solubility, but the potential for solubility (or dissolution) to present itself as the limiting step for oral absorption is determined by the triad of dose (i.e. potency and metabolic stability), solubility and permeability [1,2]. This concept is evident also in the Biopharmaceutical Classification System (BCS) where oral absorption potential is classified according to the permeability and the dose-based solubility of a compound [3]. Compounds classified according to the BCS as belonging to class II (high permeability, low solubility) are likely to exhibit solubility or dissolution rate limited absorption, since the amount permeating will be limited by the amount (concentration) of compound available. However, the BCS is based on solubility in aqueous buffers, which for lipophilic compounds may gravely underestimate their solubility in small intestinal fluids containing bile salts and phospholipids [4,5]. This should be kept in mind especially with highly lipophilic compounds, which derive relatively higher benefits from solubilisation into the mixed micelles (higher solubilisation ratio) [6]. Among the reasons for poor aqueous solubility of a molecule are low polarity/high hydrophobicity, high lipophilicity and/or high crystal energy [2]. The reason/s for poor solubility will impact on the feasibility of a particular formulation strategy as will the dose that needs to be incorporated into the formulation. Awareness of the dissolution process as presented in the modified Noyes-Whitney equation will provide insights to the means available for improving the dissolution rate of poorly soluble compounds [7]. J = dm dt = D A (C h s C b ) = K A (C s C b ) J = amount of material dissolved and transported across stagnant diffusion layer per unit time D = diffusion coefficient (diffusivity) h = thickness of stagnant/unstirred diffusion layer A = surface area of dissolving solid K = dissolution rate constant C s = concentration in saturated diffusion layer C b = concentration in bulk solution Based on the above, the two main approaches for improving dissolution are to increase the surface area by reduction of particle size and to improve the (apparent/local) solubility of the compound. The implementation of a particular approach may involve physical, mechanical, chemical and/or formulation (excipient) based strategies as illustrated in the following table (Table 1) [7-16]. 9

10 Table 1. Strategies to improve the oral absorption of compounds having solubility or dissolution limited absorption Approach Chemical Physical Formulation Excipient Particle size - Micronisation - Engineering Crystal habit Increase A Wetting Soluble excipients & Wetting agents - sugars - co-solvents - surfactants - polymers Salt form Pro-drug Buffering agents Increase C s Physical state - Amorphous - Polymorph - Pseudopolymorph/solvate Solubilisation - Micellar - Co-solvent - Complexing Surfactants Co-solvents Polymers Cyclodextrins Increase A & Increase C s Solutions, microparticulate and/or amorphous state Solutions or dispersions in carriers Co-solvents Polymers Lipids Emulsifying Mixtures of above Complexation Cyclodextrins (Calixarenes) REFERENCES [1] C. A. Lipinski, F. Lombardo, B. W. Dominy, and P. J. Feeney. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv. Drug Del. Rev. 23: 3-25 (1997) [2] C. A. Lipinski. Drug-like properties and the causes of poor solubility and poor permeability. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 44: (2000) [3] G. L. Amidon, H. Lennernas, V. P. Shah, and J. R. Crison. Theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability. Pharmaceutical Research 12: (1995) [4] D. Hörter and J. B. Dressman. Influence of physicochemical properties on dissolution of drugs in the gastrointestinal tract. Adv. Drug Delivery Rev. 25: 3-14 (1997) 10

11 [5] W. N. Charman, C. J. H. Porter, S. Mithani, and J. B. Dressman. Physicochemical and physiological mechanisms for the effects of food on drug absorption: The role of lipids and ph. J. Pharm. Sci. 86: (1997) [6] T. S. Wiedmann and L. Kamel. Examination of the solubilization of drugs by bile salt micelles. J Pharm Sci 91: (2002). [7] C. Leuner and J. Dressman. Improving drug solubility for oral delivery using solid dispersions. Eur J Pharm Biopharm 50: (2000) [8] B. C. Hancock and G. Zografi. Characteristics and significance of the amorphous state in pharmaceutical systems. J Pharm Sci 86: 1-12 (1997) [9] L. Yu. Amorphous pharmaceutical solids: preparation, characterization and stabilization. Advanced Drug Delivery Reviews 48: (2001) [10] L.-F. Huang and W.-Q. T. Tong. Impact of solid state properties on developability assessment of drug candidates. Advanced Drug Delivery Reviews 56: (2004) [11] D. Singhal and W. Curatolo. Drug polymorphism and dosage form design: a practical perspective. Advanced Drug Delivery Reviews 56: (2004) [12] A. T. M. Serajuddin. Solid dispersion of poorly water-soluble drugs: Early promises, subsequent problems, and recent breakthroughs. J Pharm Sci 88: (1999) [13] W. N. Charman. Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery - some emerging concepts. J. Pharm. Sci 89: (2000) [14] C. W. Pouton. Lipid formulations for oral administration of drugs: non-emulsifying, selfemulsifying and self-microemulsifying drug delivery systems. Eur. J. Pharm. Sci. 11: S93- S98 (2000) [15] T. Loftsson and M. E. Brewster. Pharmaceutical applications of cyclodextrins. 1. Drug solubilization and stabilization. J Pharm Sci 85: (1996) [16] V. M. Rao and V. J. Stella. When can cyclodextrins be considered for solubilization purposes? J Pharm Sci 92: (2003) 11

12 QUANTIFICATION OF AMORPHOUS SOLIDS Vesa-Pekka Lehto & Mikko Koivisto Laboratory of Industrial Physics, Department of Physics, University of Turku, FI Turku ABSTRACT Almost all the solid materials from metals to proteins can exist in amorphous forms. The amorphous material differs from its crystalline counterpart in that the atoms, ions or molecules comprising the solid material does not occupy space according to any three-dimensional systematic crystal structure but the long-range order between the atoms/ions/molecules is missing. The material is in a disordered state. The difference between the amorphous solid and the corresponding liquid is in the viscosity. As the mutual motions of atoms/ions/molecules is restricted in the amorphous solid its viscosity is higher. The overriding issues for pharmaceutical amorphous solids are the physico-chemical properties, stability and bioavailability. The importance of amorphous solids derives its origin from their useful properties (higher solubility, higher dissolution rate, better compression characteristics), common occurrence (can be produced deliberately or inadvertently e.g. during powder processing) and instability (physical and chemical) relative to corresponding crystals. Thus, it is normally of utmost importance to be able to quantify small degrees of amorphicity and hence ascertain the manufacturability and performance of the solid dosage form. The main topics discussed here involve the structural, thermodynamic and kinetic background of amorphous solids. The theoretical approach is elementary to understand the results obtained when utilized various techniques; the information from different sources is of different type and not on the same line. In the oral presentation it will be concentrated on the potential methods suitable to quantify amorphicity. AMORFISUUS Jäähdytettäessä lasia (aineen amorfinen muoto) muodostavaa materiaalia on jäädytysprosessi liian nopea, jotta kiteytyminen tapahtuisi. Tämä saattaa johtua siitä, että jäähdytys on äärimmäisen nopea (metallit) tai että molekyylien koosta ja muodosta johtuen kiteytymisprosessi ei ole suosiollinen (polymeerit, proteiinit). Tällöin jäähdytettäessä materiaali sulamispisteensä T m alapuolelle ei havaita entalpian eikä tilavuuden muutoksessa epäjatkuvuutta. Systeemi on muodostanut siis alijäähtyneen nesteen. Jäähdytettäessä alijäähtynyttä nestettä edelleen pyrkii systeemi normaalisti jollain alijäähtymisasteella kiteytymään joko stabiiliksi tai metastabiiliksi kiinteäksi aineeksi. Jossain tapauksissa (materiaalista riippuen) voi kuitenkin käydä niin, että kiteytyminen on kineettisesti estynyt. Tämä johtuu siitä, että molekyylien liikkuvuus (mobiliteetti) on tullut liian alhaiseksi johtuen viskositeetin kasvusta, jolloin aine ei voi molekyylien uudelleenjärjestymisten kautta kiteytyä eikä toisaalta myöskään omata alijäähtyneen nesteen rakennetta. Materiaali jää siis lasimaiseen tilaan, missä molekylaarinen rakenne on jähmettynyt. Transitiota kutsutaan lasisiirtymäksi ja sen lämpötilaa lasisiirtymälämpötilaksi T g. Lasisiirtymässä (muutos alijäähtynyneestä nesteestä lasitilaan lämpötilaa laskettaessa) molekyylien väliset sidokset eivät oleellisesti muutu, vaan molekyylien translaatioja rotaatioliike pienenevät dramaattisesti ja jäljelle jää pääosin vain molekyylinen värähdysliike. Lasisiirtymää voidaan täten karakterisoida lämpökapasiteetin C p askelmaisella muutoksella, joka puolestaan on entalpian H osittaisderivaatta lämpötilan T suhteen (C p = ( H/ T) p ). Havaitaan, että transitio riippuu molekyylien mobiliteetista eikä siihen liity lämmön vaihtumista; transitio ei ole termisesti aktiivinen. LASITRANSITIO Lasisiirtymää ja sen luonnetta voidaan tarkastella monen eri lähestymistavan avulla, eikä yksittäistä yleistä ilmiötä selittävää teoriaa ole vieläkään hyväksytty. Eräs tapa on tarkastella lasisiirtymää termodynaamisena toisen kertaluvun faasitransitiona, missä Gibbsin energian ensimmäiset osittaisderivaatat lämpötilan ja paineen suhteen ovat nollat, mutta toiset osittaisderivaatat poikkeavat nollasta 12

13 (transition yhteydessä ei tapahdu entalpian eikä tilavuuden muutosta). Koska kuitenkin T g on riippuvainen jäähdytysnopeudesta eikä lasitila ole termodynaaminen tasapainotila, ei lasisiirtymän kohdalla voida kuitenkaan puhua ideaalisesta toisen kertaluvun transitiosta. Toinen termodynaaminen lähestymistapa on tarkastella systeemin entropiaa S, joka tasapainotilassa on yhteydessä ominaislämpökapasiteettiin yhtälön C p = T ( S/ T) p kautta. Koska sekä lasitilassa (T < T g ) että kiteisessä tilassa olevan materiaalin lämpökapasiteetit aiheutuvat lähinnä molekyylien värähdysliikkeestä, ovat niiden C p :t likimain samat. Toisaalta taas alijäähtyneen nesteen (kumitilan, T > T g ) molekyylien liikkeellä on enemmän vapausasteita, ja C p -arvo on näin ollen korkeampi edellisiin verrattuna. Loogisena jatkumona seuraa, että nesteen C p -arvot ovat kaikkia kolmea jo mainittua arvoa suuremmat. Nyt voidaankin ajatella, että lasisiirtymä tapahtuu jollain tietyllä entropian ylimäärä -arvolla. Tästä voidaan päätellä, että T g :llä on olemassa jokin tietty (ainekohtainen) alaraja, vaikka jäähdytys tapahtuisi äärettömän nopeasti. Jos siis T g edustaa ylimäärä-entropian häviämistä, ei tämä arvo voi ylittää entropian muutosta, joka liittyy aineen transitioon nesteestä kiteiseksi. Muussa tapauksessa lasitilan entropia olisi pienempi kuin kiteisen tilan, ja tämä rikkoo termodynamiikan kolmatta pääsääntöä. Lasisiirtymälämpötilalle on siis olemassa alaraja T k (Kauzmannin lämpötila), ja käytännössä kokeellinen T g sijoittuu noin 20 K Kauzmannin lämpötilan yläpuolelle. Lasisiirtymää voidaan tarkastella myös (kineettisenä) molekylaarisena relaksaatio-prosessina nestettä jäädytettäessä. Relaksaatioaika τ riippuu lämpötilasta, siten että relaksaatioaika pitenee lämpötilan laskiessa. Vetysidoksia omaavan materiaalin kohdalla tämä relaksaatio liittyy lähinnä vetysidosten uudelleenjärjestäytymiseen. Jos materiaalin rakenteellinen relaksaatioaika τ r on lyhyt verrattuna havainnointiaikaan t o (kuten on tilanteessa T > T g ), on materiaali nesteenomaista, sillä näyte pystyy tällöin reagoimaan lämpötilanmuutoksiin jäähdytysprosessin aikaskaalassa. Tällöin näyte on tasapainossa jäähdytysohjelman kanssa. Jos taas relaksaatioaika on pitkä (T < T g ) ja t o < τ r materiaali käyttäytyy kuten kiinteässä olomuodossa, koska molekyyleillä on alhainen mobiliteetti, eivätkä ne pysty riittävän nopeasti seuraamaan lämpötilaohjelman aiheuttamia muutoksia. Lämpötilan muutoksen yhteydessä havaitaan lasisiirtymä, kun τ r t o. Ominaista amorfisille materiaaleille on myös tiettyjen lisäaineiden, liuottimista eteenkin veden, vaikutus lasisiirtymälämpötilaan. Vesi pyrkii kasvattamaan materiaalin vapaata tilavuutta ja lisäämään näin molekyylien mobiliteettia toimimalla plastisoijana. Tämä taas puolestaan vaikuttaa laskevasta T g -arvoon, mitä kuvaa alun perin lähinnä eri polymeeriseoksille johdettu Gordon-Taylor -yhtälö T g, mix w T 1 g,1 2 g,2 =. 1 + Kw T w + Kw 2 Yhtälössä w esittää alaindeksin ilmaiseman komponentin massaosuutta seoksessa, ja K esittää kyseisten komponenttien vapaiden tilavuuksien suhdetta. Vakio K voidaan laskea kaavasta (ρ 1 α 2 )/(ρ 2 α 1 ), missä ρ on tiheys ja α on lämpölaajenemiskertoimen muutos lasisiirtymäpisteessä (esim. laktoosi/vesi-systeemille K = 6,7). Toisaalta K voidaan arvioida myös kaavan (ρ 1 T g,1 )/(ρ 2 T g,2 ) avulla. Koska veden lasisiirtymälämpötilaksi on määritetty -135 C, on vedellä edellisen yhtälön mukaisesti lähes poikkeuksetta laskeva vaikutus materiaalien T g -arvoihin (esim. amorfiselle laktoosille T g = 97 C). Oleellista näissä tapauksissa on myös veden sorptiokäyttäytyminen, joka on luonteeltaan siis absorptiota. Täten veden sorptio amorfisiin materiaaleihin on verrannollinen näytteen massaan eikä pinta-alaan kuten adsorption tapauksessa. 13

14 VALMISTUS Sen lisäksi, että jotkut materiaalit (esim. polymeerit) luonnostaan esiintyvät amorfisina, voidaan normaalisti kiteisenä esiintyvä materiaali joko tahallisesti tai tahattomasti tuottaa kokonaan tai osittain amorfiseksi. Menetelmiä, joissa amorfista materiaalia syntyy, ovat mm.: - Liuoksesta nopeasti sakkauttaminen (ph:n muutos, siemenkiteet) - Sulan nopea jäähdytys (sammutus) - Partikkelikoon pienentäminen jauhatus / myllytys sumukuivaus kylmäkuivaus - Hydraattimuotojen dehydratoiminen. Vaikka amorfinen muoto onkin termodynaamisesti epästabiili, ja se pyrkii muuttumaan stabiiliksi kiteiseksi muodoksi kinetiikan riippuessa säilytysolosuhteista (kosteus/lämpötila), pyritään tietyissä tapauksissa materiaali nimenomaan saattamaan amorfiseen muotoon. Amorfinen ja vastaava kiteinen materiaali ovat kemiallisessa mielessä (molekyylitasolla) identtiset, joten niiden terapeuttinen vaikutuskin on identtinen. Kuitenkin kiderakenteella (tai sen puuttumisella) on suuri merkitys materiaalin fysikaaliskemiallisiin ominaisuuksiin vaikuttaen mm. materiaalin tiheyteen, optisiin ja mekaanisiin ominaisuuksiin, sähkönjohtavuuteen, viskositeettiin, kosteuden sorptiokäyttäytymiseen sekä fysikaaliseen ja kemialliseen stabiiliuteen. Farmaseuttisessa mielessä yksi merkittävimmistä eroista kiteisen ja amorfisen materiaalin välillä on vesiliukoisuus amorfisen aineen ollessa yleisesti huomattavasti liukoisempaa, tai ainakin nopeammin liukenevaa. Etenkin huonosti veteen liukenevien materiaalien kohdalla amorfisen materiaalin hyväksikäyttö saattaa mahdollistaa muuten soveltumattoman lääkeyhdisteen käytön, sillä esim. suun kautta nautittavien lääkkeiden on liuottava ruuansulatuskanavassa, ennen kuin ne voivat imeytyä systeemiseen verenkiertoon ja vaikuttaa terapeuttisesti. Tällöin kuitenkin amorfisen muodon on oltava riittävän stabiili, että valmistetta voidaan tuottaa, varastoida, jakaa ja käyttää ilman että siinä tapahtuu merkittäviä muutoksia. Tietyissä lääkevalmistuksessa käytettävissä prosesseissa (mm. jauhatus, puristus, mikronointi) saatetaan käsiteltävään materiaaliin tuottaa amorfisuutta tahattomasti, ikään kuin sivutuotteena. Tällöin amorfisuudella on tuotteen performanssin (toimivuuden) kannalta pelkästään negatiivinen vaikutus, ja tästä syystä sitä pyritäänkin useimmiten välttämään. Tuotettu amorfisuusmäärä saattaa kuitenkin olla liian pieni havaittavaksi erilaisilla analysointimenetelmillä mutta kuitenkin tarpeeksi suuri aiheuttamaan muutoksia tuotteen performanssiin. Esimerkkinä voidaan tarkastella 325 Meshin seulalla seulottua laktoosi-jauhetta, jonka partikkelien halkaisija on n. 100 µm. Arvioidaan laktoosimolekyylien halkaisijaksi 1 nm, ja oletetaan partikkelin pinnalle muodostuneen amorfinen kerros, jonka paksuus on kymmenen laktoosimolekyyliä. Kerroksen paksuus on niin pieni, että sen havaitseminen teoriassakin on vaikeaa esim. röntgendiffraktion (XRD) avulla (Scherrerin yhtälön mukaan CuKα-säteilyllä heijastusten puoliarvoleveydet ovat tällöin 1, kun 2θ = 20 ). Kerroksen paksuus on kuitenkin niin suuri, että se määrää partikkelin vuorovaikutuksen ympäristönsä kanssa. Kaavasta 1-((50-0,01)/50) 3 laskemalla saadaan amorfisen materiaalin osuudeksi 0,06%. Tämä osuus on niin pieni, että sen havaitsemin analyysimenetelmästä riippumatta on käytännössä mahdotonta. 14

15 MENETELMÄT Amorfisen materiaalin detektointiin ja sen kvantitatiiviseen määritykseen käytettäviä menetelmiä, joista tärkeimpiin ja yleisimmin käytettyihin perehdytään esimerkkien valossa suullisessa esityksessä, ovat mm.: - Röntgendiffraktio (XRD) - Kalorimetriset/termoanalyyttiset menetelmät Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria (DSC) Lämpötilamoduloitu DSC (MTDSC, MDSC) Isoterminen mikrokalorimetria (IMC) Liuoskalorimetria Termomekaaninen analyysi (TMA) Dynaaminen termomekaaninen analyysi (DTMA, DMA) Dynaaminen elektrinen analyysi (DEA) - Spektroskopiset menetelmät NIR Raman NMR - Kosteuden sorption määrittäminen gravimetrisesti - Muita Käänteinen kaasugromatografia (IGC) Termo-optinen mikroskopia (TOA) Tiheyden määrittäminen. 15

