Liuosten valmistus, puskuriliuokset ja ph

2 3 Liuosten valmistus, puskuriliuokset ja ph 740151P Biokemian menetelmät I BMTK / Juha Kerätär Päivän aiheet Mihin puskuriliuoksia tarvitaan biokemiassa? Miten liuoksia valmistetaan? Mitä on sterilointi? Luennon oppimistavoitteet: Opiskelija ymmärtää miksi biokemian töissä käytetään puskuriliuoksia. Opiskelija tietää, miten valmistetaan biokemian laboratoriossa käytettäviä liuoksia, ja osaa soveltaa tietoa käytännön töissä. Opiskelija tietää ja osaa kertoa, mitä tarkoittaa steriilityöskentely ja miksi se on tärkeää biokemiallisissa töissä. Keskustelkaa parin kanssa tai pienessä ryhmässä: Mikä on solun yleisin molekyyli? Mikä on solun ph? Miksi elimistön ph:ta säädellään? Keskusteluun aikaa hetki, jonka jälkeen otetaan muutamia kommentteja ja vastauksia. 1

4 5 6 Vesi NaCl-kide liukenee veteen Kaikki elävät solut tarvitsevat vettä. Solun massasta 60-90% on vettä. Biologiset reaktiot tapahtuvat vesipohjaisessa ympäristössä. Rakenteestaan johtuen vesimolekyyli on polaarinen. Toiset polaariset ja ionisoituvat yhdisteet liukenevat siihen helposti eli ovat hydrofiilisia. Poolittomat (ei-polaariset) yhdisteet liukenevat veteen huonosti tai eivät ollenkaan eli ovat hydrofobisia. Biologiset yhdisteet sisältävät usein sekä hydrofiilisiä että hydrofobisia osia, eli ne ovat amfipaattisia molekyylejä. Polaariset vesimolekyylit muodostavat vetysidoksia. ph ph-asteikko mittaa liuoksen happamuutta ja emäksisyyttä - Hapan aine: kykenee luovuttamaan protonin vesiliuoksessa, esim HCl. - Emäksinen aine: kykenee vastaanottamaan protonin vesiliuoksessa, esim. NaOH. ph-asteikko kuvaa liuoksen vapaiden vetyionien molaarista konsentraatiota [H + ] (joskus [H 3O + ]) Asteikon perustana puhtaan veden ionisoituminen: neutraaliksi ph:ksi on määritelty tilanne, jossa ionisoituneiden vety- ja hydroksyyli-ionien konsentraatio on sama, [H + ] = [OH - ] = 10-7 M (25 C). ph = -log 10[H+]; esim. -log 10(10-7 ) = 7 Pidettävä mielessä: ph-asteikko ei ole lineaarinen vaan logaritminen. Liuos, jonka ph on 3 on tuhat kertaa happamampi kuin liuos, jonka ph on 6. ph:n mittaaminen Biokemian laboratoriossa ph:n määrittämiseen esimerkiksi liuoksia valmistaessa käytetään tyypillisesti phmittaria. H + -elektrodit mittaa jännite-eron mitattavassa nesteessä olevan elektrodin ja referenssinesteessä olevan eletrodin välillä ph Muistettava kalibroida ph-mittari säännöllisesti referenssinäytteillä, joiden ph tunnettu! ph:n ja sen muutosten määrittämiseen voidaan käyttää myös ph:n muutoksiin reagoivia väriaineita. ph-indikaattoripaperi tai -liuska ph-väriaineet (esimerkiksi fenolipunainen soluviljelymedian ph:n seurannassa) 2

