Laboratorioiden välinen pätevyyskoe 17/2016

SUOMEN YMPÄRISTÖKESKUKSEN RAPORTTEJA 3 2017 Laboratorioiden välinen pätevyyskoe 17/2016 Rakennusmateriaali- ja suspensionäytteen mikrobiologinen määritys viljelymenetelmällä sekä homekantojen morfologinen tunnistaminen Kaisa Jalkanen, Heli Martikainen, Anne Hyvärinen, Katarina Björklöf, Mirja Leivuori ja Markku Ilmakunnas Suomen ympäristökeskus

TIIVISTELMÄ Pätevyyskokeeseen osallistui 18 laboratoriota. Näytteet olivat rakennusmateriaalinäyte ja suspensionäyte sekä puhdaskannat maljalla tunnistusta varten. Pätevyyden arvioinneissa käytettiin vertailuarvoina osallistujatulosten robustia keskiarvoa. Kvantitatiivisista tuloksista 91 % oli hyväksyttäviä (z-arvo ±2) kun sallittiin 15-35 % poikkeama vertailuarvosta. Kaikki laboratoriot toimivat Asumisterveysasetuksen soveltamisohjeen ja annettujen ohjeiden mukaisesti. Tulkinnan materiaalinäytteestä raportoi 15 osallistujaa. He päätyivät kaikki samaan tulokseen mikrobikasvusta tai vauriosta materiaalinäytteessä. Kaikkiaan 17 laboratoriota suoritti hyväksyttävästi vertailukierroksen kvalitatiivisen osan, eli tunnisti vähintään 2 kantaa sukutasolle oikein. Lämmin kiitos pätevyyskokeen osallistujille! Avainsanat: sienten kokonaispitoisuus, bakteerien kokonaispitoisuus, aktinomykeetit, asumisterveystutkimukset, vertailumittaus, mikrobiologinen määritys, pätevyyskoe, viljelymenetelmä ABSTRACT In this proficiency test took part 18 laboratories. The samples were a building material sample, a suspension sample and plate cultivations for identification. The robust means of the participants results were used as assigned values. In all, 91 % of the quantitative results were acceptable (z-value ±2) when a deviation from the assigned values was between 15-35 %. All participants acted according to national guidelines. All 15 participants that made interpretation of the results came to the same conclusions about the microbial growth or damage of the material sample. In all, 17 participants got acceptable result from the qualitative part of the proficiency test, which correspond to at least two correct identifications to the genus level. Warm thanks to all the participant of this proficiency test! Keywords: water and environmental laboratories, proficiency test, interlaboratory comparisons, total counts of fungi, total count of bacteria, actinomycetes, plate count, microbiological analysis, housing and health studies SAMMANDRAG Total 18 laboratorier deltog i provningsjämförelsen för laboratorier som analyserar prover för inomhusklimat. Proverna bestod av ett byggnadsmaterialprov, en suspension samt odlingar på plattor för identifieringstestet. Som jämförelsevärden användes det robusta medeltalet av deltagarnas resultat. I provningsjämförelsen var 91 % av alla resultaten tillfredsställande när 15-35 % avvikelse från jämförelsevärdena tilläts. Alla deltagare använde Social- och hälsovårdsministeriets instruktioner. Alla laboratorier som tolkade resultaten drog rätt slutsats om mikrobtillväxten på materialprovet. Totalt 17 deltagare fick tillfredsställande resultat i identifieringstestet, där minst 2/3 rätt krävdes till släktnivå. Ett varmt tack till alla deltagarna i testet! Nyckelord: Totalhalten av mögel, totalhalten av bakterier, aktinomyceter, forskning av inomhusklimat, provningsjämförelse, mikrobiologiska bestämningsmetoder, odlingsmetoder

SISÄLLYS Tiivistelmä Abstract Sammandrag... 3 1 Korjaussivu... 6 2 Johdanto... 7 2.1 Osallistujat... 7 3 Tulokset... 8 3.1 Laboratorioiden ilmoittamat tulokset... 8 3.2 THL:n Ympäristömikrobiologian yksikön viljelemien näytteiden tulokset... 8 3.3 Kvantitatiivinen pätevyyskoe sukujen esiintyminen... 8 3.4 Mikrobiryhmien kvantitatiivinen määritys ja pätevyyden arviointi... 10 3.4.1 Sienten kokonaispitoisuus... 11 3.4.2 Cladosporium... 11 3.4.3 Penicillium... 12 3.4.4 Trititrachium... 12 3.4.5 Stachybotrys... 12 3.5 Rinnakkaismääritysten toistettavuus... 12 3.6 Osallistujien tulkinta näytteestä... 13 3.7 Kvalitatiivinen pätevyyskoe homekantojen tunnistaminen... 13 3.7.1 Geomyces pannorum... 13 3.7.2 Aspergillus ochraceus... 13 3.7.3 Absidia repens... 13 4 Huomioitavaa tuloksista... 14 4.1 Mittausepävarmuus... 14 4.2 Näytteiden esikäsittely, viljely ja maljojen kasvatus... 15 4.3 Tulosten ilmoittaminen... 17 5 Palaute pätevyyskokeesta... 17 6 Toteutus... 18 6.1 Näytteiden valmistus, niiden toimitus ja säilytys... 18 6.1.1 Kvantitatiivinen pätevyyskoe: Rakennusmateriaalinäyte... 18 6.1.2 Kvantitatiivinen pätevyyskoe: Suspensionäyte... 18 6.1.3 Kvalitatiivinen pätevyyskoe: Tunnistettavat homesienikannat... 18 6.2 Näytteiden homogeenisuuden määrittäminen ja säilyvyystestaus... 19 6.3 Kvantitatiivisten tulosten käsittely... 19 6.4 Näytteiden homogeenisuuden laskeminen... 19 6.5 Näytteiden säilyvyystestaus... 20 6.6 Vertailuarvot ja kokonaishajonnan tavoitearvot... 21 4 Proftest SYKE THL 17/16

6.7 Pätevyyden arvioinnin suoritus... 22 7 Yhteenveto... 23 8 Summary... 23 Kirjallisuus... 25 LIITE 1 : Tulostaulukoissa esiintyviä käsitteitä... 26 LIITE 2 : Vertailuarvot ja niiden mittausepävarmuudet... 28 LIITE 3 : Osallistujakohtaiset tulokset muunnettuna log-muotoon... 29 LIITE 4 : Osallistujien tulokset graafisesti muunnettuna log-muotoon... 37 LIITE 5 : Yhteenveto z-arvoista... 43 LIITE 6 : Materiaalinäytteiden alkuperäiset tulokset... 44 LIITE 7 : Suspensionäytteiden alkuperäiset tulokset... 46 LIITE 8 : z-arvot suuruusjärjestyksessä... 48 Proftest SYKE THL 17/16 5

1 Korjaussivu Loppuraportin 1.2.2017 toimitetussa versiossa havaittiin virhe yhteenvedossa z-arvoista (Liite 5) ja näytteiden esikäsittelytiedoissa (Taulukko 6). Virheet on korjattu tässä loppuraportissa ja versio korvaa edellisen raportin. 6 Proftest SYKE THL 17/16