16 MODIFICATION OF ERYTHROMYCIN BY SOLID DISPERSIONS AND CRYSTAL ENGINEERING Sabiruddin Mirza a, Inna Miroshnyk a, Jyrki Heinämäki a, Jukka Rantanen a,b, Leena Christiansen a & Jouko Yliruusi a,b a Pharmaceutical Technology Division, University of Helsinki b Viikki Drug Discovery Technology Centre (DDTC), University of Helsinki, Finland Poorly water-soluble compounds with dissolution rate-limited low oral bioavailability present one of the major challenges in pharmaceutical development. There are several techniques [1-3] to increase the aqueous solubility of such compounds, including: particle size reduction modification of the crystalline form formulation of the drug as a solid dispersion. For many compounds, however, decreasing the particle size may not lead to a significant or adequate enhance in bioavailability. Moreover, the common way to reduce the particle size by milling may result in the particles with a broad size distribution, decreased crystallinity, poor flow properties, and static charges. The crystal form modification is not always feasible due to stability issues. An advantage of the solid dispersion technique is that it allows several mechanisms of solubillization such as micronization, improved wettability, dissolution of the drug in the hydrophilic carrier, absence of aggregation, and conversion of the drug to the amorphous state to be simultaneously employed. [4] In this presentation, two different approaches to modify solid-state properties of a model drug, erythromycin dihydrate (ED), are discussed. The first part deals with a development of solid dispersion of the drug in a water-soluble polymer, polyethylene glycol 6000 (PEG). The solid dispersions, when characterized by variable-temperature X-ray powder diffraction, revealed that ED was predominantly transformed to its anhydrous form during hot-melt processing. The temperature/composition phase diagram of the solid dispersions constructed by using hot-stage microscopy and differential scanning calorimetry suggested the formation of a monotectic. In summary the factors that may contribute into the dissolution rate improvement of the drug from the solid dispersion formulation are inferred. In the second part of the presentation, a particle engineering technique for in situ micronization of the model compound is introduced. A batch crystallizer (Figure 1) was used for the recrystallization of ED in the presence of adsorbed polymer, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), to control the crystal growth, and subsequently the final crystal size, shape and surface properties. Figure 1: A batch crystallizer used in the recrystallization experiments. 16

17 The nature of the HPMC-induced modifications of the drug particles was studied by means of various analytical techniques. Thus, the relationship between solid-state properties, crystal morphology and powder properties of the drug was deduced. Crystallization protocol for ED, which utilizes the HPMC as an additive in the crystallization media, is described. Finally, it is shown that by implementing the controlled crystallization technique micronized particles with narrow size distribution as well as improved handling properties and processability can be obtained. REFERENCES [1] Chiou W.L. and Riegelman S., Pharmaceutical applications of solid dispersion systems. J.Pharm.Sci. 60, [2] Serajuddin A. T. M., Solid dispersion of poorly water soluble drugs, early promises, subsequent problems and recent breakthrough. J. Pharm. Sci. 88, [3] Leuner C. and Dressman J., Improving drug solubility for oral delivery using solid dispersions. Eur. J. Pharm. & Biopharm.50, [4] Ford J.L., The current status of solid dispersions, Pharm. Acta Helv. 61,

18 CYCLODEXTRINS IN PULMONARY DRUG DELIVERY Tarja Toropainen a, Pekka Jarho a, Kristiina Järvinen b, Henna Vihola c, Jouni Hirvonen c & Tomi Järvinen a a Department of Pharmaceutical Chemistry, University of Kuopio, Finland b Department of Pharmaceutics, University of Kuopio, Finland c Division of Pharmaceutical Technology, University of Helsinki, Finland INTRODUCTION Cyclodextrins (CDs) are a group of cyclic oligosaccharides which has been used as excipients in pharmaceutical formulations. CDs have, for example, been used to increase the water solubility and dissolution rate of drugs in ophthalmic, intravenous and oral formulations [1]. Furthermore, they can also be used to improve drug stability and bioavailability, prevent drug:drug or drug:excipient interactions or reduce bad taste/odor of drugs. Figure 1: An example of a drug:cyclodextrin complex formation Recently, there has been an increased number of publications dealing with pulmonary applications of CDs. The systemic delivery of inhaled drugs requires various challenges to overcome. In addition to drug deposition and safety issues, there is also a need for rapid dissolution of inhaled particles since insoluble particles are removed via mucociliary clearance of uptake of alveolar macrophages [2]. This may lead to reduced absorption and bioavailability of a drug. We have shown earlier that the aerodynamic properties of a lipophilic drug (budesonide) in vitro are not impaired by complexation with γ-cd when the drug is delivered from a multiple-dose reservoirbased dry powder inhaler [3]. In the present study, we determined the dissolution behaviour of budesonide with γ-cd and evaluated the pulmonary safety of various CDs to be used in inhalation powders. METHODS Budesonide/γ-CD complex was prepared using a precipitation complexation method [3]. Dissolution profiles of micronised budesonide (420 µg), physical mixture (420 µg budesonide µg γ- CD) and budesonide/γ-cd complex (3000 µg; corresponding 420 µg budesonide) was determined in a shaking water bath (37 C, 100 rpm). A precisely weighed amount of budesonide, physical mixture or complex was dissolved in 20 ml of 1 % (m/v) γ-cd aqueous solution under sink conditions. Samples of 1 ml were taken at given intervals, replaced with an equal amount of the solvent and analyzed using HPLC. The pulmonary safety of various CDs (α-cd, β-cd, γ-cd, hydroxypropyl-β-cd and randomly methylated β-cd) was evaluated using Calu-3 pulmonary epithelial cells in vitro. Shortly, the cells were cultured onto 96-well plates hours prior to the experiment and incubated with various CD concentrations for 4 hours. The concentrations of β-cd were mm (due to its low water solubility) and the concentrations of other CDs were mm. The cell viability was determined by a MTT test [4] and the results were expressed as a viability ratio of treated cells vs. non-treated cells (%). 18

19 RESULTS The slowest dissolution was obtained for micronised budesonide. Figure 2 shows that after 30 minutes only 51 ± 12 % (mean ± SD) of plain budesonide was dissolved. The addition of γ-cd significantly increased the dissolution rate of budesonide. From physical mixture, 83 ± 7 % of budesonide was dissolved in 30 minutes. The dissolution was fastest and showed almost no variation between the trials from budesonide/γ-cd complex, from which 94 ± 2 % budesonide was dissolved in 30 minutes. Cumulative dissolved amount (%) (mean +/- SD) Complex Physical mixture Budesonide Time (min) Figure 2: Dissolution profiles of micronised budesonide (n=4), physical mixture of budesonide and γ-cyclodextrin (n=5) and budesonide/γ-cyclodextrin complex (n=3) (100 rpm, 37 C, in 1 % (m/v) γ-cd in water; mean ± SD). The results of the MTT test showed that the Calu-3 cell viability is strongly dependent on CD concentration (Figure 3). γ-cd and HP-β-CD decreased cell viability at concentrations of 100 mm and 50 mm, respectively. Therefore, they can be considered as the most tolerable CDs of this study. The most toxic CDs were β-cd and RM-β-CD which decreased cell viability at concentrations of 15 mm and 10 mm, respectively. 19

20 Cell viability (% of control) (mean +/- SD) α-cd γ-cd HP-β-CD RM-β-CD 0,05 0,1 0, CD concentration (mm) Cell viability (% of control) (mean +/- SD) ,01 0,05 0,1 0, β-cd concentration (mm) Figure 3: Calu-3 cell viability (%) after a 4-hour incubation with cyclodextrins (mean ± SD): α-cd (n=3-5), γ-cd (n=6), HP-β-CD (n=3) and RM-β-CD (n=3) (top) and β-cd (n=6) (bottom). Note the differences of scale on the x-axis. CONCLUSIONS The use of γ-cd significantly increased the dissolution rate of lipophilic model drug, budesonide. In addition, the dissolution profile of complexed budesonide showed almost no variation compared to plain budesonide and physical mixture. This indicates that the complexation of a lipophilic drug may be used to increase drug solubility and decrease the dissolution rate variability at the site of absorption. The toxicity study showed that CDs decreased cell viability only at high CD concentrations. Despite the lack of the local toxicity, the systemic safety needs also to be evaluated before a CD can be considered for pulmonary administration. As a conclusion, CDs remains to be potential pharmaceutical additives to be used in pulmonary drug delivery of lipophilic drugs. REFERENCES [1] Rajewski RA, Stella VJ: Pharmaceutical applications of cyclodextrins. 2. In vivo drug delivery. J Pharm Sci 85 (11): , 1996 [2] Labiris NR, Dolovich MB: Pulmonary drug delivery. Part I: Physiological factors affecting therapeutic effectiveness of aerosolized medications. Br J Clin Pharmacol 56: , 2003 [3] Kinnarinen T, Jarho P, Järvinen K, Järvinen T: Pulmonary deposition of a budesonide/γcyclodextrin complex in vitro. J Control Release 90: , 2003 [4] Hansen MB, Nielsen SE, Berg K: J Immunol Methods 119: ,

21 WATER-SOLUBLE PRODRUGS OF CANNABINOIDS Juha Juntunen a, Riku Niemi a, Jouko Vepsäläinen b, Krista Laine a & Tomi Järvinen a a Department of Pharmaceutical Chemistry, University of Kuopio, Finland b Department of Chemistry, University of Kuopio, Finland INTRODUCTION The active constituent of cannabis, 9 -tetrahydrocannabinol (THC), was isolated in The discovery of cannabinoid receptor in 1988 [1] led to search for endogenous compounds that bind to the cannabinoid receptor. Arachidonylethanolamide (AEA) [2] (Figure 1) was the first endogenous cannabinoid receptor agonist discovered. Later more endocannabinoids, like noladin ether (HU-310) [3] (Figure 1) were found. The potential use of cannabinoids in various neurological disorders like Alzheimer s disease, MS-disease and Parkinson s disease and control of pain, blood pressure and intraocular pressure (IOP) has recently been proposed. The pharmaceutical usefulness of cannabinoids is, however, limited by their lipophilic nature. Various approaches such as non-aqueous solvents, emulsifiers and cyclodextrins [4] have been used to overcome the poor aqueous solubility of both classical and endogenous cannabinoids. The poor aqueous solubility of cannabinoids can also be improved by incorporating ionizable or permanently charged pro-moiety to the cannabinoid structure. In this study we have synthesized different types of endocannabinoid (AEA and HU-310) prodrugs and evaluated their use as water-soluble prodrugs [5,6]. AEA O N H OH HU-310 O OH OH Figure 1. Endocannabinoids arachidonylethanolamide (AEA) and noladin ether (HU-310). MATERIALS AND METHODS Acidic (phosphate esters), basic (tertiary methyl piperazine derivatives) and permanent charge containing (quaternary methyl piperazine derivatives) prodrugs were synthesized (Figure 2). Various physicochemical properties (solubility, pk a, distribution coefficient) were determined for the synthesized molecules. Since prodrugs should release the parent compound after enzymatic (or chemical) hydrolysis in the body, the stability in several enzyme-containing media (serum, liver homogenate, cornea homogenate, pure enzyme) was studied. Also the in vitro cornea permeation and in vivo IOP reducing properties of phosphate ester prodrugs were evaluated and compared to results obtained by cyclodextrin formulation of the parent compounds. 21

22 Monophosphate ester: O R1= P OH R2= H OH O R1 O O R2 HU-310 Diphosphate ester: R1 and R2 = O P OH OH R= Tertiary prodrugs: N N O N N O P OH O OH N H AEA Phosphate ester: O R= R= N + N I O O R Quaternary prodrugs:: N + N + I I O N + N I O N + N + I I O Figure 2. Water-soluble AEA and HU-310 prodrugs. RESULTS Phosphate ester prodrugs increased the aqueous solubility of parent compounds considerably. The solubility of HU-310 phosphate at ph 7.4 was more than fold compared to HU-310. Phosphate ester prodrugs are almost completely in dianionic form at ph 7.4 and this ensures the good solubility. Basic prodrugs containing tertiary nitrogen atoms were not so soluble because they have pk a -values near the 7.4 and the molecules are not completely ionized. However, prodrug molecule with the pk a -value of 7.49 was surprisingly soluble at ph 7.4 and the solubility increases very rapidly near the pk a -value. This solubility behavior is not in agreement with the theoretical solubility but it can be explained by the ability of these molecules to form aggregates like micelles [7]. Micelles can incorporate the unionized, lipophilic form into the micelle interior. Solubilities of quaternary prodrugs were not dependent on the ph since there is a permanent positive charge in the molecule. Some of the quaternary compounds were quite unstable chemically and they were not very good substrates for the esterases present in serum and liver homogenate. However, one quaternary prodrug was an exception showing good aqueous solubility together with reasonable chemical stability and was quite rapidly cleaved in enzyme-containing media. The fact that these prodrug molecules contain negative (acidic) or positive (basic or permanently charged) charges may affect the absorption of these molecules. We tested how some of the synthesized phosphate ester prodrugs permeate rabbit cornea in vitro. The results were compared with the cyclodextrin formulation. The best permeation was achieved with the cyclodextrin formulations but also the prodrugs were effective. The prodrugs were cleaved just before or during the cornea permeation since only the parent compound was detected on the receiver side. Although there were differences in in vitro cornea permeation, the in vivo IOP reduction results are similar between phosphate ester prodrugs and cyclodextrin formulation of parent compounds. 22

23 CONCLUSIONS All the synthesized prodrugs were more soluble than the parent compounds AEA and HU-310. Although all of the quaternary prodrugs were very soluble and the solubility was not dependent on the ph, most of them were not very good substrates for esterases and some of them were chemically unstable. The solubility of tertiary amine prodrugs at ph 7.4 is highly dependent on the degree of ionization of these molecules and a slight change in ph can have dramatic effect on solubility. Phosphate esters showed good solubility and they released parent compounds after alkaline phosphatases in cornea and liver homogenate and in pure enzyme containing solution. Phosphate esters also work in vivo as the IOP studies show. REFERENCES [1] Devane, W. A.; Dysarz, F. A.; Johnson, M. R.; Melvin, L. S.; Howlett, A. C. Determination and Characterization of a Cannabinoid Receptor in Rat Brain. Molecular Pharmacology 1988, 34, [2] Devane, W. A.; Hanus, L.; Breuer, A.; Pertwee, R. G.; Stevenson, L. A. et al. Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor. Science 1992, 258, [3] Hanus, L.; Saleh, A.-L.; Fride, E.; Breuer, A.; Vogel, Z. et al. 2-Arachidonyl glyceryl ether, an endogenous agonist of the cannabinoid CB1 receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 2001, 98, [4] Jarho, P.; Urtti, A.; Järvinen, K.; Pate, D. W.; Järvinen, T. Hydroxypropyl-beta-Cyclodextrin Increases Aqueous Solubility and Stability of Anandamide. Life Sciences 1996, 58, [5] Juntunen, J.; Huuskonen, J.; Laine, K.; Niemi, R.; Taipale, H. et al. Anandamide prodrugs. 1. Water-soluble phosphate esters of arachidonylethanolamide and R-methanandamide. Eur J Pharm Sci 2003, 19, [6] Juntunen, J.; Vepsäläinen, J.; Niemi, R.; Laine, K.; Järvinen, T. Synthesis, in vitro evaluation, and intraocular pressure effects of water-soluble prodrugs of endocannabinoid noladin ether. J Med Chem 2003, 46, [7] Roseman, T. J.; Yalkowsky, S. H. Physicochemical properties of prostaglandin F2 alpha (tromethamine salt): solubility behavior, surface properties, and ionization constants. J Pharm Sci 1973, 62,

24 NANOPARTICLES: APPLICATIONS AND METHODS OF MANUFACTURE Hannele Eerikäinen Orion Pharma PH.D. THESIS: Preparation of Nanoparticles Consisting of Methacrylic Polymers and Drugs by an Aerosol Flow Reactor Method (in review) Usually the diameter of nanoparticles used in pharmaceutical applications varies between ten and one thousand nanometers. The particles of this size, when consisting of the drug material only, are very unstable. Therefore, the nanoparticles need to be stabilised by a plastic material, polymer, suitable for a pharmaceutical application. The polymer gives the nanoparticles adequate mechanical hardness and rigidity. In addition, the polymer can be used to modify the properties of the nanoparticles, for example to control the solubility properties or to protect a fragile drug molecule. Nanoparticles can be classified according to their structure to two groups: matrix-type nanoparticles or capsule-type nanoparticles. In a matrix-type nanoparticle the drug is evenly distributed within the particle and the polymer and the drug form a solid, homogeneous particle. In a capsule-type nanoparticle, the polymer forms a hard shell, which encapsulates the drug. Several applications have been proposed for nanoparticles in the pharmaceutical field, such as increase in solubility and dissolution rate. Nanoparticles could also be used to target drug delivery into certain sites or organs within the body, for example into tumours. In addition, it has been proposed that nanoparticles could be used as carriers deliver DNA or proteins inside cells. The dissolution rate depends on the surface area of the dissolving particle according to Noyes- Whitney equation. One method to increase the surface area available for solvent is to decrease the particle size. dm/dt = the dissolution rate D = diffusion coefficient A = surface area available for solvent h = the thickness of the diffusion layer C s = saturation concentration C = concentration. dm DA = ( Cs C), dt h Several methods of manufacture of the nanoparticles have been shown in the literature. The most widely used methods include emulsion-based methods. In these methods the poorly water soluble drug and the polymer are dissolved in an organic solvent, for example in chloroform. Nanosized emulsion droplets of chloroform in water are formed and the resulting nanodroplets are hardened by evaporation the solvent. Usually, emulsion-based methods cannot be used for preparation of nanoparticles from water soluble drugs. Other similar methods are for example coacervation or precipitation, in which the polymer is precipitated using a poor solvent. Special milling methods, especially wet milling, can be used to grind larger drug particles to nanosized particles. In these methods the achievable particle size depends on the duration of treatment and the hardness of the material. Most currently used methods for the production of nanoparticles result in an aqueous suspension. Surface-active agents, surfactants, have to be added to make the suspension stable. If the nanoparticles could be prepared as dry powder, it would increase the stability of the particles. This research concentrated on manufacturing drug-containing polymer nanoparticles by an aerosol flow reactor method. In this method, first a solution containing the drug and the stabilising polymer was prepared. This solution was sprayed to form nanosized droplets having a diameter of approximately 300 nm, which were dried by evaporation of the solvent. The nanoparticles were then collected directly as dry powder. The particles prepared were matrix-type particles, and the drug and 24

