Ribosomit 1 Ribosomit 4 Palade & Siekevitz eristivät jaottelusentrifugaatiolla ns. mikrosomeja radioakt. aminohapot kertyivät mikrosomeihin, jotka peräisin rer:ää sisältävistä soluista proteiinisynteesi soluliman basofiilinen aines RNA:ta (hav. 40- luvulla) EM: ø 30 nm:n jyväset vastasivat basofiilista materiaalia radioakt. aminohapot osoittivat jyväset valkuaisainesynteesin paikaksi rrna-geenit esiintyvät monistuneina, n. 200 kopiota/geeni transkriptio tehokasta (huom! rrna on lopputuote!) Ribosomit 2 RNA:sta mikrosomeille nimitys ribosomi ribosomeja on kaikissa valk.ainesynteesiin pystyvissä soluissa prokaryooteilla hajallaan eukaryooteilla suuri osa liittynyt ER:n rer (spesifisesti proteiineja sitovat) Rakenne mitokondrioissa ja viherhiukkasissa omat ribosomit perusrakenne sama kaikissa soluissa 2 osaa (subunits), joissa molemmissa RNA:ta (2/3) ja proteiineja (1/3) koko alayksiköt suurempi alayksikkö pienempi alayksikkö bakteerit 21x29 nm, 70S MW 2,5 milj. 50S + 30S 50S, MW 1,6 milj. 5S rrna 0,12 kb 23S rrna 2,9 kb 34 proteiinia 30S, MW 0,9 milj. 16S rrna 1,54 kb 21 proteiinia eukaryosyytit 22x32 nm, 80S MW 4,2 milj. 60S + 40S 60S, MW 2,8 milj. 5S rrna 0,12 kb 28S rrna 4,7 kb n. 49 proteiinia 40S, MW 1,4 milj. 18S rrna 1,9 kb n. 33 proteiinia (S = sedimentaatiovakio, koon, muodon ja tiheyden funktio, ei additiivinen esim. 30S + 50S = 70S, kb = kilobase = 1000 nukleotidia) Ribosomit 3 Proteiinisynteesin periaate 1 rakentuminen alayksiköistä itseohjautuva tapahtuma (perustuu rrna:n informaatioon) ribosomipartikkelissa aina 2 uurretta: 1. syntyvää polypeptidiketjua varten 2. lähetti-rna:ta varten nisäkässolussa n. 10x10 6 ribosomia ribosomaalinen RNA (rrna) tuotetaan tumassa, sen tumajyväsessa (nukleolus) emäkset: A, G, C, U osa nukleotideista metyloituneita tapahtuu aina polyribosomeissa eli polysomeissa (lähetti-rna:n eli mrna:n toisiinsa liittämiä ribosomeja) tuma mrna mrna:n 1 kodoni (3 emästä) 1 aminohappo prot. synteesissä ribosomi liukuu pitkin urassaan olevaa mrna:ta mrna määrää aminohappojärjestyksen eli proteiinin primaarirakenteen ribosomi käyttää 4 ATP:tä/peptidisidos 1
Proteiinisynteesin periaate 2 Initiaatio 1 aminohapon tuo paikalle trna (siirtäjä eli transfer RNA) aminohappo + trna aminoasyyli-trna (AA-tRNA), korkeaenerginen tuottaa osan synteesin vaatimasta energiasta ah:n ja trna:n kytkee yhteen entsyymi, spesifinen tunnistus trna käsittää n. 80 nukleotidia muod. polynukleotidiketju kiertyy 2-kierteeksi (komplementaariset emäkset) Suunta vasemmalta oikealle! Pienemmän alayksikön rooli? Upstream nucleotide sequence distinguishes initiation AUG sequence Small ribosomal subunit Initiator trna Proteiinisynteesin periaate 3 Initiaatio 2 poikkeavat emäkset taipuminen apilanlehtikuvioon aminohapon paikan tunnistaa trna eikä aminohappo itse mrna:ta muokataan ennen proteiinisynteesiä mrna:n synteesi = transkriptio mrna:n viestin lukeminen ( kääntäminen ) = translaatio 30S Initiation complex (mrna aligned, amino terminal Met in place) Translaatio Initiaatio 3 Mikä on suuremman yksikön rooli? kolme vaihetta: 1. Initiaatio eli aloitus mrna + 40S osa (pienempi osa) kolmen proteiinin (initiaatiofaktorit) avustamana energia GTP:stä solussa initiaatiokoodi aina AUG; koodaa aminohappo metioniinin bakteereissa, mitokondrioissa, kloroplasteissa; formylmetioniini kun met. kiinnittynyt paikoilleen 60S-osa kiinnittyy metioniinin jälkeen Large ribosomal subunit 2
