Solubiologia 750121 (5 op) Tentit ja muut suoritukset Seppo Saarela (eläintieteen osuus) http://cc.oulu.fi/~ssaarela/sb.htm Ulla Kemi (genetiikan osuus) Hely Häggman (kasvitieteen osuus) Kotitentti: solun kemia, solubiologiset tutkimusmenetelmät, solubiologian historia (esseevastausten palautus vko 39 perjantai 27.9.2013 klo 16 mennessä) Tentit (eläintieteen osuus): 1 vk. avoin, uusinta avoin Mistä löytyy tietoa? Oppikirja: Molecular Biology of the Cell: Alberts, Bray, Johnson, Lewis, Raff, Roberts & Waalter. Garland 2008 http://www.garlandscience.com/textbooks/0815332181.asp Molecular Cell Biology (6. painos) 2008 Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore & Darnell. Freeman Solubiologia (2. painos) 2004, Jyrki Heino & Matti Vuento. WSOY Mistä löytyy Tieteelliset lehdet: Cell, Nature, Science http//:cc.oulu.fi/~ssaarela/
Lähtötaso-oletus Kemian perustiedot oletetaan hankituiksi jo aiemmin Kemialliset reaktiot Solubiologian kannalta tärkeät yhdisteet Mitochondrion Plasma membrane Peroxisome Nucleus Nucleolus Rough ER Smooth ER Golgi apparatus Nuclear pore Cytoskeletal fibers Lysosome Sisältö 1 Kantasolukeksintö mahdollistaa henkilökohtaiset soluvaraosat Kari Alitalo & Timo Otonkoski Helsingin Sanomat 20.9.2008 Solubiologian opiskelusta Käytännön ohjeita solubiologian opiskeluun Solubiologian historia Solubiologian kannalta tärkeitä tiedemiehiä ja keksintöjä. Nämä asiat kuuluvat "hauska tietää" -kategoriaan. BIOLOGIAN BIOLOGIAN LAITOS, LAITOS, SEPPO SEPPO SAARELA, SAARELA, 2013 2013
Sisältö 2 Sisältö 3 Solubiologiset tutkimusmenetelmät Solun kemia Solun rakenteen ja toiminnan kannalta tärkeät pienmolekyylit, makromolekyylit, epäorgaaniset ja orgaaniset yhdisteet. KOTITENTTI TÄHÄN SAAKKA! Solun rakenne ja toiminta SOLUKALVO Solukalvon kemiallinen koostumus ja hienorakenne Aineiden kulkeutuminen solukalvon läpi Solukalvojen erilaistumat ja solujen kiinnittyminen toisiinsa Sisältö 4 Sisältö 5 Endosytoosi Eksosytoosi Sytosoli ja solunsisäinen kalvosto Tärkeimpiä käsiteltäviä organelleja eläintieteen osuudessa ovat: Endoplasmakalvosto Golgin laite Lysosomit Peroksisomit Glyoksisomien rakenne ja toiminta opiskellaan kasvitieteen osuudessa. Kalvostojen liike
Sisältö 6 Sisältö 7 Ribosomit ja valkuaisainesynteesi Energian virtaus ja energiaaineenvaihdunta soluissa Mitokondriot Energia-aineenvaihdunta Anaerobinen ja aerobinen soluhengitys Fototrooppinen energia-aineenvaihdunta käsitellään kasvitieteen osuudessa Solun tukiranka Tuma Ainoastaan tuman rakenne käsitellään tässä yhteydessä. Tuman merkitys solun toiminnan kannalta ja perinnöllisen informaation siirrossa käsitellään perinnöllisyystieteen osuudessa. Sisältö 8 Erilaistuneita soluja 1. Lihassolu 2. Hermosolu Signaalien välitysmekanismit 1. Sähköinen signaalinvälitys 2. Hormonit ja reseptorit Solujen erilaistuminen ja solukuolema Mikä virhe pakinassa? Miksi Jeppe juo? Kuopiolaiset ovat löytäneet viinageenin! Ihmiset, joilta puuttuu geeneistään ihastuttava valkuaisaine nimeltään neuropeptidi Y, sortuvat jupotteluun. Sanomalehti Kaleva kesä 2000
