Polysakkaridialdehydien selektiivinen muokkaus oksinitrilaasientsyymillä

Polysakkaridialdehydien selektiivinen muokkaus oksinitrilaasientsyymillä Tia-Annette Kakko Pro gradu -tutkielma Orgaanisen kemian laboratorio Kemian laitos Helsingin yliopisto Marraskuu 2012

Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion Faculty Matemaattis-luonnontieteellinen tiedekunta Laitos/Institution Department Kemian laitos Tekijä/Författare Author Tia-Annette Kakko Työn nimi / Arbetets titel Title Polysakkaridialdehydien selektiivinen muokkaus oksinitrilaasientsyymillä Oppiaine /Läroämne Subject Kemia Työn laji/arbetets art Level Maisterin tutkielma Tiivistelmä/ Referat Abstract Aika/Datum Month and year Marraskuu 2012 Sivumäärä/ Sidoantal Number of pages 67 Guarkumi on monikäyttöinen aine niin lääke- kuin ravintoaineteollisuudessa. Guarkumille tehtävät reaktiot lisäävät mahdollisesti sen monikäyttöisyyttä. Tässä työssä tarkoituksena oli pidentää guarkumialdehydin (galaktomannaanin galaktoosin C-6 aldehydin) hiiliketjua yhdellä hiilellä syanohydriinien avulla. Oksinitrilaasi on syanohydriinejä muodostava entsyymi, jota kasvit käyttävät syanogeneesissä. Orgaanisissa synteeseissä tätä entsyymien ominaisuutta käytetään päinvastaiseen tarkoitukseen eli syanohydriinien muodostamiseen. Reaktioita oksinitrilaasilla on suoritettu kirjallisuuden mukaan runsaasti, mutta lähtöaine on ollut orgaaniseen liuottimeen liukeneva, reaktioseoksena on käytetty orgaanista liuotinta, liuotinseosta tai entsyymi on ollut kiinnitettynä matriisiin. Tutkimuksen kohteena olivat polysakkaridialdehydien oksinitrilaasilla tehtävät entsymaattiset jatkoreaktiot. Työssä tutkittiin syanohydriinien entsymaattista syntetisointia vesipitoisissa puskuriliuoksissa. Kokeet tehtiin raffinoosilla ja guarkumilla, jotka oli hapetettu entsymaattisesti, selektiivisesti, galaktoosin C-6 asemasta aldehydiksi. Syanohydriinien muodostumista tutkittiin kolmella eri oksinitrilaasilla ja kahdella syanidia vapauttavalla yhdisteellä; natriumsyanidilla ja etyylisyanoformaatilla. Lisäksi tutkittiin erilaisten puskurien vaikutusta tulokseen. Näytteistä muodostettiin johdos metanolyysin ja silyloinnin avulla. Haihtuviksi tehdyt sakkaridit analysoitiin GC-MS:lla. Tulokset tarkistettiin lisäksi NMR- ja LC- MS/MS tekniikoilla. Reaktioiden tuloksena oli -hydroksiamidiksi hydrolysoitunut syanohydriini. Synteesin toimivuutta ja tuloksia olisi hyvä tutkia vielä alhaisessa lämpötilassa, sillä tähän tutkimukseen sisälletyt kokeet tehtiin huoneenlämpötilassa. Lisäksi parhaan tuloksen tuottanutta AtHNL -entsyymiä olisi hyvä kokeilla ph:ssa 3,3, jolloin kemiallinen reaktio olisi kokonaan suppressoitu. Avainsanat Nyckelord Keywords Oksinitrilaasi, hydroksinitriililyaasi, guarkumi, polysakkaridi, PaHNL, syanohydriini Säilytyspaikka Förvaringställe Where deposited Kumpulan kampuskirjasto, Kemian laitos, orgaanisen kemian laboratorio Muita tietoja Övriga uppgifter Additional information i

Alkusanat Erikoistyön tekeminen ja pro gradun kirjoittaminen on ollut opettavainen ja kärsivällisyyttä vaativa projekti. Haluaisin kiittää ohjaajaani FT Kirsti Parikkaa positiivisesta kannustuksesta ja opastuksesta laboratoriotyötä suoritettaessa. Lisäksi hän on antanut hyviä kommentteja kirjoitusta ajatellen. Kiitän myös Sami Heikkistä avusta NMR-analyysien suorittamisessa sekä Sun-Li Chongia MS-analyysien tekemisestä. Professori Maija Tenkaselle kiitos siitä, että kokeellisen osuuden suorittaminen Viikin Elintarvike- ja ympäristötieteiden laitoksella oli mahdollista. Professori Ilkka Kilpeläistä haluan kiittää tuesta ja ymmärtäväisestä asenteesta koko opintojeni aikana. Työn, opiskelun ja kodin yhteensovittaminen on toisinaan ollut haasteellista, opintojeni loppuun saattamiseksi olen saanut paljon tukea sekä työ- että opiskelukavereilta. Kaikkein eniten tahdon kuitenkin kiittää puolisoani Tommyä siitä, että hän on tukenut minua opintojeni aikana ja kannustanut minua tässä projektissa aina loppuun saakka. jatkamaan opintojani filosofian maisteriksi asti. ii

Sisällys Tiivistelmä... i Alkusanat... ii Sisällys... iii Lyhenneluettelo...v KIRJALLINEN OSUUS...1 1 Johdanto...1 2 Syanohydriinit...2 2.1 Määrittely ja synteesi...2 2.1.1 Syanidilähteet...4 2.2 Syanohydriinien reaktioita...5 2.2.1 Hydroksyyliryhmän reaktiivisuus...5 2.2.2 Syanoryhmän reaktiivisuus...7 3 Entsymaattiset menetelmät syanohydriinien valmistuksessa... 11 3.1 Entsyymit... 11 3.2 Syanohydriinien valmistaminen... 12 3.2.1 Hydroksinitriililyaasilähteitä... 13 3.2.1.1 Rekombinanttientsyymit... 16 3.2.2 (R)-Oksinitrilaasi... 17 4 Hiilihydraatit... 18 4.1 Mono-, oligo- ja polysakkaridit... 18 4.2 Galaktomannaanit... 22 4.2.1 Galaktomannaanien reaktiivisuus... 23 KOKEELLINEN OSUUS... 25 5 Johdanto... 25 5.1 Materiaalit ja menetelmät... 26 5.1.1 Reagenssit ja entsyymit... 26 5.1.2 Sokereiden hapetus... 28 iii

5.2 Syanohydriinien synteesi... 29 5.2.1 Syanidilähteet... 29 5.2.2 Puskuriolosuhteet... 30 5.3 Synteesit hapetetulla raffinoosilla... 31 5.3.1 Reaktiot natriumsyanidilla... 31 5.3.2 Reaktiot etyylisyanoformaatilla... 32 5.3.3 Kemiallisen reaktion tutkiminen... 33 5.3.4 Reaktiot korkeammassa ph:ssa... 34 5.4 Synteesit hapetetulla guarkumilla... 35 5.5 Näytteiden käsittely... 36 5.5.1 GC-MS näytteiden valmistaminen... 36 5.5.1.1 Pelkistäminen... 36 5.5.1.2 Hapan metanolyysi ja silylointi... 36 5.5.2 NMR- ja MS- näytteiden valmistaminen... 38 5.6 Muita kokeita... 38 5.6.1 Saostus... 38 5.6.1.1 Puhdistuskokeet... 39 5.6.2 Jätteiden hävitys... 39 5.7 Analysointi... 40 5.7.1 GC-MS analyysi... 40 5.7.1.1 Lähtöaineiden hapetusasteen määrittäminen... 40 5.7.2 Massaspektrometrinen analyysi... 41 5.7.3 NMR analyysi... 42 5.8 Tulokset... 42 5.8.1 Lähtöaineiden hapetusasteet... 42 5.8.2 Syanohydriinit... 43 5.8.2.1 GC-MS analyysin tulokset... 43 5.8.2.2 MS/MS analyysin tulokset... 51 5.8.2.3 NMR analyysin tulokset... 55 5.8.2.4 Tulosten kooste... 59 6 Johtopäätökset... 60 Viiteluettelo... 61 LIITE 1. iv