2 Johdanto Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen (THL) Asuinympäristö ja terveys -yksikkö järjestää vuosittain pätevyyskokeita asumisterveystutkimuksia tekeville laboratorioille. Tämän pätevyyskokeen toteuttivat tutkija Kaisa Jalkanen, tutkimusanalyytikko Heli Martikainen ja johtava tutkija Anne Hyvärinen. Pätevyyskoe toteutettiin yhteistyössä Suomen ympäristökeskuksen (SYKE) pätevyyskoetoiminnan Proftest SYKE kanssa, josta pätevyyskokeen toteutukseen osallistui erikoistutkija Katarina Björklöf. Ryhmäpäällikkö Mirja Leivuori Proftest SYKEstä osallistui tämän loppuraportin kirjoittamiseen ja laboratoriomestari Markku Ilmakunnas raportin taittoon. Pätevyyskokeen näytteiden tulosten tilastollinen käsittely sekä z-arvojen laskeminen tehtiin Proftest SYKE:n käyttämillä menetelmillä. Pätevyyskokeen järjestämisessä noudatettiin standardeja SFS-EN ISO/IEC 17043 [1] ja ISO 13528 [2] sekä IUPACin teknistä raporttia [3]. 2.1 Osallistujat Pätevyyskokeen kohderyhmä oli mikrobiologisia asumisterveystutkimuksia rakennusmateriaalinäytteistä Asumisterveysasetuksen soveltamisohjeen laimennossarjamenetelmällä tekevät laboratoriot [4]. Kaikkiaan pätevyyskokeessa oli 18 osallistujaa. Asiantuntijalaboratorio THL määritti sekä suspensionäytteet että materiaalinäytteet kahdeksana rinnakkaisena. Osallistujat olivat: BotniaLab Oy, Vaasa Inspecta Oy, KiraLab, Oulu ISS Proko Oy, Sisäilmalaboratorio, Jyväskylä Kokemäenjoen vesistön vesiensuojeluyhdistys ry, Rauma Kokemäenjoen vesistön vesiensuojeluyhdistys ry, Tampere Länsi-Uudenmaan vesi ja ympäristö ry, Lohja Metropolilab Oy Mikrobioni Oy, Kuopio Ositum Oy, Oulu Ositum Oy, Vantaa Ramboll Finland Oy, Ramboll Analytics, Lahti Savo-Karjalan Ympäristötutkimus Oy, Joensuu ScanLab Oy THL/ Ympäristöterveyden osasto, Kuopio TTL/ Työterveyslaitos, Kuopio Turun yliopisto, Aerobiologinen yksikkö VITA-Terveyspalvelut Oy, VITA Laboratorio WSP Finland Oy, Sisäilmalaboratorio Proftest SYKE THL 17/16 7

3 Tulokset 3.1 Laboratorioiden ilmoittamat tulokset Kaikki pätevyyskokeeseen osallistuneet laboratoriot (18 kpl) ilmoittivat kvalitatiivisen pätevyyskokeen tulokset eli homekantojen tunnistustulokset sekä kvantitatiivisen pätevyyskokeen tulokset suspensio- ja rakennusmateriaalinäytteelle. Osallistujien ilmoittamat alkuperäiset tulokset pesäkkeen muodostavaa yksikköä grammaa tai millilitraa kohden (pmy/g tai pmy/ml) on koottu liitteisiin 6 ja 7. Pitoisuudet log-muodossa ja niistä lasketut tunnusluvut on ilmoitettu liitteessä 3. Tulokset on esitetty graafisesti log-muodossa liitteessä 4. Asiantuntijalaboratorion tulokset on esitetty taulukoissa ja liitteissä numerolla 18. 3.2 THL:n Ympäristömikrobiologian yksikön viljelemien näytteiden tulokset Asiantuntijalaboratorio THL määritti kvantitatiivisen osan suspensio- ja materiaalinäytteet kahdeksana rinnakkaisena määrityksenä. THL:n analysoimien näytteiden pitoisuudet rinnakkaisista määrityksistä on esitetty liitteessä 6 ja 7. THL:n viljelemien näytteiden tulosten perusteella analysoitiin näytteiden homogeenisuutta (ks. 5.4 Näytteiden homogeenisuuden laskeminen). 3.3 Kvantitatiivinen pätevyyskoe sukujen esiintyminen Tulokset näytteistä ilmoitettiin sukutasolla ja kvantitatiivisen pätevyyskokeen tulokset on arvioitu sukutason tunnistuksen mukaan. Rakennusmateriaalinäytteisiin oli laitettu Penicillium brevicompactum, Cladosporium sphaerospermum ja Trititrachium oryzae -sienisuspensioita sekä rakennusmateriaalinäytteistä eristetyistä bakteereista tehtyä bakteerisuspensiota. Suspensionäytteet oli tehty Penicillium brevicompactum, Cladosporium sphaerospermum ja Stachybotrys chartarum puhdasviljelmistä sekä rakennusmateriaalinäytteestä eristetystä aktinomykeetistä tehdystä puhdasviljelmästä. Vertailunäytteiden valmistus epäonnistui bakteereiden osalta, joten tryptoni-hiivauute-glugoosi (THG) -alustan tuloksia ei voitu arvioida. Osallistujien tunnistamat mikrobiryhmät materiaali- ja suspensionäytteistä on esitetty taulukossa 1A ja 1B. Kaikki osallistujat tekivät Penicillium- sukutunnistuksen 2 % mallasuute- (M2) ja dikloraaniglyseroli- (DG-18) alustoilta rakennusmateriaalinäytteestä (taulukko 1). Cladosporiumia löytyi kaikista rakennusmateriaalinäytteistä kummaltakin sienialustalta, yhtä näytettä lukuun ottamatta. Trititrachiumia esiintyi kaikkien osallistujien näytteissä M2 alustalla, mutta viiden näytteen DG18 alustalta sitä ei ollut ilmoitettujen tulosten perusteella. Lisäksi yksi osallistuja (12) ilmoitti steriileistä pesäkkeistä M2 alustalla, mutta epäili niiden kuitenkin olevan itiöimättömiä Trititrachium -pesäkkeitä. 8 Proftest SYKE THL 17/16

Taulukko 1A. Osallistujien tunnistamat mikrobiryhmät materiaalinäytteestä M2- ja DG18- alustoilta. Table 1A. Microbial groups identified in the building material sample on M2- and DG18- media. Osallistuja nro nr M2-alusta M2-medium DG18-alusta DG18-medium 1 Pen Cla Tri Pen Cla Tri 2 Pen Cla Tri Pen Cla Tri 3 Pen Cla Tri Pen Cla Tri 4 Pen Cla Tri Pen Cla - 5 Pen Cla Tri Pen Cla Tri 6 Pen Cla Tri Pen Cla - 7 Pen - Tri Pen - - 8 Pen Cla Tri Pen Cla Tri 9 Pen Cla Tri Pen Cla Tri 10 Pen Cla Tri Pen Cla - 11 Pen Cla Tri Pen Cla Tri 12 Pen Cla Tri ste Pen Cla Tri 13 Pen Cla Tri Pen Cla Tri 14 Pen Cla Tri Pen Cla Tri 15 Pen Cla Tri Pen Cla - 16 Pen Cla Tri Pen Cla Tri 17 Pen Cla Tri Pen Cla Tri 19 Pen Cla Tri Pen Cla Tri Penicillium (Pen), Cladosporium (Cla), Trititrachium (Tri), steriili, eli itiöimätön pesäke (ste). Suspensionäytteistä löytyi osallistujien ilmoituksen mukaan kaikista näytteistä Penicilliumia M2- ja DG18 -alustoilta. Osallistujan nro 4:n suspensionäytteessä ei kasvanut Cladosporiumia kummallakaan sienialustalla. Stachybotrys -tunnistuksen teki suspensionäytteestä M2 alustoilta kaikki osallistujat ja DG18 -alustalta kolmetoista osallistujaa. Lisäksi kolme osallistujaa ilmoitti näytteessä olleen steriilejä pesäkkeitä, kaksi ilmoitti löytäneensä Trititrachium -hometta ja yksi Geomyces -hometta sekä samoin yksi tunnistamattomia pesäkkeitä. Proftest SYKE THL 17/16 9

Taulukko 1B. Osallistujien tunnistamat mikrobiryhmät suspensionäytteestä M2- ja DG18 - alustoilta. Table 1B. Microbial groups identified in the suspension sample on M2- and DG18-media. Osallistuja nro nr M2-alusta M2-medium DG18-alusta DG18-medium 1 Pen Cla Sta Pen Cla - ste 2 Pen Cla Sta Pen Cla Sta 3 Pen Cla Sta Pen Cla Sta 4 Pen - Sta Pen - Sta tun 5 Pen Cla Sta Pen Cla Sta 6 Pen Cla Sta Pen Cla - Tri 7 Pen - Sta Pen Cla - Geo 8 Pen Cla Sta Pen Cla Sta 9 Pen Cla Sta Pen Cla Sta 10 Pen Cla Sta Pen Cla Sta 11 Pen Cla Sta Pen Cla Sta 12 Pen Cla Sta Pen Cla Sta 13 Pen Cla Sta Pen Cla - ste 14 Pen Cla Sta Pen Cla Sta 15 Pen Cla Sta Pen Cla Sta 16 Pen Cla Sta Pen Cla Sta 17 Pen Cla Sta Pen Cla Sta 19 Pen Cla Sta Tri Pen Cla - ste Penicillium (Pen), Cladosporium (Cla), Stachybotrys (Sta), Trititrachium (Tri), Geomyces (Geo), steriili, eli itiöimätön pesäke (ste), tunnistamaton (tun). 3.4 Mikrobiryhmien kvantitatiivinen määritys ja pätevyyden arviointi Tulosraportoinnissa käytetyt termit on esitetty liitteessä 1, laboratoriokohtaiset tulokset liitteessä 3, laboratorioiden ilmoittamat tulokset graafisesti testisuureittain liitteessä 4 ja yhteenveto pätevyyskokeen kvantitatiivisten tulosten z-arvoista liitteessä 5. z-arvot on esitetty suuruusjärjestyksessä liitteessä 8. Osallistujien suoriutuminen arvioitiin z-arvojen perusteella (kts 5.6 Vertailuarvot ja kokonaishajonnan tavoitearvot) yhteensä 16 testisuuren mukaan (taulukko 2). z-arvojen laskennassa on käytetty vertailuarvona osallistujien tulosten robusteja keskiarvoja (liite 2). Arvioiduista tuloksista 84-100 % oli hyväksyttäviä ( z-arvo 2) testisuureesta riippuen (liite 3, 4, 5). 10 Proftest SYKE THL 17/16