25 the polymer formed an amorphous solid solution. It was observed that there was an upper limit to how much drug could be incorporated in the nanoparticles. If the amount of drug in the nanoparticles was over the solubility limit of drug in the polymer, excess drug material formed separate crystallites. Depending on the interaction between the drug and the polymer, incorporation of drug in the polymer matrix led to lowering of the glass transition temperature of the polymer. The softened nanoparticles coalesced and formed large clusters. Dissolution of drug from the nanoparticles could be varied as a result of different solubility properties of the polymers. As a summary it can be stated that the preparation of drug-containing polymer nanoparticles by the aerosol method was successful. The developed method does not require the use of surfactants, but the nanoparticles consist of only the drug and the polymer in question. The method produces the nanoparticles directly as dry powder, so the problems involved in suspensions can be avoided. The maximum possible amount of drug in the nanoparticles was found to be dependent on the properties of the drug and properties of the polymer, as well as on the interactions between the drug and the polymer. 25

26 POSTERIABSTRAKTIT 26

27 CHARACTERIZATION OF POTENTIAL NON-EROSIVE ORAL DRUG DELIVERY SYSTEMS: MESOPOROUS MCM-41 AND SILICON POWDERS T. Heikkilä a,c, J. Paski a, J. Salonen a, K. Vähä-Heikkilä a, N. Kumar b, D.Yu. Murzin b, T. Salmi b & V-P. Lehto a a Laboratory of Industrial Physics, Department of Physics, University of Turku, FI Turku, Finland b Laboratory of Industrial Chemistry, Process Chemistry Centre, Åbo Akademi University, FI Åbo, Finland c Graduate School of Materials Research, Turku, Finland The adsorption of active pharmaceutical molecules into stabile, non-erosive mesoporous materials offers potential to control (delay) drug release, enhance drug dissolution, promote drug permeation across the intestinal cell wall (bioavailability) and improve drug stability under the extreme environment of the gastro-intestinal tract when administered orally. Different types of drug molecules (including macromolecules) can be adsorbed into mesoporous microparticles by modifying the pore architecture and surface chemistry of the carrier material. Porous silicon (PSi), produced by anodizing Si(100) wafers, has already been proven to be a potential candidate for biomaterial applications as its toxicity has been studied in vivo [1]. Synthetic MCM-41 type molecular sieves consist of a uniform mesopore channel structure providing a very narrow pore size distribution [2]. Some preliminary in vitro studies indicate it has very low cytotoxicity providing predictive evidence of its biocompatibility [3]. Recently, some applications have been reported regarding both PSi and MCM-41 as promising drug delivery vehicles [4,5]. In the present study, drug loaded microparticles of calcined siliceous MCM-41 and thermallycarbonized porous silicon (TCPSi) were produced and characterized. First, the starting materials are examined to verify that their synthesis has been successful considering the structural properties and phase purities. Secondly, the drug loaded matrices are studied to determine if the loading procedure has been efficient i.e. to determine if the drug has adsorbed into the pores. In the case of successful loading, the structural state of the drug is qualified (crystalline or molecular amorphous) and the amount adsorbed quantified (w/w%). The characterization methods used for this are x-ray powder diffraction (XRPD), nitrogen adsorption (SSA and pore size distribution), pycnometry (density), differential scanning calorimetry (DSC) and thermogravimetry (TG). Ibuprofen, a well-known analgesic was selected as the model drug. Ibuprofen was loaded into sieved TCPSi and MCM-41 microparticles (<38 µm) using saturated ethanol (EtOH, 99.5 %) solutions. After a loading period the samples were filtered and dried at suitable temperatures. It was found that the combination of the characterization methods employed here yield a good insight into the drug loading properties of the studied materials. The results of the characterization indicated the desired quality of the synthesized mesoporous silica, their maintained stability after the loading process and the successful impregnation of the matrices mesopores with iburofen. The results of the quantification indicate a drug load value of 9wt% for MCM-41 and 30wt% for TCPSi. The study also revealed that the measurement results have to be analysed with great care as these mesoporous materials have many properties, which can affect the results obtained (e.g. the drug load values). REFERENCES [1] A. P. Bowditch, K. Waters, P. Rice, E. A. M. Scott, Mat. Res. Soc. Symp. Proc, 536 (1999), [2] J. S. Beck, J. C. Vartuli, W. J. Roth, M. E. Leonowicz, C. T. Kresge, K. D. Schmitt, C. T-W. Chu, D. H. Olson, E. W. Sheppard, S. B. McCullen, J. B. Higgins, J. L. Schlenker, J. Am. Chem. Soc., 114 (1992), [3] L. Mollo, V. Levresse, M. F. Ottaviani, S. Ellouk-Achard, M-C. Jaurand, B. Fubini, Environ. Health Perspect. 105 suppl. 5 (1997), [4] A. Foraker, R. Walczak, M. Cohen, T. Boiarski, C. Grove, P. Swaan, Pharm. Res., 20 (2003), [5] M. Vallet-Regi, A. Rámila, R. P. del Real, J. Pérez-Pariente, Chem. Mater., 13 (2001),

28 CORRELATION BETWEEN TEXTURE AND TABLETTING PROPERTIES OF SOME PHARMACEUTICAL TABLETS Mikko Koivisto a,b & Vesa-Pekka Lehto a a Laboratory of industrial Physics, University of Turku b Graduate School of Materials research, Turku Pharmaceutical tablets are usually made by compressing crystalline powder. The resulted tablet is a polycrystalline object and its properties may depend on the orientation of the crystallites. In the present study an x-ray diffraction method was used to characterize the texture of various pharmaceutical one-component tablets. The results of the texture measurements were then linked to the tabletting properties of the materials from which the studied tablets were compressed. The studied materials were lactose, mannitol, sodium chloride, ibuprofen, dicalsium phosphate and aspirin. The tablets were compressed using a tabletting simulator or a hydraulic press. Three different pressures were used in order to study the effect of the compression force to the texture. The used tablet moulds were flat-faced with a diameter of 8 or 13 millimeters. The texture measurements were done with X'Pert Pro MPD diffractometer equipped with ATC-3 texture goniometer. Most of the studied materials texturized in compression. The extent of texture appeared to be dependent on the compaction behavior of the tablet material. If the compaction behavior was elastic no clear texture or no texture at all was observed. The plastic and brittle materials had clear texture but the clearest and strongest texture was observed from materials whose compaction behavior were proper combination of plastic and brittle. The compaction pressure had no effect on the direction of texture. Furthermore, the extent of texture was changed only a little when the pressure was increased. The particle size was found to have major effect on the formation and quality of texture. It has been suggested that the texture of pharmaceutical tablets may affect the dissolution properties, breaking strengths and hardness of tablets, for example. Therefore, texture analysis of pharmaceutical substances could give valuable information about their properties. Based on this study, the texture analysis seems to offer new and powerful nondestructive research tool for pharmaceutical physics. 28

29 DEVELOPMENT OF NEW SPRAYING SYSTEM FOR MICROSCALE FLUID BED GRANULATOR USING ELECTROSTATIC ATOMIZATION N. Kivikero a, M. Murtomaa b, M. Savolainen c, N. Laitinen c O. Antikainen c & J.P. Mannermaa a a Industrial Pharmacy, University of Helsinki, Finland b Department of Physics, University of Turku, Finland c Division of Pharmaceutical Technology, University of Helsinki, Finland PURPOSE The purpose of this study was to create a method to generate droplets in the microscale fluid bed powder processor (MMFP). The electrostatic atomization was chosen, because the delicate process cannot tolerate any pressurized air, and also because the method provides control on the trajectories of the droplets. METHODS The granulations were performed with alpha-lactose monohydrate in MMFP with a handmade experimental nozzle set-up. Solutions of polyvinylpyrrolidone (PVP) and water were used as a granulation liquid. The variables in the study were granulation liquid flow rate, atomization voltage and PVP-concentration. Additional voltage was applied to guide the droplets to the powder bed. The droplet size was determined by laser diffraction. The particle size was determined by sieve analysis and a new powder surface imaging instrument. System was modelled using advanced field solving software which enabled the droplet trajectories to be simulated. RESULTS The granule size can be modified by changing the three variables studied. Liquid flow rate had the most significant effect on the granule size followed by PVP-concentration. The atomization potential had the smallest effect. Computer simulations were used to assess the electric fields in the system [1]. The collecting electric field was capable to direct the charged droplets to the powder bed against the upwards moving air. CONCLUSIONS Electrostatic atomization is a promising new technique to generate controllable droplets in microscale fluid bed granulation. More studies are needed because of the poor repeatability and complexity of the fluid bed granulation process especially in microscale. REFERENCES [1] M. Murtomaa, N. Kivikero, J-P. Mannermaa, V-P. Lehto, Electrostatic Atomization in the Microscale Granulation, J. Electrostat. (in press). 29

30 EFFECT OF ELECTRON WITHDRAWING SUBSTITUENTS ON THE ACIDITY OF p-vinylphenols THROUGH A VINYLIC DOUBLE BOND A COMPARISON OF CALCULATED AND EXPERIMENTAL pk A VALUES Harri Nurmi, Jari Yli-Kauhaluoma, Julius Sipilä, Jyrki Taskinen, Jouni Hirvonen & Ann Marie Kaukonen Viikki Drug Discovery Technology Center, Faculty of Pharmacy, P.O. Box 56, FI University of Helsinki During early-adme phase of drug discovery, the use of computational methods for rapid and accurate physico-chemical profiling of candidate drugs is desirable. When predicting pk a values, the accuracy of the computational method will depend on the chemical structure of the molecules studied, especially when parametric methods (based on a database of experimental values) are used. Due to previously observed inaccuracies in predicting the acid strength of entacapone, a series of p- vinylphenols were used to compare the predictive capacity of different computational methods (ACD/Labs TM v 4.0 and 7.0, Pallas and SPARC). A total of 14 p-vinylphenols were studied. They were either synthesized or obtained from commercial sources. The compounds contained various electron withdrawing vinyl substituents, which were likely to increase the acidity of the phenolic hydroxyl group and included also two catechols. Experimental pk a values were determined using potentiometric titration (GLpKa, Sirius Analytical) and, due to the low aqueous solubility of the compounds, initial values were obtained in co-solvent systems at starting concentrations of 0.5 mm. Two of the substances were soluble enough for aqueous titration, whereas those having insufficient solubility in methanol-water mixtures were titrated using 4 % DMSO in water. Solubility allowing, initial values were confirmed by the use of higher concentrations (1-4 mm) or determination in additional co-solvent systems. Consequently most of the values calculated with Hammett type equations were found to underestimate the effect of the substituent on the acidity of the studied p-vinylphenols. The current predictive methods using Hammett type equations need to be adjusted to account for the effect of an electron withdrawing substituent on the phenolic hydroxyl through the vinylic double bond. The pk a values calculated using the latest available version of the ACD/Labs program were compared with the ones calculated by its earlier version. We found that the latest version actually made worse predictions (appr. error ±1.1) than the earlier version (appr. error ±1.0) for this type of compounds although its database had more than doubled in size between these two versions. Best predictions for the studied substances were made by SPARC on-line calculator (appr. error ±0.4). 30

31 HYDRATE SCREENING - APPLICATION OF CLUSTER ANALYSIS TO RAMAN SPECTRA OF NITROFURANTOIN CRYSTALS Jaakko Aaltonen a, Jukka Rantanen b & Jouko Yliruusi a,b a Division of Pharmaceutical Technology, University of Helsinki b Viikki Drug Discovery Technology Center, University of Helsinki Solid forms that contain water molecule(s) in their crystal structure are called hydrates. The stability of anhydrous material is often disturbed by water molecules: Unstable anhydrous material may entrap water molecules from the surrounding air and convert to a hydrate. Hydrate formation is also a common processing induced transformation. It has been estimated that one out of three drug molecules is capable of forming a hydrate. Since hydrates may have completely different physicochemical properties than their anhydrous counterparts a conversion from anhydrate to hydrate is highly undesirable. The hydrate forming capability of excipients and active pharmaceutical ingredients should be screened at early stage of drug development in order to avoid subsequent setbacks. Such screenings are expensive and time consuming, therefore reliable and rapid methods are welcome. In this study, a rapid hydrate screen was performed on anhydrous nitrofurantoin. Recrystallizations were performed using a wide range of acetone-water mixtures as solvents (a:w-ratio varying from 1:49 to 3:1). Effects of cooling rate and stirring on the crystal form were also investigated. The crystals were analysed using Raman spectroscopy and the results were verified with x-ray powder diffraction. Two different anhydrous forms (LABJON01 and LABJON02) and one monohydrate (HAXBUD) were crystallized. The Raman spectra were treated with standard normal variate (SNV) correction, thereafter a principal components analysis (PCA) was performed. Three principal components explained 99% of spectral variation. Samples of different crystal forms were separated clearly in their own clusters in the PCA score plot (Figure 1). Figure 1. The PCA score plot of the SNV corrected Raman spectra of the recrystallized samples. Circled areas represent different crystal forms verified by XRPD. Codes refer to structures in the Cambridge Structural Database. 31

32 MESOPOROUS SILICON MICROPARTICLES ENHANCED SOLUBILITY OF POORLY SOLUBLE DRUGS J. Salonen a, J. Tuura a, M. Björkqvist a, T. Heikkilä a, K. Vähä-Heikkilä a & V-P. Lehto a L. Laitinen b, A.M. Kaukonen b & J. Hirvonen b a Department of Physics, University of Turku, FI Turku, Finland b Viikki Drug Discovery Technology Center, Faculty of Pharmacy, University of Helsinki, FI Helsinki, Finland In this work, mesoporous silicon microparticles have been studied as drug delivery vehicles for oral administration applications. Three model drugs with poor solubility have been chosen. Two of those drugs are classified as a BCS class II drug (ibuprofen and griseofulvin) and one as a class IV drug (furosemide). The drugs have been loaded into the porous silicon microparticles, which are chemically treated to obtain a desired surface chemistry and stability. The drug loads were quantified with five different methods: thermogravimetry (TG), differential scanning calorimetry (DSC), helium pycnometry, N2 desorption and dissolution in organic solvent (HPLC). Table 1. Drug load degrees determined with different methods Drug TG Pycnometry N 2 sorption DSC* Av. load** Dissolution Ibuprofen 30.8% 33.0% 27.4% 0.2% 30.4% 28% Griseofulvin 12.5% 20.5% % 16.5% 12% Furosemide 43.0% 39.6% 41.2% 0.0% 41.3% 39% The drug loads are in weight percents *Crystallized substance found on the surface of the microparticles ** Av. load is a mean value of TG, He and N 2 results The release rates of loaded drugs were compared to the dissolution of unloaded drug substances. The drug release tests were performed in Hank s balanced salt solution and analysed with HPLC. For all three drugs, the dissolution rate of the drug was enhanced. Ibuprofen and furosemide, for which solubility increases with inreasing ph, showed almost independent dissolution rates as a function of ph, while loaded in the microparticles. For griseofulvin, the opposite behaviour was observed. The dissolution of the loaded griseofulvin significantly increased at ph 7.4, while in the unloaded griseofulvin the solubility slightly decreased as a function of ph. After the first 60 min, the release of the loaded griseofulvin was 20 times that of the unloaded grisefulvin (30.5 w- % and 1.5 w-%, respectively). ACKNOWLEDGEMENTS Release (%) ph 7.4 ph 6.8 ph Time (min) The financial support from the Academy of Finland is acknowledged (grant no and ) Fig. 1. Dissolution of loaded (solid symbols) and unloaded (open symbols) griseofulvin at three ph values 32

33 ORAL CONTROLLED RELEASE OF SACCHARIDES Riikka Mäki, Eero Suihko, Ossi Korhonen & Jarkko Ketolainen Department of Pharmaceutics, University of Kuopio, P.O. Box 1627, FI Kuopio The aim of this study was to design site specific, controlled release tablets of different saccharides by using hydrophobic matrix formers ethyl cellulose (EC) and starch acetate (SA). The matrices were designed to release saccharides in 2-4 hours, starting already in stomach and mainly at the upper part of the small intestine. Maltose monohydrate and N-acetyl-D-glucosamine (NAG) were used as model substances in this study. Physical and powder properties of maltose monohydrate, NAG and SA were studied by using DSC, FT-IR, UV-Vis, He-pycnometer, SEM and laser diffraction. The release characteristics of saccharides were determined by USP in vitro dissolution method (basket). Two water based dissolution media were used: ph 1.2 adjusted with HC1 for the first two hours and water for the next 2 24 hours. Based on preformulation studies, maltose monohydrate and NAG were found to be flaky shaped, crystalline material (m.p ± 1.5 C and ± 0.9 C with particle densities 1.52 g/cm 3 and 1.48 g/cm 3, respectively). They both are readily soluble in water, with solubilities of 0.43 mol/l in pure water [1]. The physicochemical properties of SA were found to be similar to those reported earlier [2]. The release of saccharides was examined by using a full 2-level factorial design of experiment, where the factors studied were the amount of drug in the tablet and tablet porosity. The study showed that it is possible to control the release rate of saccharides by altering the relative amount of hydrophobic matrix former in the tablet. The dissolution studies showed, that the release type of saccharides from the formulations studied varied from immediate release to sustained release in 24 hours. In the case of intermediate and slowly releasing formulations, it was found that the release of maltose monohydrate was two-phase and slower than the release rate of NAG from the corresponding tablets. NAG release kinetics followed square root of time kinetics, while in the case of maltose monohydrate the release kinetics was zero order in both phases. The release characteristics of EC and SA matrices were similar. REFERENCES [1] ACD Labs, Advanced Chemistry Development Inc., USA [2] Korhonen O, Raatikainen P, Harjunen P, Nakari J, Suihko E, Peltonen S, Vidgren M, Paronen P. Starch Acetates Multifunctional Direct Compression Excipients. Pharmaceutical Research 2000;17:

34 RAMAN SPECTROSCOPY FOR QUANTIFICATION OF AMPHETAMINE IN SEIZED SAMPLES Erja Katainen a, Ulla-Maija Laakkonen b, Erkki Sippola b Pentti Niemelä c, Janne Suhonen c & Kristiina Järvinen a a University of Kuopio, P.O. Box 1627, Kuopio b National Bureau of Investigation Finland, P.O. Box 285, 01301Vantaa c VTT-Electronics, P.O. Box 1100, Oulu We developed a Raman spectroscopy method for a rapid quantification of amphetamine in seized samples. The quantitative analysis of the seized drugs is complex because of the inhomogeneous nature of these samples. Seized powder samples that contained amphetamine were provided by National Bureau of Investigation (Finland). The amphetamine content in the seized samples was measured with a CCD-Raman spectrometer developed by VTT Electronics, Finland [1]. The samples were dissolved in acidic aqueous solution. A standard curve was prepared from pure amphetamine by the internal standard method using sodium dihydrogen phosphate. A high linear correlation between amphetamine content and the ratio of the amphetamine peak height to the sodium dihydrogen phosphate peak height was observed (Figure 1). Raman results were compared with HPLC analysis made by National Bureau of Investigation. Table 1 shows that the Raman results are in line with the HPLC results. Our results suggest that the content of amphetamine in seized samples may be determined quickly and simply by Raman spectrometer Amphetamine Table 1. Amount of amphetamine in some seized samples according to HPLC and Raman spectormeter Sample Amphetamine [%] σ Intensity NaH2PO4 HPLC Raman Huu , Huu , Wavenumber cm -1 Figure 1. Spectrum of hydrochloric solution of amphetamine and internal standard (sodium dihydrogen phosphate). REFERENCES [1] Niemelä P. and Suhonen, J. Appl. Spectrosc. 55, , Huu ,5 Huu ,2 Huu ,7 Huu ,5 Huu ,4 Huu ,2 Huu ,8 34