Lyhenneluettelo CLEA DAST DIPE DMF DS Et 2 O Fru Gal GC GG Glc GO HCN HMDS HNL KCN KF Man Me 3 SiCl MS NaBD 4 NaBH 4 NaCN NCCOOEt NMR Cross -linked enzyme aggregate, ristisilloitettu entsyymiryhmittymä Dietyyliaminorikkitrifluoridi di-isopropyylieetteri N,N-Dimetyyliformamidi Substituutioaste Dietyylieetteri Fruktoosi Galaktoosi Kaasukromatografi Guarkumi Glukoosi Galaktoosioksidaasi Vetysyanidi Heksametyylidisiloksaani Hydroksinitriililyaasi, (R)-oksinitrilaasi Kaliumsyanidi Kaliumfluoridi Mannoosi Trimetyylisilyylikloridi Massaspektrometri Natriumboorideuteridi Natriumboorihydridi Natriumsyanidi Etyylisyanoformaatti Nuclear magnetic resonance, ydinmagneettinen resonanssi v

NTP PCl 5 Pd py R 3 SiCN Raf Sac TBDMS-Cl TEMPO TMCS TMSCl t r Normal temperature and pressure, normaalilämpötila ja -paine Fosforipentakloridi Palladium Pyridiini Trialkyylisilyylisyanidi Raffinoosi Sakkaroosi tert-butyylidimetyylisilyylikloridi 2,2,6,6,-Tetrametyylipiperidiini-1-oksyyli Trimetyylikloorisilaani Trimetyylisilyylikloridi Retentioaika vi

KIRJALLINEN OSUUS 1 Johdanto Kemia on jatkuvasti kehittyvä tieteenala, jossa edistystä tapahtuu niin uusien tuotteiden syntetisoinnissa kuin laitetekniikassa. Usein tutkimuksessa sovelletaan monia eri menetelmiä ja tieteen alalajeja. Käytännössä tämä tarkoittaa sitä, että yhden asian hallinta ei aina riitä, vaan monen alalajin tuntemus ja soveltaminen on tarpeen. Tässä työssä yhdistyvät orgaaninen kemia, biotekniikka sekä laitetekniikka. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää muodostuuko mantelista peräisin olevan hydroksinitriililyaasi -entsyymin avulla vesipitoisissa sakkaridiliuoksissa yhdisteitä, jotka sisältävät syanohydriini-funktionaalisuuden. Reaktiossa muodostui kuitenkin amidiksi hydrolysoitunut syanohydriini. Haastetta tutkimukseen toivat sekä lähtöaineiden liukoisuusominaisuudet että entsyymien vaatimien reaktio-olosuhteiden säätely. Lisäksi lähtöaineiden rajallisuus ja synteesituotteen puhdistuksen haasteellisuus toivat lisämaustetta. Uusien, synteesimenetelmien ympäristöystävällisyys, ns. vihreä kemia, on viime aikoina ollut tärkeässä asemassa. Lisäksi tuotantotekniset vaatimukset ovat tiukkoja, mieluiten käytetään olemassa olevaa tekniikkaa, sitä vain hiukan muunnellen. Orgaanisten liuottimien käytön vähentäminen ja synteesimenetelmien muuttaminen kestävämmän kehityksen suuntaan ovat tärkeässä asemassa uusia menetelmiä kehitettäessä. Bioteknologian yhdistäminen orgaanisen kemian reaktioihin on vähentänyt suojaryhmien käyttöä, samalla reaktioreitit ovat lyhentyneet ja tarvittavien reagenssien määrä on vähentynyt. Tässä työssä ympäristönäkökohdat huomioitiin mahdollisuuksien mukaan. Syanohydriinit ovat monikäyttöisiä lähtöaineita kemiallisissa synteeseissä ja niiden muodostaminen on yksi orgaanisen kemian perusreaktioista. Kemiallisessa reaktiossa tuotteena muodostuu -hydroksinitriilien raseeminen seos. Entsymaattisessa reaktiossa saadaan muodostettua suurimmaksi osaksi tiettyä konformaatiota, jolloin lopputuotteen stereokemia riippuu käytetyn entsyymin stereospesifisyydestä. 1

2 Syanohydriinit 2.1 Määrittely ja synteesi Syanohydriineissä on sekä syano- että hydroksyyliryhmä, jotka ovat kiinnittyneinä molekyylin samaan, alifaattiseen, osaan. 1 Syanohydriinejä valmistettaessa hiiliketju pitenee yhdellä hiilellä ja molekyyliin saadaan usein muodostettua kiraliakeskus. 2. Tämän lisäksi syanohydriinejä voidaan valmistaa sekä kemiallisesti että entsymaattisesti. Kuva 1. Syanohydriinien muodostuminen. R 1 = alkyyli, sykloalkyyli, aryyli, heteroaryyli; R 2 = H, alkyyli. 3. Kemiallisessa synteesissä vetysyanidia voidaan liittää raseemisesti joko aldehydi- tai ketonirunkoon jolloin muodostuu -hydroksinitriilejä. Reaktiota katalysoidaan emäksellä (kuva 1.). 1, 4 Vetysyanidin vaaralliselta käsittelyltä vältytään muodostamalla se suola- tai rikkihapon avulla in situ. 5. Vaihtoehtoisesti -hydroksinitriili muodostetaan syanidi-ionin vaihdolla ketonisyanohydriinin ja aldehydin välillä. Menetelmää kutsutaan transhydrosyanaatioksi. 3 Reaktiossa muodostuu stabiilimpi, aldehydistä peräisin oleva, 1, 6, 7 syanohydriini (kuva 2.). Usein tässä reaktiossa ketonina toimii asetonisyanohydriini. Kuva 2. Syanohydriinin valmistaminen transhydrosyanaatiolla. R, R ja R = alkyyli- tai aryyliryhmä. 1, 3 2

Mekanistisesti reaktio on nukleofiilinen additio karbonyylihiileen, jolloin syanidi-ionin liittyminen karbonyylihiileen on reaktion nopeutta säätelevä tekijä. Alifaattiset aldehydit ja suurin osa alifaattisista ketoneista muodostavat syanohydriinejä. 5 Ketoneilla reaktio on yleisesti ottaen hitaampi johtuen sekä elektroneja luovuttavan ryhmän vaikutuksesta että alkyylin aiheuttamasta steerisestä esteestä. Joissakin tapauksissa reaktion tasapaino on enemmän lähtöaineiden puolella. Tällöin tasapainon siirtäminen tuotteen puolelle onnistuu vain joko reaktiotuotteen poistamisella reaktioseoksesta, vetysyanidin määrän lisäämisellä tai biokatalyytin avulla. 4 Aldehydeistä muodostuva syanohydriini on pysyvämpi ja reaktion tasapaino on pääsääntöisesti tuotteen puolella. 1, 5 Ketonin ja aldehydin muoto vaikuttavat reaktionopeuteen ja -tasapainoon siten, että alkyyli-aryyliketonit reagoivat huonosti, jos lainkaan. Lisäksi molemmilla ryhmillä molekyylin haaroittuneisuus hidastaa reaktiivisuutta. 1 Entsymaattisissa reaktioissa perusperiaate reaktiolle on sama kuin kemiallisessa reaktiossa, mutta näissä reaktioissa entsyymit katalysoivat vetysyanidin enantioselektiivistä liittymistä karbonyylihiileen. 3, 4 Samalla molekyyliin muodostuu kiraliakeskus, jossa hiiliatomiin on liittynyt neljä erilaista ryhmää ja molekyylistä tulee optisesti aktiivinen. Käytettävät entsyymit tuottavat reaktiossa usein vain joko R- tai S- muotoa, kun taas kemiallisessa 2, 3, 8 reaktiossa muodostuu aina molempia stereoisomeerejä. Tällöin enantiopuhtaita tuotteita valmistettaessa kemiallisen reaktion tuottavuus jää suurimmillaan 50 %:iin. 9 Entsymaattinen hiili-hiili sidoksen muodostuminen on yleensä hyvin diastereo-, enantio-, kemo-, ja regioselektiivistä. 3 Edellä mainittujen menetelmien lisäksi syanohydriinien enantioselektiivistä syntetisointia on tehty yhdistämällä sekä kemiallinen että entsymaattinen menetelmä. Tällöin emäskatalysoidussa reaktiossa muodostetaan syanohydriinien raseeminen seos, jonka annetaan edelleen reagoida entsymaattisesti esim. lipaasientsyymin ja asetylointireagenssin kanssa. 10 Syanohydriinien muodostumisreaktio on eksoterminen ja korkeassa ph:ssa reversiibeli. Tästä seuraa, että kemiallisten, emäskatalysoitujen, reaktioiden tuotteet saadaan eristettyä vasta kun reaktioseos on stabiloitu hapon avulla. 1 3