7 8 9 Puskuriliuokset (buffer solution) (Reed 2013) Puskuriliuoksen ph ei muutu, kun pieni määrä happoa tai emästä lisätään siihen. Klassinen puskuriliuos valmistetaan heikosta haposta ja sitä vastaavasta emäksestä. Kun hapon ja emäksen konsentraatio on on yhtä suuri, ph = pka ja liuoksen puskurointikapasiteetti on suurimmillaan. pka = happovakio, kuvaa hapon ionisoitumista ja sen kautta hapon vahvuutta Nyrkkisääntönä puskuri toimii parhaiten ph-alueella pka±1. Puskurin konsentraatio yleensä noin 10 mm 200 mm. Puskuriliuoksen ph voidaan laskea Henderson-Hasselbachin yhtälöstä: missä ph = pka + lg [A ] [HA] pka = käytetyn hapon happovakio [A - ] = emäksen konsentraatio [HA] = hapon konsentraatio Yleisiä puskuriliuoksia Klassisia puskureita ovat esim. fosfaatti-, karbonaatti-, asetaatti- ja sitraattipuskurit. Valmistetaan aina heikosta haposta ja emäksestä. Tehdään tyypillisesti kirjallisuudesta löytyvän ohjeen tai taulukon mukaan. Toisiaan vastaavasta emäs- ja happoliuoksesta tehdään saman konsentraation liuokset, joita sekoitetaan tietyssä suhteessa, jotta saadaan haluttu ph. Esimerkki: Valmistetaan 50 mm Na 2HPO 4 ja 50 mm NaH 2PO 4 liuokset. Sekoitetaan näitä ph-mittarin avulla ph:ta seuraten 18,75 ml ja 31,25 ml, kunnes on saatu aikaan ph 6,6 50 mm fosfaattipuskuriliuosta noin 50 ml. http://www.sigmaaldrich.com/life-science/corebioreagents/biological-buffers/learning-center/buffer-referencecenter.html Yleisiä puskuriliuoksia Joidenkin yleisten puskurien ph-alueita (Reed 2013). Monet perinteisten puskurien komponenteista (esim. fosfaatti, sitraatti) voivat vaikuttaa solujen aineenvaihduntaan. On kehitetty synteettisiä puskurimolekyylejä (ns. Goodin puskurit) jotka soveltuvat etenkin biokemiallisiin ja biokemiallisiin kokeisiin. Tyypillisesti nämä ovat ns. zwitterionisia molekyylejä, eli niissä on sekä positiivisesti että negatiivisesti varautuneita ryhmiä. (Huomaa: myös proteiinit zwitterionisia!) Esim. TRIS, HEPES, MES, PIPES Käytetään valmistamalla oikean konsentraation liuos, ja phmittaria apuna käyttäen säätämällä sen ph halutuksi HCl- tai NaOH-liuoksella. Valmis puskuri merkitään esimerkiksi Tris- HCl, ph 7,8. Puskurin lämpötila voi vaikuttaa sen pharvoon! Säädä ph mielellään siinä lämpötilassa, jossa aiot puskuria käyttää. Etenkin Tris-puskuri on herkkä lämpötilan muutokselle. Samalla puskurilla ph 7,50 kun lämpötila 25 C, mutta 8,07 kun lämpötila 5 C 3

10 11 12 ph ja puskuriliuokset biokemiassa Casey et al. 2010 (Nature Reviews Molecular Biology) Biomolekyylit (esim. entsyymit) ja soluorganellit kokonaisuuksina toimivat elimistössä ja soluissa parhaiten tietyllä phalueella. Elimistön ph on tarkasti säädelty! Ihmisen veriplasman ph on 7,4, sitä ylläpitää bikarbonaattihiilihappo-puskurointi. Soluissa puskureina toimivat proteiinit ja epäorgaaninen fosfaatti. Kun tehdään kokeita in vitro eli koeputkessa solumateriaalilla, solun ulkopuolisen ph:n tulisi olla mahdollisimman samanlainen kuin soluissa käytetään puskuroivia molekyylejä reaktiokomponentteina. Sopiva puskuri löytyy usein yrityksen ja erehdyksen kautta, mutta: Kannattaa tutustua olemassaolevaan julkaistuun tietoon tutkittavasta molekyylistä tieto voi löytyä sieltä. Jos tiedetään tutkittavan molekyylin tai organellin toiminnan kannalta optimaalinen ph-alue, käytetään puskurimolekyyliä jonka pka-arvo on mahdollisimman lähellä alueen keskikohtaa. Reagenssien punnitseminen Punnitsemiseen käytössä erilaisia vaakoja. Reagenssivaaka (käyttöalue 0,01 g 2 kg) Analyysivaaka (käyttöalue 0,0001 g 200 g) Varo punnitessa reagenssien kontaminoitumista. Käytä aina puhdasta spaattelia tai lusikkaa kun siirrät reagenssia purkista punnitusalustalle. Jokainen reagenssi punnitaan omalle, puhtaalle punnitusalustalle. Älä laita punnitusalustalta ylimääräistä reagenssia takaisin purkkiin reagenssit voivat olla kalliita, siirrä punnitusalustalle vain vähän kerrallaan! Jauhemaiset reagenssit voivat pölytä helposti jos punnitset jotain terveydelle vaarallista, käytä vetokaappia, hengityssuojainta ja mahdollista kohdepoistoa. Siivoa jälkesi punnituksen jälkeen vaaka ja punnituspöytä! Ilmoita aina reagenssien loppumisesta. Älä koskaan vie tyhjää purkkia takaisin hyllyyn! Huomioi oikeat säilytyslämpötilat! Vesi laboratoriokäytössä Laboratorioliuokset tehdään lähes aina erityispuhdistettuun veteen. Puhtaustaso käyttötarkoituksen mukaan (herkkä analyysimenetelmä = ultrapuhdas vesi). Tislattu ja deionisoitu (ddh 2O) tai Nanopure-suodatettu vesi tavallisin biokemian laboratoriossa. Tyypillisesti laboratoriossa erillisissä vesiastioissa. Dietyylipyrokarbonaatti-käsitelty (DEPC) vesi RNA-töissä, RNAasien inaktivoimiseen. DEPC on hajonnut kun käsitelty vesi on autoklavoitu. Puhtausstandardeja useita https://en.wikipedia.org/wiki/purified_water#laboratory_u se 4