Taulukko 2. Yhteenveto pätevyyskokeen THL 17/2016 tuloksista. Table 2. Summary of the results in the proficiency test THL 17/2016. Measurand Sample Unit Assigned value Mean Rob. mean Median SD rob SD rob % 2 x spt % n (all) Acc z % DG18 Cla M pmy/g 4.3 4,35 4,31 4,47 0,53 12,4 20 18 89 S pmy/ml 1,94 1,99 1,94 1,97 0,29 14,8 25 19 89 DG18 Pen M pmy/g 4,3 4,20 4,25 4,20 0,66 15,5 25 19 89 S pmy/ml 1,99 2,03 1,99 2,02 0,21 10,3 25 19 89 DG18 Stac S pmy/ml 3,01 3,00 3,01 3,03 0,21 7,1 15 13 92 DG18 tot M pmy/g 4,9 4,92 4,93 5,09 0,63 12,8 20 19 95 S pmy/ml 3,10 3,08 3,10 3,08 0,19 6,0 15 19 100 DG18 Trit M pmy/g 4,8 4,76 4,76 4,93 0,70 14,7 20 14 86 M2 Cla M pmy/g 4,3 4,29 4,33 4,29 0,43 10,1 20 18 89 S pmy/ml 1,78 1,79 1,78 1,77 0,20 11,0 20 17 94 M2 Pen M pmy/g 4,1 3,98 4,06 4,12 0,86 21,2 35 19 89 S pmy/ml 2,06 2,01 2,06 1,96 0,23 11,2 20 19 84 M2 Stac S pmy/ml 3,00 2,99 3,00 2,97 0,24 8,1 15 19 95 M2 tot M pmy/g 5,0 5,09 5,10 5,19 0,47 9,2 15 19 95 S pmy/ml 3,08 3,08 3,08 3,04 0,23 7,3 15 19 100 M2 Trit M pmy/g 4,9 4,86 4,86 5,00 0,51 10,5 18 19 95 Rob. mean: Robusti keskiarvo, The robust mean, SD rob: Robusti keskihajonta, The robust standard deviation, SD rob %: Robusti keskihajonta prosentteina, The robust standard deviation as percent, 2 s pt %: Arvioinnissa käytetty tavoitehajonta, 95%:n luottamusvälillä, The standard deviation for proficiency assessment at the 95 % confidence interval, Acc z %: Niiden tulosten osuus (%), joissa z 2, The results (%), where z 2, n(all): Osallistujien kokonaismäärä, The total number of the participants. Kokonaispitoisuudet M2 ja DG-18 -alustoilla erosivat edellisestä kierroksesta niin, että materiaalinäytteen kokonaispitoisuus oli tällä kierroksella noin kymmenen kertaa pienempi ja suspensionäytteen kokonaispitoisuus noin kymmenen kertaa suurempi kuin edellisellä kierroksella [5]. Arvioinnissa käytettyjä tavoitehajontoja (2 x s pt % 95 % luottamusvälillä) muutettiin edelliseen kierrokseen verrattuna [5]. Alustavien tulosten lähettämisen jälkeen ei ole tehty muutoksia pätevyyden arvioinnissa. 3.4.1 Sienten kokonaispitoisuus Osallistujien ilmoittamat tulokset arvioitiin z- arvon avulla. Suspensionäytteen osalta hyväksyttäviä tuloksia oli 100 % sekä M2- että DG-18 -alustalta. Materiaalinäytteen osalta hyväksyttäviä tuloksia oli 95 % M2- ja DG-18 -alustalta (taulukko 2). Asetetut tavoitehajonnat sienten kokonaispitoisuuksille olivat pienemmät kuin edellisellä kierroksella; 15 % suspensionäytteessä ja 15 % tai 20 % materiaalinäytteessä (taulukko 2). 3.4.2 Cladosporium Osallistujien ilmoittamat tulokset arvioitiin z- arvon avulla. Materiaalinäytteessä hyväksyttäviä tuloksia oli 89 % sekä M2- että DG-18 -alustalta, kun tavoite-hajonta Cladosporium -sienelle oli 20 % (taulukko 2). Suspensionäytteessä hyväksyttäviä tuloksia oli 94 % M2- ja 89 % DG18 -alustalta, kun tavoitehajonnat olivat vastaavasti 20 % ja 25 % (taulukko2). Proftest SYKE THL 17/16 11

3.4.3 Penicillium Osallistujien ilmoittamat tulokset arvioitiin z- arvon avulla. Hyväksyttäviä tuloksia oli 89 % M2- ja DG18-alustoilla (taulukko 2), kun tavoitehajonnat olivat 25 % DG18 -alustalla ja 20 % tai 35 % M2 -alustalla kun tavoitehajonnat olivat 35 % M2 ja 25 % DG18 -alustalla (taulukko 2). Penicillium sp. pitoisuudet materiaalinäytteessä arvioitiin alustavina homogeenisuustulosten suuren hajonnan takia. Suspensionäytteessä hyväksyttyjä tuloksia oli 84 % M2- ja 89 % DG18 -alustoilla, kun tavoitehajonnat olivat vastaavasti 20 % ja 25 % (taulukko2). 3.4.4 Trititrachium Trititrachiumia oli vain materiaalinäytteessä. Osallistujien ilmoittamat tulokset arvioitiin z- arvon avulla. Materiaalinäytteen Trititrachium sp. -pitoisuuksien tulokset olivat M2-alustalla 95 % hyväksyttyjä ja DG-18 -alustalla 86 % hyväksyttyjä, kun tavoitehajonnat olivat 18 % M2- alustalla ja 20 % DG18- alustalla (taulukko 2). 3.4.5 Stachybotrys Stachybotrysta oli vain suspensionäytteessä. Osallistujien ilmoittamat tulokset arvioitiin z- arvon avulla. Suspensionäytteen Stachybotrys sp. tuloksista hyväksyttäviä tuloksia oli 95 % M2 -alustalla ja 92 % DG18- alustalla (taulukko 2), kun tavoitehajonnat olivat 15 % (taulukko 2). 3.5 Rinnakkaismääritysten toistettavuus Pätevyyskokeeseen osallistuneilta laboratorioilta arvioitiin kahden rinnakkaisten laimennossarjan tulokset jokaisesta ilmoittamastaan testisuureesta. Taulukko 3. Yhteenveto rinnakkaismääritysten tuloksista (ANOVA käsittely). Table 3. Summary of parallel measurements (ANOVA statistics). Measurand Sample Unit Assigned value Mean sw sb st sw% sb% st% sb/sw DG18 Cla M pmy/g 4.3 4,35 0,733 0,456 0,863 17 11 20 0,62 S pmy/ml 1,94 1,99 0,283 0,324 0,430 15 17 22 1,1 DG18 Pen M pmy/g 4,3 4,20 0,143 0,690 0,705 3,4 16 17 4,8 S pmy/ml 1,99 2,03 0,467 0 0,467 24 0 24 0 DG18 Stac S pmy/ml 3,01 3,00 0,0700 0,218 0,229 2,3 7,3 7,6 3,1 DG18 tot M pmy/g 4,9 4,92 0,0864 0,567 0,574 1,8 12 12 6,6 S pmy/ml 3,10 3,08 0,101 0,172 0,199 3,3 5,6 6,5 1,7 DG18 Trit M pmy/g 4,8 4,76 0,178 0,603 0,628 3,7 13 13 3,4 M2 Cla M pmy/g 4,3 4,29 0,213 0,435 0,484 5,0 10 11 2,0 S pmy/ml 1,78 1,79 0,166 0,144 0,219 9,3 8,0 12 0,87 M2 Pen M pmy/g 4,1 3,98 0,667 0,795 1,04 17 20 26 1,2 S pmy/ml 2,06 2,01 0,186 0,217 0,286 9,0 10 14 1,2 M2 Stac S pmy/ml 3,00 2,99 0,139 0,243 0,280 4,6 8,1 9,4 1,8 M2 tot M pmy/g 5,0 5,09 0,0743 0,426 0,433 1,5 8,4 8,5 5,7 S pmy/ml 3,08 3,08 0,140 0,191 0,237 4,6 6,2 7,7 1,4 M2 Trit M pmy/g 4,9 4,86 0,157 0,444 0,471 3,2 9,1 9,7 2,8 Ass.val.: assigned value, vertailuarvo; s w : repeatability standard error, toistettavuus; s b : between participants standard error, laboratorioiden välinen keskihajonta; s t : reproducibility standard error, uusittavuus. 12 Proftest SYKE THL 17/16