Initiaatio 4 Elongaatio 2 70S initiation complex (ready for elongation) Proteiinisynteesi... Elongaatio 3 2. Elongaatio eli piteneminen uusien ah:jen liittyminen n. 20 ah/s keskikokoinen proteiini syntyy n. 60 sekunnissa ah:t liittyvät peptidiketjun karboksyylipäähän 3. Terminaatio eli lopetus lopetuskoodi: UAA, UAG, UGA ribosomi hajoaa alayksiköikseen (dissosioituu) prot. irtoaa mrna vapautuu irtoamiseen tarvitaan kaksi terminaatiofaktoria ja vielä yksi GTP Uncharged-tRNA Peptide bond Peptidyl-tRNA Elongaatio 1 Elongaatio 4 ELONGATION Aminoacyl-tRNA P site Peptidyl-tRNA A-puoli on oikealla 3
Terminaatio Vielä kerran proteiinisynteesin vaiheet yhdessä kuvassa TERMINATION Polypeptide Growing Completed Peptidyl-tRNA mrna Release factors Lopetuskoodi: UAA, UAG, UGA Stop codon Incoming ribosomal subunits Start of mrna (5 end) End of mrna 3 end) mrna Link between and trna broken Terminationn complex Stop codon Released Lopuksi ribosomi dissosioituu alayksiköikseen SRP receptor Signal recognition particle (SRP) Signal sequence (hydrophobic) Ribosome mrna Protein synthesis begins Lumen of rough eendoplasmic reticulum Protein synthesis inhibited Signal peptidase Protein synthesis resumes Mikä suuntaa polypeptidit ja sopivat signaalipeptidit esim. endoplasmakalvoston lumeniin? Docking proteiiniksi tai signaaliproteiiniksi sanottu reseptori (SRP) vetää polypeptidin lumeniin. BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, Ribosomal 2007 subunits dissociate 4
Virheiden minimointi 1 Proteiinien hajoaminen mrna kodoni ja trna:n antikodoni virhe 1/100 sidoksen löystyminen virheet vähenevät 1/2000 mrna:n kodonin lisäksi trna:n mutkalla 3 sitoutumispaikkaa (A,R,P) trna heilahtaa A R, jos sidos mrna:n ei riittävän luja, sidos irtoaa Proteasomi on suuri useiden proteiinien muodostama entsyymiyhdistelmä, holoentsyymi. Ubikitiinin ja proteasomin osuus hajoamisessa Virheiden minimointi 2 Proteiinin hajoaminen 1 vapaiden ribosomien syntetisoimat proteiinit suoraan solulimaan osittain sytosolin ribosomeissa, pääasiassa rer:n kalvoihin kiinnittyneissä ribosomeissa rer membraanin läpi ER:n onteloihin rer proteiineissa signaalisekvenssi alussa (leikataan myöhemmin pois) usein glykosylointi ER:n onteloissa Vaihe 1 Hajotettava proteiini kulkeutuu ulos endoplasmakalvostosta sytoplasmaan Ks. edellinen luentokerta: Signaalijakso ohjaa ER sisällä, SRP, tyypin I ja II kalvoproteiinit, dolikolin merkitys glykoproteiinin synteesissä. Proteiinien hajoaminen Proteiinin hajoaminen 2 Vain oikein laskostuneet proteiinit ja oikein muodostuneet proteiiniyhdistelmät pääsevät eteenpäin ER:ssa Virheellisesti laskostuneet hajoavat endoplasmakalvostoon liittyvä proteiinien hajotus, ERAD (endoplasmic reticulum associated protein degradation) Ylijääneet alayksiköt hajotetaan samalla mekanismilla Hajotettavat proteiinit poistetaan ER:sta Hajotus sytoplasman proteasomeissa Vaihe 2 Hajotettava proteiini merkitään useilla ubikitiineillä ja viedään proteasomille 5
Proteiinin hajoaminen 3 Vaihe 3 Ydinkappaleessa hajotettava proteiini pilkotaan peptideiksi Muut proteaasit ja aminopeptidaasit viimeistelevät hajotustyön Proteasomi koostuu säätelykappaleesta (19 S) ja ydinkappaleesta (20 S) 7α-alayksikkö, 7β, 7β, 7α. Proteolyyttiset kohdat β alayksiköissä. Ubikitiiniin liittyminen proteiineihin Kolmivaiheinen entsyymijärjestelmä 1) E1-entsyymi aktivoi ubikitiinin, 2) E2 siirtää sen ubikitiiniligaasin-ryhmän entsyymille, 3) joka siirtää sen hajotettavaksi määrättyyn proteiiniin Ubikitinaatio Ubikitinaatio on erittäin keskeinen osa solunsisäistä tiedonsiirtoa. solujen viestinvälityksessä solunjakautumisessa solukuolemassa 6