2.1.1 Syanidilähteet Syanohydriinien muodostamiseen tarvitaan syanidi-ioni, - CN. Perinteinen tapa syanidiionin muodostamiseksi on ollut käyttää vetysyanidia (HCN) emäskatalysoidussa tai syanidisuolaa (NaCN tai KCN) happokatalysoidussa reaktiossa. Muita syanoryhmän lähteitä voivat olla asetonisyanohydriini 11, etyylisyanoformaatti (NCCOOEt) 12, 13, hydroksibentseeniasetonitriili eli mantelinitriili, dietyylisyanofosfonaatti 13, trialkyylisilyylisyanidi (R 3 SiCN) 3, alkyylisyanidi ja metallisyanidi 8. Esimerkkejä rakenteista on esitetty kuvassa 3. Kuva 3. Asetonisyanohydriinin, etyylisyanoformaatin, trimetyylisilyylisyanidin 14 mantelinitriilin rakennekaavat. ja Käytettävä substraatti valikoituu monien eri tekijöiden summasta. Vetysyanidin myrkyllisyys, alhainen kiehumispiste ja reaktion eksotermisyys ovat tärkeitä työturvallisuudessa huomioitavia seikkoja. Lähteissä kehotetaankin käyttämään hälytysjärjestelmää. 3 Muiden, hiukan turvallisempien, lähtöaineiden tarkoituksena on vapauttaa vetysyanidi reaktioseokseen in situ, josta se liittyy kohdemolekyyliin. Käytettävä reaktiotyyppi vaikuttaa syanidilähteen valintaan siten, että esimerkiksi lähtöaineen emäksisyys vaikuttaa entsymaattisten reaktioiden kulkuun. 3 4

2.2 Syanohydriinien reaktioita Syanohydriinit ovat bi- tai monifunktionaalisia yhdisteitä, joiden kemiallinen rakenne sisältää nitriili- ja hydroksyyliosan. Nämä funktionaaliset ryhmät ovat reaktiivisia ja siten monikäyttöisiä. 3, 15 Tästä syystä niitä käytetään välituotteena useissa kemian teollisuuden reaktioissa. 1 Kiraliakeskus tuo lisäarvoa syanohydriinien monikäyttöisyydelle, ja siksi myös maatalouskemikaali- ja lääkeaineteollisuus ovat kiinnostuneita syanohydriinien 8, 12 kehittämisestä. 2.2.1 Hydroksyyliryhmän reaktiivisuus Hydroksyyliryhmän aktiivisuutta voidaan lisätä muuttamalla se hyväksi poistuvaksi ryhmäksi. 16 Tämä mahdollistaa S N 2 -tyypin korvautumisreaktiot, joissa tapahtuu konfiguraation kääntyminen. 17 Hydroksyyliryhmä voidaan syrjäyttää myös elektronegatiivisella ryhmällä; esimerkiksi primaariset ja sekundaariset amiinit korvaavat hydroksyylin muodostaen -aminonitriilejä. Myös halogeenivedyt sekä fosforipentakloridi (PCl 5 ) reagoivat samalla tavalla muodostaen -halogeeninitriilejä. 1 Lisäksi suorat stereoselektiiviset reaktiot ovat mahdollisia eräiden reagenssien avulla (kuva 4.) esimerkkinä dietyyliamiinirikkitrifluoridin (DAST) reaktio syanohydriinin kanssa. 16 Kuva 4. (S)-2-fluoronitriilien ja edelleen (S)-2-fluorokarboksyylihappojen valmistaminen (R)-syanohydriineistä. 16 Sen sijaan, että koko hydroksyyliryhmä (OH) vaihdetaan, voidaan ainoastaan OH-ryhmän vety korvata. Reaktioista yleisin on esterin muodostaminen hapon tai happokloridin kanssa. 1 Kuten alkoholeilla yleensä, niin myös tässäkin tapauksessa, aktivaatio sulfonyyliryhmällä johtaa useisiin erilaisiin jatkoreaktiomahdollisuuksiin (kuva 5). 5

17, 18 Muodostuvat -sulfonyylioksinitriilit sisältävät hyvän poistuvan ryhmän. Optisesti aktiivisten -sulfonyylioksinitriilien nukleofiiliset substituutioreaktiot johtavat moniin mielenkiintoisiin yhdisteisiin: -atsidonitriileihin, -aminonitriileihin, -aminohappoihin sekä etyleeni-imiineihin. 19 Edellä mainituista, alifaattiset optisesti aktiiviset molekyylit säilyttävät konfiguraationsa, kun taas aromaattiset ovat epästabiilimpia optisen puhtautensa suhteen. 16 Kuva 5. Kiraalisten syanohydriinien hydroksyyliryhmän jatkoreaktioita. 17 a) R 1 SO 2 Cl, pyridiini (py), b) kaliumftaali-imidi, N,N-Dimetyyliformamidi (DMF) c) kaliumatsidi, DMF, d) LiAlH 4, Et 2 O, - 80 C, ph 7 fosfaattipuskurissa, e) kaliumasetaatti (KOAc), DMF f) KF, kruunueetteri, 45 100 C tai amberlyst A-26-F -, CH 2 Cl 2, 0 C, g) DAST, - 80 C 25 C tai TMSCl. py, DAST, - 80 C 25 C, h) hydratsiini (N 2 H 4 ),, i) Pd-C, H 2. 6

Syanohydriineistä poistetaan vettä fosforipentoksidin avulla. Dehydrauksella molekyyliin muodostetaan kaksoissidos, joka saadaan polymeroitua. Menetelmällä valmistetaan alkyyliakrylonitriilejä, joita käytetään muun muassa muoviteollisuuden raaka-aineina. 1 2.2.2 Syanoryhmän reaktiivisuus Syanohydriinien nitriiliryhmälle voidaan tehdä monenlaisia reaktioita, mutta suojaamalla hydroksyyliryhmä esimerkiksi tert-butyylidimetyylisilyylikloridin (TBDMS-Cl) avulla voidaan syanoryhmän reaktiivisuutta lisätä. 17 Ilman hydroksyyliryhmän suojausta voidaan toteuttaa muun muassa pelkistys- ja hydrolyysireaktioita. Hiili-typpi kolmoissidoksen pelkistäminen amiiniksi tapahtuu joko litiumalumiinihydridillä (LiAlH 4 ) 16 tai katalyyttisellä vedytyksellä, jossa katalyyttinä toimii esimerkiksi palladium. 20 Yleensä natriumboorihydridi (NaBH 4 ) ei pelkistä kolmoissidoksia, mutta eräiden lähteiden mukaan sillä voidaan pelkistää syanohydriinien nitriiliryhmä, kun katalyyttinä käytetään trifluorietikkahappoa 8, 21 tai nikkelisuolaa. 15 Hiili-typpi sidoksen pelkistyksen jälkeen on mahdollista muokata amiinifunktionaalisuutta happoklorideilla, jolloin muodostetaan -hydroksiamideja. Vaihtoehtoisesti etikkahappo muurahaishappoanhydridiln avulla muodostetaan N-alkyyli- -aminoalkoholeja. 18 Nitriilien hydrolysointi on happokatalysoitu reaktio (kuva 6.), jossa muodostuu ensin amidi joka hydrolysoituu edelleen karboksyylihapoksi. 1 Vaikka hydrolysointi väkevällä hapolla tai emäksellä muodostaa yleensä raseemisen seoksen, 15 niin yllättävää kyllä väkevä suolahappo ei muuta kiraalisten syanohydriinien optista aktiivisuutta. 17 Silloin kun amidin hydrolyysi on hitaampi kuin nitriilin, on amidi mahdollista eristää reaktioseoksesta. 1 Hydrolysoitaessa trimetyylisilyylikloridia (TMSCl) vedellä muodostuu suolahappoa. Jos reaktio muodostetaan nitriilien kanssa in situ, hydrolysoituu nitriili amidihydrokloridiksi. Amidi saadaan vapautettua suolastaan neutraloimalla seos. 22 7

Kuva 6. Nitriilin hydrolyysi. R = alkyyli tai fenyyli ja R = alkyyli tai vety 1 Hellävaraisempia kemiallisia aineita tai biokatalyyttejä käytettäessä tulee amidin muodostumisesta todennäköisempää, tällöin amideja voidaan valmistaa siirtymätila- metallikatalyyttien tai entsyymien avulla. Toimiviksi todettuja metallikatalyyttejä ovat olleet esimerkiksi platinium(ii)fosfiniitti tai palladium(ii)kloridi. 15 Entsyymeistä nitriilihydrataasit aikaansaavat amideja, kun taas nitrilaaseilla hydrolyysi etenee karboksyylihapoksi saakka. 23 Liittämällä useampaa entsyymiä apuaineeseen muodostetaan nk. CLEA- entsyymejä (cross-linked enzyme aggregate), joita käyttämällä on mahdollista suorittaa monta reaktiovaihetta samanaikaisesti. Esimerkkinä (S)-mantelihapon valmistaminen bentsaldehydistä (kuva 7). 24 Toisen tyyppinen nitriilin hydrolyysi tehdään Pinner 1, 25 reaktiossa, jossa kuivan alkoholin ja suolahapon avulla, saadaan valmistettua estereitä. Kuva 7. Käyttämällä samanaikaisesti (S)-HNLa ja epäspesifistä nitrilaasia CLEAmatriisiin immobilisoituna saadaan syntetisoitua (S)-2- hydroksihappoja. R=C 6 H 5 24 8