Tulosten hajonta laboratorioiden sisällä (s w ) kuvaa määrityksen toistettavuutta ja yhdessä laboratorioiden välisen (s b ) kanssa ne kuvaavat määrityksen uusittavuutta (s t ). Laboratorioiden välinen hajonta (s b ) oli useimmiten suurempi kuin laboratorioiden sisäinen hajonta (s w ) (taulukko 3) mikä on odotettavissa jos laboratorio hallitsee analytiikan hyvin. 3.6 Osallistujien tulkinta näytteestä Kolme pätevyyskokeeseen osallistujaa ei ilmoittanut tulkintaa materiaalinäytteen tuloksista. Loput osallistujista tulkitsivat, että materiaalissa katsottiin esiintyvän mikrobikasvua, tulos viittaa kosteus- tai mikrobivaurioon, tulos viittaa vaurioon tai tulos viittaa vahvasti vaurioon. Osa osallistujista mainitsi Asumisterveysasetuksen soveltamisohjeen toimenpiderajat [4] ja osa lisäksi erikseen näytteessä esiintyvän kosteusvaurioindikaattorin (Trititrachium oryzae). Yksi osallistuja mainitsi että näytteessä esiintyneet Penicillium sp. ja Cladosporium sp. ovat mahdollisesti toksiinien tuottajia. 3.7 Kvalitatiivinen pätevyyskoe homekantojen tunnistaminen Osallistujien ilmoittamat homekantojen tunnistustulokset ovat taulukossa 4. Laboratorion katsottiin onnistuneen tunnistamisessa, jos home oli tunnistettu oikein suku/ryhmätasolle. Hyväksyttävä tulos vertailussa on 2/3 sukutasolle oikein tunnistettua hometta. Tunnistettavat homekannat olivat: A: Geomyces pannorum, B: Aspergillus ochraceus ja C: Absidia repens. 17/18 osallistujaa sai kvalitatiivisesta pätevyyskokeesta hyväksytyn tuloksen. Tunnistus tehtiin sukutasolle oikein näytteen A osalta 78 % (14/18) ja näytteen C osalta 83 % (15/18) laboratorioista. Näyte B tunnistettiin sukutasolle oikein kaikissa laboratorioissa (taulukko 4). 3.7.1 Geomyces pannorum Geomyces pannorum tunnistettiin sukutasolle 14 laboratoriossa, joista yhdessä laboratoriossa tulos ilmoitettiin oikein lajitasolle. Kaksi osallistujaa oli ilmoittanut tuloksesi Oidiodendron sp., yksi Verticillium sp. ja yksi Chrysosporium sp. 3.7.2 Aspergillus ochraceus Kaikki osallistujat tunnistivat Aspergillus ochraceus -homeen sukutasolle oikein. Viisitoista osallistujaa oli tunnistanut homeen laji- tai ryhmätasolle oikein. Aspergillus ochraceus - hometta pidetään ns. kosteusvaurioindikaattorina, joten sen tunnistaminen muista Aspergillus - pesäkkeistä, jotka eivät ole indikaattoreita, on merkityksellistä näytteen tulkinnan kannalta joissain tapauksissa. 3.7.3 Absidia repens Viisitoista osallistujaa tunnisti Absidia -homeen sukutasolle oikein. Yksi osallistuja oli antanut lajitason vastaukseksi Absidia orympifera. Kaksi osallistujaa tunnisti kannan Rhizopus - homeeksi ja yksi osallistuja ei antanut vastausta. Proftest SYKE THL 17/16 13

Taulukko 4. Kvalitatiivisen pätevyyskokeen tulokset. Table 4. The reported results of the qualitative proficiency test. Osallistuja A B C 1 Geomyces sp. Aspergillus ochraceus -ryhmä Absidia sp. 2 Geomyces sp. Aspergillus ochraceus Absidia sp. 3 Geomyces Aspergillus westerdijkiae Absidia 4 Geomyces sp Aspergillus sp 5 Geomyces Aspergillus ochraceus Absidia 6 Oidiodendron Aspergillus ochraceus Absidia 7 Verticillium sp. Aspergillus ochraceus Absidia sp. 8 Geomyces Aspergillus Absidia 9 Geomyces Aspergillus ochraceus Absidia 10 Geomyces sp. Aspergillus ochraceus Absidia sp. 11 Chrysosporium sp. Aspergillus ochraceus Absidia sp. 12 Geomyces Aspergillus ochraceus Absidia 13 Oidiodendron Aspergillus ochraceus Rhizopus 14 Geomyces Aspergillus ochraceus Rhizopus 15 Geomyces pannorum Aspergillus ochraceus Absidia orympifera 16 Geomyces Aspergillus ochraceus Absidia 17 Geomyces Aspergillus ochraceus Absidia 19 Geomyces Aspergillus ochraceus Absidia 4 Huomioitavaa tuloksista Myös tällä kierroksella pyydettiin osallistujilta tietoa, onko menetelmä akkreditoitu vai ei. Kierrokselle osallistuneista laboratorioista 14 on akkreditoinut menetelmän ja neljältä akkreditointi puuttui (osallistujat nro 1, 4, 8 ja 13). Suurin osa osallistujista oli samoja kuin edellisellä kierroksella, joten muutosta akkreditointiin ei ole juuri tapahtunut edellisen pätevyyskokeen jälkeen. Akkreditoitujen laboratorioiden tuloksista 92 % oli hyväksyttyjä ja vastaavasti eiakkreditoitujen laboratorioiden tuloksista 88 % (liite 5). 4.1 Mittausepävarmuus Vertailukierrokselle osallistuneilta laboratorioita pyydettiin määrittämään mittausepävarmuudet kokonaispitoisuuksille. Kaikki paitsi kolme osallistujaa (4, 5, 6) ilmoitti kokonaispesäkelukujen mittausepävarmuudet materiaalinäytteelle ja suspensionäytteelle. Mittausepävarmuudet vaihtelivat 3,5-26 % välissä. Mittausepävarmuuksien laskemisessa voidaan hyödyntää Mittatekniikan keskuksen ohjeita [6]. Mittausepävarmuus on aina arvio, joten sitä ei tulisi ilmoittaa liian suurella tarkkuudella. Kokonaisluvut ovat riittävä tarkkuus. 14 Proftest SYKE THL 17/16