Solujen vanheneminen Mitä kuva mahtaa esittää? Terveessä mitokondriossa happi sitoutuu oksidatiiviseen fosforylaatioon Vanhenemisen myötä ATP:tä syntyy vähemmän ja vapaiden radikaalien osuus lisääntyy. Mihin solurakenteisiin vapaat radikaalit iskevät? Scientific American 1997 Scientific American 1997 Kysymyksiä Mistä solut tulevat? Mistä solut tulevat? Miten organismit muodostavat sidoksia? Miten tulehtunut kudos nopeasti täyttyy valkosoluilla? Solujen alkuperän ymmärtäminen on tärkeää biologiassa ja lääketieteessä! Rudolf Virchow - lääkäri ja antropologi osoitti 1850-luvulla, että solut muodostuvat aina toisista soluista
Solut eivät peräisin nonsellulaarisesta materiaalista! Elävät organismit Syöpäkudoksen nopea kasvu johtuu organismin omien solujen kontrolloimattomasta jakautumisesta. Valkosolujen nopea kasautuminen tulehtuneeseen kudokseen on peräisin verenkierrosta. Saavat energiaa ympäristöstä Suorittavat kemiallisia reaktioita Muuttuvat ajan mukana Reagoivat ympäristöön Lisääntyvät Voidaanko solu määritellä? Solu on kaikkien organismien pienin toiminnallinen yksikkö. Molekulaarisella tasolla kaikki solut muistuttavat toisiaan. Moderni solubiologia pyrkii selittämään ja etsimään ominaisuuksia soluorganellien ja pienempien solurakenteiden tasolla. Solubiologian juuret
Historia 1 Historia 2 Soluoppi eli sytologia (kreik. kytos = kotelo) Robert Hooke (1665): cellula (= solu, suom. Lönnrot) 1674 van Leeuwenhoek - kuvasi useita solutyyppejä 1800-luku Schleiden ja Schwann (1838): Kaikki eläimet ja kasvit rakentuvat soluista Hertwig: Uusi yksilö syntyy kahden solun yhteensulautumisesta Mendel (1865) Historia 3 Historia 4 1900-luku Sumner (1926): Entsyymit ovat valkuaisaineita Beadle ja Tatum (1940): Mutaatiokäsite Averly (1944): DNA sisältää geneettisen informaation Watson ja Crick (1953): DNA:n rakenne kaksoishelix 1950-luku elektronimikroskopia kehittyi (tosin keksittiin jo 1931) soluorganellit (Palade, Claude, de Duve 1974) 1980-luku yhdistelmä-dna, DNA:n emäsjärjestys (Berg, Gilbert, Sauger)
Historia 5 Konfokaali- ja scanning-elektronimikroskooppi yleiseen käyttöön 1990-luku videotekniikka mikroskopoinnissa (Allen ja Inoue) transgeenisten eläinten tuottaminen Immunoblottaus, Northern, Western PCR, q-pcr (RT-PCR) 2000-luku geenisiru Genomiikka Transkriptomiikka Proteomiikka Fysiomiikka Solubiologisia tutkimusmenetelmiä 10m 1m 0.1 m 1 cm 1 mm 100 μm 10 μm 1 μm 100 nm 10 nm 1 nm Skaalaus Ihmisen pituus Eräiden hermo ja lihassolujen pituus Kananmuna Sammakon muna Kasvi- ja eläinsolut Tuma, bakteerit, mitokondrio Mykoplasma, virukset Ribosomit, pallomaiset proteiinit, lipidit Pienet molekyylit Mikroaallot (radioaallot) Infrapuna (IR) Näkyvä valo UV-valo Röntgensäteet -säteet
Mikroskoopit Valomikroskoopin periaate Suurennus ja erotuskyky valomikroskooppi max 1000 x elektronimikroskooppi jopa 10 000 x tärkeämpi on resoluutio eli erotuskyky Hooke, van Leeuwenhoek 1600-luku objektiivi yl. 10-100 x okulaari 4-16 x kondensori kohdistaa valon, useita osalinssejä suurennus = obj x okul. Valomikroskooppi Resoluutio eli erotuskyky Resoluutio paranee, kun aallonpituus lyhenee tai objektiivin numeerinen apertuuri kasvaa