35 ULTRASOUND STUDIES FOR STARCH ACETATE TABLETS K. Pirskanen a ([email protected]), J. Pajander b, J. Ketolainen b, A. Poso c & R. Lappalainen a a Department of Applied Physics, BioMater Centre, University of Kuopio, P.O.B. 1627, FI Kuopio, Finland b Department of Pharmaceutics, University of Kuopio, P.O.B. 1627, FI Kuopio, Finland c Department of Pharmaceutical Chemistry, University of Kuopio, P.O.B. 1627, FI Kuopio, Finland INTRODUCTION Destructive and non-destructive testing (NDT) and diagnostics can be used to study physical and chemical properties and drug release of tablets. Ultrasound method is a non-destructive testing technique and can be used to study, e.g. elasticity and porosity of tablets. The main aim of VARMA project (Vapautumisen rakennetutkimus ja mallinnus, Research of drug release from structures and modeling), which is one of the projects in Tekes COMBIO program (Commercialization of Biomaterials), is to develop a computational model to predict drug release from starch acetate tablets. In VARMA project two different kinds of spectroscopic and non-destructive techniques (ultrasound and impedance methods) that provide several parameters or spectra are used to study structure and physical properties of tablets and drug release. The data from, e.g. ultrasound transmission method, among other things, is used as input data for the model development. MATERIALS AND METHODS Several sets of tablets that had different porosities (12-42 %) were compressed with compaction simulator (PCS- 1, Puuman, Kuopio Finland) from two different types of starch acetate powder (SA DS 2.7) that had particle size fractions 0-53 µm or µm, respectively. Ultrasound burst (Optel OPBOX-01/100, 1 MHz transducer) was transmitted through dry and dissolved tablets and time-dependent signal was analyzed. Parameters of the transmitted signal (i.e. velocity of ultrasound and attenuation coefficient of starch acetate) that relate to the structure and physical properties of tablets and thereby to the drug release were investigated as a function of porosity. The effects of the two different particle size fractions, model drug (20 weight% of Caffeine) and colorant (0.5 weight% of Phenol red) on the velocity and attenuation of ultrasound were examined in dry tablets. Dissolution test and six different dissolution times (from 5 to 240 min) were used to determine the liquid penetration rate as a function of dissolution time and to determine the effect of the liquid penetration on the ultrasound parameters. Colorant (Phenol red) and tablet splitting were used as a reference method to evaluate liquid penetration. RESULTS AND DISCUSSION The reproducibility of the measurements with the customized measurement setups was very good because the standard coefficient of variation (scv) was low and even below 1 %. According to the measurements, the examined parameters (velocity and attenuation coefficient) did not change considerably by addition of model drug or colorant. The particle size fraction of the powder did not seem to have effect on the ultrasound velocity but had an effect on the attenuation coefficient of the starch acetate. The linear correlation (Pearson) between ultrasound velocity and porosity of tablets and between attenuation coefficient and porosity were very significant for both particle size fractions. The values of ultrasound velocity and attenuation coefficient of SA decreased linearly as a function of porosity in dry starch acetate tablets. According to the results, it was possible to determine the amount of penetrated liquid during dissolution test from the velocity of ultrasound and attenuation coefficient of starch acetate. SUMMARY According to this study, the ultrasound parameters turned out to correlate with structural parameters of the tablets such as porosity and particle size fraction. Also the amount of liquid penetration vs. dissolution time can be evaluated by ultrasound method. Therefore these measured ultrasound parameters are related to the structure and physical properties of the tablets and thereby it is possible to use them to predict the drug release. Based of this study transmission ultrasound method is very potential as a non-destructive tool to study tablets and could be used as a PAT (Process Analytical Technology) in pharmaceutics. In the future, other ultrasound methods such as ultrasound reflection technique and gas matrix piezoelectric transducers (GMP) for non-contacting measurements will used to study tablets, too. ACKNOWLEDGEMENTS Orion Pharma Oyj, Polymer Corex Ltd., Visipoint Oy, M.Sc. Kati Niinimäki and Ph.D. Bert van Veen. REFERENCE K. Niinimäki, Tablettien ominaisuuksien tutkiminen ultraäänellä, 77 p., M.Sc. thesis, Univ. of Kuopio, Nov

36 USE OF THERMOANALYTICAL METHODS IN QUANTIFICATION OF DRUG LOAD IN MESOPOROUS SILICON MICROPARTICLES V-P. Lehto, K. Vähä-Heikkilä, J. Paski & J. Salonen Industrial Physics, Department of Physics, University of Turku, FI Turku, FINLAND Porous silicon (PSi) has been reported to be a promising choice as a vehicle in oral dosing of drugs. With the drug-loaded PSi microparticles it is possible to control the drug release by varying the pore sizes and/or by functionalizing the pore walls. Perhaps the most interesting feature of PSi microparticles in oral drug delivery is their capability to enhance the drug permeation across the intestinal wall in vitro. Especially, the possibility to deliver peptides and proteins when loaded in PSi and to reach the therapeutically acceptable concentration level in the bloodstream is fascinating. Thus, the possibilities and advantages due to the versatility and the assumed non-toxicity of the PSi are encouraging. PSi is prepared by etching the Si wafers electrochemically. After etching the PSi is unstable and is stabilized via an appropriate surface termination to obtain desirable chemical surface properties. In the present study thermally-carbonized PSi (TCPSi) was used in the form of microparticles. The porous microparticles (1 38 µm) was obtained by ball-milling the etched PSi films before stabilization. Ibuprofen was used as a model drug. The loading of the drug was performed by the immersion of the TCPSi microparticles in saturated drug solution and the subsequent filtering and drying. As a result of the loading procedure, the drug molecules are adsorbed not only into the pores but also on the external surfaces of the microparticles. The latter portion of the drug is normally washed out with a proper manner and thus there exist a need for a rapid and reliable method to distinguish between the two portions. A possibility is to combine the information obtained with thermo-gravimetry (TG) and differential scanning calorimetry (DSC). In the presentation, the method to quantify the drug loaded within the pores is discussed and examples are given (Figure 1). ACKNOWLEDGEMENTS The financial support from the Academy of Finland is acknowledged (grant no and ). Weight (%) Heat Flow (mw) ,20 0,15 0,10 0,05 0,00 a) b) TCPSi TCPSi+ibuprofen Ibuprofen Total ibuprofen content = 260 mg/g External ibuprofen content = 19 mg/g TCPSi+ibuprofen; m = mg Ibuprofen; m = mg Melting of external ibuprofen Temperature ( o C) J Temperature ( o C) 25.4% 97.7% J Figure 1. a) TG traces to quantify the total ibuprofen content of the porous TCPSi microparticles. b) DSC traces to quantify ibuprofen located on the external surfaces of the particles. 36

37 Fysikaalisen farmasian XVI vuosittainen symposium OSALLISTUJAT Jaakko Aaltonen Helsingin yliopisto Lotta Akkanen Orion Pharma Leena Christiansen Helsingin yliopisto Hannele Eerikäinen Orion Pharma Ritva Haikala Orion Pharma Leena-Maija Harju Orion Pharma Teemu Heikkilä Turun Yliopisto Paula Heinänen Orion Pharma Jouni Hirvonen Helsingin yliopisto Pekka Hoppu Helsingin yliopisto Johanna Husman-Piirainen Orion Pharma Samuli Hyvönen Helsingin yliopisto Juha Juntunen Kuopion yliopisto Anne Juppo AstraZeneca Kristiina Järvinen Kuopion yliopisto Arto Karjalainen Orion Pharma Erja Katainen Kuopion yliopisto Kirsi Katila Biotie Therapies Amie Kaukonen Helsingin yliopisto Esko Kekäläinen Cemic Arja Kekäläinen Orion Pharma Jarkko Ketolainen Kuopion yliopisto Niina Kivikero Helsingin yliopisto Mikko Koivisto Turun Yliopisto Jani Komppa Cemic Jari Kovalainen Vitabalans Marko Kuosmanen Kuopion yliopisto Vesa-Pekka Lehto Turun Yliopisto Teea Lehtovaara Orion Pharma Jarmo Lintulaakso Orion Pharma Juha Lintunen Orion Pharma Tanja Lipsanen Orion Pharma Petteri Lyytinen Orion Pharma Saara Mahlamäki Orion Pharma Inna Miroshnyk Helsingin yliopisto Sabir Mirza Matti Murtomaa Marika Mustonen Riikka Mäki Jenni Nieminen Harri Nurmi Tero Närvänen Leena Otsomaa Martti Ovaska Marja Partanen Leena Peltonen Katriina Pirskanen Mika Pulkkinen Maria Rantala Jukka Rantanen Kirsti Saarnivaara Henri Salokangas Kirsi Salomäki Jarno Salonen Marja Savolainen Paulus Seitavuopio Anna Shevchenko Eero Suihko Krista Taipale Veli-Pekka Tanninen Saara Tiittanen Tarja Toropainen Kari Vahervuo Bert van Veen Helsingin yliopisto Turun Yliopisto Orion Pharma Kuopion yliopisto Biotie Therapies Helsingin yliopisto Orion Pharma Orion Pharma Orion Pharma Orion Pharma Helsingin yliopisto Kuopion yliopisto Kuopion yliopisto Orion Pharma Helsingin yliopisto Orion Pharma Orion Pharma Orion Pharma Turun Yliopisto Helsingin yliopisto Helsingin yliopisto Orion Pharma Kuopion yliopisto Vitabalans Orion Pharma Orion Pharma Kuopion yliopisto Orion Pharma Orion Pharma 37

38 GRADUTIIVISTELMÄT 38

39 ASEPTISEN VALMISTUSMENETELMÄN VALIDOINTI Anna Sundell Farmasian teknologia, Farmasian tiedekunta, Helsingin yliopisto Steriiliydellä tarkoitetaan kaiken tyyppisten organismien täydellistä poissaoloa. Valmisteen steriiliys aikaansaadaan joko loppusteriloimalla valmiste tai valmistamalla se aseptisesti. Aseptinen valmistus tapahtuu puhdastiloissa, käyttäen steriilejä raaka-aineita ja pakkausmateriaaleja. Kummallakaan menetelmällä ei aikaansaada absoluuttista steriiliyttä, vaan joudutaan hyväksymään steriiliys tietyllä todennäköisyydellä. Aseptisessa valmistuksessa tämän todennäköisyyden ajatella olevan SAL 10-3 (kontaminaatioaste 0,1 %) eli tuhannesta valmisteesta yksi on kontaminoitunut. Lopputuotteiden steriiliys testataan steriiliystestauksella, joka suoritetaan Euroopan farmakopean menetelmien mukaan. Koska steriiliystestauksella ei tutkita jokaista valmistetta, tulee valmistusprosessin taata Se, että jokainen valmiste on steriili. Aseptisessa valmistuksessa tämä tarkoittaa aseptisten valmistusmenetelmien validointia eli normaalin valmistusprosessin jäljittelyä käyttämällä raakaaineena elatusainetta (yleisimmin soijakaseiiniliuosta). Aseptisen valmistusmenetelmän validointi voidaan jakaa kolmeen osaan: alkuvalidointi, uudelleenvalidointi ja jaksottainen uudelleenvalidointi. Alkuvalidointi tehdään jokaiselle uudelle valmisteelle ja siihen kuuluu kolme validointiajoa. Tällä pyritään arvioimaan prosessin toimivuutta ja soveltuvuutta tuotantoon. Jaksottaisella validoinnilla tarkoitetaan puolivuosittain toistettavaa validointia, jolla pyritään osoittamaan, että valmistusprosessi on säilynyt hyväksyttävänä. Uudelleenvalidointi suoritetaan, jos prosessiin on tehty muutoksia, jotka voivat vaikuttaa tuotteen steriiliyteen tai jos jaksottainen validointi ei täytä asetettuja vaatimuksia. Validoinnin tulee jäljitellä normaalia valmistusta kaikin mahdollisin tavoin ja sen tulee kuvata myös valmistuksen worst case -tilanteita. Validoinnin eräkoon tulee olla riittävä, jotta se kuvaa normaalia valmistusta ja arvioi tarkasti valmistuksen kontaminaation todennäköisyyttä. Validoinnin jokaista näytettä inkuboidaan 14 vuorokauden ajan, jonka aikana ja jälkeen näytteet tarkastetaan visuaalisesti, seuraamalla niiden mahdollista kontaminaatiota eli samentumista. Jos näyte on kontaminoitunut, tutkitaan mikä mikrobi on aiheuttanut kontaminaation. Yleisesti hyväksytty kontaminaatioaste validoinnissa on 0,1 %. Jokaiselle validoinnin eräkoolle tulee määrittää erikseen kontaminaation hälytys- ja toimenpiderajat, jotka ilmoitetaan kontaminaatioasteena tai kontaminoituneiden yksikköjen lukumääränä. Jos nämä rajat saavutetaan, tulee tutkia kontaminaation aiheuttanut syy. Jos toimenpideraja ylittyy, tulee tämän lisäksi korjata prosessin virheellisyys ja suorittaa uudelleenvalidointi. Sairaalamittakaavaisessa valmistuksessa aseptisen valmistusmenetelmän validointia käytetään ensisijaisesti henkilöstön osaamisen tarkastamiseen. Jokaisen henkilön pitää osallistua validointiin kerran vuodessa. Erikoistyönäni laadin HYKS Apteekille uuden toimintaohjeen Aseptisen valmistusmenetelmän validointi, jonka valmisteet jäljittelevät hyvin sairaala-apteekin monimutkaisimpia valmisteita, sillä ne on laadittu apteekin omien valmisteiden pohjalta. Avainsanat: aseptinen valmistus, validointi, aseptisen valmistusmenetelmän validointi, kontaminaatio, kontaminaatioaste 39

40 β-sitosterolin FAASITRANSITIOIDEN KINETIIKAN RÖNTGENDIFFRAKTOMETRINEN JA KALORIMETRINEN TUTKIMUS Mikko Huhtamäki Teollisuusfysiikan laboratorio, Fysiikan laitos, Turun yliopisto Aineen ominaisuudet saattavat poiketa merkittävästi sen eri polymorfisilla muodoilla. Lääkeaineilla toisella polymorfisella muodolla voi olla parantava vaikutus, kun taas pieni ero kiderakenteessa voi muuttaa lääkkeen neutraaliksi tai jopa myrkylliseksi. Tutkielman kappaleissa 1, 2, 3 ja 4 perehdytään teoreettisesti aiheisiin, jotka ovat edellytyksenä työn kokeellisen osion tekemiselle ja ymmärtämiselle. Teoriaosassa käsitellään polymorfiaa, kinetiikkaa ja menetelmiä, joilla havaitaan faasitransitioita ja aineen eri polymorfisia muotoja. Työn kokeellisessa osassa tutkitaan pseudopolymorfisen β-sitostero1in faasitransitioiden kinetiikkaa. β-sitosteroli on yleisin kasvisteroli, ja sillä on havaittu kolme pseudopolymorfista kiderakennetta: anhydraatti, hemihydraatti ja monohydraatti. β-sitosterolin molekyylirakenteessa on yksi etyyliryhmä enemmän kuin kolesterolin rakenteessa. β-sitosterolilla on havaittu olevan veren kokonaiskolesterolia ja erityisesti pahaa LDL-kolesterolia alentavia vaikutuksia. β-sitosterolin kinetiikasta tehtiin havaintoja jauheröntgendiffraktometrillä sekä mikrokalorimetrillä. Tutkimukset painottuivat monohydraatin dehydratoitumiseen ja anhydraatin hydratoitumiseen lämpötilavälillä 5 C 45 C. Saatuihin mittaustuloksiin sovitettiin Avramin ja Janderin yhtälöistä muokattuja yhtälöitä. Parhaiten sovitetuista yhtälöistä anhydraatin hydratoitumista kuvasi kaksinkertainen Avrami ja monohydraatin dehydratoitumista kuvasi kolminkertainen Avrami. (βsitosterolin hydratoitumisesta tai dehydratoitumisesta ei kirjallisuushaun perusteella ole aikaisemmin julkaistu tuloksia. Asiasanat: β-sitosteroli, pseudopolymorfia, kinetiikka, mikrokalorimetri, röntgendiffraktio 40

41 BETA-SITOSTEROLIN KITEYTYMINEN ERI LIUOTTIMISTA Noora Gisselberg Farmasian teknologian osasto, Farmasian tiedekunta, Helsingin yliopisto Beta-sitosteroli on kasveissa yleisimmin esiintyvä kasvisteroleihin kuuluva sterolijohdannainen, jonka on useissa eri tutkimuksissa todettu laskevan kokonaiskolesterolia noin %. Kasvisterolit laskevat kolesterolia pääasiassa estämällä kolesterolin imeytymistä ohutsuolessa. Beta-sitosteroli on veteen liukenematon ja öljyyn niukkaliukoinen aine. Huono liukoisuus heikentää sen käytettävyyttä ja asettaa valmistusteknisiä ongelmia. On todettu, että tehokkain kolesterolia laskeva vaikutus saadaan formulaatioilla, joissa beta-sitosteroli on hienojakoisena dispersiona, jolloin sen efektiivinen pinta-ala on suuri. Hyviä tuloksia on saatu myös tutkimuksissa, joissa betasitosteroli on ollut esteröityneenä ja liuotettuna rasvahappoihin. Tässä tutkimuksessa keskityttiin beta-sitosterolin kiteytymiseen. Kiteytyminen on menetelmä, jota käytetään paljon lääketeollisuudessa poistamaan lääkeaineesta epäpuhtauksia, sekä muokkaamaan syntyviä polymorfisia muotoja sekä kideasua ja -kokoa. Tutkimuksen kiteytyksissä käytettiin liuottimina metanolia, etanolia, 1- ja 2-propanolia ja asetonia. Myös kiteytysolosuhteiden vaikutusta tutkittiin kiteyttämällä beta-sitosteroli eri lämpötiloissa sekä muuttamalla kiteytysaikaa ja -konsentraatiota, sekä kiteytysmenetelmää (haihdutus vs. jäähdytys). Kiteiden säilyvyyttä tutkittiin säilyttämällä kiteitä silikageelieksikaattorissa ja liuotinhöyryeksikaattorissa (kiteytyksessä käytetty liuotin). Kiteitä tutkittiin erottelevalla pyyhkäisykalorimetrilla (DSC), jauheröntgendiffraktiometrillä (XRPD), termogravimetrillä (TG) ja lämmitys-xrpd:llä. Kideasun karakterisointiin käytettiin pyyhkäisyelektronimikroskooppia (SEM). Beta-sitosteroli kiteytyi kaikista käytetyistä liuottimista muodostaen solvaatteja. Alkoholeista kiteytyi solvaatteja, jotka sisälsivät liuotinta ja beta-sitosterolia suhteessa 0,5:1 moolia. Asetonista kiteytetyt solvaattirakenteet sisälsivät liuotinta ja beta-sitosterolia suhteessa 1:5 moolia. Metanolista ja 2-propanolista beta-sitosteroli kiteytyi solvaattina, jossa liuotinmolekyylit olivat sitoutuneet heikoimmin kidehilaan, jolloin desolvatoituminen tapahtui alhaisessa lämpötilassa. Etanolista betasitosteroli kiteytyi pysyvimpänä solvaattirakenteena, ja desolvatoituminen tapahtui vasta korkeassa lämpötilassa, jolloin beta-sitosteroli oli jo osittain sulaneena. Kiteytysolosuhteet eivät merkittävästi vaikuttaneet syntyvään kiderakenteeseen liuosta jäähdyttämällä kiteytetyissä kiteissä. Haihdutuskiteytetyt kiteet olivat rakenteeltaan amorfisempia kuin jäähdyttämällä kiteytetyt. Käytetty liuotin vaikutti syntyneiden kiteiden kokoon ja muotoon, alkoholeista kiteytyneet kiteet olivat muodoltaan levymäisiä ja asetonista kiteytyneet neulasmaisia. 2-propanolista ja metanolista syntyi pienempiä kiteitä kuin muista käytetyistä liuottimista. Tutkimuksen perusteella metanoli ja erityisesti 2-propanoli vaikuttaisivat sopivan käytetyistä liuottimista parhaiten beta-sitosterolin kiteyttämiseen. Desolvatoituminen, joka on solvaattikiteissä yleensä haluttu ominaisuus, tapahtui suhteellisen alhaisessa lämpötilassa ja tämän jälkeen rakenne muuttui stabiiliksi anhydraattirakenteeksi. Ei-toivottuja faasitransitioita ei metanolaatti- ja 2- propanolaattikiteillä myöskään havaittu. Avainsanat: beta-sitosteroli, kiteytyminen, solvaatti, kiderakenne, desolvatoituminen 41