Taulukko 5. Osallistujien ilmoittamat kokonaismittausepävarmuudet (UC%) eri kasvatusalustoilla. Table 5. The measurements uncertainty (UC%) for different culturing media reported by the participants. Kokonaismittausepävarmuus (UC%) Total measurement uncertainty (UC%) Rakennusmateriaalinäyte Building material sample Suspensionäyte Suspension sample Osallistuja M2 DG18 M2 DG18 1 9 10 9 10 2 3,5 3,5 3,5 3,5 3 22 20 22 20 4 - - - - 5 - - - - 6 - - - - 7 15 10 15 10 8 11 18 11 18 9 5 6 5 6 10 3,5 3,5 3,5 3,5 11 12 7 12 7 12 16,01 18,65 16,01 18,65 13 17 17 17 17 14 16 19 16 19 15 13 13 13 13 16 15 16 15 16 17 9 9 9 9 19 20 26 20 26 4.2 Näytteiden esikäsittely, viljely ja maljojen kasvatus Pätevyyskokeen näytteet viljeltiin suurimmassa osassa laboratorioista samana tai seuraavana päivänä siitä, kun ne olivat saapuneet. Näytteet ohjeistettiin viljelemään mahdollisimman pian ja säilyttämään + 4 C:ssa ennen viljelyä. Yhdessä laboratoriossa rakennusmateriaalinäytettä säilytettiin 5 vuorokautta ennen viljelyä (taulukko 6). Materiaalinäytteen pitkäaikaisen säilyttämisen vaikutuksesta tuloksiin ei ole julkaistua tietoa, mutta voidaan olettaa, että säilytys voi vaikuttaa mikrobien pitoisuuksiin. Pätevyyskokeen säilyvyystestauksen mukaan viikon säilytys vaikutti kaikkien näytteeseen ympättyjen mikrobien pitoisuuksiin (kts kappale 5.5, taulukko 9). Asumisterveysasetuksen soveltamisohjeessa suositellaan viljelemään näytteet mahdollisimman pian, esimerkiksi näytteenottoa seuraavana päivänä. Materiaalinäyte oli suunniteltu siten, että siitä saatiin ohjeen mukaan tehtynä punnittua n. 2 g painoinen näyte analyysiin. Kaikki laboratoriot olivat toimineet näin. Punnitustuloksen ilmoitettu tarkkuus vaihteli kokonaisluvuista neljän desimaaliin tarkkuuteen. Suurin osa laboratorioista oli tehnyt ensimmäisen laimennoksen 10-1 tai 10-2, mutta myös muita laimennoksia oli käytetty. Kolme laboratoriota ei käyttänyt 30 minuutin ultraäänikäsittelyä materiaalinäytteille Proftest SYKE THL 17/16 15

(taulukko 6) ja yksi laboratorio ei ilmoittanut käyttääkö vai ei. Ravistelun pituus oli kaikilla laboratorioilla 60 min, lukuun ottamatta yhtä laboratoriota, jossa käytettiin 30 minuutin ravistelua. Ravistelussa käytetyt kierrokset vaihtelivat 150-1700 rpm ja 50 400 g välillä. THL:n Ympäristömikrobiologian yksikön tutkimuksissa on havaittu, että ultraäänikäsittely sekä ravisteluaika vaikuttavat mikrobien irtoamiseen materiaalista [7]. Kaikki laboratoriot ilmoittivat tulokset M2- sekä DG18 -elatusalustalta. Bakteeritulokset ilmoitettiin THG -elatusalustalta, mutta niitä ei voitu arvioida näytteiden epäonnistuttua. Laboratorioiden käyttämät kasvatuslämpötilat ja -ajat erosivat hyvin vähän. Asumisterveysasetuksen soveltamisohje [4] ilmoittaa menetelmän kasvatuslämpötilaksi 25 ± 3 C, jota kaikki laboratoriot ilmoittivat käyttävänsä. Kasvatusajat olivat kaikilla 7 ± 1 vrk, lukuun ottamatta yhtä laboratoriota, joka ilmoitti lukeneensa maljat vasta 14 vrk kasvatuksen jälkeen (taulukko 6). Taulukko 6. Rakennusmateriaali- ja suspensionäytteiden käsittely laboratorioissa. Asumisterveysoppaasta [1] poikkeavat tiedot on ilmoitettu. Table 6. Handling of the building material- and suspension samples in the laboratories. Information that differs from the national guidelines is reported. Osallistuja nro nr Näytettä säilytetty ennen viljelyä (vrk) Storage before analysis Ensimmäinen laimennos (jos ei 10-1 ) First dilution ( if not 10-1 ) Ultraääni-käsittely Ultrasonic treatment Ravisteluaika Shaking time 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 Materiaalinäyte / Material sample 1 1 5 1 1 1 1 1 20-1 10-2 EI 10-2 muu ETe ETe ETe EI 30 min Ravistelun nopeus Shaking speed (g) 50 rpm n. 600 250 rpm ET 400 EI EI 225 1700 rpm 150 350 rpm 260 rpm 500 rpm 300 EI 350 225 rpm 600 rpm Kasvatusaika (vrk) Incubation time (days) 14 Suspensionäyte / Suspension sample Näytettä säilytetty ennen viljelyä (vrk) Storage before 1 1 1 1 1 1 1 analysis Kasvatusaika (vrk) Incubation time 14 (days) EI; ei ilmoitettu, not reported, ETi; ei tietoa, no information, ETe; ei tehty, not done. 16 Proftest SYKE THL 17/16

4.3 Tulosten ilmoittaminen Kaksi osallistujaa (8, 11) ilmoitti toisen rinnakkaisen laimennossarjan tuloksia nollatuloksina. Mikrobiologian periaate on, että jos maljoilla ei kasva mitään, tuloksia ei ilmoiteta nollatuloksina, vaan ilmoitetaan raportoidaan tulokset alle määritysrajan tuloksina (esim. alle 45 pmy/g). 5 Palaute pätevyyskokeesta Alustavien tulosten lähettämisen jälkeen vastaanotettiin kaksi palautetta. Lisäksi pätevyyskokeen toteutuksesta vastaanotettiin yksi palaute ja kolme laboratorioita pyysi kvalitatiivisen vertailukierroksen näytteitä lähetettävän uudelleen. OSALLISTUJILTA SAATU PALAUTE Feedback from the participants Osallistuja Kommentti Comment 2 Osallistujia epäili systemaattista virhettä omissa ja/tai järjestäjän kaikissa suspensionäytteen tuloksissa. 7, 11 Vertailukoetta olisi hyvä monipuolistaa (esim. mikrobilajisto, rakennusmateriaalin matriisi, analyysimenetelmien kirjo). 19 Materiaalinäytteen kokonaissienitulos M2 alustalla oli kirjattu väärin. 4 Kvalitatiivisen kierroksen tunnistusmaljat olivat menneet rikki kuljetuksen aikana. 5 Kvalitatiivisen kierroksen maljat eivät saapuneet laboratorioon. 14 Kvalitatiivisen kierroksen malja B oli kontaminoitunut. Järjestäjän vastine Reply by the organizer Tarkastettuaan tulokset, järjestäjä ilmoitti, ettei virhettä ole. Myöhemmin osallistuja ilmoitti löytäneensä virheen omista laskuistaan. Tämä osoittaa hyvin pätevyyskokeen roolia laadunvarmistuksessa. Järjestäjä tekee vuosittain testauksia pätevyyskokeen kehittämiseksi. Suurin este laajemman kehitystyön tekemiseksi on tällä hetkellä rahoitus. Sähköinen tilasto-ohjelma oli tulkinnut välilyönnin tuhatlukujen välissä pilkuksi. Virhe korjattiin tähän loppuraporttiin. Tämä muutti M2-alustan arviointia kyseisen testisuureen kohdalla. Osallistujalle lähetettiin uudet maljat. Osallistujalle lähetettiin uudet maljat Osallistujalle lähetettiin uusi B malja. JÄRJESTÄJÄN PALAUTE OSALLISTUJILLE Feedback to the participants Osallistuja Kommentti Comments 8, 11 Tuloksia ei tulisi ilmoittaa nollatuloksina vaan tulos ilmoitetaan alle määritysrajan. Vastaanotamme jatkossakin mielellään palautetta ja palautteiden esiintuomat asiat pyritään ottamaan huomioon seuraavia pätevyyskokeita järjestettäessä, jos se on mahdollista. Proftest SYKE THL 17/16 17