13 14 15 Liuosten valmistus ja säilytys Liuosten valmistus mittapulloon (volumetric flask). Dekantterilasin tai erlenmeyer-kolvin tilavuusasteikko ei ole riittävän tarkka. Happo tai kiinteä emäs lisätään veteen pienissä erissä. Liuota liuoksen eri reagenssit veteen yksi kerrallaan voidaan tehdä dekantterissa tai mittalasissa, ja tasata tilavuus mittapullossa vasta lopuksi. Jotkin reagenssit saattavat liueta vain tietyssä ph:ssa seuraa liuoksen valmistusohjetta tarkasti. Jos liuoksen ph pitää säätää: lisää vettä ensin selvästi alle lopputilavuuden, säädä ph dekantterilasissa, siirrä lopuksi mittapulloon ja säädä tilavuus tarkaksi. https://youtu.be/aousywhjoi4 Liuosten valmistus ja säilytys Mittalasit ja mittapullot eivät ole säilytysastioita! Valmistetut liuokset tulee siirtää uuteen pulloon, putkeen tai vastaavaan. Valmistetut liuokset tulee varustaa etiketillä, josta selviää: päiväys liuoksen nimi aineiden pitoisuudet mihin työhön käytetään tekijä (kurssilla esimerkiksi ryhmän numero) tarvittavat varoitusmerkinnät Epämääräisesti merkittyjä liuoksia ei saa jättää laboratorioon tai säilytystiloihin! Säilytä liuos oikeassa lämpötilassa (-20 C, +4 C, RT). Tarkista viimeistään työtä edeltävänä päivänä, että tarvitsemiasi liuoksia on riittävästi. Biokemian liuoslaskut M(NaCl) = 58,44 g/mol V = 0,5 l c = 0,3 mol/l m =? koska n = m M ja c = n V, m = n M = c V M = 0, 3 mol 0, 5 l 58, 44 g l mol = 8, 766 g Konsentraatio, molaarisuus c: yksikkönä mol/l = M eli liuenneen aineen määrä mooleina / liuoksen tilavuus litroina. Liuoslaskuissa käytetään kaavoja: n = m M ja c = n V jossa n = liuotettavan aineen määrä mooleissa (mol) m = liuotettavan aineen massa grammoissa (g) M = liuotettavan aineen molekyylipaino (g/mol) V = liuoksen tilavuus litroissa Esimerkki: Miten valmistetaan 500 ml 0,3 M natriumkloridiliuosta, kun tiedetään että M(NaCl) = 58,44 g/mol? Käytännössä: Punnitaan natriumkloridia 8,77 g. Liuotetaan dekassa tai mittapullossa alle 500 ml:aan H 2 O. Täytetään 500 ml mittapullossa merkkiin saakka. 5