42 CACO-2 SOLULINJAN KARAKTERISOINTI FDA:N MALLIYHDISTEILLÄ Tuula Ahtola-Sätilä Farmasian teknologia, Farmasian tiedekunta, Helsingin yliopisto Lääkeaineiden solukerroksen läpäisevyyden eli permeabiliteetin ja metabolian tutkimiseen on kehitetty Caco-2 soluviljelymalli, joka jäljittelee ihmisen ohutsuolen epiteeliä. Caco-2 solut ovat peräisin ihmisen paksusuolisyövästä. Ne erilaistuvat spontaanisti polarisoituneeksi yksisolukerrokseksi. Caco-2 solut ilmentävät myös monia kantajaproteiineja ja entsyymejä. Caco-2 solukerrosta on käytetty erilaisten lääkeainemolekyylien aktiivisen ja passiivisen permeabiliteetin tutkimiseen. Täysin erilaistuneen ja yhtenevän Caco-2 solukerroksen kasvattamiseen kuluu aikaa noin kolme viikkoa, ja solujen elatusliuos täytyy vaihtaa noin 10 kertaa tänä aikana. Koska soluviljelmien kasvattaminen vaatii suuren työmäärän, on solukerroksen tehokkaaseen käyttöön permeaatiokokeissa kiinnitetty huomiota ja haettu uusia tapoja, joilla lääkeaineiden kulkeutumiskokeita ja näytteiden analysointia voitaisiin tehostaa. Yhdysvaltojen lääkeviranomainen (FDA) on laatinut ohjeet lääketeollisuudessa tehtäville bioekvivalenssitutkimuksille. FDA on ohjeissaan lääketeollisuudelle hyväksynyt Caco-2 solukerroksella tehtävät kulkeutumiskokeet in vitro menetelmäksi, jolla voidaan arvioida uusien lääkeainemolekyylien imeytymisominaisuudet ohutsuolesta in vivo. Ohjeistossa on listattuna 20 erilaista malliyhdistettä soluviljelmän karakterisoimiseen. Ennen kuin soluviljelmä soveltuu uusien lääkeaineiden imeytymisen arviointiin, on osoitettava sen toimivuus malliyhdisteillä. Tässä tutkimuksessa käytettiin seitsemää malliyhdistettä ja fluoreskeiinia, joiden permeabiliteettivakio (Papp(a-b)) määritettiin suurilla (1,1 cm2) Caco-2 solukerroksilla. Yhdisteiden permeaatiokokeista piirrettiin kuvaaja, jossa esitetään yhdisteen ohutsuolesta imeytynyt osuus (fa %) suhteessa sen Caco-2 solukerroksella määritettyyn Papp-arvoon. Kuvaajaa voidaan kutsua Caco-2 solulinjan karakterisointikuvaajaksi, ja sen avulla pyritään erottelemaan lääkeaineet hyvin ja huonosti permeoituviin. Kuvaajasta muodostui sigmoidaalinen ja siitä pystyttiin erottelemaan hyvin ja huonosti permeoituvat yhdisteet. Samanlainen korrelaatio näiden parametrien välille on saatu myös aikaisemmissa tutkimuksissa. Monet lääkeaineiden permeaatiokokeista Caco-2 solukerroksella on tehty olosuhteissa, jotka ovat varsin kaukana ohutsuolessa vallitsevista olosuhteista in vivo. Kuitenkin tiedetään, että ohutsuolen ph vaikuttaa lääkeaineen imeytymiseen. Ohutsuolen epiteelin yli vallitseva ph-gradientti voi muuttaa lääkeaineen dissosioitumisastetta siten, että lääkeaineen passiivinen diffuusio pienenee tai aktiivinen kuljetusmekanismi voimistuu. Tässä tutkimuksessa määritettiin kahdeksan malliyhdisteen Papp(a-b)-arvo suurilla (1,1 cm2) solukerroksilla ph-gradientilla. Tuloksista voitiin havaita, että ph-gradientilla suoritetun kokeen passiivisesti permeoituvien yhdisteiden Papp(a-b)-arvot korreloivat paremmin yhdisteen ruoansulatuskanavasta imeytyneeseen osuuteen (fa %). Osassa kulkeutumiskokeita käytettiin seosannostelua. Aikaisemmassa tutkimuksessa on havaittu seosannostelulla suoritetussa kokeessa eri yhdisteiden Papp-arvojen korreloivan hyvin vastaaviin yksittäisillä yhdisteillä suoritettujen kokeiden Papp-arvoihin. Tulevaisuudessa on tarkoitus siirtyä manuaalisesta pipetoinnista robottityöskentelyyn. Koska robotti ei kykene tekemään 15 minuutin inkubointeja tai lyhyempiä, tässä työssä käytettiin seosannostelulla AP-BL suuntaan suoritetuissa kokeissa 30 minuutin näytteenottovälejä. Nopeasti permeoituvien yhdisteiden kohdalla menetettiin kulkeutumiskokeissa sink-olosuhteet. Eri yhdisteiden permeaatiojärjestys säilyi kuitenkin samana kuin yksittäisillä yhdisteillä tehdyissä kokeissa. Avainsanat: Caco-2 solukerros, permeabiliteetti, väliaineen ph, karakterisointi, seosannostelu 42

43 ENNUSTAVAT JA KORRELOIVAT LASKENNALLISET MENETELMÄT LÄÄKEVALMISTEKEHITYKSESSÄ: KEINOTEKOISET NEUROVERKOT, MONIMUUTTUJA-ANALYYSIT JA ASIANTUNTIJAJÄRJESTELMÄT Jari Pajander Farmasian teknologia, Farmaseuttinen tiedekunta, Kuopion yliopisto Lääkeyritykset pyrkivät saamaan tuotteitaan nopeasti markkinoille. Valmistusprosessien parametrejä ja uusia formulaatioita ennustamaan kykenevien ohjelmien tarve on suuri, sillä vanhat, toisen asteen polynomiin perustuvat ennustamismenetelmät ovat riittämättömiä jopa satojen muuttujien ja vasteiden sekä niiden välisien monimutkaisten riippuvuuksien käsittelemiseen. Nopeasti kehittyvä tietotekniikka on mahdollistanut uusien ennustamismenetelmien kehittämisen. Tekoälyyn pohjautuvat sovellukset, kuten keinotekoiset neuroverkot ja asiantuntijajärjestelmät, sekä tilastolliseen tietojenkäsittelyyn perustuvat monimuuttuja-analyysit hallitsevat useiden muuttujien ja vasteiden välisten yhtäaikaisten riippuvuuksien analysoinnin ja ovat siten mullistaneet lääkevalmistekehityksessä käytettävien ennustamismenetelmien hyödyntämisen. Keinotekoiset neuroverkot voidaan jakaa rakenteensa perusteella kahteen eri ryhmään, joita ovat koulutettavat hierarkkiset neuroverkot sekä itsestään järjestäytyvät verkot. Monimuuttuja-analyysi voidaan jakaa myös kahteen eri ryhmään, joita ovat pääkomponenttianalyysi sekä piilevien rakenteiden projisointi. Hierarkkinen neuroverkko sekä piilevien rakenteiden projisointi soveltuvat ennustamiseen, sillä ne kykenevät havaitsemaan yhtäaikaisten muuttujien vaikutuksen vasteisiin ja niiden väliset korrelaatiot. Itsestään järjestäytynyttä verkkoa sekä pääkomponenttianalyysia voidaan käyttää tiedon havainnollistajina. Niiden avulla tieto voidaan luokitella siten, että esimerkiksi poikkeavuudet pystytään havaitsemaan helposti. Asiantuntijajärjestelmät kykenevät luomaan syötettyjen parametrien perusteella uusia formulaatioita sekä näyttämään yksityiskohtaisesti prosessit, jotka vaadittiin komposition aikaan saamiseksi. Avainsanat: ennustaminen, keinotekoinen neuroverkko (ANN), hierarkkinen neuroverkko, itsestään jarjestaytynyt verkko (SOM), monimuuttuja-analyysi, pääkomponenftianalyysi (PCA), piilevien rakenteiden projisointi (PLS), asiantuntijajärjestelmä 43

44 IN VITRO -IHOPERMEAATIOTUTKIMUKSISSA KÄYTETTÄVÄT MALLIMEMBRAANIT Anne Soikkeli Farmasian teknologian osasto, Farmasian tiedekunta, Helsingin yliopisto Kirjallisuusosassa luodaan katsaus in vitro -ihopermeaatiotutkimuksissa tällä hetkellä käytössä oleviin mallimembraaneihin. Näistä ihmisen epidermis on edelleen luotettavin vaihtoehto mallimembraaniksi, kun lääkeaineiden iholäpäisevyyttä tutkitaan in vitro -diffuusiokammioissa. Eläinperäisten ihomembraanien ja ihmisihon välille ei ole löydetty yleispätevää korrelaatiota, vaan niiden käyttökelpoisuus on tutkittava aina erikseen jokaisella lääkeaineen, valmisteen ja ihomembraanin yhdistelmällä. Eläinperäisistä membraaneista sian ihon on havaittu mallintavan parhaiten ihmisihon lääkeainepermeaatiota, minkä uskotaan johtuvan ihon pintakerrosten lipidirakenteiden samankaltaisuudesta. Tähän mennessä tutkituista soluviljelmistä ja -linjoista REK-solut pystyvät ainoana solumallina muodostamaan läpäisyesteen, joka on permeaatio-ominaisuuksiltaan vertailukelpoinen kuolleen ihmisen ihoon. Synteettisten membraanien huimasta kehityksestä huolimatta eivät nekään ole pystyneet korvaamaan ihmisihomembraaneja, vaikkakin Feldsteinin tutkimusryhmän tulokset osoittivat siloksaanin ja polykarbonaatin lohkoseospolymeerin kykenevän yllättävän hyvin mallintamaan tutkittujen lääkeaineiden kinetiikkaa ihmisen ihossa. Tutkituista ihomembraanimalleista juuri synteettiset membraanit olisivat helppokäyttöisimpiä ja niillä saataisiin toistettavimmat tulokset. Niiden heikkoutena on kuitenkin elävän biologisen materiaalin puuttuminen, millä on merkitystä erityisesti ihossa metaboloituvien lääkeaineiden permeaatiota tutkittaessa. Kokeellisessa osassa REK-soluviljelmällä tehdyt permeaatiotutkimukset antoivat lupaavia tuloksia. REK-membraani pystyi mallintamaan ihmisen ihon permeaatio-ominaisuuksia niin passiivipermeaatio- kuin iontoforeesikokeissakin. Myös sähköiset ominaisuudet membraanivakiota lukuun ottamatta olivat hyvin ihmisihon kaltaisia. Sähköinen ominaisvaraus oli negatiivinen kuten ihmisihossakin ja impedanssimittausten tulokset pystyttiin sovittamaan aiemmin ihmisiholla muodostettuun equivalent circuit -malliin. Membraanivakion arvojen suuri hajonta antaisi aihetta laajemmille lisätutkimuksille. Avainsanat: in vitro -ihopermeaatiotutkimukset, ihomembraanimallit, ihmisen iho, REK 44

45 ISOTERMISEN MIKROKALORIMETRIN LIUKENEMISLAITTEISTON VALIDOINTI JA MITTAUKSIA Jenni Kosunen Teollisuusfysiikan laboratorio, Fysiikan laitos, Turun yliopisto Tutkielman päätarkoituksena oli validoida isotermiselle mikrokalorimetrille liukenemismäärityksiä varten suunniteltu mittauslaitteisto. Tässä tarkoituksessa määritettiin laitteistolle havaitsemisraja, toistettavuus ja epätarkkuus. Validointimittausten reagensseina käytettiin natriumkloridia, amorfista laktoosia sekä laktoosi monohydraattia. Liuottimena toimi vesi. Havaitsemisrajan itseisarvoksi saatiin 30 mj. Toistettavuudelle saatavat arvot vaihtelivat mittaussarjan mukaan, mutta kaikille reagensseille suhteellinen standardipoikkeama oh vain muutaman prosentin luokkaa. Epätarkkuuden arvot jäivät natriumkloridilla ja laktoosi monohydraatilla alle 2,5 %:n. Amorfisen laktoosin sen sijaan katsottiin olevan sopimaton validointitarkoituksiin. Sille mitattu epätarkkuus oli jopa 15 %. Pienien näytemäärien mittaukset kärsivät luotettavuudessaan, koska liukenemisen käynnistävästä pudotustoimenpiteestä aiheutuva signaali vaihtelee mittauskerroittain. Toinen päätavoite oh selvittää termisesti karbidoituun huokoiseen piihin ladatun ibuprofeenin liukenemiseen kuluva aika verrattuna vastaavan määrän jauhemuodossa olevaa ibuprofeenia liukenemiseen. Ladatun huokoisen pun havaittiin yllättäen antavan simuloituun suolinesteeseen joutuessaan eksotermisen signaalin. Koska ibuprofeenin liukeneminen jauhemuodosta on endoterminen tapahtuma, ei tuloksista voitu päätellä liukenemisaikojen eroa. Ladatun huokoisen pun reaktio liuoksessa oli kuitenkin huomattavasti hitaampi kuin jauheena olevan ibuprofeenin liukeneminen. Asiasanat: isoterminen mikrokalorimetria, liukeneminen 45

46 JAUHEINHALAATIOT JA NIIDEN FARMASEUTTINEN KEHITYS Hanna Nuorento Farmasian teknologia, Farmasian ja biofarmasian laitos, Kuopion yliopisto Keuhkolääkintä on yleistynyt huomattavasti viimeisten vuosien aikana. Paikallisen lääkinnän lisäksi myös systeeminen lääkintä on tutkimuskohteena. Keuhkojen rakenne mahdollistaa nopean terapeuttisen vasteen sekä vähentyneet sivuvaikutukset. Suurien biomolekyylien annostelu on mahdollista keuhkojen kautta ja tämä helpottaa herkkien proteiinien ja peptidien systeemistä annostelua. Jauheinhalaatiot ovat alkaneet syrjäyttää aerosolityyppiset laitteet ympäristöllisistä ja annosteluun liittyvistä syistä. Useimmat jauheinhalaatiot koostuvat aktiivisesta aineesta sekä suurempikokoisesta kantaja-aineesta. Koska useimmat pienet lääkeainepartikkelit ovat kohesiivisia, keuhkolääkintää voidaan parantaa käyttämällä kantajapartikkeleita, kuten laktoosia. Kaikki laitteet eivät välttämättä tarvitse kantajaa ollenkaan. Kantajapartikkeleiden koko, muoto sekä pinnan rakenne ovat ominaisuuksia, jotka vaikuttavat lääkeainepartikkeleiden irtoamiseen kantajasta sekä lääkeainepartikkeleiden keuhkoihin kulkeutuvaan osaan. Liian pienet kantajapartikkelit voivat kulkeutua keuhkoihin, mikä ei ole suotavaa keuhkojen herkästä rakenteesta johtuen. Suurempia keuhkoihin kulkeutuneita lääkeainemääriä on kuitenkin havaittu kun pieniä kantajapartikkeleita on käytetty. Kantajapartikkelin muoto vaikuttaa valuvuuteen ja voi siten muuttaa keuhkoihin pääsevän lääkeaineen määrää. Karhea kantajapartikkeli voi sitoa lääkeainepartikkelin pintaansa liian tiukkaan, eikä irtautuminen kantajasta ole mahdollista. Eräs menetelmä parantaa lääkeaineen keuhkoihin kulkeutuvaa osuutta karhealta kantajan pinnalta, on käyttää pieniä kantajapartikkeleita isojen lisäksi. Nämä pienet kantajapartikkelit miehittävät korkeat adheesiovoimat omaavat kohdat kantajan pinnassa ja edesauttavat lääkeainepartikkeleiden irtoamista. Ryppyiset ja huokoiset partikkelit ovat erikoistekniikoita, joita on kehitetty ja joiden avulla keuhkoihin kulkeutuvaa lääkeainemäärää on saatu parannettua. Keuhkolääkintään soveltuvia partikkeleita voidaan valmistaa esimerkiksi hienontamalla, sumukuivaamalla ja ylikriittisellä nesteuutolla. Hienontamisen ongelmana on sen muodostamat kohesiiviset partikkelit ja sen takia muita tekniikoita käytetään useammin. Tutkielman kokeellinen osa käsittää jauheiden valuvuuksien vertailua. Valuvuudella on tärkeä osa valmistettaessa kiinteitä farmaseuttisia lääkemuotoja. Mannitolin eriä vertailtiin tutkimalla partikkeleiden koon, muodon sekä pinnan karheuden vaikutuksia valuvuuteen. Käytetyt menetelmät olivat kaato- ja tärytiheydet, pyyhkäisyelektronimikroskopia, valumiskulmat sekä Aeroflow -laite. Tiheyksien avulla määritetyt tulokset eivät ole välttämättä luotettavia. Valuvuuskulmien ongelmana on, että tulokset eivät aina ole toistettavia. Aeroflow -laitteella saadut tulokset olivat yhteneväisiä valuvuuskulmien kanssa. Aeroflow -laite on erittäin käyttökelpoinen ja nopea menetelmä määritettäessä jauheiden valuvuuksia. Käsitellyt jauheet, joiden partikkeleilla oh säännöllinen muoto sekä sileä pinta, valuivat huomattavasti paremmin kuin jauheet ilman mitään käsittelyä. Avainsanat: keuhkolääkintä jauheinhalaatiot, jauheformulaatio, kantajapartikkelit, farmaseuttinen kehitys, mannitoli, jauheen valuvuus 46