-Aminoalkoholien valmistaminen on tärkeätä niiden biologisen aktiivisuuden takia. 8 Esimerkiksi efedriinityyppisiin yhdisteisiin kuuluvan yhdisteen, enantiomeerisesti puhtaan 2-aminoalkoholin, valmistuksessa hydroksyyliryhmä suojataan trimetyylisilyylikloridilla (Me 3 SiCl), reaktioseokseen lisätään Grignardin reagenssia ja muodostunut imiini välituote pelkistetään natriumboorihydridillä (kuva 8.). 16, 17 Edellä mainituista imiineistä voidaan edelleen valmistaa N-substituoituja aminoalkoholeja transiminaatiolla. Vaihtoehtoisesti aminoalkoholit voidaan hydrolysoida, jolloin muodostetaan optisesti aktiivisia asyloineja, joiden karbonyylihiilen -asemassa on hydroksyyliryhmä. 16 Kuva 8. Stereoselektiivinen 2-aminoalkoholien synteesi. R = C 3 H 7, C 6 H 5 ; R 1 = CH 3, C 2 H 5, C 6 H 5 ; X = Br, I 16 Hydroksyyliryhmän suojauksen jälkeen nitriilin mahdollisia reaktioita (kuva 9.) ovat nukleofiiliset additioreaktiot, joissa muodostetaan -hydroksialdehydejä (a), hydroksiketoneita (b), 2-amino-1,3-dioleja (c), substituoituja -aminoalkoholeja (d), N- substituoituja -hydroksi- -aminohappoja (e), N-substituoituja, -substituoituja, -amino- -alkoholeja (f), -hydroksialdonitroneja (g), -substituoituja -aminoalkoholeja (h), tetronihappoja (i) ja -aminoalkoholeja (j). 18 Näiden yhdisteiden jatkoreaktiona voivat esimerkiksi olla pelkistäminen, transiminaatio, hydrolyysi sekä syklisointi. 8 9

Kuva 9. Hydroksyyliryhmän suojaus mahdollistaa seuraavat reaktiot: a) Di-isobutyylialumiinihydridi (DIBAL), H 2 SO 4, b) Grignard, H 3 O +, c) Vinyyli Grignard, NaBH 4, di-tertbutyylidikarbonaatti [(BOC) 2 O], metanoli, NaBH 4, d) DIBAL, amiini, NaBH 4 e) DIBAL, amiini, HCN, karbonyyli-imidatsoli, emäs, happo, f) Grignard, NaBH 4, formyyliasetaatti, litiumalumiinihydridi (LiAlH 4 ) g) DIBAL, N-bentsyylihydroksyyli-amiini h) Grignard, NaBH 4 i) BrZnCHR 3 COOR 4, H 3 O + j) LiAlH 4 tai boraani (BH 3 ). Mukailtu lähteestä Sharma et al. 18 10

3 Entsymaattiset menetelmät syanohydriinien valmistuksessa 3.1 Entsyymit Entsyymit ovat luonnonkatalyyttejä, joita esiintyy kaikissa elämää sisältävissä olosuhteissa. Ne katalysoivat valtavan määrän erilaisia reaktioita alentamalla reaktioiden aktivointienergiaa. Reaktionopeus muuttuu tyypillisesti 10 5 10 8 -kertaiseksi, mutta voi muuttua jopa 10 17 4, 26 kertaa nopeammaksi kuin ilman entsyymiä tapahtuva reaktio. Entsyymit ovat proteiineja, ja pysyäkseen aktiivisena niiden tulee esiintyä tietyssä luonnonmukaisessa muodossa. 26 Toisin kuin useat kemialliset reagenssit, entsyymit eivät ole herkkiä kosteudelle tai ilmalle. 4 Osa entsyymeistä vaatii toimiakseen myös kofaktorin ja/tai koentsyymin. Kofaktori on epäorgaaninen ioni, esimerkiksi Fe 2+ tai Mg 2+, kun taas koentsyymi on metalli-orgaaninen- tai orgaaninen molekyyli. 27 Entsyymien luonnonmukaisuuden ja rakenteen takia niillä on tiettyjä reaktioolosuhdevaatimuksia. Kullakin entsyymillä on sille ominainen ph- ja lämpötila-alue, jossa se toimii optimaalisesti. 26 Entsyymien toiminta on usein substraattispesifistä, eli entsyymit toimivat vain tietynlaisen rakenteen omaavien lähtöaineiden kanssa. Nämä aineet sisältävät kullekin entsyymille oikeanlaisen, aktiivisen sitoutumiskohdan. Entsyymin kiinnittyessä substraattiin siihen muodostuu entsyymisubstraattikompleksi, reaktion aktivointienergia laskee ja reaktio nopeutuu. 27 Entsyymien käyttö lisääntyy jatkuvasti mikä johtuu niiden tietyistä, hyvistä ominaisuuksista: ne ovat yleensä kemo-, regio- ja stereoselektiivisiä. 9 Entsyymien katalysoimat reaktiot suoritetaan normaalipaineessa ja lämpötilassa (NTP), jolloin sivureaktioita tapahtuu vähemmän kuin perinteisissä kemiallisissa reaktioissa. Entsyymien katalysoimissa reaktioissa suojaryhmien käyttö on yleensä tarpeetonta. Lisäksi näitä biokatalyyttejä saadaan eristettyä luonnosta ja synteesituotteiden tuotantoprosessien energiankulutus on NTP -olosuhteiden takia vähäisempää. 28 Edelleen biokatalyytit hajoavat biologisesti ja teollisuudessa ympäristöystävällisyys tuo tuotteille lisäarvoa. 28 11

3.2 Syanohydriinien valmistaminen Oksinitrilaaseja esiintyy luonnossa erittäin yleisesti. Siemenkasvit tuottavat puolustuksekseen ja aminohappojen biosynteesiin hydroksinitriililyaasia (HNL) eli oksinitrilaasia. Kasvin sisältämät syanogeeniset glykosidit ja/tai syanolipidit ovat stabiilissa muodossa olevia syanohydriinejä, joita oksinitrilaasit pilkkovat vapauttaen 15, 29, 30 samalla vetysyanidia (kuva 10). -Hydroksinitriilien entsymaattisessa valmistuksessa tätä katalyyttiominaisuutta käytetään päinvastaiseen tarkoitukseen eli syanohydriinien muodostamiseen. 15 Syanohydriinit ovat tärkeitä kemiallisten reaktioiden lähtöaineina käytettäviä bifunktionaalisia yhdisteitä, joilla voidaan valmistaa enantiopuhtaita synteesituotteita. 31 Lipaasientsyymillä (E.C.3.1.1.3) saadaan valmistettua syanohydriinejä, mutta tällöin tuotteet muodostuvat raseemisena seoksena, aivan kuten kemiallisessa reaktiossa. 11 Kuva 10. Syanogeenisten glykosidien hajoaminen ensin glukosidaasin avulla, seuraavassa vaiheessa HNL katalysoi vetysyanidin vapautumisen kasvin puolustukseksi. - Hydroksinitriilien entsymaattinen valmistus tapahtuu käänteisessä reaktiossa. Mukaillen lähteistä Schmidt et al. 17, Pichersky et al. 32 ja Johnson et al. 33 12