6 Toteutus 6.1 Näytteiden valmistus, niiden toimitus ja säilytys 6.1.1 Kvantitatiivinen pätevyyskoe: Rakennusmateriaalinäyte Kvantitatiivisen pätevyyskokeen materiaalinäyte valmistettiin kuten edellisellä kierroksella [5]. Pätevyyskokeeseen valitut homesienet Penicillium brevicompactum, Cladosporium sphaerospermum ja Trititrachium oryzae kasvatettiin ja käsiteltiin kuten edellisellä kierroksella [5]. Rakennusmateriaalinäytteistä eristetyt bakteerit kasvatettiin THG -alustalla (7 vrk +37 C) ennen bakteerisuspension valmistamista. Materiaalinäytteet valmistettiin 7.10.2016 kuten edellisellä kierroksella. Näytteitä valmistettiin 40 kpl. Näytteitä inkuboitiin 18 vuorokautta +25 C:ssa 90 % kosteudessa olosuhdekaapissa. Kasvatuksen päätyttyä kaikki 40 materiaalinäytettä pussitettiin pieniin Minigrip -pusseihin, näistä arvottiin 18 näytettä, jotka pakattiin ja lähetettiin osallistuneille laboratorioille 25.10.2016. Jokaisen näytteen mukana oli saatekirje, jossa ohjeistettiin rakennusmateriaalinäytteen esikäsittely, analysointi ja tulosten ilmoittaminen. Osallistujien ilmoittamille yhteyshenkilöille lähetettiin sähköpostilla tuloslomake sekä linkit verkossa täytettäviin lomakkeisiin, joista osallistujat saivat valita mieleisimmän tulosten ilmoittamistavan. Kvantitatiivisen pätevyyskokeen tulokset ohjeistettiin ilmoittamaan kahden merkitsevän numeron tarkkuudella, tulosten lisäksi pyydettiin ilmoittamaan mittausepävarmuus kokonaispitoisuusmäärityksille. 6.1.2 Kvantitatiivinen pätevyyskoe: Suspensionäyte Kvantitatiivisen pätevyyskokeen suspensionäytettä varten valmistettiin suunnitelman mukaiset laimennosliuossuspensiot Penicillium brevicompactum, Cladosporium sphaerospermum ja Stachybotrys chartarum sekä aktinomykeetti puhdasviljelmistä. Suspensionäytteet valmistettiin 25.10.2016 kuten edellisellä kierroksella [5]. Suspensionäytteitä valmistettiin 40 kpl, joista 18 näytettä arvottiin lähetettäväksi osallistuneille laboratorioille. Jokaisen näytteen mukana oli saatekirje, jossa ohjeistettiin suspensionäytteen käsittely, analysointi ja tulosten ilmoittaminen. Kvantitatiivisen pätevyyskokeen tulokset ohjeistettiin ilmoittamaan kahden merkitsevän numeron tarkkuudella. Tulokset oli mahdollista ilmoittaa joko sähköpostilla palautettavalla lomakkeella tai verkkolomakkeella. 6.1.3 Kvalitatiivinen pätevyyskoe: Tunnistettavat homesienikannat Kvalitatiivisen vertailukierroksen näytteinä oli kolme puhtaaksi viljeltyä homekantaa: A: Geomyces pannorum, B: Aspergillus ochraceus ja C: Absidia repens. Kannat viljeltiin M2- alustoille edellisellä viikolla ennen näytteiden lähetystä. Jokainen malja tarkastettiin ja pakattiin huolellisesti ennen niiden lähettämistä. Näytteisiin ympätyt sienikannat olivat lajitasolle tunnistettuja ja sekvensoimalla tarkastettuja. 18 Proftest SYKE THL 17/16

Tunnistettavat homesienikannat lähetettiin kaikille 16 osallistujalle 12.10.2016 ja kahdelle jälki-ilmoittautuneelle 24.10.2016. Jokaisessa lähetyksessä oli mukana saatekirje, jossa annettiin tarkemmat toimintaohjeet homeiden tunnistamiseksi ja tulosten ilmoittamiseksi. Kvalitatiivisen pätevyyskokeen vastauksena pyydettiin lähettämään kunkin tunnistettavan homesienen tunnistustulos sekä tieto siitä mihin tunnistaminen on perustunut. Tulokset oli mahdollista palauttaa sähköpostilla tai verkkolomakkeella. 6.2 Näytteiden homogeenisuuden määrittäminen ja säilyvyystestaus THL:n Ympäristömikrobiologian yksikössä analysoitiin kahdeksan rinnakkaista suspensionäytettä ja rakennusmateriaalinäytettä näytteiden homogeenisyyden määrittämiseksi. Näytteet valmistettiin ja ne käsiteltiin kuten osallistuville laboratorioille menevät näytteet. Näytteiden esikäsittely, viljely ja kasvatus tehtiin saatekirjeiden ohjeiden ja Asumisterveysasetuksen soveltamisohjeen mukaisesti [4]. 6.3 Kvantitatiivisten tulosten käsittely Tulokset käsiteltiin log-muodossa aineiston normaalijakauman varmistamiseksi. Aineiston normaalisuus testattiin Kolmogorov-Smirnov-testillä. Tulosaineistosta poistettiin mediaanista merkitsevästi poikkeavat tulokset Grubbs- tai Hampel-testillä ennen keskiarvon laskemista. Myös robustissa laskennassa hylättiin tulokset, jotka poikkesivat yli 50 % tai 5 kertaa alkuperäisen tulosaineiston robustista keskiarvosta. Harha-arvotestejä ja tulosten tilastollista käsittelyä kuvataan tarkemmin Proftest asiakasohjeessa [9]. 6.4 Näytteiden homogeenisuuden laskeminen Näytteiden homogeenisuus testattiin kahdeksan THL:n analysoiman materiaalinäytteen ja suspensionäytteen rinnakkaisten laimennussarjojen tuloksista. Tilanteissa, jossa osa tuloksista oli alle määritysrajan, käytettiin keskiarvojen laskennassa arvoa, joka oli puolet määritysrajoista. Rakennusmateriaalinäytteen määritysraja oli 45 pmy/g ja suspensionäytteen määritysraja oli 4,5 pmy/ml. Näytteiden välinen homogeenisuus testattiin käyttäen log -muunnettuja arvoja. Suspensionäytteiden homogeenisuus oli hyvä. Ero rinnakkaisten välillä oli pääsääntöisesti enintään 0,5 log-yksikköä ja CV % oli alle 10 % (taulukko 8). Poikkeus tähän oli Cladosporium sp. M2-alustalla, jonka eri rinnakkaisten väillä oli log 1,1 log-yksikköä ja CV% 15 %. Pätevyysarvioinnissa tämä huomioitiin käyttämällä 20 % tavoitehajontaa (2 s pt ) (taulukko 8). Rakennusmateriaalinäytteiden homogeenisuus oli parempi kuin edellisellä kierroksella. Vaikka erotus suurimman ja pienimmän tuloksen välillä usein oli yli 10-kertainen (eli >log 1), niin CV % olivat korkeimmillaan 10 %. Tästä poikkesi kuitenkin Penicillium sp. -tulokset, joiden CV % oli noin 25 % (taulukko 8). Tämän takia Penicillim sp. -tulokset arvioitiin materiaalinäytteessä suuntaa antavina. Proftest SYKE THL 17/16 19

6.5 Näytteiden säilyvyystestaus Säilyvyystestaus tehtiin neljälle materiaali- ja suspensionäytteelle, joita säilytettiin viikon ajan kylmähuoneessa (+5 ± 2 C) ja neljälle materiaali- ja suspensionäytteelle, jota säilytettiin viikon ajan huoneen lämmössä (noin 20 C). Tulokset tutkituista testisuureet osoittavat, että viikon säilytyksellä oli vaikutusta kaikkiin tutkittaviin mikrobeihin (taulukko 9). Molempien näytetyyppien pitoisuudet pääsääntöisesti pienenivät; huoneenlämmössä enemmän kuin kylmässä. Säilytyskokeen tulosten testauksessa käytettiin ISO-standardin kriteereitä [3]. Erot pitoisuuksissa olivat suurimmaksi osaksi isompia kuin 0,3 x s pt. Tämä tarkoittaa, että pätevyyden arvioinnissa käytetty tavoitehajonta on asetettu niin tiukaksi, että viikon verran säilytetty näyte todennäköisesti ei ole hyväksyttävyyden rajoissa. Taulukko 8. THL:n Ympäristömikrobiologian yksikön viljelemien näytteiden log-arvojen keskiarvot, standardihajonta (SD), CV % sekä tuloksien maksimi ja minimiarvot. Jokaisesta näytteestä on tehty kaksi rinnakkaismääritystä. Table 8. Means, standard deviations (SD), CV% and maximum and minimum values from samples analysed by the expert laboratory. From each sample two parallel analyses were done. Näyte Sample Rakennusmateriaali Building material Suspensio Suspension Keskiarvo Mean (n=8) Alusta Medium Testisuure Measurand DG18 Sienet kokonaispitoisuus Total fungal concentration 5,26 0,45 9 % 5,86 4,43 1,43 Penicillium sp. 4,01 1,01 25 % 5,18 2,43 2,75 Cladosporium sp. 4,65 0,47 10 % 5,32 3,86 1,46 Trititrachium sp. 5,04 0,49 10 % 5,67 3,86 1,81 M2 DG18 M2 Sienet kokonaispitoisuus Total fungal concentration 5,3 0,43 8 % 5,95 4,43 1,52 Penicillium sp. 4,08 0,99 24 % 5,15 2,26 2,89 Cladosporium sp. 4,54 0,4 9 % 5,15 4,04 1,11 Trititrachium sp. 5,13 0,47 9 % 5,87 4,16 1,71 Sienet kokonaispitoisuus Total fungal concentration 2,91 0,11 4 % 3,04 2,66 0,38 Penicillium 2,08 0,15 7 % 2,23 1,8 0,43 Cladosporium sp. 1,89 0,15 8 % 2,15 1,56 0,59 Stachybotrys 2,78 0,14 5 % 2,94 2,49 0,45 Sienet kokonaispitoisuus Total fungal concentration 2,94 0,14 5 % 3,08 2,62 0,46 Penicillium 2,03 0,13 6 % 2,23 1,8 0,43 Cladosporium sp. 1,76 0,26 15 % 2,08 0,95 1,13 Stachybotrys 2,85 0,18 6 % 3,04 2,48 0,56 SD CV% Isoin arvo Biggest value Pienin arvo Smallest value Erotus Difference 20 Proftest SYKE THL 17/16