47 KARBAMATSEPIININ POLYMORFIASTA Mervi Taurén Teollisuusfysiikan laboratorio, Fysiikan laitos, Turun yliopisto Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli valmistaa ja tunnistaa karbamatsepiinin eri polymorfisia muotoja. Lisäksi pyrittiin muodostamaan transitiokaavio muotojen välille. Kaaviosta kävisi ilmi, miten eri muodoista pääsee toisiin muotoihin. Tutkielmassa määritellään, mitä tarkoitetaan polymorfialla ja millaisissa olosuhteissa eri polymorfisia muotoja voi syntyä. Lisäksi on selvitetty polymorfien muutoksia toisiin muotoihin, sekä esitetty polymorfien nimeämisessä käytettäviä peniaatteita. Tutkimusmenetelminä tässä työssä on käytetty pääasiassa kahta eri menetelmää; pyyhkäisykalorimetriaa ja jauheröntgendiffraktiota. Tämän vuoksi kyseiset menetelmät on esitetty lyhyesti. Samalla on myös hieman selitetty niiden kuvaajien muodostumista ja menetelmään liittyvää laitteistoa. Tutkittavana aineena käytetty karbamatsepiini (5H-dibenz[b,f]azepine-5-carboxamide, C15H12N20) on epilepsian ja hermosärkyjen hoidossa käytetty lääkeaine. Se puuduttaa ja estää kouristuksia. Muutamien aikaisempien tutkimusten tuloksia esitellään lyhyesti, sillä ainetta on tutkittu maailmalla paljon. Tässä tutkimuksessa haettua kaaviota eri polymorfien välille ei kuitenkaan ole ennen muodostettu. Tutkimukset tehtiin Turun yliopiston Fysiikan laitoksen Teollisuusfysiikan laboratoriossa. Kalorimetrinä käytettiin PerkinElmer Instruments n DSC-7 -kalorimetriä, jota ohjattiin saman valmistajan DSC-Robo -laitteiston ja PYRIS Software Version ohjelman avulla. Röntgenmittauksissa käytettiin Philips n laitteistoa, jossa jännitegeneraattorina oli PW 1830, goniometrinä PW 1820 ja ohjausyksikkönä PW Laitteiston toimintaa ohjattiin Automatic Powder Diffraction -ohjelmalla. Lisäksi jokaisesta muodosta otettiin kuva Olympus BH-2 valomikroskoopilla, joka oli liitetty videoiden kautta tietokoneeseen. Tuloksena saatiin valmistettua viisi eri Karbamatsepiinin polymorfia ja tunnistettua ne eri muodoiksi analyysimenetelmien avulla. Tulosten perusteella polymorfien välille muodostettiin muutoksista kertova kaavio. Asiasanat: polymorfia, DSC, XRD, carbamazepine/karbamatsepiini 47

48 LÄÄKEVALMISTEISSA KÄYTETTÄVIEN BIOHAJOAVIEN POLYMEERIEN TURVALLISUUDEN TUTKIMINEN Tiina Saarimäki Farmasian teknologia, Farmasian ja biofarmasian laitos, Kuopion yliopisto Biohajoavat polymeerit hajoavat elimistössä hajoamistuotteiksi, jotka poistuvat erittymällä tai metabolialla. Biohajoavia polymeerejä tutkitaan ja kehitetään lääkeaineiden, proteiinien ja geenien annosteluun sekä kudos- ja luuvaurioiden korjaamiseen. Biohajoavien polymeerien ja niiden hajoamistuotteiden täytyy olla bioyhteensopivia elimistön kanssa. Bioyhteensopiva polymeeri aiheuttaa elimistössä vain hyväksyttyjä vasteita ja toimii elimistön kanssa ennalta suunnitellulla tavalla. Biohajoavien polymeerien turvallisuustestauksen päälinjat löytyvät kansainvälisistä ohjeistoista. Kokeita muokataan polymeerikohtaisesti aikaisempien tutkimustulosten perusteella. Tutkimukset aloitetaan in vitro -kokeissa sytotoksisuusmäärityksillä, joissa käytetään monia solumalleja sekä altistus- ja määritysmenetelmiä. Biohajoavien polymeerien hajoamistuotteiden aiheuttamiin vaikutuksiin on kiinnitettävä erityishuomiota. Polymeerien hajoamistuotteiden vaikutuksia voidaan tutkia esihajottamalla polymeerejä ennen altistusta. In vivo -koesarjat aloitetaan jyrsijöillä, joille joko implantoidaan kiinteä polymeeri-implantti tai injektoidaan polymeeriliuosta. Tutkimuksissa on hyvä käyttää erisuuruisia annoksia polymeeriä sekä erikokoisia implantteja ja eri implantaatiopaikkoja. Paikalliset ja systeemiset vaikutukset on tutkittava kudoskohtaisesti. Pitkäaikaisvaikutukset on myös selvitettävä. Normaali tulehdusreaktio on erotettava implantin aiheuttamasta pitkittyneestä voimakkaammasta tulehdusreaktiosta. Jatkotutkimuksissa käytetään isompia eläinlajeja. Tutkimusten in vitro in vivo -korrelaatio on yleensä hyvä biohajoavilla polymeereillä. Kokeellisessa osassa tutkittiin oksatsoliinilla linkattujen PCL-polymeerien sekä perinteisen PCL:n hajoamista fosfaattipuskurissa sekä keinotekoisessa ohutsuolinesteessä. Lisäksi tutkittiin pienimolekyylipainoisten lääkeaineiden vapautuminen PCL-O-kalvoista. PCL-O oli herkempi hydrolyysille kuin PCL. Oksatsoliininkin tiheyttä säätämällä voitiin hieman nopeuttaa PCL-O:n bulk-eroosiota fosfaattipuskurissa. Keinotekoisen ohutsuolinesteen sisältämä pankreatiini aiheutti PCL-Okalvoissa pintaeroosiota. Nopeimmin hajosivat tiheimmin oksatsoliinilla linkatut PCL-O-kalvot. PCL-kalvojen hajoaminen oli bulk-eroosiota. Lääkeaineiden vapautuminen oli nopeinta eniten oksatsoliinia sisältävistä kalvoista. Hydrofiiliset lääkeaineet vapautuivat nopeimmin. Vapautuminen ei ollut riippuvaista kalvojen hajoamisesta. Avainsanat: biohajoava polymeeri, bioyhteensopivuus, in vitro- ja in vivo -turvallisuustutkimukset, in vitro in vivo -korrelaatio 48

49 NANOPARTIKKELIT LÄÄKEAINEIDEN KOHDENTAJINA Riikka Järvenpää Farmasian teknologia, Farmasian ja biofarmasian laitos, Kuopion yliopisto Nanopartikkelien käyttö lääkeaineiden annostelussa ja sen tutkimisessa on lisääntynyt viimeisten vuosikymmenien aikana. Nanopartikkeleita, jotka ovat kooltaan 1 nm 1 µm, käytetään lääkeaineen kohdentamisessa. Nanopartikkeleissa voidaan käyttää monenlaisia materiaaleja. Yleisimpiä ovat biohajoavat nanopartikkelit, jotka hajoavat vähitellen elimistössä. Nanopartikkeleita voidaan annostella useita eri reittejä pitkin, mutta yleisintä on annostella ne iv-injektioina. Verenkierrossa partikkelien pintaan sitoutuu proteiineja eli partikkelit opsonisoituvat. Opsonisaation seurauksena elimistön makrofagit kykenevät tunnistamaan nanopartikkelit ja fagosytoivat ne. Partikkelit kertyvät elimiin, joissa esiintyy paljon makrofageja, kuten maksaan ja pernaan, eivätkä partikkelit yleensä kulkeudu terapeuttisina pitoisuuksina muihin kudoksiin. Opsonisaatiota voidaan vähentää steerisellä stabiloinnilla, eli päällystämällä partikkelit hydrofiilisellä aineella. Steerisen stabiloinnin ansiosta nanopartikkelit kiertävät kauemmin verenkierrossa, jolloin ne pystyvät jakaantumaan myös sellaisiin kudoksiin ja soluihin, joihin päällystämättömät partikkelit eivät kulkeudu. Näin ollen niiden mahdollisuus tavoittaa kohdekudoksensa on suurempi ja terapeuttisen vasteen saavuttaminen todennäköisempää. Nanopartikkelien pintaan voidaan sitoa ligandeja, joilla on lisääntynyt affiniteetti kohdekudoksiinsa tai kohdesoluihinsa. Ligandeina voidaan käyttää useita eri aineita, kuten vitamiineja, polysakkarideja, vasta-aineita sekä verenkierron omia komponentteja. Monilla aktiivisilla kohdentimilla on reseptoreja vain tiettyihin soluihin, jolloin kohdennus on hyvin spesifistä. Nanopartikkelien kohdennusta on tutkittu hyvin paljon, mutta edelleenkään kohdennus ei ole tarpeeksi spesifistä ja tehokasta. Useimmat kokeet on tehty in vitro -olosuhteissa, jotka voivat poiketa paljonkin in vivo -olosuhteista. Monet valmisteet ovat olleet toimivia in vitro, mutta in vivo -kokeissa ei ole saavutettu haluttua vastetta. Lisätutkimuksia tarvitaan edelleen niin vanhojen kohdentimien tutkimuksessa kuin uusien kohdentimien etsimisessäkin. Olen jättänyt erikoistyöstäni Oksatsoliinilla linkattu poly(ε-kaprolaktoni) (PCL-O): Solutoksisuus, biohajoaminen ja lääkeaineiden vapautuminen mikropartikkeleista erillisen selostuksen ohjaajilleni. Avainsanat: nanopartikkeli, steerinen stabilointi, PEG, ligandi, spesifinen soluunotto 49

50 N-HEKSAANIN, 1-HEKSEENIN, 1-HEKSYYNIN, 1-DEKEENIN JA UNDEKYLEENIHAPON SOVELTUVUUS LÄÄKEAINEELLA LADATUN HUOKOISEN PIIN TERMISEEN HYDROSILYLAATIOON Mikko Kujanpää Teollisuusfysiikan laboratorio, Fysiikan laitos, Turun yliopisto Tutkielma liittyy huokoisen piin käyttöön biomateriaalina. Yksi uusimmista tämän alan tutkimuskohteista on huokoisen piin käyttö suun kautta otettavien lääkeaineiden kuljettajana. Keskeisenä ajatuksena on se, että lääkeaineita ladattaisiin huokosiin, joista ne sitten liukenisivat elimistön käyttöön. Käytännön sovellusten kannalta yhdeksi keskeisimmäksi kysymykseksi voi nousta se, miten huokosiin ladattujen lääkeaineiden liukenemisnopeuksiin pystytään vaikuttamaan. Tutkielmassa on tarkasteltu huokoista piitä yleisesti, erilaisia pintakäsittelymenetelmiä sekä lääkeaineiden lataamista ja liukenemista. Kokeellisessa osassa tutkittiin n-heksaanin, 1-hekseenin, 1- heksyynin, 1-dekeenin ja undekyleenihapon soveltuvuutta lääkeaineella ladatun huokoisen piin termiseen hydrosilylaatioon. Tämän lisäksi pyrittiin selvittämään huokosten muodon ja termisen hydrosilylaation vaikutusta lääkeaineen liukenemisnopeuteen huokoisista piimikropartikkeleista. Tutkimukseen valittujen yhdisteiden soveltuvuutta huokoisen piin termiseen hydrosilylaatioon tutkittiin differentiaalisella pyyhkäisykalorimetrillä (DSC) ja FTIR-spektrofotometrillä tehdyillä mittauksilla sekä lääkeaineiden liukoisuuskokeilla. Undekyleenihappo ja 1-dekeeni osoittautuivat tutkituista yhdisteistä soveliaimmiksi lääkeaineella ladatun huokoisen piin termisen hydrosilylaatioon. Tutkimuksen toisen osan liukenemisnopeuskokeita varten valmistettiin kahdenlaisia huokoisia piimikropartikkeleja. Toisissa huokoset olivat ns. mustepullo -tyyppisiä, toisissa tasapaksuja. Täyttä varmuutta siihen, onnistuiko mustepullo -huokosten valmistaminen nyt käytetyllä menetelmällä, ei kuitenkaan saatu. Huokosiin ladattiin ibuprofeiinia ja osa mikropartikkeleista hydrosilyloitiin termisesti 1-dekeenillä. Ibuprofeiinin liukenemista huokosista simuloituun suolistonesteeseen (SIF) seurattiin ph-mittarilla. Käytetty menetelmä ei ollut kuitenkaan riittävän tarkka, jotta olisi pystytty päättelemään huokosten muodon ja hydrosilylaation vaikutusta liukenemisnopeuksiin. Tulevien tutkimusten kannalta olisi erittäin tärkeää löytää toimiva menetelmä mustepullo -huokosten valmistamiseen. On erittäin todennäköistä, että juuri mustepullo -muoto on yksi keino, jolla lääkeaineiden liukenemista pystytään hidastamaan. Myös sellaisten menetelmien löytäminen, joilla lääkeaineiden liukenemista huokosista pystytään seuraamaan tarkasti, on tulevien tutkimusten kannalta ensiarvoisen tärkeää. Asiasanat: huokoinen pii, lääkeaineiden lataaminen, terminen hydrosilylaatio, huokosten muoto, lääkeaineiden liukenemisnopeus 50

51 NOPEASTI HAJOAVAN TABLETTIVALMISTEEN KEHITTÄMINEN KAHDELLE SUURIANNOKSISELLE LÄÄKEAINEELLE Sanna Sirkkala Farmasian teknologian osasto, Farmasian tiedekunta, Helsingin yliopisto Tämän työn tarkoituksena oli selvittää kirjallisuustyöosuudessa tabletin hajoamiseen liittyvää teoreettista pohjaa, sekä kehittää erikoistyöosuudessa nopeasti hajoava suorapuristeinen tablettiformulaatio kahdelle suuriannoksiselle lääkeaineelle, fenobarbitaalille ja tylosiinitartraatille. Valmistusmenetelmäksi haluttiin suorapuristus menetelmään liittyvien etujen vuoksi, ja raaka-aineiden tuli olla helposti saatavilla ja mielellään edullisia. Suorapuristus vaatii valmistusmenetelmänä erityisesti suuriannoksiselta lääkeaineelta hyvää valuvuutta ja puristuvuutta, ja apuaineiden on tuettava näitä ominaisuuksia. Ongelmana oli lääkeaineiden suuri annos ja se, että toinen lääkeaineista oli niukkaliukoinen. Tämä johtaa yleensä tabletin hitaaseen hajoamiseen. Jotta lääkeaine imeytyisi elimistöön ja saisi aikaan farmakologisen vaikutuksen, on lääkeaineen vapauduttava lääkevalmisteesta. Lääkeaineen vapautuminen voi tapahtua suoraan liukenemisen kautta, tai tabletin hajoaminen voi edistää liukenemista liukenemispinta-alaa suurentamalla. Kun lääkeaine on niukasti veteen liukeneva, ja kun halutaan nopea lääkeaineen vapautuminen, nousee tabletin hajoaminen merkittäväksi tekijäksi biologisen hyväksikäytettävyyden kannalta. Tabletin hajoaminen tarkoittaa (farmaseuttisissa tieteissä) tapahtumaa, jossa lääkemuoto murtuu, kun se joutuu kosketuksiin vesiliuoksen kanssa. Hajoamiseen liittyy useita eri mekanismeja, joita kirjallisuustyössä tarkasteltiin. Hajoamiseen voidaan myös vaikuttaa monilla valmistusteknisillä tai apuaineisiin liittyvillä tekijöillä. Edellytyksenä hajoamiselle on kuitenkin veden tunkeutuminen tablettiytimeen. Kokeellisessa osassa tutkittiin kolmen eri tavoin puristuvan täyteaineen ja niiden seosten toimivuutta tutkittavien lääkeaineiden kanssa. Näistä valittiin kyseisten lääkeaineiden kanssa parhaiten toimiva täyteaine. Mittareina arvioinnissa olivat jauheseosten tabletoitavuus, sekä tablettien hankaus- ja pudotuskestävyys, painonvaihtelu ja hajoamisaika. Kummallekin lääkeaineelle löydettiin sopiva täyteaine, joka molempien lääkeaineiden kohdalla oli mikrokiteinen selluloosa. Valitulla formulaatiolla fenobarbitaalitabletit hajosivat riittävän nopeasti (täyttivät farmakopean hajoamisaikavaatimukset) ilman hajotusainettakin. Tylosiinitartraattitablettien koostumukseen päätettiin lisätä hajotusaine. Hajotusainevaihtoehdoiksi valittiin kolme tehokasta, yleisesti käytössä olevaa ns. superhajotusainetta, joiden vaikutus tablettien ominaisuuksiin tutkittiin. Hajotusaineista lupaavimmaksi tylosiinitartraattiformulaatioon osoittautui ristisidottu natriumkarboksimetyyliselluloosa. Lopuksi tablettiformulaatioiden toimivuus testattiin tuotantolaitteilla. Tässä työssä aikaansaadut kaksi formulaatiota toimivat hyvin laboratoriomittakaavassa, ja myös tuotantolaitteilla valmistettuina, sekä tabletit hajosivat nopeasti. Näin ollen erikoistyölle asetetut tavoitteet saavutettiin. Avainsanat: fenobarbitaali, tylosiinitartraatti, tabletin hajoaminen, hajotusaine, hajoamisnopeus 51

52 TABLET DISINTEGRATION: EFFECT OF TEMPERATURE AND ph OF AQUEOUS DISINTEGRATING FLUID AND INFLUENCE OF PROPERTIES OF DILUENT ON THE BEHAVIOUR OF SUPERDISINTEGRANTS Eija Leskinen Division of Pharmaceutical Technology, Faculty of Pharmacy, University of Helsinki Dissolution and disintegration are crucial properties of pharmaceutical tablets and often are correlated. Dissolution of poorly soluble drugs from tablets can be strongly improved by solid deposition upon super disintegrants and disintegration generally enhances the dissolution rate. Disintegration takes place by the annihilation of the interparticle bonding (passive mechanism) and by the development of separating stress due to swelling (active mechanism) by the liquid permeating into the tablet. Therefore, besides the force exerted by the swelling disintegrant development the disintegration may be affected by the initial dissolution rate of the major tablet components in two ways, by the altering the penetration rate of the liquid and by changing the intermolecular solid bonds. In the experimental work combinations of different disintegrants and diluents were used to prepare tablets with different porosity levels. The mechanism of action of the disintegrants used was either to swell in contact with water or induct water uptake into the tablet. The diluents had different initial dissolution rates and one of them was completely water insoluble. The purpose was to investigate, if the properties of the diluent have effect on the efficiency of disintegrant by affecting its mechanism of action. Disintegration tests were done in three different dissolution media with three different temperatures in order to investigate also the effect of the properties of the disintegrating fluid. It was found that the choice of the combination of disintegrant and diluent can have a great influence on disintegration time of a tablet. With strongly swelling disintegrants the diluent should not be too soluble, as dissoluting of the diluent widenes the pores inside the tablet and diminishes the strength of the swelling force. If the main mechanism of action of disintegrant was to increase capillary activity, solubility of the diluent did not worsen the efficiency, as disintegration was affected by other factors than swelling. The properties of the disintegrating fluid had some effect on tablet disintegration. Increasing ph of the fluid increased also disintegration times in most of the cases, and increasing temperature of the fluid decreased disintegration times. Keywords: disintegrant, disintegration mechanism, swelling, capillary activity, properties of diluent 52

