Hevosten keinosiemennys Seminaaliplasma ja siirtosperman säilyvyys Maria Kareskoski ELT DiplECAR Kliinisen tuotantoeläinlääketieteen osasto 16.3.2013 Osasto / Henkilön nimi / Esityksen nimi www.helsinki.fi/yliopisto 15.10.2010 1
I. Hevosten keinosiemennys II. Siirtosperman säilyvyyteen vaikuttavia tekijöitä: Seminaaliplasma (SP) Sperman fraktiointi III. Siirtosperman käyttö ja raportointi Suomessa
I. Hevosten keinosiemennys Etuja: yhdestä ejakulaatista saa monta siemennysannosta tammojen määrää voi lisätä parhaat oriit saavat enemmän jälkeläisiä tammoja ja varsoja ei tarvitse kuljettaa (siirtosperma) tautien leviämistä voidaan rajoittaa loukkaantumisen riskit pienenevät sperma tutkitaan ja käsitellään voidaan käyttää myös ulkomaisia huippuoriita jalostukseen Suomessa oriin kilpailukäyttö mahdollista Haittoja: vaatii osaamista ja välineistöä eläinlääkäri joidenkin oriiden siittiöt kestävät huonosti säilytystä
Hevosten keinosiemennys hevosia Suomessa noin 75 000, varsoja syntyy vuosittain noin 4000 2010: lämminverisiä 1390, suomenhevosia 1680, loput ratsuja 422 ja poneja 575 2011: ratsuoriita 25, yht 340 astutusta, sekä 105 tuontispermaratsuoria joilla yht 265 tammaa poneja 140 kpl, yht 810 tammaa lv-oriita 187 kpl, tammoja yht 2259 kpl sh-oriita 206 kpl, tammoja 2115 kpl keinosiemennysasemia 83 www.hippos.fi
Hevosten keinosiemennys monissa Euroopan maissa valtaosa tammoista keinosiemennetään, täysiverisiä laukkahevosia lukuun ottamatta keinosiemennystoiminta on luvanvaraista MMM, Evira, Suomen Hippos ry keinosiemennysasema, lähetysasemat, vastaanottoasemat vastuueläinlääkäri, koulutettu avustaja Spermanotto Ma, ke, pe Keräyksiä/viikko 1 3 6 Tilavuus (ml) 47 56 51 Tiheys (siittiöitä/ml, x 10 6 ) 288 248 142 Siittiöitä/ejakulaatti (x 10 6 ) 11400 11700 5900 Siittiöitä/viikko (x 10 6 ) 11400 35200 35300
Keinosiemennys: spermanotto
Keinosiemennys: sperman käsittely Raakasperman siittiötiheyden määritys Laimennus 1:1 Motiliteetin arviointi Lisälaimennus: seminaaliplasman osuuden vähentäminen 5-20%:iin Tamman siemennys (tuoresperma) Tarvittaessa sentrifugointi Jäähdytys ja säilytys 5-10 C, 12-48h Tamman siemennys (siirtosperma)
Keinosiemennys: siemennyksen ajoittaminen Tuoresperma säilyy hedelmöittämiskykyisenä 2-3 vrk Siemennys mahd lähellä ovulaatiota Yleensä ennen ovulaatiota Mahd myös ovulaation jälkeen (<8-12h sisällä) Siemennykset aloitetaan kun Tamma on kiimassa Näyttää kiimaa Ödeemiä kohdussa (uä) Cervix auki, ei pitkää napukkaa Follikkeli 3.5-4 cm siem jtp kunnes ovuloi, tai hcg