16 17 18 Biokemian liuoslaskuja n = 5 pmol = 5 x 10-12 mol N = 20 (bp) c = 100 ng/µl V =? m = n M = 5 10 12 mol 330 g mol 20 = 3,3 10 8 g = 33 ng V = m c = 33 ng 100 ng/µl = 0,33 µl Reaktion pipetoidaan 0,33 µl oligonukleotidia. DNA:n, RNA:n ja proteiinien pitoisuus (massakonsentraatio) Näiden molekyylien molekyylipainoa ei yleensä tiedetä. Pitoisuus ilmoitetaan muodossa massa / tilavuus, esimerkiksi 815 µg/ml DNA:ta. Joskus tarvitaan näiden ainemäärä tai molekyylipaino. Silloin on tiedettävä DNA-, RNA- tai polypeptidiketjun pituus. Yhden nukleotidin molekyylipaino (M) on noin 330 g/mol, siispä n oligonukleotidi = m oligonukleotidi 330 g N, missä N = oligonukleotidin pituus. mol Esimerkki: PCR-reaktioon tarvitaan 5 pmol oligonukleotidia. Sinulla on tarvittavaa 20 emäksen pituista oligonukleotidia pitoisuudessa 100 ng/µl. Kuinka paljon oligonukleotidia pipetoit reaktioon? Biokemian liuoslaskuja Yhden aminohapon molekyylipaino on keskimäärin noin 110 g/mol. Esimerkki: Proteiini sisältää 534 aminohappoa. Mikä on sen likimääräinen molekyylipaino? 534 110 g g = 58740 = 58,7 kda mol mol Proteiinien koon nimeämisessä käytetään rutiinisti yksikköä dalton (Da, D). 1000 Da = 1 kda. Dalton on atomimassan yksikkö. 1 Da = yhden vetyatomin paino ja vastaa numeerisesti 1 g/mol. Biokemian liuoslaskuja Prosenttiosuudet liuoslaimennoksissa: weight = w; volume = v Liuenneen aineen massan osuus liuoksen massasta (w/w) Liuenneen aineen massa liuoksen tilavuudesta (w/v) Liuenneen aineen tilavuus liuoksen tilavuudesta (v/v) Esimerkkejä: Valmistetaan 5 % sakkaroosiliuosta (w/w) 100 ml: punnitaan 5 g sakkaroosia ja 95 g vettä (kun oletetaan että veden tiheys 1 g/ml, 95 mg = 95 ml). Valmistetaan 70% etanoliliuosta (v/v) 100 ml: mitataan 70 ml puhdasta etanolia ja täytetään vedellä 100 ml:aan. Valmistetaan 20 % ammoniumpersulfaattiliuosta, APS (w/v), 10 ml: punnitaan 2 g ammoniumpersulfaattia ja liuotetaan se veteen siten, että lopullinen tilavuus on 10 ml. 6

19 20 21 Liuosten laimentaminen Kantaliuos Osuus käyttöliuoksen tilavuudes ta Osaa kantaliuosta 20x 1/20 1 19 10x 1/10 1 9 5x 1/5 1 4 2x 1/2 1 1 Osaa H 2O Laboratoriossa tarvitaan usein suuria määriä liuoksia. Voidaan tehdä vahvuudeltaan esimerkiksi 5- tai 10- kertaisia kantaliuoksia, joita tarvittaessa laimennetaan 1-kertaiseksi käyttöliuokseksi. Kantaliuosten käyttö säästää aikaa ja vaivaa, varastointitilaa, vahvempi kantaliuos voi joskus myös säilyä paremmin. Ellei toisin ohjeessa mainita, käyttöliuos on aina 1-kertainen. Esimerkki: Valmistetaan 50 ml Tris-EDTA puskurin (TE-puskuri) 1x käyttöliuosta 10x TE-kantaliuoksesta (100 mm EDTA, 250 mm Tris/Cl, ph 8,0): 5 ml (1 osa) 10x kantaliuosta + 45 ml (9 osaa) H 2 O = 50 ml 1x käyttöliuosta Liuosten laimentaminen c 1 = 0,3 M c 2 = 0,125 M V 2 = 100 ml V 1 =? c 1 V 1 = c 2 V 2 V 1 = c 2 V 2 0, 125 M 100 ml = c 1 0, 3 M 41, 7 ml Alkuperäisestä liuoksesta otetaan 41,7 ml ja laimennetaan se vedellä niin, että lopputilavuus on 100 ml. Kantaliuokset usein myös vain valmistettu tiettyyn konsentraatioon, josta ne laimennetaan eri käyttöliuoksiin tarpeen mukaan. Kun kantaliuoksesta (konsentraatio c 1, kantaliuosta tilavuus V 1 ) tehdään laimennos (konsentraatio c 2, laimennoksen tilavuus V 2 ), ainemäärä n pysyy samana, vaikka tilavuus ja konsentraatio muuttuvat, eli c 1 V 1 = c 2 V 2 Laskuesimerkki: Miten 0,3 M natriumkloridiliuoksesta valmistetaan 100 ml 0,125 M laimennosta? Monissa käytettävissä liuoksissa useampia komponentteja kunkin komponentin osuus lisätään toisistaan riippumatta yhteiseen lopputilavuuteen. Kantaliuoslaskuja 3. 1. Kuinka valmistat 1 l seuraavia liuoksia? 1 M NaOH 10% NaCl (w/v) 10% metanoli (v/v) M(NaOH) = 40 g/mol; M(NaCl) = 58,4 g/mol; M(metanoli) = 32 g/mol 2. Käyttämällä kohdassa 1 valmistettuja kantaliuoksia, kuinka valmistat liuoksen jossa on 500 mm NaOH, 1% NaCl, 1% metanoli, lopputilavuuteen 100 ml? Kuinka valmistat ammoniumsulfaatista (MW = 132 g/mol) 1 M liuoksen, jonka tilavuus on 500 ml? 4. Kuinka saat käyttäen kohdassa 3 valmistettua kantaliuosta tehtyä liuoksen, jonka tilavuus on 100 ml ja ammoniumsulfaattikonsentraatio 500 µm? 5. Proteiinin tuottamiseksi E. coli-kannassa BL21(DE3)pLysS, johon on siirretty proteiinia tuottava pet-15b plasmidivektori, soluja on kasvatettava kasvatusliemessä jossa on seuraavat antibioottikonsentraatiot: 50 µg/ml kanamysiini, 7 µg/ml gentamysiini ja 10 µg/ml tetrasykliini. Kuinka paljon pipetoit eri antibiootteja 500 ml:aan kasvatusliuosta, kun kunkin antibiootin kantaliuos on pitoisuudeltaan 10 mg/ml? 7