Resoluutio 2 Resoluutio 3 Objektiivin numeerinen apertuuri kasvaa, kun objektiivin avautumiskulma kasvaa Objektiiveja, joiden NA jopa 0.95 Immersioöljyä (taitekerroin sama kuin objektiivilla) käyttämällä objektiivin ja kohteen välissä taitekerroin paranee. NA voi olla jopa 1.4 Näin mikroskoopin erotuskyvyn max 1/3 käytetyn valon aallonpituudesta r 0.2 m mitokondriot voi erottaa pistemäisinä Resoluutio 4 Fluoresenssimikroskooppi Elektronivuon aallonpituus 10 pm erinomainen erotuskyky Valonsäde valolähteestä kulkee ekskitaatiosuotimen kautta (musta viiva) Näytteen valaiseminen tämän valonsäteen avulla saa aikaan molekyylien fluoresenssin (elektronien virittyminen), emittoituu ja lähettää valoa pitemmällä aallonpituudella (sininen)
Fluoresenssimikroskooppi Fluoresenssimikroskopia 1 Näytteeseen kohdistetaan UV-valoa (360-400 nm) objektiivin jälkeen UV leikataan pois suotimella fluorisoiva aine näkyy vihreänä (fluorisoivat värit) Fluoresenssimikrograafi osoittaa pitkien aktiinisyiden jakautumisen fibroblastisoluviljelmässä Ihmisen ihon fibroblasteja käsiteltiin ensin detergentillä ja sitten värjättiin antiaktiini antibodylla Fluoresenssimikroskopia 2 Fluoresenssimikroskopia 3 Hiiren lisäkives: suurennus 1.25x40 (Ahti Pyörnilä) Metsäsopuli (Myopus schisticolor), ruskea rasvakudos (BAT), suurennus 10x100x1.25 (Ahti Pyörnilä ja Seppo Saarela)
Fluoresenssimikroskopia 4 Fluoresenssimikroskopia 5 Osoittaa sympaattisten hermopäätteiden (noradrenergisten) esiintymisen Heat shock proteiinin ekspressoituminen C. elegans mutantissa. Fluoresenssiajastin Proteiini, joka vaihtaa väriä ajan funktiona Helmipöllön sydän: Noradrenaliinin fluoresenssi, 10x40x1.25 (Ahti Pyörnilä) Terskikh et al. (2000) Science 24 Nov Pimeäkenttämikroskooppi Faasikontrastimikroskooppi Vain kohteen rajapinnoista siroava valo päästetään ohjektiiviin Tumma tausta voidaan erottaa pienempiä kohteita Vaihevastakohtamikroskooppi Näytteen läpi kulkeneeseen valoon aiheutetaan 1/4- aallon vaihe-ero yhdistetään sironneeseen valoon vaihe-erot muuttuvat amplitudieroiksi kontrasti kuvan osien välille
Faasikontrastimikroskooppi Interferenssimikroskooppi Optiikka Suora valo mustalla Näytteestä lähtenyt hajavalo punaisella Kaksi sädettä: näytteeseen ja näytteestä ohi Säteiden yhdistäminen vaihe-ero amplitudiero Muistuttaa faasikontrastia, mutta antaa 3D-vaikutelman Mikrograafeja KONFOKAALIMIKROSKOPIA Fibroblasti kudosviljelmässä: Valomikroskopia ilman värjäystä Faasikontrastimikroskopia Interferenssikontrastimikroskopia Pimeäkenttämikroskopia Konfokaalimikroskoopilla saadaan laservalo keskitetyksi hyvin tarkkaan yhdelle optiselle tasolle, jolloin sen pyyhkäisy antaa kuvan kyseisestä solutasosta. Ottamalla kuvia peräkkäisistä leiketasoista voidaan tiettyjen matemaattisten algoritmien avulla suodattaa kuvista pois kuvia vääristävä informaatio. Näin optimoitujen tasokuvien avulla voidaan seuraavaksi tehdä kohteesta kolmiulotteinen mallinnos, jota voidaan vapaasti pyörittää kaikissa suunnissa.