Pakastesiemennykset hcgn käyttö tutkimuskertojen vähentämiseksi (annetaan kun follikkeli 3,5 cm) Jos yksi annos maksaa paljon, voidaan siementää vain kerran Tutkimukset aloitetaan hcg:n annon jälkeen siittolan rutiinien mukaisesti (6, 8 tai 12 tuntia) 36-44 tuntia hcg:stä voidaan tutkia tiheämminkin Siemennys, kun tamma näyttää olevan hyvin lähellä ovulaatiota tai ovulaation jälkeen Jos ei makseta siemennysannoksesta, tai jos olkia voi jakaa ja syväsiementää, voidaan siementää 2 kertaa/kiima Kun follikkeli 3,5 cm, annetaan hcg Seuraava tutkimus ja siemennys 24 h hcg:stä (ennen ovulaatiota) aamullapäivällä Seuraava tutkimus ja siemennys 48 h hcg:stä (ovulaation jälkeen) Parantaa tiineystuloksia, koska pystytään siementämään lähellä ovulaatiota ja ennen ovulaatiota Osasto / Henkilön nimi / Esityksen nimi www.helsinki.fi/yliopisto 15.10.2010 9
FH SB
Osuus (%) Osuus (%) 60 50 40 30 20 10 0 1991-1994 1995-1998 1999-2002 2003-2005 ks siittolassa siirtosperma astutus sh 60 50 40 30 20 10 0 1991-1994 1995-1998 1999-2002 2003-2005 ks siittolassa siirtosperma pakaste astutus lv
II. Seminaaliplasma (SP) ja siirtosperman säilyvyys Seminaaliplasma: lisäsukurauhasten tuottamaa nestettä prostata, bulbouretraalirauhaset, ampullat, rakkularauhaset ainesosia myös kiveksistä ja lisäkiveksistä hormonaalinen säätely, vuodenaika koostuu monista eri tyyppisistä aineista proteiinit, ionit, aminohapot, lipidit, hiilihydraatit, prostaglandiinit, steroidihormonit, oksitosiini
SP:n tehtävät siittiöiden huuhteleminen uretrasta siittiöiden kuljetus, ravinto ja suoja tamman kohdussa siemennyksen aiheuttaman kohtutulehduksen säätely kapasitaation ja akrosomireaktion säätely, sukusolujen välinen vuorovaikutus ennen hedelmöittymistä ja sen aikana kohdun verenkierto
SP:n vaikutukset siittiöihin säilytyksen aikana SP:n osuus < 5-10% parempi motiliteetti, vähemmän DNA-vaurioita säilytyksen jälkeen (24-48h) verrattuna 10-50%:n SP osuuksiin (Jasko et al. 1991, Braun et al. 1994, Todd et al. 2001, Alghamdi et al. 2002, Love et al. 2005) SP:n osuudella ei kuitenkaan ole vaikutusta tiinehtymisprosenttiin kun säilytysaika on lyhyt (10-12h) SP:n osuutta voi vähentää: laimentamalla spermaa riittävästi sentrifugoimalla keräämällä vain siittiörikkaat fraktiot
SP:n vaikutukset siittiöihin Vielä alhaisempi SP:n osuus (1.25%, 2.5%) saattaisi ylläpitää motiliteettia vielä paremmin (Pruitt et al. 1993, Todd et al. 2001) SP:n poiston jälkeen vähemmän DNA vaurioita (verrattuna 20%:n SP-osuuteen) (Love et al. 2005) SP:n osuudella ei vaikutusta tiinehtymiseen kun kuljetusaika lyhyt (~12h) Siittiötiheydellä ei niin suurta merkitystä, SP:n osuus tärkeämpi (Voge et al. 2010).
Sperm motility SP:n poisto VAP, VCL, VSL 180 160 140 * * SP1 SP0 120 100 80 60 WE * * * * 40 20 0 TMOT PMOT VAP VCL VSL TMOT, PMOT: ei eroa Components of fractionated stallion seminal plasma and the effects of seminal plasma on sperm longevity (Kareskoski 2011).