53 THE EFFECT OF DIFFERENT GRANULATORS ON THE PROPERTIES OF GRANULES AND TABLETS Pekka Hoppu Department of Pharmacy, Faculty of Science, University of Helsinki The purpose of this study was to investigate the effect of different granulators and process parameters on the properties of granules and tablets. The experimental design was full factorial interaction model with totally 112 experiments, which were decreased to 40 experiments. Composition included microcrystalline cellulose (MCC) 78.5 % (w/w), mannitol 18.5 % and polyvinyl pyrrolidone (PVP, K-30) 3.0 %. Three different granulators were used. Mi-Pro and Diosna being high shear mixers and mixer torque rheometer (MTR) being a low shear mixer. Four water levels were used from 26 to 44.4 % (w/w). The wet densities, near infrared (NIR) spectra and consistency were measured after granulation. Granules were dried on trays. After drying, granules size distribution was measured and granules were milled. Milled granules were evaluated for size, shape, total pore volume and compactibility. Tablets were evaluated for total pore volume and crushing strength. Increasing the water level, kneading time and impeller or shaft speed affected the size and shape of granules, increased the granular density, and decreased the porosity and compactibility of dry granules. Bulk density, particle size distribution, total pore volume, baseline corrected NIR spectra, consistency and compactibility were noticed to differ between high shear mixers and low shear mixer. In the consistency measurement, the consistency profile gave more information than a single consistency value. Consistency profile gives information about granule growth mechanism and growth region. Densification of granules was more effective in high shear mixers than in MTR. In addition, Diosna mixer was more effective than Mi-Pro. A new parameter, the effective relative swept volume, was developed to compare mixing effectiveness between the high shear mixers. More effective mixing in Diosna was partly connected to the high effective relative swept volume. In addition, differences in mixing chamber and impeller design affected granule flow. The compactibility of granules increased as the pore volume of granules increased in the pore range from 100 nm to 10 µm. A good correlation between total intruded volume of granules and tablets tensile strength was noticed. In addition, low bulk density increased compactibility. Mercury porosimetry was noticed to be an effective method to analyze compactibility of granules. Tablet strength increased as the volume of large pores decreased and the pore volume in the pore diameter range of 100 to 2000 nm increased. Keywords: wet granulation, Mi-Pro, Diosna, MTR, NIR, tablet, consistency, total pore volume, swept volume 53

54 UUSIEN LÄÄKEAINEMOLEKYYLIEN IMEYTYMISEN ARVIOINTI JA OLIGOPEPTIDITRANSPORTTERI PepT1 Harri Purhonen Farmasian teknologian osasto, Farmasian tiedekunta, Helsingin yliopisto Uusien lääkeainemolekyylien farmakokineettiset ominaisuudet pyritään selvittämään mahdollisimman varhaisessa lääkkeen kehitysvaiheessa. Farmakokineettisten ominaisuuksien tutkimukseen kaytetään ohutsuolen limakalvoa muistuttavia solukerroksia, joilla voidaan mitata molekyylin permeaationopeutta. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää laskentaohjelmia, jotka ennustavat molekyylin biologisia ominaisuuksia, kuten permeaationopeuden, molekyylirakenteen perusteella. Verrattaessa kirjallisuudessa esitettyjä kokeellisia permeaationopeusvakioita ja QikProp-laskentaohjelmalla laskettuja permeaationopeuksia ihmisillä mitattuihin lääkeaineen imeytyvään osuuteen, saadaan kokeellisilla ja lasketuilla arvoilla lähes yhtä hyvä korrelaatio passiivisesti imeytyvien molekyylien osalta. Passiivisen permeaation lisäksi molekyylit voivat imeytyä jonkin aktiivisen kuljetusmekanismin avustuksella kuten oligopeptiditransportterilla. Tutkielman kokeellisessa osassa selvitettiin, onko Orion Pharman käyttämässä Caco-2 solulinjassa oligopeptiditransportteri (PepT1) -aktiivisuutta. Samalle solulinjalle määritettiin myös sopiva kasvatustiheys 24-kuoppalevyille. Solulinjassa voitiin osoittaa olevan PepT1-aktiivisuutta. PepT1-transportterien substraateille kehitettiin alustava suurtehoseulontamenetelmä. Seulontamenetelmä perustuu Val-Lys-Fitc -dipeptin ja tutkittavan molekyylin kilpailevaan sitoutumiseen Caco-2 solujen pinnassa oleviin PepT1- transportteriproteiineihin. Menetelmällä voidaan yksinkertaisella järjestelyllä ja fluoresenssispektrometrillä arvioida uusien lääkeainekandidaattien mahdollista PepT1-aktiivisuutta. Asiasanat: solulinja, imeytyminen, QikProp, oligopeptiditransportteri, PepT1 ja Val-Lys-Fitc 54

55 VIRUSTEN JA DNA-PLASMIDIEN ANNOSTELU NANO- JA MIKROPARTIKKELIEN AVULLA Sonja Thors Farmasian teknologia, Farmasian ja biofarmasian laitos, Kuopion yliopisto Tällä hetkellä markkinoilla olevat rokotteet eivät ole riittävän tehokkaita; ne vaativat tehosteannoksia ja annostelu tapahtuu useimmiten neulalla lihakseen. Virusten ja DNA-plasmidien annostelua polymeeripartikkelien avulla on tutkittu parin viime vuosikymmenen ajan ja se on avannut uusia mahdollisuuksia lääkekehitykseen. Kapseloimalla virus tai DNA-plasmidi polymeeripartikkelin sisään voidaan mm. pidentää antigeenin vaikutusta, käyttää muita annostelutapoja ja -reittejä, suojata antigeenin hajoaminen elimistössä ja pidentää annosväliä. Tähän päivään mennessä polymeerikapselointia on kokeiltu lähinnä syöpälääkintään sekä rokotteisiin. Tässä tutkielmassa on tutkittu poly( D,L -laktidi-ko-glykoli hapon) (PLGA), kitosaanin, alginaatin ja gelatiinin kayttöä virusten ja DNA-plasmidien kapselointiin. Erityistä huomiota on kiinnitetty valmistusmenetelmiin, partikkelikokoon, kapseloimistehokkuuteen, stabiiliuteen, antigeenien tehoon ja antoreitteihin. Tutkittavat polymeerit eroavat toisistaan niin partikkelien valmistusmenetelmien, partikkelikoon kuin stabiloimiskeinojenkin osalta. Tästä syystä yksittäinen polymeeri ei ole paras vaihtoehto kaikissa tapauksissa vaan sopivin materiaali on valittava aina tapauskohtaisesti. Polymeerin valintaan vaikuttaa käyttötarkoituksen lisäksi myös kapseloitava antigeeni. Laajasta tutkimuksesta huolimatta kapseloiduilla antigeeneillä on ollut huonompi teho kuin eläviä viruksia sisältävillä rokotteilla. Antigeenin kapseloinnilla on kuitenkin saavutettu parempi immuunivaste kuin paljaassa vesiliuoksessa annostelluilla antigeeneillä. Vaikka tulokset ovat olleet lupaavia, jatkokehitystä tarvitaan yhä entistä parempien valmisteiden löytämiseksi. Kokeellisessa osassa tutkittiin baculovirusten kapselointia alginaatti-gelatiinimikropartikkeleihin. Mikropartikkelien valmistusmenetelmä pyrittiin optimoimaan ennen virusten kapselointia partikkelien sisään. Ihanteellisen partikkeliformulaation löytämiseksi kokeiltiin erilaisia sekoitusnopeuksia, valmistusmenetelmiä, lähtöaineiden tilavuuksia, lämpötiloja ja liuottimia. Optimaalisinta valmistusmenetelmää käyttäen virusten kapseloitumistehokkuus jäi alhaiseksi (0,5 %), mutta määrällisesti eläviä viruksia kapseloitui huomattava määrä. Viruksen ilmentämä geeni havaittiin eläinkokeissa, kun koe-eläimeen injisoitiin alginaatti-gelatiinikapseloituja viruksia heti partikkelivalmistuksen jälkeen. Jatkotutkimuksia tarvitaan baculoviruksille sopivamman valmistusmenetelmän löytämiseksi ja lisäksi partikkeleille on kehitettävä sopiva kuivausmenetelmä, joka ei tuhoa kapseloituja viruksia. Avainsanat: virus, DNA-plasmidi, nano- ja mikropartikkeli, PLGA, kitosaani, alginaatti ja gelatiini 55

56 LISENSIAATINTUTKIMUSTIIVISTELMÄT 56

57 MELTING BEHAVIOUR AND QUANTIFICATION OF LOW AMORPHOUS LEVELS IN SUGARS AND SUGAR ALCOHOLS Minna Hurtta Department of Chemistry, University of Jyväskylä, P.O Box. 35, Jyväskylän yliopisto The licentiate thesis summarizes my share of the research on sugar alcohols and sugars carried out on co-operation with Danisco Sweeteners. The samples examined in these studies were sucrose, glucose, fructose and maltitol. The research was divided into three parts: the melting behaviour, the preparation of amorphous sample and the development of a method for quantification of low amorphous content. The interest of amorphous form and the quantification of low levels of the amorphous content are rapidly expanding. The reason is that even a small amorphous content may have considerable impact on the bioavailability, the processability and stability of the system and the performance of the material during product manufacture and use. There has been remarkable interest in the development of techniques for the detection and quantification of low levels of amorphous material. There are plenty of techniques available, but the methods are usually sample-specific. In addition, the quantity of the amorphous material may be small in proportion to the crystalline mass and it can be difficult to detect using traditional analytical techniques hence many analytical techniques are insufficiently sensitive to allow such measurements. For quantification of amorphous content, there has to be a crystalline and an amorphous sample. For that reason, the preparation of amorphous sample is the essential part of method development. On of the most used method for preparation of amorphous sample is melting of the crystalline sample followed by rapid cooling. However, when melting temperatures of sugars are reviewed in the literature, it is discovered that values for same sugar may slightly differ from each other. The melting behaviour of sucrose, glucose and fructose was studied in this study. The melting peaks were determined with DSC and the start of decomposition was studied with TG at different rates of heating. In addition, melting points were determined with a melting point apparatus. There were differences between the different samples of the same sugar and the rate of heating had remarkable effect on the melting behaviour. The melting of sugars is not unambiguous event. The basic objective of this thesis was to develop a method for quantification of low levels of amorphous content in sugars and sugar alcohols. The technique chosen was hyperdsc, which is one of the newest DSC techniques. The methods for the quantification of low levels of amorphous content of maltitol and sucrose with hyperdsc were developed. There are many ways known to form amorphous sugars and sugar alcohols (dry-milling, the quenching the melt, the rapid drying of solutions, the freeze-drying, etc). In this study, the amorphous maltitol was prepared from crystalline by melting. The amorphous form of sucrose could not be prepared in the same way due to chemical degradation during melting and therefore, the amorphous sucrose was prepared by spray drying. For amorphous samples, the effect of annealing time and temperature to the change of specific heat at the glass transition region were studied. The annealing temperature had notable effect on the change of specific heat. It was also found that as annealing time increased, the glass transition temperature moved to a higher temperature and the change of specific heat increased. The methods for the quantification of low amorphous levels were based on the fact that the change of specific heat at the glass transition is linearly proportional to the amorphous content. The following linear regression between Cp and the amorphicity was obtained: Cp = X (R=0.996) for maltitol and Cp= X (R=0.999) for sucrose. The limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) values were and % for maltitol and and % for sucrose. The effect of grinding time on the amorphous content of crystalline sucrose was studied and a correlation between grinding time and amorphous content of the sucrose was found. 57

58 A review of the literature involves some theory regarding to amorphous state, preparation of amorphous sample and the basics of determination of amorphous content in hyperdsc. The list of original publications: I M. Hurtta, I. Pitkänen and J. Knuutinen, Melting behaviour of D-sucrose, D- glucose and D- fructose, Carbohydr. Res., 339 (2004) II III M. Hurtta and I. Pitkänen, Quantification of low levels of amorphous content in maltitol, Thermochim. Acta, 419 (2004) M. Hurtta, I. Pitkänen and P. Harjunen, Quantification of amorphous content in sucrose by hyper DSC, Eur. J. Pharm. Sci., submitted 58

59 TABLETTIEN TEKSTUURITUTKIMUS UUSIA SUUNTAUKSIA FARMASEUTTISEEN FYSIIKKAAN Mikko Koivisto Teollisuusfysiikan laboratorio, Fysiikan laitos, Turun yliopisto Tabletti on suosituin lääkkeenantomuoto, ja tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää röntgendiffraktioon perustuvan tekstuuritutkimuksen tablettitutkimukseen tarjoamia uusia mahdollisuuksia. Koska tabletit puristetaan useimmiten kiteisistä partikkeleista, on tuloksena monikiteinen kappale. Monikiteisen kappaleen kiteiden etuoikeutettua suuntautumista eli tekstuuria voidaan tutkia tekstuurigoniometrian avulla nykyaikaiset tekstuurinmäärityslaitteet mahdollistavat automaattiset ja vaivattomasti suoritettavat mittaukset. Nykyaikaista tekstuurigoniometriaa ei kuitenkaan ole vielä sovellettu farmaseuttisten tablettien tutkimuksessa. Kuitenkin on selvää, että tabletin kiteiden suuntautumisella on vaikutusta tabletin ominaisuuksiin. Tutkimuksen teoriaosassa on lyhyesti kuvattu röntgendiffraktion, tekstuuritutkimuksen ja tabletoinnin teoriaa. Lisäksi pyrittiin tekemään mahdollisimman kattava katsaus aikaisemmin julkaistuihin vähälukuisiin tablettitekstuuritutkimuksiin. Tätä tutkimusta varten valmistettiin tabletteja sekä käsikäyttöisellä puristimella että puristussimulaattorilla. Malliaineiksi valittiin laktoosi, mannitoli, natriumkloridi, ibuprofeeni, glukoosi, dikalsiumfosfaatti ja asetyylisalisyylihappo. Puristussimulaattori mahdollistaa tabletointiprosessin tutkimisen tarkasti, jolloin saadaan tietoa mm. tabletoitavan aineen myötöpaineesta, joka kuvaa sitä, tapahtuuko tabletoituminen elastisesti, plastisesti vai fragmentoitumalla. Tekstuuritutkimukset tehtiin ATC-3 -tekstuurigoniometrillä varustetulla Philips Expert Pro MPD -diffraktiolaitteistolla. Röntgendiffraktion avulla määritettiin myös tablettien kidekokoa ja hilavääristymätiheyttä. Röntgendiffraktiomenetelmien lisäksi määritettiin lähtöainejauheiden tiheys, huokoisuus ja ominaispinta-ala sekä radiaalinen murtolujuus; osa tableteista kuvattiin elektronimikroskoopilla. Useimmat tutkitut aineet teksturoituivat tabletoitaessa, ja tekstuurin syntyminen ja voimakkuus näyttäisi liittyvän aineen tabletointikäyttäytymiseen: Eniten teksturoituvat aineet, jotka tabletoituvat sekä plastisesti että fragmentoituen. Myös lähinnä fragmentoitumalla tabletoituvat aineet teksturoituvat, mutta elastisten aineiden ei havaittu teksturoituvan. Teksturoitumiseen vaikuttaa myös tabletoitavan jauheen partikkelikoko ja muoto: mitä pienemmät ja epämääräisemmän muotoiset partikkelit, sitä vähäisempi tekstuuri. Käytetyn puristuspaineen ei havaittu selvästi vaikuttavan teksturoitumisen suuntaan tai määrään. Koska tekstuuritutkimuksista on vaikea saada numeerista dataa, ja koska tulosten tulkinta perustuu paljolti napakuvioiden ja suuntajakaumafunktioiden tarkasteluun, on tekstuurin ja tablettien muiden ominaisuuksien välisten korrelaatioiden tutkiminen vaikeaa. Kuitenkin esimerkiksi tablettien murtolujuuden havaittiin olevan yhteydessä tekstuurin määrään ja laatuun. Tämän tutkimuksen perusteella tekstuuritutkimus näyttäisi tarjoavan uuden ja monipuolisen työkalun farmaseuttiseen fysiikkaan. Asiasanat: tekstuuri, tabletointi, röntgendiffraktio, napakuvio, puristuskäyttäytyminen, laktoosi, mannitoli, natriumkloridi, ibuprofeeni, glukoosi, dikalsiumfosfaatti, asetyylisalisyylihappo 59

60 VÄITÖSKIRJATIIVISTELMÄT 60

61 INCREASING PROCESS UNDERSTANDING OF WET GRANULATION BY SPECTROSCOPIC METHODS AND DIMENSION REDUCTION TOOLS Anna Cecilia Jørgensen Department of Pharmaceutics, the Danish University of Pharmaceutical Sciences Anna Cecilia Jørgensen s PhD thesis was defended at the Faculty of Pharmacy of the University of Helsinki on October 9th Professor Kenneth R. Morris from Purdue University was the opponent and Prof. Jouko Yliruusi was the custos. An electronic version of the thesis is obtainable from: INTRODUCTION Wet granulation is a common unit operation applied in the pharmaceutical industry. It is a complex process where several interrelated phenomena take place simultaneously. Moreover, it exposes the processed materials to harsh conditions such as increased temperatures, significant amount of moisture and mechanical stress. This may alter the solid-state of the active substances or excipients. Thus, in order to increase process understanding of wet granulation, methods providing real-time information from the process would be valuable. AIMS OF THE STUDY The aim of the present study was to investigate the use of spectroscopic methods, near-infrared (NIR) and Raman spectroscopy, in elucidating phenomena taking place during wet granulation. More specifically, a processing-induced transformation, hydrate formation, which takes place during wet granulation, was studied. In addition, the use of near-infrared spectroscopy in the process monitoring of high-shear wet granulation was studied by comparing it to impeller torque measurements, which is an established process monitoring method. Moreover, the difficulty to grasp the large data amounts produced by different process monitoring methods was addressed by combining the data and visualizing it with projection methods. Two different approaches were investigated, principal components analysis and self-organizing maps, which are linear and non-linear methods, respectively. MATERIALS AND METHODS Theophylline and caffeine were used as hydrate forming model drugs. α-lactose monohydrate and microcrystalline cellulose (MCC) were used as excipients. A mixture design was applied to study the effect of the excipients on hydrate formation. The pure substances or mixtures were granulated with purified water either in a planetary mixer or in a small-scale high-shear mixer. NIR and Raman spectroscopy were applied to monitor the hydrate formation. The measurements were performed off- or at-line. When using the high-shear mixer, temperature of the powder mass and impeller torque were recorded as well. RESULTS It was possible to follow the processing-induced transformation, namely hydrate formation, by both spectroscopic methods. By NIR, the transformations are mainly observed as an appearance of a specific hydrate water absorbance, whereas with Raman, changes in the vibrations of the molecule can be monitored. α-lactose monohydrate or microcrystalline cellulose did not disable the measurements, but altered the rate of transformation. Microcrystalline cellulose retarded the hydrate formation, whereas the results suggest that α-lactose monohydrate slightly increased the rate of transformation. NIR reflected also macroscopic changes taking place during the high-shear granulation process, such as the increase in size and consolidation of the agglomerates, by changes in the baseline of the spectra. A saturation of the over-all water absorbance was observed for mixtures containing MCC, and this could be related to an increase of the impeller torque. 61