Taulukko 9. Säilytystestauksen tulokset. Osa näytteitä viljeltiin heti ja osa näytteistä viljeltiin viikon säilytyksen jälkeen + 4 C:ssa tai +20 C:ssa. Table 9. Results of the stability testing. Part of the samples were analysed immediately and part were kept in + 4 C or +20 C for a week. Näyte Alusta Sample Medium Rakennusmateriaali DG18 Building material Suspensio Suspension M2 DG18 Heti viljelty Cultured directly Säilytetty viikon +5 C Stored one week in +5 C Log (pmy/ml tai pmy/g) Log (cfu/ml or cfu/g) Säilytetty viikon +20 C Stored one week in +20 C Ero (heti viljelty - säilytetty +5 C ) Difference (Directly-stored +5 C) Ero (heti viljelty - säilytetty +20 C) Difference (Directly-stored +20 C) 0,3 x spt Onko ero (heti-säilytetty) Is difference ( directly-stored) < 0,3 x spt? Testisuure Measurand Sienet kokonaispitoisuus Total fungal concentration 5,44 5,18 4,74 0,26 0,70 0,16 Ei / No Penicillium sp. 4,62 4,05 3,12 0,57 1,50 0,17 Ei / No Cladosporium sp. 4,86 4,33 3,67 0,53 1,19 0,15 Ei / No Trititrachium sp. 5,22 4,67 4,56 0,55 0,66 0,16 Ei / No Sienet kokonaispitoisuus Total fungal concentration 5,47 5,25 5,06 0,22 0,41 0,12 Ei / No Penicillium sp. 4,64 4,08 3,36 0,56 1,28 0,24 Ei / No Cladosporium sp. 4,7 4,49 3,97 0,21 0,73 0,14 Ei / No Trititrachium sp. 5,31 4,84 4,95 0,47 0,36 0,14 Ei / No Sienet kokonaispitoisuus Total fungal concentration 2,92 2,86 2,29 0,06 0,63 0,07 Kyllä Yes / Ei No Penicillium sp. 2,1 1,97 1,68 0,13 0,42 0,08 Ei / No Cladosporium sp. 1,92 1,86 1,81 0,06 0,11 0,07 Kyllä Yes / Ei No Stachybotrys sp. 2,8 2,74 1,81 0,06 0,99 0,06 Kyllä Yes / Ei No M2 Sienet kokonaispitoisuus 2,96 2,95 2,31 0,01 0,65 0,07 Kyllä Yes / Ei No Penicillium sp. 2,05 1,98 1,78 0,07 0,27 0,06 Ei / No Cladosporium sp. 1,82 1,97 1,79-0,15 0,03 0,05 Kyllä Yes / Ei No Stachybotrys sp. 2,88 2,51 1,84 0,37 1,04 0,06 Ei / No 6.6 Vertailuarvot ja kokonaishajonnan tavoitearvot Vertailuarvoina käytettiin osallistujatulosten robustia keskiarvoa (liite 2). Kokonaishajonnan tavoitearvojen (s pt ) asettamisessa hyödynnettiin homogeenisuustestin tuloksia ja osallistujien tuloksien robustia keskihajontaprosenttia (SD rob ). Vertailuarvojen laajennetut mittausepävarmuudet (U%) laskettiin THL:n rinnakkaistulosten hajonnoista. Vertailuarvon luotettavuuskriteeri täyttyi useimmissa tapauksissa (liite 2). Lasketun z-arvon avulla osallistujien tulokset normalisoidaan vertailuarvoon ja sallittuun hajontaan [3]. Pätevyyden arvioinnissa käytettävän sallitun tavoitehajonnan (2 s pt, 95 % luottamusvälillä) asettamisessa huomioitiin homogeenisuusarvioinnin tuloksia sekä aiemmissa vastaavissa pätevyyskokeissa käytettyjä tavoitehajontoja. Penicillium sp. pitoisuudet materiaalinäytteessä arvioitiin suuntaa antavina homogeenisuustulosten suuren hajonnan takia. Vertailuarvon luotettavuutta arvioitiin kriteerillä u pt / s pt 0,3; kriteerissä u pt on vertailuarvon standardiepävarmuus ja s pt on tavoitehajonta [3]. Tämä kriteeri täyttyi kaikkien suspensionäytteiden osalta ja usein myös rakennusmateriaalinäytteen osalta, joten vertailuarvoja voitiin pitää Proftest SYKE THL 17/16 21

luotettavina. Asetetun kokonaishajonnan luotettavuutta ja samalla z-arvon luotettavuutta arvioitiin vertaamalla tulosaineiston robustin keskihajonnan (s rob ) ja asetetun tavoitehajonnan (2 s pt ) suhdetta, jonka pitäisi olla pienempi kuin 1,2 [3]. Tämä yhtenevyyskriteeri täyttyi pääsääntöisesti määrityksien osalta. Vertailuarvon luotettavuus 1 ja/tai yhtenevyyskriteeri 2 eivät täyttyneet seuraavien testisuureiden osalta, mikä heikentää näiden tulosten arvioinnin luotettavuutta: Näyte M Määritys DG18 Cla 1, DG18 Pen 1, DG18 Tot 1,2, DG18 Trit 1,2, M2 Pen 1, M2 Tot 1,2 6.7 Pätevyyden arvioinnin suoritus Osallistujien pätevyyttä arvioitiin z-arvojen perusteella (liite 1). Lasketun z-arvon avulla osallistujien tulokset normalisoidaan vertailuarvoon ja sallittuun hajontaan [2]. Pätevyyden arvioinnissa käytettävän sallitun tavoitehajonnan asettamisessa huomioitiin homogeenisuusarvioinnin tuloksia sekä aiemmissa vastaavissa pätevyyskokeissa käytettyjä tavoitehajontoja. Arvioinnin kriteereitä ei ole muutettu alustavien tulosten lähettämisen jälkeen. Tuloksia arvioitiin z-arvojen perusteella käyttäen seuraavia kriteereitä: Kriteeri z 2 Suoritus tulos hyväksyttävä 2 < z < 3 tulos kyseenalainen z 3 tulos ei-hyväksyttävä Kvantitatiivisen pätevyyskokeen tulosaineistossa hyväksyttäviä tuloksia oli kaikkiaan 91 % kun tulosten sallittiin poiketa vertailuarvosta 15 35 % (taulukko 2). Edellisellä vastaavalla kierroksella hyväksyttäviä tuloksia oli 96 % [5]. 22 Proftest SYKE THL 17/16