SP:n poisto vähensi DNA-vaurioita
SP:n vaikutukset : orivaihtelua eri oriiden siittiöt reagoivat eri tavalla SP:n läsnäoloon/poistoon, ja eri laimennusnesteisiin (Padilla and Foote 1991, Jasko et al. 1992, Akcay et al. 2006) SP:n vaihtokokeet: orivaihtelua, toisten oriiden SP on vähemmän haitallista (Aurich et al. 1996) ei eroja eri oriiden välillä 24 ja 48h kohdalla (Todd et al. (2001) Brinsko et al. (2000): good coolers ja bad coolers (prog mot 48h kylmäsäil jälkeen) SP:n poisto bad cooler oriilla: parempi prog mot 48h jälkeen, ei niin selvää eroa 24h kohdalla
Difference in motility (%) Motiliteetti säilytyksen jälkeen: orivaihtelua 30 25 HIGH 20 15 10 5 0-5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40-10 -15-20 Stallion -25 Difference in total motility Difference in progressive motility 53%:lla oriista totaalimotiliteetti oli korkeampi niissä näytteissä jotka sisälsivät SP:aa, verrattuna näytteisiin joista suurin osa SP:sta oli poistettu
Difference in DFI (%) Muutos DFI:ssä useimmilla oriilla samansuuntainen: vähemmän orivaihtelua DNA-vaurioiden määrässä, ja yleensä vähemmän DNA-vaurioita säilytyksen jälkeen kun suurin osa SP:sta poistettu 40 30 HIGH 20 10 0-10 -20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Stallion Difference in DFI
Laimennusneste ja SP Kenney ei välttämättä paras vaihtoehto jos SP poistettu Padilla and Foote (1991), Akcay et al. (2006): kun SP poistettu, motiliteetti parempi KMT:ssä kuin KE:ssä kun SP mukana, KE oli parempi kuin KMT Rigby et al. (2001): KMT parempi riippumatta SP:n läsnäolosta SP: Na 120 mm, K 26 mm KMT: Na 43 mm, K 10 mm KE: Na 1 mm, K 1 mm) Akcay et al. 2006 Skim milk Skim milk ext. + extender modified Tyrode s Total motility (%) 45.8 67.3 Progressive motility (%) 37.0 60.2 Osmotic pressure (mosm) 374.3 329.9 ph 6.77 7.35
Emissio ja ejakulaatio ori on nopea; reaktioaika keskim. 221 s, hyppyjä 1.8 pitkä teasing, useat hypyt SP:n tilavuus nousee (sperma laimenee) emissio juuri ennen ejakulaatiota (rauhaset alkavat tyhjentyä, sileälihassupistukset) ejakulaatio koostuu useista sykäyksistä muodostuu fraktioita
Sperman fraktiointi Menetelmä Siittiörikas fraktio Siittiököyhä fraktio Avoin keinovagina 300.5 (24-933) 54.0 (6-522) Suljettu keinovagina 259.0 (30-429) 85.0 (21-280) Equidame -fantom 288.0 (38-463) 12.0 (7-88) Kaikki menetelmät 300.0 (24-983) 54.0 (6-522)
Fraktioerot siittiörikkaissa fraktioissa parempi motiliteetti kuin kokoejakulaateissa (Varner et al. 1987) säilytettiin 25 C:ssa 12-24h, motiliteetin subjektiivinen arviointi, vain 2 hevosta rakkularauhasten poisto paransi motiliteettia ja elävyyttä 4h säil jälkeen (Webb et al. 1990) sentrifugoidut siittiörikkaat fraktiot parempia pakastuksen ja sulatuksen jälkeen kuin sentrifugoimattomat siittiörikkaat sekä sentrifugoidut kokoejakulaatit (mot, elävyys) (Sieme et al. 2004) siittiörikkaissa huonompi prog mot ja elävyys kuin siittiököyhissä (Akcay et al. 2006)
Fraktioeroja: Vähiten DNA-vaurioita siittiörikkaassa fraktiossa, joka säilytetty ilman SP:aa DIFF in motility (SP1 SP0) HIGH LOW Total motility (%) 1.79 ± 0.28 1.83 ± 0.31 Progressive motility (%) 1.12 ± 0.18 0.86 ± 0.15 Average path velocity (VAP, µm/s) 10.01 ± 1.56 12.30 ± 2.08 Curvilinear velocity (VCL, µm/s) 16.64 ± 2.60 23.95 ± 4.04 Straight-line velocity (VSL, µm/s) 4.83 ± 0.75 5.44 ± 0.92 Straightness (STR) -0.027 ± 0.004-0.038 ± 0.006 Linearity (LIN) -0.005 ± 0.001-0.016 ± 0.002 DFI (%) 7.61 ± 1.40 4.78 ± 1.34 DIFF in DFI (after storage - before storage) HIGH LOW DFI (%) in SP1 11.34 ± 1.79 13.58 ± 2.36 DFI (%) in SP0 3.53 ± 0.56 a 10.00 ± 1.69 b