Entsyymeillä on niille suositellut nimet, mutta useiden eri synonyymien takia International Union of Biochemistry and Molecular Biology:n nimeämislautakunnasta koostuva entsyymikomissio (E.C.) on luokitellut entsyymejä E.C.-numeroilla vuodesta 1961 alkaen. 34 E.C.-numeron käyttö julkaisuissa on suositeltavaa epäselvyyksien välttämiseksi. Entsyymien luokittelussa käytetään nelinumeroista järjestelmää, jossa ensimmäinen numero kertoo reaktiotyypin, toinen reaktion alaluokan, kolmas antaa lisätietoa reaktiosta ja neljäs numero kertoo substraattispesifisyyden. 35 Esimerkiksi E.C.4.1.2.x:ssä ensimmäinen 4. tarkoittaa, että entsyymit kuuluvat lyaaseihin, toisena oleva 1. kertoo kyseessä olevan hiili-hiilisidoksia muodostava lyaasi ja kolmantena oleva 2. on aldehydilyaasien numero. 35, 36. Enantioselektiivinen vetysyanidin additio tuottaa tietyn stereoisomeerin omaavia syanohydriinejä, jotka saadaan aikaan käyttämällä hydroksinitriililyaaseja eli oksinitrilaaseja. Näihin kuuluvat E.C.4.1.2.x; E.C.4.1.2.10, E.C.4.1.2.11, E.C.4.1.2.37, E.C.4.1.2.38 ja E.C.4.1.2.39. 18, 36. E.C.-numerot E.C.4.1.2.37 ja E.C.4.1.2.39 on poistettu ja niitä korvaavat uudet numerot E.C.4.1.2.46 ja E.C.4.1.2.47. Tässä työssä käytetään uusia numeroita, vaikka viitteessä olisi käytetty vanhoja E.C.-numeroita. (Taulukko 1. s. 15) 3.2.1 Hydroksinitriililyaasilähteitä Kolmisentuhatta kasvilajia tuottaa oksinitrilaasientsyymiä. Lajeihin kuuluu useita eri kasvisukuja, joiden tuottamat entsyymit erovat toisistaan substraattispesifisyyden ja koentsyymivaatimusten mukaisesti. 37 Entsyymilähteet jaotellaan kahteen luokkaan sen mukaan, minkälaisen kofaktorin ne tarvitsevat. Luokkaan I kuuluvat käyttävät flaviiniadeniinidinukleotidia (FAD) ja luokkaan II eivät. 18. Luokkaan I kuuluvat Rosaceae-suvun alalajien Pruinoideae ja Maloideae kasvit, kuten omenat (McHNL), kirsikat (PsHNL, PlyHNL) ja mantelit (PaHNL). 18. Näiden entsyymien sekvenssi koostuu pääsääntöisesti N-glykolysoituneesta proteiinista, jonka hiilihydraattipitoisuus on 30 %. 17 I luokan entsyymien luonnossa esiintyvä substraatti on (R)-mantelinitriili (E.C.4.1.2.10). 37, 38 (R)-mantelinitriililyaasin substraattispesifisyys on laaja sillä se reagoi myös alifaattisten, aromaattisten, heteroaromaattisten ja -tyydyttymättömien aineiden kanssa. 15 Luokkaan II kuuluvat entsyymit eivät vaadi FAD:a toimiakseen. Tähän luokkaan kuuluvat Euphorbiaceae-sukuun kuuluvat kumipuu 13

(Hevea Brasiliensis) HbHNL (E.C.4.1.2.47) ja kassava (Mannihot esculenta) MeHNL (E.C.4.1.2.38). Näiden entsyymien toiminta on / -hydrolaasien kaltaista. Edellä mainituista kasveista saatavan entsyymin luonnollinen substraatti on asetonisyanohydriini, mutta ne hyväksyvät reagenssikseen mantelinitriililyaasin lailla alifaattiset, aromaattiset, heteroaromaattiset ja -tyydyttymättömät substraatit. Niiden stereoselektiivisyys on mantelinitriilistä poiketen S-muotoa. 37. (Taulukko 1. s. 15) Muita II luokkaan kuuluvia kasveja ovat mm. durra ja pellava. Durran (Sorghum bicolor) SbHNL (E.C.4.1.2.11), entsyymin aminohapposekvenssi on erilainen kuin muiden tunnettujen hydroksinitriililyaasien ja muistuttaakin suurimmaksi osaksi karboksipeptidaasien sekvenssiä. 37 Sen luonnollinen substraatti on (S)-4-hydroksi- 15, 39 mantelinitriili, ja se reagoi lisäksi aromaattisten ja heteroaromaattisten aineiden kanssa. Pellavasta (Linus usitatissimum) saadaan (R)-spesifistä hydroksinitriililyaasia (LuHNL, E.C.4.1.2.46), joka on alkoholidehydrogenaasien lailla toimiva sinkistä (Zn 2+ ) riippuvainen entsyymi. Sen luonnollinen substraatti on (R)-2-butanoni syanohydriini, ja se toimii alifaattisten ja -tyydyttymättömien aldehydien kanssa. 37 (Taulukko 1.) Entsyymilähteestä riippuen kullakin HNL:lla on sille optimaalinen ph-toiminta-alue. Edellä mainituista suurin osa toimii hyvin ph:ssa 5.5, mutta ääritapauksia ovat MeHNL:n ph-alue 3.5 5.4 ja PsHNL:n alue 6.0 7.0. 18 Lisäksi rekombinanttitekniikalla tuotetuilla entsyymeillä on omat optimialueensa. Entsymaattisissa reaktioissa lämpötilalla on suuri vaikutus entsyymien stabiilisuuteen ja muodostuvien tuotteiden enantiomeeriseen puhtauteen. Sen lisäksi, että alhainen lämpötila (-5 4 C) stabiloi entsyymien toimintaa, tuottavat ko. lämpötilassa tehdyt reaktiot 3, 18, 40, 41 enantiomeerisesti puhtaampaa syanohydriiniä. 14

35, 42 Taulukko 1. Hydroksinitriililyaasien E.C.-numerot, niiden suositellut nimet ja synonyymit. E.C.-numero Systemaattinen nimi Synonyymejä Substraatit ph alue 4.1.2.10 (R)- mantelinitriili bentsaldehydilyaasi (syanidia muodostava) (R)-mantelinitriililyaasi, (R)- oksinitrilaasi, Oksinitrilaasi, D- oksinitrilaasi, D- hydroksinitriililyaasi mantelinitriili bentsaldehydilyaasi PaHNL, AtHNL, (R)-HNL, (R)- PeHNL, (R)-hydroksinitriililyaasi R-selektiivinen hydroksinitriililyaasi R-selektiivinen HNL (R)-(+)- mantelinitriililyaasi Mantelinitiriili Alifaattiset ja aromaattiset aldehydit ja metyyliketonit Lämpötila-alue 2,5-7 10-35 C 4.1.2.11 4.1.2.38 (S)-4- hydroksimantelinitriili 4-hydroksi bentsaldehydilyaasi (syanidia muodostava) 2-hydroksi-1,2-difenyylietanoni bentsaldehydilyaasi (bentsaldehydiä muodostava) Hydroksimantelinitriililyaasi Hydroksinitriililyaasi Oksinitrilaasi (S)-4-hydroksimantelinitriili Hydroksibentsaldehydilyaasi Sorghum hydroksinitriililyaasi SbHNL Bentsoiini aldolaasi Bentsaldehydilyaasi 4-Hydroksi-mantelinitriili, aromaattiset aldehydit, ja metyyliketonit 2-hydroksi-1,2-difenyylietanoni, 3,2-6,5-5-25 C 6-8,5 25-37 i 4.1.2.46 (2R)-2-hydroksi-2- metyylibutaaninitriili butan-2- one-lyaasi (syanidia muodostava) Alifaattinen (R)- hydroksinitriililyaasi (R)-HNL (R)-oksinitrilaasi (R)-hydroksinitriililyaasi LuHNL Asetonisyano-hydriini, alifaattiset aldehydit ja metyyliketonit 4,1-5,5 25 C 4.1.2.47 i stabiilisuustestien tulos (S)-syanohydriinilyaasi (syanidia muodostava) (S)-hydroksinitriililyaasi (S)-oksinitrilaasi, (S)-HbHNL (S)-MeHNL, Hydroksinitriililyaasi Mantelinitriili, alifaattiset ja aromaattiset aldehydit sekä metyyliketonit 4,8-8 -5-25 C 15

