eptidisynteesi uoritetaan yleensä kiinteän n faasin pinnalla; solid phase peptide synthesis () uuret peptidiainemää äärät t valmistetaan liuosfaasissa.. B. Merrifield: ribonukleaasientsyymin synteesi vuonna 1969 (obel 1984) :n eriaate Aminohappo kytketää ään linkkerin avulla kovalenttisesti karboksyylipää äästään liukenemattomaan polymeeriin. ivuketjut suojataan pysyvästi iitettävän aminohapon t. peptidin -terminaaliin kiinnitetään väliaikainen suojaryhmä iitettävän n aminohapon t. peptidin karboksyyliterminaali aktivoidaan Kunkin reaktiovaiheen jälkeen j peptidin sisält ltävä polymeeri suodatetaan ja pestää ään n sopivilla pesuliuottimilla. Valmis peptidi irrotetaan polymeeristä reagensseilla, joka katkaisee peptidin ja polymeerin välisen v kovalenttisen sidoksen. Kiinteän faasin peptidisynteesi olid phase peptide synthesis () 1) olymeeriin liitetään linkkeri () johon ensimmäinen suojattu aminohappo liitetään. 2 2 n n 1) uojaryhmä ()( ) poistetaan terminaalisesta aminoryhmästä. 2) isätään seuraava aminohappo ja muodostetaan peptidisidos. 3) Toistetaan vaiheet 2 ja 3 (n- kertaa) kunnes saadaan haluttu peptidi 4) oistetaan viimeinen - terminaalinen suojaryhmä sekä sivuketjujen suojaryhmät ja peptidi irrotetaan linkkeristä. 1
Aktivointireagensseja Disykloheksyylikarbodi-imidi imidi (D) eptidisidoksen muodostamiseen tarvitaan karboksyyliterminaalin aktivointi. D muodostaa -asyyliurea- rakenteen,, joka aktivoi karbonyylihiilen aminoryhmän nukleofiiliselle hyökkäykselle; peptidisidos muodostuu ja kiinteä disykloheksyyliurea (DU) saostuu. D AA AA 2 DU Muita aktivointireagensseja 3 3 DI di-isopropyylikarbodi-imidi 3 3 3 3 3 ED; EDI; EDA -(3-dimethylaminopropyl)- '-ethylcarbodiimide u -hydroksisukkini-imidi Bt -hydroksibentsotriatsoli DI,'-karbonyylidiimidatsoli 3 3 2 DMA p-nitrofenoli,-dimetyyliaminopyridiini Fosfoniumsuolat: esim. B (Bentsotriatsol-1- yylioksitris(dimetyyliamino)-fosfoniumheksafluorofosfaatti) F - 6 Me 2 Me 2 Me 2 AA F - 6 Me 2 Me 2 Me 2 AA AA 2 2
Aminoryhmän suojaryhmät D-koplauksessa aminoryhmä suojataan polymeroitumisen estämiseksi. leisimmät t suojaryhmät t ovat karbamaatteja AA benzyloxycarbonyl (bz) AA t-butyloxycarbonyl (tboc) AA 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Kullakin suojaryhmällä on oma poistomenetelmänsä Fmoc tboc bz aq. 3 tai 20% piperidiini 100%, rt, 1 h 2 /d- uojaryhmän poisto-olosuhteet on valittava sellaisiksi, etteivät ne poista sivuryhmien suojaryhmiä. Bentsyylioksikarbonyyli (bz tai Z) 3 Bz (benxyloxycarbonyl chloride) a Bz-AA (carbobenzyloxy) Emässtabiili Voidaan poistaa hydraamalla ( 2,d/) tai voimakkaalla hapolla Kysteiini ja metioniini voivat myrkyttää d/- katalyytin, joten sen sijaan käytetään Boc- ja Fmoc-suojaryhmiä Käytetään edelleen sivuryhmien suojauksessa Useimpia Bz, Boc ja Fmoc-aminohappoja on kaupallisesti saatavissa. 3
Tert-butyylioksikarbonyyli (Boc) Boc-suojaryhmä voidaan liittää Boc-anhydridillä tai Boc-n -reagenssilla (Boc) 2 tai 3 a tai Et 3 Boc-AA (Butyloxycarbonyl) Boc-n (t-butoxycarbonyloximinophenylacetonitrile) Boc on emässtabiili ja kestää vedytyksen Boc-suoja poistetaan hapolla (, Br,,, F) Boc-AA F 3 1 2 2 Merrifield-peptidisynteesi aminohapon amiinipää suojataan Boc-ryhmällä sivuketjut suojataan bentsyyliryhmillä (Bn( Bn) Boc-suojan poisto 50% /DM Fenyyliasetamidometyyli (AM) AM)-linkkeri ivuketjujen suojaryhmät poistetaan vahvalla hapolla (F tai Br/) F s Boc-asparagiinihapon cesium suola F AM-linkkeri Merrifield-hartsi 4