22 23 24 Keskustelua Keskustelkaa parin kanssa tai pienessä ryhmässä: Mitä tarkoittavat sterilointi ja desinfiointi? Miksi biokemian laboratoriossa tarvitaan steriileitä välineitä ja liuoksia? Lyhyt keskustelu, jonka jälkeen muutamia kommentteja. Sterilointi ja desinfiointi Desinfiointi vähentää mikrobien määrää, mutta sillä ei voida varmistaa kaikkien mikro-organismien tuhoutumista. Tärkeä osa labran arkista etikettiä ja siivoamista vähentää mikrobien määrää ja siten riskejä. Steriloinnilla varmistetaan, ettei käytetyissä välineissä tai reagensseissa ole eläviä mikro-organismeja (viruksia, bakteereita, bakteerien itiöitä, jne.) Molekyylibiologian, solubiologian ja mikrobiologian töissä kaikkien käytettävien liuosten, reagenssien ja välineiden tulee olla steriilejä. Bakteeri- tai soluviljelmässä ei saa olla ylimääräisiä mikrobeja. Näytteissä ei saa olla vierasta DNA:ta tai RNA:ta. Näytteissä ei saa olla RNAaseja (DEPC-käsitelty vesi). Sterilointitapoja Autoklavointi: Sterilointi ylipaineessa, kylläisessä vesihöyryssä. Lämpötila vähintään 121 C, yhden ilmakehän eli 101 kpa:n (1 bari) ylipaine. Normaali tapa steriloimattomien liuosten sekä steriloimattomien muovisten astioiden ja muovisten kertakäyttövälineiden sterilointiin. Steriloitavat liuokset autoklaavin kestäviin pulloihin (pyrex), ei aivan täyteen (max. 80% tilavuudesta). Korkki löysästi kiinni, korkin ympärille folio, ja folioon autoklaavimerkkiteippi. Pieni muovitavara (pipetinkärjet, putket) pakataan autoklaavipusseihin, tai autoklaavin kestävään astiaan, jonka suu peitetään foliolla. Myös steriloitavien mittalasien suu peitetään. 8

25 Sterilointitapoja Kuumailmasterilointi Lämpökaappi, jossa kuuma ilma kiertää (170 C, 1 t). Lasisten ja metallisten astioiden sterilointiin. Ionisoiva säteily Tyypillisesti gammasäteilytys. Välineiden valmistaja huolehtii. Tyypillisesti materiaalia, joka ei kestä autoklavointia (esimerkiksi polystyreeniset muovilaadut). Suodattaminen Vähintään 0,22 µm steriili filtteri. Liuokset, joita ei voida autoklavoida (sokeriliuokset, SDS, antibiootit). 9