3.2.1.1 Rekombinanttientsyymit Entsyymien saatavuus riippuu tuotantokasvin HNL pitoisuudesta ja kasvien sadosta. Jotta entsyymien tuotanto ei olisi kasvien tuotannosta ja kasvikaudesta riippuvaista, on niiden tuottamiseksi kehitetty geenitekniikkaan perustuvia menetelmiä. 15 Useita HNL-entsyymejä on tuotettu yhdistelmä-dna-tekniikkaa hyväksi käyttäen. Esimerkiksi bakteeri- ja hiivakantojen avulla on onnistuttu optimoimaan MeHNL ja HbHNL entsyymien kloonaus ja tuottaminen. 15 Mantelista (Prunus amygdalus, Pa) saatavaa oksinitrilaasia, PaHNL-entsyymiä, on muokattu DNA-tekniikalla kloonaamalla isoentsyymi 5:a. Tätä on edelleen tuotettu Pichia pastoris -hiivan kasvuliuoksessa onnistuneesti. 43, 44 Tällä tavalla muokkaamalla voidaan tuottaa reaktiivisempia entsyymejä. Rekombinantti isoentsyymi PaHNL5:n toiminnallinen ph-alue on 2.5 6.5, 44 perinteisesti mantelista eristetyn PaHNL:n optimaalinen alue on 5.5 6.0. Reaktiivisempien 44, 45 entsyymien ansiosta myös epätavallisten substraattien käyttö on mahdollistunut ja lääkeaineena käytettyjen kiraalisten tuotteiden saanto on parantunut. 46 Yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla on tuotettu myös lituruohosta (Arabidopsis thaliana, AtHNL, E.C.4.1.2.10), saatavaa oksinitrilaasia. Se on rakenteeltaan samankaltainen raseemisen seoksen tuottavan lipaasientsyymin, sekä (S)-syanohydriiniä tuottavien 47, 48 HbHNL:n ja MeHNL:n kanssa. Edellä mainituista poiketen AtHNL tuottaa (R)- konformaatiota. Tällöin voidaan syntetisoida (R)-syanohydriinejä 49 tai (R)- nitroalkoholeja. 50 ja 16

3.2.2 (R)-Oksinitrilaasi Syanohydriinien synteesiä on tehty pääasiassa PaHNL -entsyymillä, sillä mantelista peräisin olevaa entsyymiä on saatavilla kohtuulliseen hintaan ja runsaasti. 51 Kirjallisuudessa on esitetty useita erilaisia menetelmiä sisältäen eri lähtöaineita ja muita reagensseja syanohydriinien valmistamiseksi. Seuraavassa käsitellään vain (R)- oksinitrilaasientsyymillä suoritettuja reaktioita. Suurin osa kaupallisesti kiinnostavista oksinitrilaasin substraateista on bentsaldehydijohdannaisia, yleensä veteen liukenemattomia aineita. 42 Oksinitrilaasi on inaktiivinen täysin vedettömissä olosuhteissa ja kaikissa viitteissä onkin käytetty vettä ph:n säätämiseksi tai entsyymin aktivoimiseksi. Reaktioita (R)-oksinitrilaasilla on tehty etyyliasetaatissa, di-isopropyylieetterissä (DIPE) ja dibutyylieetterissä. 52-57 Tämä johtuu siitä, että nämä liuottimet liukenevat veteen vain osittain. Tällöin jopa hitaasti reagoivat karbonyyliyhdisteet muodostavat haluttuja tuotteita mitätömän pienillä vetysyanidin lisäyksillä. 17 DIPE on osoittautunut hyväksi liuottimeksi, sillä entsyymin aktiivisuus pysyy pitkään hyvänä. 51 16, 52, Muita käytettyjä liuoksia ja liuosyhdistelmiä ovat olleet vesi-etanoli, 55 vesi-dietyylieetteri, 52 metyyli-tert-butyylieetteri (MTBE), 58, 59 etanoli-etikkahappo, 60 vesi-ioniliuos, 61 kaliumfosfaatti-sitraattipuskuri, 12 tolueeni, 12 ja dikloorimetaani. 12 Vetysyanidilähteinä on käytetty HCN, 54, 55, 62, 63 KCN, 52 52, 62, 63 asetonisyanohydriiniä, NaCN 58 tai etyylisyanoformaattia. 12 Reaktion ph:ta on säädetty oksinitrilaasientsyymille optimaalisen ph:n aikaansaamiseksi. Kirjallisuudessa reaktioseoksen ph on vaihdellut 3,3 ja 7 välillä lähtöaineesta ja puskurista riippuen. Artikkeleissa todetaan optimin olevan ph viidessä 11, 17 tai 5,5-6,0:ssa. 64 Tämän lisäksi todetaan orgaanisen liuottimen ja alhaisen ph:n, vähentävän kemiallista reaktiota. 11, 37, 51 Reaktiolämpötila vaikuttaa entsyymin stabiilisuuteen ja tuotteen enantiomeeriseen puhtauteen. 3 Syanohydriinejä onkin syntetisoitu oksinitrilaasilla reaktioseoksissa joiden 29, 65, 66 lämpötila on ollut 0-30 C asteen välissä, yleensä noin 5 C:ssa. 17

4 Hiilihydraatit Hiilihydraatit ovat aldehydejä tai ketoneja, joiden hiilirunkoon on liittyneenä useita hydroksyyliryhmiä. Suurin osa luonnon orgaanisesta materiaalista koostuu hiilihydraateista; ne toimivat muun muassa energiavarastona, osana DNA- ja RNA:ta sekä rakenne-elementteinä kasvi- ja bakteerisoluissa. Kasvien kuivapainosta jopa 80 % on 20, 67 hiilihydraatteja. 4.1 Mono-, oligo- ja polysakkaridit Hiilihydraatit jaotellaan mono, oligo- ja polysakkarideihin. Monosakkarideissa on yksi sokerimolekyyli, oligosakkarideista muodostuu hydrolyysissä kahdesta kahdeksaan monosakkaridiyksikköä 68 ja polysakkaridit hydrolysoituvat monosakkarideiksi. 69 Monosakkaridit ovat yksinkertaisimpia hiilihydraatteja, joissa on kolmesta yhdeksään hiiliatomia 69 ja joiden stereokemiallinen rakenne vaihtelee yhden tai useamman hiiliatomin osalta. Viisi- ja kuusiatomiset sokerit ovat yleisimpiä luonnossa. Pentooseja ovat mm. D- ksyloosi ja D-arabinoosi, heksooseja ovat D-glukoosi, D-fruktoosi, D-galaktoosi ja D- mannoosi. 70 Monosakkaridit esiintyvät usein rengasrakenteisena johtuen molekyylin etäisten funktionaalisten ryhmien interaktiosta. Yleisesti aldehydin ja alkoholin reaktiossa muodostuu hemiasetaali ja vastaavasti ketonin reagoidessa alkoholin kanssa muodostuu hemiketaali. 71 Sokerimolekyylin sisältämät hydroksyyliryhmät numeroidaan molekyylissä olevien hiiliatomien mukaisesti. 71 18

Kuva 11. Glukoosimolekyylin hemiasetaalin muodostuminen. 71 Rengasrakenne syntyy, kun aldoheksooseista muodostuu hemiasetaali ensimmäiseen ja viidenteen hiilen kiinnittyneen ryhmän reaktiossa esimerkkinä glukoosi (kuva 11). Vastaavasti ketoheksooseista muodostuu hemiketaali, kun toisen ja viidennen hiilen funktionaaliset ryhmät reagoivat keskenään esimerkkinä fruktoosi (kuva 12.). Molemmissa tapauksissa entiseen karbonyylihiileen muodostuu uusi kiraliakeskus ja siitä tulee ns. anomeerinen hiili. Kuva 12. Fruktoosin hemiketaalin muodostuminen. 71 Rengasrakenteinen, anomeerisen hiilen sisältävä sokerimolekyyli esiintyy - tai muodossa, riippuen muodostuneen hydroksyyliryhmän suunnasta molekyyliin nähden. 71 Liuoksissa sokerien anomeeriset muodot esiintyvät tautomerisessa tasapainossa (kuva 13.) 72 19

Oligo- tai polysakkaridissa anomeerisen hiilen hydroksyyliryhmä on sitoutunut toisen sokerimolekyylin hiileen. Sokerimolekyylin anomeerinen hiili voi liittyä toisen sokerin mihin tahansa hydroksyyliryhmään muodostaen uuden - tai -glykosidisen sidoksen. Aksiaalisesti toisiinsa sitoutuneet sokerimolekyylit voivat muodostaa kierteisen konformaation, tällöin glykosidiset sidokset ovat -muotoa. Tärkkelyksen sisältämä amyloosi on esimerkki tällaisesta kierteisestä muodosta. -Glykosidisten sidosten muodostama molekyyli on taas lineaarinen, kuten esimerkiksi galaktomannaanissa. 70 Kuva 13. Glukoosin vesiliuoksessa (rt) muodostuvat eri tautomeriamuodot. - furanosodi, -furanosodi-, ja asyklista aldehydi -muotoa on liuoksessa yhteensä alle 0,2 %. Mukaillen lähteestä 72 20