9-(fluorenyylimetyylioksi)karbonyyli (Fmoc) Et 3 leisin suojausmenetelmä Kestää happoja ja vedytystä oistetaan miedolla emäksellä (esim. piperidiinillä tai morfoliinilla) Muita Fmoc-reagensseja: X = X = Fmoc-AA (fluorenylmethyloxycarbonyl) X = X Fmoc- Fmoc- Fmoc-bt Fmoc-peptidisynteesi Wanghartsi ivuketjut suojataan tert- butyyliryhmillä 4-Bentsyylioksibentsyyli- alkoholi (Wang) Wang)-linkkeri Amiinipään Fmoc-ryhmä poistetaan piperidiinillä ivuketjujen suojaryhmät poistetaan :lla ja samalla peptidi irtoaa hartsista. 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Fmoc-u (fluorenylmethyloxycarbonyloxysuccinimide) 5
ivuryhmien suojaus Gly (glysiini) glysiini)-,, Ala (alaniini)( alaniini)-, Val (valiini) valiini)-, e (fenyylialaniini) fenyylialaniini)-, eu (leusiini) leusiini)- Ile (isoleusiini)( isoleusiini)-, Met (metioniini) metioniini)-,, ro (proliini)( proliini)-, Trp (tryptofaani) tryptofaani)-, Asn (asparagiini) asparagiini)- ja Gln (glutamiini) glutamiini)- aminohappoja ei yleensä tarvitse suojata ysiinin ε-aminoryhmä ja kysteiinin -ryhmä on suojattava aina Muiden ryhmien suojaus vähentää sivureaktioden määrää ivuryhmien suojaus Fmoc-kemiassa Fmoc-kemiassa käytettyjä suojaryhmiä, jotka voidaan poistaa :lla tai trimetyylisilyylibromdilla (TMBr) Arginiini: Me 2 Arginine or TMBr or TMBr Arg(Boc)2,'-bis(t-butyloxycarbonyl)-Arg Arg(Mtr) -γ -4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl--arginine Arg(bf) -γ - (2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl) -- arginine Arg(mc) -γ-(2,2,5,7,8- pentamethylchroman-6-sulfonyl)--arginine 6
ivuryhmien suojaus Fmoc-kemiassa ysiini: 2 Kysteiini: ysine ystein or TMBr ys(boc) -(t-butyloxycarbonyl)-ys ys(mtt) -ε-4-methyltrityl--lysine ys(trt) -trityl--cystein ivuryhmien suojaus Fmoc-kemiassa istidiini: is(boc) is(trt) eriini, treoniini ja tyrosiini: erine er(tbu) -t-butyl--serine Thr(tBu) Tyr(tBu) 7
ivuryhmien suojaus Fmoc-kemiassa Asparagiini- ja glutamiinihappo Aspartic acid Asp(tBu) -aspartic acid 4-tert-butyl ester Glu(tBu) eptidit lääkeaineina Aivolisäkkeen takalohko tuottaa peptidihormoneja mm. vasopressiinia ja oksitosiinia. iklosporiini lisää kudossiirränn nnäisten pysyvyyttä. iklosporiinia käytetään n myös nivelreuman ja vaikean psoriaasin hoidossa. Monet AE-est estäjät ovat peptidirakenteisia, esim. enalapriili enalapriili 2 ksitosiini 2 2 Gly eu ro ys Asn Gln 2 2 ys Tyr Ile siklosporiini 8
Kirjallisuutta ouben-weyl Weyl Methods of rganic hemistry. ynthesis of eptides and eptidomimetics; ; M. Goodman, A. Felix,. ; M. Moroder and. Toniolo Ed.; Georg Thieme Verlag: : tuttgart, 2001; Vols.. E22a- d.. kada,, ynthesis of eptides by olution Methods. urr. rg. hem.. 2001, 5, 1. Aimoto,, ontemporary methods for peptide and protein synthesis. urr. rg. hem.. 2001, 5, 45 M. A. Walker,, rotein synthesis by chemical ligation of unprotected peptides in aqueous solution. Angew. hem., Int.. Ed. Engl. 1997, 36, 1069 loyd-williams, F. Albericio,, E. Giralt, hemical Approaches to the ynthesis of eptides and roteins.; : Boca aton, Florida, 1997. 9