Johtopäätöksiä orivaihtelua subfertiilillä oriilla kannattaa kokeilla eri menetelmiä: SP:n osuus, sentrifugointi, laimennusnesteen vaihto, fraktioerot SP:n osuuden pienentäminen vähentää DNA-vaurioita sentrifugoi tai laimenna riittävästi ei tarpeellista tai edes hyödyllistä kaikilla motiliteetin arviointi vaikeaa, SP:n vaikutukset motiliteettiin voivat olla päinvastaiset kuin DFI-arvoon vähiten DNA-vaurioita nähtiin sentrifugoidussa siittiörikkaassa fraktiossa
Oriin fertiliteettimarkkereita fertiliteetti vaihtelee oreittain oriin lisäksi tiinehtymistuloksiin vaikuttavat mm. vuodenaika, siemennyspaikka, tamman ikä ja historia, menetelmä (astutus/ks), siemennysten ajoitus sekä tamman ja oriin muu hoito fertiliteetin geneettisiä markkereita tutkittu ja löydetty seminaaliplasman komponenttien yhteys fertiliteettiin mm. CRISP-3 fertiliteetti ja sperman laatu eivät aina korreloi keskenään
III. Siirtosperman käyttö ja raportointi Suomessa The proportion of seminal plasma in transported insemination doses and the outcome of inseminations with transported stallion semen. 10th International Symposium on Equine Reproduction, 2010. Katila T, Kareskoski M, Venhoranta H, Virtala A-M. Uudet siirtospermalomakkeet 2007 2101 siemennettyä tammaa 3727 lomaketta = siirtosperma-annosta Poistettiin ratsut, sekä yhden oriaseman kaikki lomakkeet Jäi 3582 siirtoannosta
Tavoitteet Lomakkeen käyttö Onko kaikki tiedot täytetty? Ejakulaattien tietoja, siittiötuotanto sh ja lv erikseen Siirtoannosten valmistus Avoin/suljettu keinovagina Laimennussuhde (SP:n osuus) Annoksen siittiömäärät Säilytyksen vaikutus kesto motiliteetti Tiineys%, varsomis%
Oriasemat 37 oriasemaa 128 oria (min 1, max 14) keskim 3.5 oria/asema keskim 92 annosta/asema (min 1, max 498)
Lomakkeiden täyttö ja käyttö: tuloksia Useimmat oriasemat tekivät huolellista työtä Kaikki tiedot täytetty: 57% Ejakulaatin tiedot: 87% Laimennussuhde: 98% Annoksen siittiötiheys: 88% Annoksen siittiömäärä: 73%...mutta joillakin oli ongelmia: Annoksen tiheytenä mainittu ejakulaatin tiheys (2 asemaa) Ejakulaatin tiheyttä ei tiedossa (3 asemaa) Laimennussuhde ilmoitettu virheellisesti Laimennusneesteen määrää ei ilmoitettu, vain tyyppi/merkki
Ejakulaatin siittiötiheys
Ejakulaatin progressiivinen motiliteetti Suljettu keinovagina (66% annoksista) Avoin keinovagina (34%)
Siirtosperma-annos SP:n osuus miel <20% (s:e 1:4) Optimaalinen tiheys 25-50 x10 6 /ml Osasto / Henkilön nimi / Esityksen nimi 34 www.helsinki.fi/yliopisto 15.10.2010 34
Prog mot siittiöitä annoksessa Suositus: 1000 x 10 6 500-800 usein riittävä, riippuen oriista ka 1818 x 10 6 Osasto / Henkilön nimi / Esityksen nimi 35 www.helsinki.fi/yliopisto 15.10.2010 35
PMOT säilytyksen jälkeen ka 9h 40min, mediaani 10h kotitallisiemennys: 44%, siittolassa 56% ell 70%, siittolaellavustaja 30% pmot arvioitu 46%:ssa annoksista Osasto / Henkilön nimi / Esityksen nimi 36 www.helsinki.fi/yliopisto 15.10.2010 36
Johtopäätöksiä SP:n osuus ei vaikuttanut tuloksiin (tiineys/kausi, kierrot/tiineys) Vai voisiko tulokset olla parempia? 69,8% Säilytysaika kohtalaisen lyhyt, joten SP:n vaikutukset eivät ehkä tule esiin? Korkea siittiömäärä annoksissa voi kompensoida Kaikkien oriiden sperma ei sovellu siirtoihin (alhainen siittiötiheys, pmot) Sentrifugointi/suodatus voi olla hyödyksi Osasto / Henkilön nimi / Esityksen nimi 37 www.helsinki.fi/yliopisto 15.10.2010 37
Samuli Kelmi Pysteri Samuli Taikuri Osasto / Henkilön nimi / Esityksen nimi www.helsinki.fi/yliopisto 15.10.2010 38