Kolme tärkeintä oligosakkaridia ovat sakkaroosi, laktoosi ja maltoosi, nämä kaikki ovat disakkarideja. Niiden kemiallinen merkitys on lähinnä ravitsemuksellinen. Ne hydrolysoituvat elimistössä siten, että sakkaroosi glukoosiksi ja fruktoosiksi, laktoosi galaktoosiksi ja glukoosiksi sekä maltoosi kahdeksi glukoosiksi. Nämä muutetaan elimistössä aineenvaihdunnan avulla energiaksi. 71 Eräs esimerkki trisakkaridista on raffinoosi, jota saadaan uutettua soijapavuista. 73 Raffinoosi koostuu galaktoosi-, glukoosija fruktoosiyksiköistä (kuva 14.). 68 Trisakkaridina siinä on noin 30 % galaktoosiyksiköitä. 74 Kuva 14. Raffinoosin eli -D-Galaktopyranosyyli-(1 6)- -D-glukopyranosyyli-(1 2)- - D-fruktofuranosidin rakenne. Mukailtu lähteestä Neubauer et al. 75 Polysakkaridit ovat homo- tai heteropolysakkarideja sen mukaan koostuuko sen rakenne samanlaisista vai erilaisista monosakkarideista. Polysakkaridien rakenne voi olla suora tai haaroittunut. Esimerkiksi glukoosin energiavarastomuoto glykogeeni on homopolysakkaridi. Se koostuu suorasta glukoosiketjusta, jossa on noin joka kymmenennessä yksikössä haarautuma. 69 Eräs esimerkki heteropolysakkaridista on guarkumi (kuva 15.). 21

4.2 Galaktomannaanit Galaktomannaanit ovat tärkeitä polysakkarideja useilla eri teollisuuden aloilla. Vilja- ja palkokasvien siementen varastoravintoa on yleensä tärkkelys, mutta joidenkin palkokasvien varastopolysakkaridina toimivat galaktomannaanit. 76 Nämä ovat monikäyttöisiä makromolekulaarisia hiilihydraatteja, joita saadaan sekä monivuotisten puuvartisten että yksivuotisten kasvien siemenistä. 77 Guarkumi (Cyamopsis tetragonolobus) on eräs tällainen yksivuotinen palkokasvi, jota kasvaa runsaasti Intian niemimaalla. Sen rakenne on muistuttaa useimmista palkokasveista saatavien galaktomannaanien perusrakennetta (kuva 15.). Se on lineaarinen (1 4) -glykosidisin sidoksin sitoutunut D-mannopyranosidiketju, jossa on satunnaisesti liittyneenä yksittäinen (1 6)-sidoksella kiinnittynyt D-galaktoosihaara. Johanneksen leipäpuusta (Cerartonia siliqua) saatava kumi (locust bean gum, LBG) on toinen tärkeä galaktomannaani. 78 Kuva 15. Idealisoitu guarkumin rakenne. 77 Eri kasvilajien galaktomannaanit eroavat toisistaan mannoosi-galaktoosi -suhteen (M:G), galaktoosihaarojen paikan- ja molekyylipainovaihteluvälin mukaan. 76, 79 Galaktoosihaarat voivat esiintyä molekyylissä säännöllisesti, satunnaisesti tai jaksoina. Guarkumin M:G - suhde on noin 2:1 ja siinä olevat galaktoosiyksiköt esiintyvät pareittain tai kolmen sarjoissa. Haarautumaton mannoosiketju on yleensä alle kuuden sokerimolekyylin 76, 78 mittainen. Johanneksenleipäpuukumin M:G -suhde on 4:1 ja sen haarautumaton mannoosiketju voi olla jopa 20. yksikön mittainen. 70 Johanneksenleipäpuun 22

galaktomannaanin galaktoosipitoisuus on noin 17 26 % ja guarkumin galaktoosipitoisuus vaihtelee 33 40 % välillä. 74, 77 Galaktomannaanien rakenteiden erot vaikuttavat niiden vesiliukoisuuteen, viskositeettiin ja reaktiivisuuteen. 80 Nämä määrittelevät edelleen kunkin galaktomannaanin teolliset sovellukset. Guarkumin teollinen käyttö on lähtöisin paperiteollisuuden tarpeista, mutta koska se on taloudellisin ja runsaimmin saatavilla oleva raaka-aine, on sen käyttö nykyään laaja-alaista mm. elintarvike- ja lääketeollisuudessa. 76 Käyttötarkoituksesta riippumatta galaktomannaanin perusrakenne pysyy muuttumattomana, mutta mm. molekyylipainoa, viskositeettia ja liukoisuutta voidaan muuttaa hydrolyyttisella tai oksidatiivisella depolymerisaatiolla. Tällöin muodostetaan stabilisaattoreita, viskositeetin muodostajia ja emulsaattoreita. 76 Näitä käytetään öljylähteiden kaivauksissa, räjähde-, kaivos-, paperi- ja tekstiiliteollisuudessa. Edelleen guarkumia käytetään ruoka-, lääke- ja kosmetiikkateollisuudessa edullisena lisäaineena esimerkiksi estämään veden kidemuodostusta jäätelöissä, ravintoaineissa lisäämässä kylläisyyden tunteen syntymistä ja ruokavalmisteissa miellyttävän suutuntuman 76, 77, 81 aikaansaamiseksi. 4.2.1 Galaktomannaanien reaktiivisuus Guarkumin galaktoosisivuhaarat sisältävät yhden primaarisen ja kolme sekundaarista OHryhmää, substituoitu mannoosi kaksi sekundaarista OH-ryhmää, sekä substituoimaton mannoosi kaksi sekundaarista ja yhden primaarisen OH-ryhmän (kuva 15). 77 Galaktomannaanien hydroksyyliryhmät voidaan derivatisoida. Niiden primaariset ja sekundaariset hydroksyyliryhmät (OH) ovat lähes yhtä reaktiivisia. 77 Yleisesti ottaen primaarinen hydroksyyli reagoi helpommin kuin sekundaarinen. Hydroksyyliryhmiä on mahdollista hapettaa selektiivisesti käyttämällä joko kemiallista tai entsymaattista menetelmää. Kemiallisessa reaktiossa voidaan käyttää esimerkiksi 2,2,6,6- tetrametyylipiperidiini-1-oksyyliä (TEMPO) 82, 83 ja entsymaattisessa esimerkiksi galaktoosioksidaasia (GO). 74, 84, 85 TEMPO:lla galaktoosin ja vapaiden mannoosiryhmien C-6 hydroksyyliryhmät hapettuvat karboksyylihapoksi. Entsymaattisella menetelmällä terminaalisten galaktoosien C-6 hydroksyyliryhmät hapettuvat aldehydiksi. Guarkumia voidaan derivatisoida tarpeen mukaan muodostamalla siitä estereitä tai 86, 87 eetterijohdannaisia. Sitä karboksimetyloidaan vesiliuoksissa ja hydroksietyloidaan 23

emäksisissä olosuhteissa. 88 Siitä on muodostettu metyylieettereitä, joiden metyylisubstituentit ovat olleet satunnaisesti kiinnittyneenä sokerirenkaisiin substituutioasteella 0,3-0,6. 89 Teollisuuden tarpeisiin valmistetaan hydroksipropyyli-, hydroksietyyli-, karboksimetyyli-hydroksipropyyli- ja kationista guarkumia. 90 Myös kationisia hydroksyylipropyyliguarkumeja, hydrofobisia guarkumeja sekä guarkumifosfaatteja valmistetaan. 77 Hydroksyyliryhmien korvautumista kuvataan substituutioasteella (DS, degree of substitution). Sen maksimaalinen arvo on kolme, jolloin kaikki molekyylin hydroksyyliryhmät ovat substituoituja. 90 Polysakkaridin liukoisuusominaisuudet voivat muuttua niinkin pienillä DS:n arvoilla kuin 0,1. 90 Guarkumia voidaan depolymerisoida lämmittämällä sitä suolahapon kanssa. 89 Myös muiden vahvojen happojen tai orgaanisten happojen, kuten sitruuna- tai askorbiinihapon, käyttäminen on mahdollista. Ketjun pilkkomiseen on mahdollista käyttää myös emäksisiä olosuhteita tai vahvoja hapettimia esim. vetyperoksidia, myös elektronisuihkulla tai gammasäteillä säteilyttäminen pilkkovat polymeerin pienempiin osasiin. 77 Näin ollen derivatisointireaktioita suoritettaessa on huomioitava käytetyn emäksen konsentraatio, lämpötila sekä reaktioaika suurimman mahdollisen substituutioasteen saavuttamiseksi, kuitenkin molekyylikoon siitä kärsimättä. 89 24