62 The combination of process data enabled the study of the state of the process in a way which none of the individual process measurements allowed. Both projection methods were able to solve the task of visualizing the state of the process. Hence, the use of all of the available process data in a multidisciplinary way, allowed by the projection methods, may contribute to the creation of better process understanding. The thesis is based on the following papers: I Räsänen, E., Rantanen, J., Jørgensen, A., Karjalainen, M., Paakkari, T., Yliruusi, J., 2001: Novel identification of pseudopolymorphic changes of theophylline during wet granulation using near infrared spectroscopy. J.Pharm.Sci., 90, II Jørgensen, A., Rantanen, J., Karjalainen, M., Khriachtchev L., Räsänen, E., Yliruusi, J., 2002: Hydrate formation during wet granulation studied by spectroscopic methods and multivariate analysis. Pharm.Res., 19, III Airaksinen, S., Luukkonen P., Jørgensen, A., Karjalainen, M., Rantanen, J., Yliruusi, J., 2003: Effects of excipients on hydrate formation in wet masses containing theophylline. J.Pharm.Sci., 92, IV Jørgensen, A.C., Luukkonen, P., Rantanen, J., Schæfer, T., Juppo, A.M., Yliruusi, J., 2004: Comparison of torque measurements and near-infrared spectroscopy in characterization of a wet granulation process. J.Pharm.Sci. 93, V VI Jørgensen, A.C., Airaksinen, S., Karjalainen, M., Luukkonen, P., Rantanen, J., Yliruusi, J., 2004: Role of excipients in hydrate formation kinetics of theophylline in wet masses studied by near-infrared spectroscopy. Eur.J.Pharm.Sci. 23, Jørgensen, A.C., Rantanen, J., Luukkonen, P., Laine, S., Yliruusi, J., 2004: Visualization of a pharmaceutical unit operation: wet granulation. Anal.Chem. 76, Anna Cecilia Jørgensen works at present as an assistant professor at the Danish University of Pharmaceutical Sciences, formerly known as the Royal Danish School of Pharmacy. She is a part of the Particle Design research group, which focuses on the formulation and processing of particulate drug delivery systems: Pelletization in high shear mixers and rotor fluidized beds, micro encapsulation by spray drying and the compression and compaction of powder systems. Furthermore, atomization of liquids, e.g. effervescent atomization, forms part of the group s research. Anna can be contacted by sending to [email protected]. Although the foreign name, Anna knows Finnish. 62

63 ROLE OF EXOGENOUS AND CELL SURFACE GLYCOSAMINOGLYCANS IN NON-VIRAL GENE DELIVERY Marika Ruponen Kuopio University Publications A. Pharmaceutical Sciences p. In principle, gene therapy offers a selective and specific way to treat both genetic and acquired diseases. In gene therapy, the absence, malproduction or too low level of a protein is compensated by transferring the cdna for the gene of interest with necessary regulatory sequences in plasmid DNA into the target cells. This triggers the production of the protein in correct form and at the right level. The most common group of delivery systems in gene therapy are the viral vectors, which are efficient but may have problems related to their production and safety. In contrast, non-viral systems are rather safe and easy to produce but they have low efficacy in vivo. The development of safer and more efficient gene delivery systems is a prerequisite for the development of gene therapy, but it requires deeper understanding of the mechanisms and barriers of gene delivery. The purpose of this study was to clarify the role of exogenous and cell surface glycosaminoglycans (GAGs) in non-viral gene transfer mediated by cationic polymers (dendrimer; poly-l-lysine, PLL; polyethyleneimine, PEI) and liposomes (N-(1-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N, N, N-trimethyl ammonium methylsulfate, DOTAP; DOTAP/1,2-dioleyl-3-phosphatidylethanolamine, DOPE; dioleyloxypropyl trimethylammonium bromide, DOTMA/DOPE; DOTAP/cholesterol; dioctadecylamidoglycylspermine, DOGS). These polymers and lipids form complexes with DNA thereby facilitating the transfer of DNA into the target cells. The effect of exogenous hyaluronan (HA), chondroitin sulfate C (CS), chondroitin sulfate B (DS) and heparan sulfate (HS) on the physicochemical properties of the complexes including their condensation/relaxation and release of DNA from the complexes. Also the influence of GAGs on the cellular uptake, intracellular distribution and transfection efficiency of the DNA complexes was studied. These studies showed that interactions between GAGs and gene delivery complexes were dependent on both the properties of the GAG and carrier. The carriers could be divided into three classes based on their interactions with exogenous GAGs: extra sensitive (PEI and DOGS), sensitive (DOTAP, DOTAP/Cholesterol, PLL and dendrimer) and resistant (DOTAP/DOPE and DOTMA/DOPE) carriers. The transfection efficiency of both the extra sensitive and the sensitive complexes was blocked by sulphated GAGs while the resistant complexes retain some transfection efficiency after exposure to sulphated GAGs. The block in transgene expression of extra sensitive complexes was due to their premature relaxation and release of DNA from the carrier by the sulphated GAGs. In the case of sensitive complexes, neither altered physicochemical properties nor cellular uptake of the complexes could explain inhibition in transgene expression. This suggests that the exogenous GAGs may alter the intracellular kinetics of the complexes. The strength of interaction of GAGs on the complexes correlates with local and overall anionic charge density, conformation and flexibility in the following order: HS DS>CS>HA. Exogenous GAGs were transffered into cell with free carrier, with DNA complexes and in some cases with carrier released from DNA, in all cases without accumulation into nucleus. The role of cell surface GAGs/PGs in gene delivery was investigated in cell cultures by modifying cell surface GAG profile by genetic and chemical means. The quantity of cell surface GAGs was correlated with the cellular uptake and transgene expression mediated by cationic polymers (PLL and PEI) and lipids (DOTAP and DOTAP/DOPE). These studies showed that cell surface GAGs/PGs are not needed but they can probably act as receptors for gene delivery complexes. However, binding and internalization of the complexes via cell surface GAGs/PGs inhibits transgene expression, suggesting that a cellular uptake route via GAGs/PGs is not favourable for successful transgene expression. In conclusion, the present study shows that extracellular GAGs and cell surface GAGs/PGs are important barriers in non-viral gene transfer. The differences in transfection efficiency between different carriers, cell types and tissues may be explained by the quality and quantity of extracellular and 63

64 cell surface GAG profile. Deeper understanding on the role of GAGs and PGs in gene transfer provides new strategies for the development of gene delivery vehicles for gene therapy. Medical Subject Headings: gene therapy / methods, gene transfer techniques, transfection, glycosaminoglycans, polymers, liposomes, proteoglycans, cell culture 64

65 STARCH ACETATE AS A COATING POLYMER FOR ORAL EXTENDED RELEASE PRODUCTS FILM-FORMING ABILITY, PERMEABILITY AND PLASTICIZATION Maarit Tarvainen Kuopio University Publications A. Pharmaceutical Sciences p. Polymeric film coating techniques have often been utilized in controlled drug release systems for orally administrated medications because they enable the prolonged and precise release of a drug with good reproducibility and versatile drug release properties. Currently, the pharmaceutical industry is replacing film coatings that are based on organic solvent polymer solutions with aqueous coating processes for safety, environmental and economic reasons. Due to limitations in commercially available polymer dispersions that are used as drug release controlling coatings, there is a need for novel polymers with better film-forming characteristics and also for novel coating additives, especially plasticizers that could improve the mechanical properties of existing film-formers. The objective of the present study was to assess starch acetate (SA), having a high degree of substitution (2.8), as a novel coating polymer for oral extended release products. Besides film- forming, mechanical and permeability properties, and drug release from SA-coated tablets, the plasticization of SA and the critical parameters affecting plasticization efficiency were also evaluated. These studies were performed both with organic solvent and aqueous dispersion-based SA films using analogous ethyl cellulose (EC) films as references. A computerized method (VolSurf with GRID) was found to be a valuable tool for predicting the plasticization efficiency from the three-dimensional molecular structure of a plasticizer. Favorable properties identified for the efficient SA plasticizer were, for example, both hydrophilic and hydrophobic regions on the molecule, small rugosity and a strong hydrogen bonding capacity. The potent plasticizers (e.g., triacetin, triethyl citrate (TEC) and the novel plasticizer, 2-octenyl succinic anhydride (OSA)) were able to decrease the otherwise high glass transition temperature (T g ) of SA (163 C) and effectively improve mechanical properties of SA films. OSA strongly enhanced filmforming properties of the normally brittle EC, too. In the case of aqueous SA dispersion, plasticization was succesfully performed by combining OSA and TEC, which resulted in a low minimum film-formation temperature (< 8 C) and a sub-zero T g of the resulting film. In general, both organic solvent and aqueous dispersion-based plasticized SA films showed remarkably better mechanical properties compared to EC, when considering their toughness, strength and flexibility. Due to the tightness and hydrophobicity of the highly acetylated potato starch films, they also had low water vapour and drug permeabilities. Moreover, the aqueous SA dispersion coating effectively extended drug release (e.g., propranolol and ibuprofen) from the hydrophilic tablet core, and demonstrated good durability against osmotic pressure. The model compounds predominantly permeated through micro-pores in the SA coatings, which resulted from the leaching of water-soluble excipients from the dispersion. Partitioning through the hydrophobic polymer film matrix was minimal. The advantageous properties of the plasticized SA films predominantly resulted from the dense film structure, which was due to close packing of the branched SA polymeric chains. In conclusion, these results suggest that SA can be considered as a useful coating material for oral extended release applications, due to its excellent mechanical properties and its potential to control drug release. Medical Subject Headings: drug delivery systems, delayed-action preparations, tablets, excipients, polymers, starch / analogs & derivatives, cellulose / analogs & derivatives, permeability, plasticizers 65

66 STARCH-ACETATE FILMS AND MICROPARTICLES DEGRADATION, EROSION AND DRUG RELEASE IN VITRO Laura Tuovinen Kuopio University Publications A. Pharmaceutical Sciences p. Biodegradable polymers are degraded and eliminated from the body, thus avoiding the necessity for surgical removal of the device after the release of the drug. Synthetic and natural biodegradable polymers have been extensively studied for pharmaceutical applications. For example, biodegradable polymers hold enormous potential in the delivery of modern peptide and protein drugs. Starch is a natural biodegradable polymer. Two factors, its hydrophilicity and the rapid enzymatic degradation limit the use of native starch in controlled drug delivery. α-amylase is the main enzyme involved in the hydrolysis of native starch. The objective of this study was to evaluate starch acetates (SAs) as controlled release materials for parenteral use. The average degree of substitution (DS) per glucose residue of starch was 1.9 (SA DS 1.9) or 2.6 (SA DS 2.6). The enzymatic degradation (decrease in molecular weight) and the erosion (weight loss) of SA films were studied in vitro. Also, factors affecting drug release profiles from the SA films and microparticles were evaluated in vitro. The cellular uptake of SA microparticles was determined using cultured human retinal pigment epithelial (RPE) cells. Increasing levels of acetylation of native starch decreased the water uptake by the matrix. In the presence of enzymes, the rate of degradation and erosion of native starch was substantially reduced by using SAs. The degradation and/or erosion of SAs were faster in the presence of α-amylase, in human serum and in RPE-cell homogenate when compared to the situation with only PBS ph 7.4 without enzymes. These results indicate that the biodegradability of starch was retained despite its chemical modification. The drugs were released more slowly from the SA films than from the native starch. The release of drugs was slower from those SA films with higher degrees of acetylation. In addition to the DS of SA, the molecular weight and lipophilicity of the drug and the release medium strongly affected the release of drugs from the SA films. In the presence and absence of enzymes, the release of small molecules (M w 332) from the SA films was continuous. The drug release rate decreased as the lipophilicity of the drug increased. Macromolecules (M w 4400) showed biphasic release profiles from the SA films in the presence and absence of enzymes. The initial fast release of macromolecules from the SA DS 1.9 films was followed by a phase of slower release, but no release occurred after this initial release from the SA DS 2.6 film under the studied conditions. The drug release from the SA DS 1.9 films was enhanced in the presence of α-amylase and in serum. The enzymes did not have any major influence on the release of drugs from the SA DS 2.6 films. During a 24-hour incubation, 8.1% of cultured human RPE cells took up calcein-containing SA DS 2.6 microparticles, as determined by flow cytometry. The degradation of SA DS 2.6 was substantially faster in the RPE-cell homogenate than in PBS ph 7.4. Incubation of cultured RPE cells with blank or calcein-containing SA microparticles did not markedly affect the viability of the cells, as determined using MTT assay. In conclusion, the present results suggest that SAs might be utilized in controlled and intracellular drug delivery. Thus, SAs may provide good alternatives to existing biodegradable polymers for drug delivery. Medical Subject Headings: acetylation, alpha-amylase, biodegradation, drug delivery systems, polymers, starch / analogs & derivatives 66

67 ARTIKKELIT 67

68 PAT JA FYSIKAALINEN FARMASIA Tero Närvänen Orion Pharma Lyhenne PAT tulee vastaan tänä päivänä monesta tuutista, esimerkiksi siihen liittyvän koulutustarjonnan määrä on vuoden sisällä noussut monikertaiseksi. Mitä tämä lyhenne oikeastaan tarkoittaa ja liittyykö se jotenkin fysikaaliseen farmasiaan? Lääketeollisuuden prosessien kyvykkyysmittarit ovat kansainvälisessä vertailuissa saaneet keskimäärin alhaisia tuloksia. Verrattuna moneen muuhun teollisuuden alaan esimerkiksi varaston kiertonopeus, hylättyjen erien lukumäärä, ja prosessin toistettavuudesta kertova CpK-arvo ovat lääketeollisuudessa selvästi huonompia. Osa tuloksista voi selittyä lopputuotteen tiukoilla laatuvaatimuksilla, mutta myös lääketeollisuudella on syytä katsoa peiliin. Siinä missä esimerkiksi paperi- ja elintarviketeollisuudessa on hyödynnetty tehokkaita ja moderneja analyysimenetelmiä ja prosessinaikaisia laadunkontrollityökaluja, on lääketeollisuudessa suosittu vanhoja, viranomaisten hyväksymiä analyysimenetelmiä pohjautuen perinteiseen loppukontrollianalytiikkaan. Arvosteluun on osittain vastattu niin, että kyllähän menetelmiä ja prosesseja mielellään parannettaisiin, mutta kun kaikki muutokset joudutaan hyväksyttämään kalliin ja byrokraattisen systeemin kautta lääkeviranomaisilla. Yhdysvaltain lääkeviranomainen (FDA) on seurannut kehitystä huolestuneena ja lähtenyt aloitteellisesti ohjaamaan lääketeollisuuden toimintaa monen uuden ohjeiston avulla. Yksi mielenkiintoisimmista on: PAT - A Framework for Innovative Pharmaceutical Development, Manufacturing, and Quality Assurance, September Siinä PAT (Process Analytical Technology) määritellään seuraavasti: A system for designing, analyzing, and controlling manufacturing through timely measurements (i.e., during processing) of critical quality and performance attributes of raw and inprocess materials and processes with the goal of ensuring final product quality. PATin tavoitteena on siis parantaa prosessiymmärrystä ja pystyä hallitsemaan lääkevalmistusprosessia siten, että lopputuotteen laatu varmistettaisiin valmistuksen aikana. Siihen liittyy myös ennustettavuus. Pisimmälle viedyssä prosessin hallinnassa prosessia voidaan säätää ja kontrolloida perustuen muuttuviin lähtötietoihin tai prosessinaikaisiin tietoihin, jolloin lopputuotteen analytiikasta voidaan luopua kokonaan, koska tuotteen laatu varmistetaan PAT-pohjaisen prosessidatan avulla. Tämä edellyttää kuitenkin syvällistä prosessiymmärtämystä, nopeiden in-line tai on-line analyysiteknologian hyväksikäyttöä ja osittain myös uudenlaisen laadunvalvontakulttuurin sisäistämistä. Fysikaalinen farmasia määritellään farmasian tutkimusalaksi, joka soveltaa luonnontieteiden, erityisesti fysiikan, teoreettisia perusteita ja käytännön tutkimusmenetelmiä farmaseuttisten ilmiöiden tutkimiseen ja käytännön farmasiaan. Lähes kaikki kiinteiden lääkemuotojen farmaseuttiset osaprosessit, esimerkiksi kiteytys, jauhaminen, rakeistus, sekoittaminen, puristus ja kalvopäällystys, ovat mitä parhaimpia fysikaalisen farmasian tutkimuskenttiä. FDA:n PAT-aloite tuleekin mielestäni nostamaan fysikaalisen farmasian merkitystä entisestään, koska ilman prosessien ymmärtämistä ei PAT:ia voida soveltaa ja taas toisaalta ilman fysikaalisten ilmiöiden ymmärtämistä meillä ei ole syvällistä prosessiymmärtämistä. Jotta PAT toteutuisi suomalaisessa lääketeollisuudessa, tarvitaan laajapohjaista yhteistyötä yliopistojen, PAT-analytiikan palveluntarjoajien ja teollisuuden kesken. Tässä kentässä fysikaalisen farmasian tutkimus ja osaaminen tulee olemaan hyvin keskeisessä roolissa. 68

69 FYSIKAALISEN FARMASIAN YHDISTYKSEN TUKIJAT Thermal Activity Monitor TAM Thermometric is a Swedish company which develops, manufactures and markets high sensitivity calorimeters worldwide. The calorimeters have found applications at universities and research institutes, biotechnical-, pharmaceutical-, defense-, and general chemical industry. Monitoring of biological and biotechnical processes Studies of ligand binding by the use of isothermal calorimetric titration ITC Determination of solution- sorption- and reaction enthalpy Studies of polymorphism Safety and risk assessment Validation of shelf life stability Studies of moisture induced crystallization Oxidation studies of polymers Determination of water vapour permeability through polymer materials Thermometric AB, Spjutvägen 5a, SE Järfälla, Sweden, Tel , Fax , [email protected], Suomessa: AboaTox Oy, Lemminkäisenkatu 36, FI TURKU, (puh), (fax), 69

70 70