7 Yhteenveto Pätevyyskokeeseen osallistui 18 laboratoriota. Pätevyyden arvioinneissa käytettiin vertailuarvoina osallistujatulosten robustia keskiarvoa. Kvantitatiivisista tuloksista 91 % oli hyväksyttäviä (z-arvo ±2) kun tulosten sallittiin poiketa 15-35 % vertailuarvosta. Kaikki laboratoriot toimivat Asumisterveysasetuksen soveltamisohjeen [4] ja annettujen ohjeiden mukaisesti. Kaikissa osallistuvien laboratorioiden rakennusmateriaalinäytteissä havaittiin Penicilliumpesäkkeitä molemmilla sienialustoilla. Cladosporiumia löytyi myös kaikista rakennusmateriaalinäytteistä kummaltakin sienialustalta, yhtä näytettä lukuun ottamatta. Trititrachiumia esiintyi kaikkien osallistujien näytteissä M2 alustalla, mutta viiden näytteen DG18 alustalla sitä ei ollut ilmoitettujen tulosten perusteella. Kaikissa THL:n viljelemissä homogeenisuustestausnäytteissä, lukuun ottamatta yhtä, esiintyi Penicillium -pesäkkeitä. Cladosporiumia ja Trititrachiumia havaittiin puolestaan kaikissa näytteissä. Kaikissa osallistuvien laboratorioiden suspensionäytteissä havaittiin Penicilliumia molemmilla sienialustoilla. Yhden osallistujan näytteessä ei kasvanut Cladosporiumia kummallakaan sienialustalla. Stachybotrys -pesäkkeitä havaittiin suspensionäytteestä M2 alustoilta kaikista näytteistä ja DG18 -alustalta kolmestatoista näytteestä. Lisäksi kolme osallistujaa ilmoitti näytteessä olleen steriilejä pesäkkeitä, kaksi ilmoitti löytäneensä Trititrachium -hometta ja yksi Geomyces -hometta sekä samoin yksi tunnistamattomia pesäkkeitä. Kaikki pätevyyskokeeseen osallistuneet laboratoriot, jotka antoivat tulkinnan materiaalinäytteestä, päätyivät samaan tulokseen mikrobikasvusta tai vauriosta materiaalinäytteessä. Kolme laboratoriota ei antanut tulkintaa. Pätevyyskokeen kvalitatiivisessa osassa laboratorioille lähetettiin kolme homepuhdasviljelmää morfologista tunnistamista varten M2 -alustoilla. Kaikkiaan 17 laboratoriota suoritti hyväksyttävästi vertailukierroksen kvalitatiivisen osan, eli tunnisti vähintään 2 kantaa sukutasolle oikein. 8 Summary In this proficiency test took part 18 laboratories. The robust means of the participants results were used as assigned values. In all, 91 % of the quantitative results were acceptable (z-value ±2) when a deviation from the assigned values was between 15-35 %. All participants acted according to national guidelines. In all material samples Penicillium colonies were detected on both culturing media. Cladosporium sp. -colonies were also detected in all material samples on both culturing media, except for one sample. Trititrachium sp. colonies were observed in all samples on M2-media, but it was not reported on five of the DG18-culturing plates. In all material samples analysed by THL Penicillium sp. was found in all samples except one and Cladosporium sp. as well as Trititrachium sp. were found in all samples cultured by THL (n=8). Proftest SYKE THL 17/16 23

In the suspension samples, Penicillium sp. -colonies were detected on both M2- or DG18- culturing media. In one participant s sample, no growth of Cladosporium was detected on either culturing media. Stachybotrys sp. -colonies were detected in the suspension sample on all M2-media and in 13 samples cultivated on DG18-media. In addition three participants reported sterile colonies in the samples, two reported Trititrachium -mould, one Geomyces mould and one unidentified colonies. All participants that made interpretation of the results came to the same conclusions about the microbial growth or damage of the material sample. Three participants did not make an interpretation of the results. In the qualitative part of the proficiency test, participants were sent three fungal pure cultures on M2-media for identification. In all, 17 participants got acceptable result from the qualitative part of the proficiency test, which correspond to at least two correct identifications to the genus level. 24 Proftest SYKE THL 17/16

KIRJALLISUUS 1. SFS-EN ISO 17043, 2010. Conformity assessment General requirements for Proficiency Testing. 2. ISO 13528, 2015. Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons. 3. Thompson, M., Ellison, S. L. R., Wood, R., 2006. The International Harmonized Protocol for the Proficiency Testing of Analytical Chemistry laboratories (IUPAC Technical report). Pure Appl. Chem. 78: 145-196 (http://www.iupac.org/publications/pac/2006/pdf/7801x0145.pdf). 4. Sosiaali- ja terveysministeriön asetus asunnon ja muun oleskelutilan terveydellisistä olosuhteista sekä ulkopuolisten asiantuntijoiden pätevyysvaatimuksista eli ns. Asumisterveysasetus (545/2015) ja sen soveltamisohje (2016, Valvira). 5. Jalkanen, K., Martikainen, H., Hyvärinen, A., Björklöf, K. ja Väisänen, R. (2016). Laboratorioiden välinen pätevyyskoe 13/2015. Rakennusmateriaali- ja suspensionäytteen mikrobiologinen määritys viljelymenetelmällä sekä homekantojen morfologinen tunnistaminen. Suomen ympäristökeskuksen raportteja 21/2016. http://hdl.handle.net/10138/162081 6. Niemelä, S., 2001. Mikrobiologian kvantitatiivisten viljelymääritysten mittausepävarmuus. MIKES julkaisu J1/2001. 7. Jämsén, Henna-Riikka 2008. Materiaalinäytteen esikäsittelyn vaikutus näytteen kokonaismikrobipitoisuuteen. Opinnäytetyö, Savon ammatti- ja aikuisopisto, Laboratorioala. 8. Eviran valvontaosasto, kirje Eviran hyväksymille laboratorioille 23.8.2011 (Dnro 5718/0403/2011) 9. Proftest SYKE 2015. Menettelyohje PK2. www.ymparisto.fi/syke/proftest > Ohjeita pätevyyskokeisiin osallistuville laboratorioille PK2. Proftest SYKE THL 17/16 25

LIITE 1 (1/2) LIITE 1: Tulostaulukoissa esiintyviä käsitteitä Terms in the results table Osallistujakohtaiset tulokset Measurand Testisuure (määritettävä alkuaine tai yhdiste) Unit Yksikkö Sample Näytekoodi z-arvo z = (x i - x pt )/s pt, missä x i = Yksittäisen osallistujan tulos x pt = Vertailuarvo s pt = Arvioinnin tavoitehajonta Assigned value Vertailuarvo 2 s pt % Arvioinnissa käytetty tavoitehajonta 95 %:n luottamusvälillä 's result Osallistujan raportoima tulos (tai rinnakkaistulosten keskiarvo) Md Mediaani Mean Keskiarvo SD Keskihajonta SD% Keskihajonta, % n (stat) Tilastokäsittelyssä mukana olleiden tulosten lukumäärä Yhteenveto z-arvoista S hyväksyttävä ( -2 z 2 ) Q kyseenalainen ( 2 < z < 3 ), positiivinen virhe, tulos poikkeaa vertailuarvosta enemmän kuin 2 s pt q kyseenalainen ( -3 < z < -2 ), negatiivinen virhe, tulos poikkeaa vertailuarvosta enemmän kuin 2 s pt U ei-hyväksyttävä ( z 3 ), positiivinen virhe, tulos poikkeaa vertailuarvosta enemmän kuin 3 s pt u ei-hyväksyttävä ( z -3 ), negatiivinen virhe, tulos poikkeaa vertailuarvosta enemmän kuin 3 s pt Robusti laskenta vertailuarvon määrittämisessä Robustin keskiarvon ja keskihajonnan laskeminen: Suuruusjärjestyksessä olevista tuloksista (x 1, x 2, x i,.., x p ) lasketaan ensimmäinen robusti keskiarvo x * ja sen keskihajonta s * x * = tulosten x i mediaani (i = 1, 2,..., p) s * = 1,483 mediaani erotuksista x i x * (i = 1, 2,..., p) Keskiarvo x * lasketaan uudelleen muokaten tuloksia, joiden poikkeama robustista keskiarvosta on suurempi kuin arvo = 1,5 s *. Jokaiselle tulokselle x i (i = 1, 2,..., p) lasketaan uusi arvo: { x * -, jos x i < x * - x * i = { x * +, jos x i > x * +, ( = 1,5 s * ) { x i muutoin Uusi robusti keskiarvo ja -keskihajonta x * ja s * lasketaan seuraavasti: * * x xi / p s * * i * 2 1,134 ( x x ) /( p 1) Robustia keskiarvoa ja -hajontaa x * ja s * voidaan muuntaa niin kauan, kunnes esim. kolmas merkitsevä numero ei enää muutu [2]. 26 Proftest SYKE THL 17/16