KOKEELLINEN OSUUS 5 Johdanto Tässä työssä tutkittiin oligo- ja polysakkarideja, joiden terminaalisen galaktoosin C-6- asemassa oleva hydroksyyliryhmä hapetettiin entsymaattisella reaktiolla selektiivisesti aldehydiksi. Muodostetun aldehydin annettiin edelleen reagoida vetysyanidin kanssa siten, että katalyyttinä toimi mantelista peräisin oleva oksinitrilaasientsyymi. Reaktioseoksessa muodostui syanohydriini, joka hydrolysoitui edelleen -hydroksiamidiksi (kuva 16.). Reaktioseokseen mahdollisesti jäljelle jäänyt lähtöaine (aldehydi) pelkistettiin alkoholiksi NaBH 4 :llä. Kuva 16. Synteesireitti, GO = galaktoosioksidasi, HRP= piparjuuriperoksidaasi, PaHNL= (R)-oksinitrilaasientsyymi Tuotteet analysoitiin pääasiassa kaasukromatografia-massaspektrometrillä (GC-MS). Analyysiä varten tuote kuivattiin vakuumiuunilla, hydrolysoitiin ja silyloitiin. Synteesituotteiden rakenteet varmistettiin nestekromatografia-massaspektrometrilla (LC- MS/MS) ja ydinmagneettisella resonanssispektroskopialla (NMR). Näitä menetelmiä varten näytteet kuivattiin kylmäkuivaimella. 25

5.1 Materiaalit ja menetelmät 5.1.1 Reagenssit ja entsyymit Sakkaridit: D-(+)-raffinoosi pentahydraatti (Sigma R0250) Guarkumi, GG (Sigma, G 4129) Pilkottu guarkumi, GM 50, (3KP17, mw 50 000 g/mol) Metyyli- -D-galaktopyranosidi (Fluka 66916) D-(+)-mannoosi, Merck D-(+)-glukoosi, Merck D-(+)-galaktoosi, Merck Syanidilähteet: Natriumsyanidi, NaCN, Merck Etyylisyanoformaatti, NCCOOEt, (Sigma E18859) Entsyymit: Galaktoosioksidaasi (GO, G7907, E.C.1.1.3.9, Sigma), 73 U/mg Piparjuuriperoksidaasi (HRP, P8250, EC 1.11.1.7, Sigma), Tyyppi II, 188 U/mg Katalaasi (Kat, C30, E.C. 1.11.1.6, Sigma), 22000 U/mg ja 638 ku/ml (R)-Oksinitrilaasi (PaHNL, M6782, E.C.4.1.2.10, Sigma) 560 U/ml -glukosidaasi (G0395, E.C. 3.2.1.21, Sigma) 2,18 U/mg Hydroksinitriililyaasi (HNL), Arabidopsis thaliana, recombinant from E.Coli, (79847, Sigma), 581 U/ml 26

Pelkistimet: Natriumboorihydridi (NaBH 4, Sigma) Natriumboorideuteridi (NaBD 4, Sigma) Silylointireagenssit: Klooritrimetyylisilaani, TMCS (Fluka 92360) Heksametyylidisiloksaani, HMDS (Fluka 52619) Pyridiini, py, (Sigma) Muut reagenssit: Etanoli, EtOH, (92,4 %) Metanoli, MeOH, (Sigma) Asetyylikloridi, (Sigma) Sitruunahappo monohydraatti, (Merck) Trinatriumsitraatti dihydraatti, (Merck) Natriumdivetyfosfaatti dihydraatti NaH 2 PO 4 2H 2 O, (Riedel de Haën) Dinatriumvetyfosfaatti Na 2 HPO 4, (Riedel de Haën) Dowex 1x2-200 ioninvaihtohartsi, (Sigma 217387) Synteesit tehtiin huoneenlämpötilassa magneettisekoituksella. 27

5.1.2 Sokereiden hapetus Hapetettua sakkaridia valmistettiin D-(+)-raffinoosi pentahydraatista (Raf) sekä 74, 84 guarkumista (GG). Menetelmässä galaktoosiyksikön C-6 hydroksyyli hapetetaan selektiivisellä entsymaattisella menetelmällä aldehydiksi vesiliuoksessa. Hapetusreaktioon käytettyjen entsyymien pitoisuus laskettiin suhteellisena osuutena polysakkaridin sisältämistä terminaalista galaktoosiyksiköistä. D-(+)-raffinoosi pentahydraattia liuotettiin ultrapuhtaaseen veteen siten, että sen raffinoosipitoisuus oli 42 mm. Liuosta sekoitettiin 200-300 rpm nopeudella kahden tunnin ajan huoneenlämpötilassa, jotta kaikki raffinoosi oli varmasti liuennut. Tähän liuokseen lisättiin galaktoosioksidaasia (GO) 73U, katalaasia (kat) 127 ku ja piparjuuriperoksidaasia (HRP) 226 U. Liuosta hapetettiin avoimessa astiassa 200 rpm sekoituksella 72 tunnin ajan +4 C. Entsyymien toiminta inaktivoitiin kuumentamalla liuosta kiehuvassa vesihauteessa. Liuoksen sisälämpötilaa pidettiin 5 minuutin ajan 80 C, jonka jälkeen liuos siirrettiin säilöpulloon ja +4 C. Tästä liuoksesta otettiin näyte hapetusasteen määritystä varten. Guarkumia hapetettaessa liuotettiin se ultrapuhtaaseen veteen ja annettiin liuoksen (1 mg/ml) sekoittua 200-300 rpm nopeudella kahden tunnin ajan. Tähän liuokseen lisättiin GO (29 U), kat (51 ku) sekä HRP (188U). Liuosta hapetettiin avonaisessa astiassa 200 rpm sekoituksella 24 h, + 4 C. Reaktio lopetettiin lämmittämällä seosta vesihauteessa, jossa sitä pidettiin niin kauan että liuoksen sisälämpötila oli 5 minuutin ajan + 80 C. Liuos jäähdytettiin ja säilytettiin + 4 C. Liuoksesta otettiin näyte hapetusasteen määritystä varten. (Taulukko 7. s. 43) Pilkottua guarkumia (GM 50 ) hapetettiin liuottamalla sitä (5 mg/ml) ultrapuhtaaseen veteen, liuosta sekoitettiin 200-300 rpm 1,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Reaktio käynnistettiin lisäämällä liuokseen HRP (37,6 U), kat (10 ku) ja GO (5,8 U). Reaktioliuosta sekoitettiin avonaisessa astiassa 200 rpm sekoituksella + 4 C 48 h, jonka jälkeen se siirrettiin säilöpulloon. 28

5.2 Syanohydriinien synteesi Syanohydriininien syntetisointia on tehty aikaisemmin useilla eri entsyymeillä, mutta reaktioliuoksena on ollut joko liuotin tai kaksifaasisysteemi. Vaihtoehtoisesti entsyymejä on käytetty kantajamateriaalissa, esimerkiksi selluloosassa. Tässä työssä tarkoituksena oli saada mantelista peräisin oleva (R)-oksinitrilaasientsyymi toimimaan sellaisenaan vesipuskuri-liuoksessa. Synteeseissä tutkittiin (R)-oksinitrilaasientsyymiä sekä -glukosidaasia, jotka molemmat toimivat kasveissa syanogeenisten glykosidien katabolian katalyytteinä. Lisäksi kokeiltiin lituruohosta saatavan hydroksinitriililyaasin toimivuutta. Synteesit suoritettiin pääasiassa ph 4.0:ssa, jotta korkeammassa ph:ssa tapahtuva kemiallinen reaktio olisi ehkäisty mahdollisimman hyvin. Kemiallisen reaktion suuruutta tutkittiin ns. reaktionollalla, jossa reaktio suoritettiin entsymaattisen reaktion optimaalisissa olosuhteissa ilman entsyymiä. Suoritettuja kokeita tehtiin suuri määrä, sillä haluttiin selvittää kaikkien reaktioon osallistuvien aineiden ristikkäisvaikutus. Näin ollen esimerkiksi oksinitrilaasilla onnistuneet kokeet toistettiin -glukosidaasilla. Lisäksi synteesin toimivuutta tutkittiin guarkumilla. 5.2.1 Syanidilähteet Reaktioissa syanidilähteenä käytettiin natriumsyanidia (NaCN) ja etyylisyanoformaattia (NCCOOEt). Kirjallisuuden mukaan asetonisyanohydriini olisi helppokäyttöinen kaupallinen syanidilähde syanohydriinin muodostamiseksi, sillä se liukenee veteen ja hydrolysoituu reaktioseoksessa asetoniksi ja syanidiksi. 2 Valitettavasti asetonisyanohydriiniä ei ollut saatavilla työnsuoritusajankohtana. Myös sekä natriumsyanidi että etyylisyanoformaatti muodostavat reaktioseokseen vetysyanidia in situ. Etyylisyanoformaatti hajoaa vedessä (kuva 17.) muodostaen vetysyanidia, hiilidioksidia ja etanolia, kun taas natriumsyanidi muodostaa vetysyanidia ja emästä. 29