Biologian laitoksen konfokaalimikroskooppi Vesikanava Zeiss LSM5 Pascal Katja Anttila, 2004 Rotan jalkapohjan poikkijuovainen lihassolu Photo: Joose Kankare Mika Kaakinen, 2004 Vesikanava kaksoisvärjäyksellä Elektronimikroskooppi Vesikanava näkyy vihreänä Z-levyn prot. näkyy punaisena Valolähteenä elektronisuihku (katodisädeputki), jännite 1-100 kv vaikuttaa aallonpituuteen ja erotuskykyyn Linsseinä magneetit Kuva syntyy fluorisoivalle kalvolle (vrt. TV) TEM eli transmissio-em, läpivalaisuelektronimikroskooppi - leikkeet - elektronien absorptio Mika Kaakinen, 2004
Pyyhkäisy-EM (SEM) Scanning electron microscope Scanning-EM Soveltuu pintojen kuvaamiseen Ei linssejä Kuva muodostuu piste pisteeltä suihkun pyyhkiesssä ( scanning ) näytteen pintaa Syntyy sekundaarielektroneja Pyyhkäisyeletronimikroskooppi Kuva syntyy sekundaarielektronien avulla, jotka emittoituvat näytteeseen Vahvistetaan tuikekiteen ja vahvistimen avulla monitorille Näytteen pinta päällystetään esim. kullalla Valo- ja elektronimikroskoopin optiset järjestelmät Elektronimikroskoopit (TEM, SEM) Valomikroskooppi käyttää näkyvää valoa ja linssejä kuvanmuodostukseen Kuva silmän verkkokalvolle, filmille tai videokuvaksi sähköiseen muotoon EM käyttää elektronisuihkua, joka emittoituu fluorisoivalle kalvolle tai filmille Vasemmalla TEM:n periaate ja oikealla SEM:n periaate TEM:n periaate muistuttaa valomikroskooppia SEM:ssä näytettä pommitetaan elektroneilla ja sen jälkeen mitataan niiden sirontaa näytteen pinnasta
SEM-kuva SEM-kuva Kesykyyhkyn väive Näytettä on rutisteltu pinseteillä! Potnapekan pää Photo: Riitta Harjula Riitta Harjula SEM-kuva SEM-kuva Ampiaisen jalan karvoja Kirva
Paramecium eri mikroskoopeilla kuvattuna Paramecium Elektronimikroskooppikuva (TEM) Valomikroskoopissa SEM Analyyttinen-EM High Performance Liquid Chromatography Alkuaineiden pitoisuudet näytteistä Photo: Joose Kankare
Tehokkaat sekvensointilaitteet Tehokkaat sekvensointilaitteet Mahdollista saada jopa yhdessä 9 tuntia kestävässä ajossa tietomäärä, jonka kokoaminen aiemmilla järjestelmillä vei vuosia (vrt. esim. ihmisen genomiprojekti) Soveltuu laajojen näyteaineistojen käsittelyyn Auttaa esim. sellaisten diagnostisten markkeriyhdistelmien valinnassa, jotka kuvaavat hyvin varhaisia vaiheita sairauksien kehittymisessä - metabolinen oireyhtymä - sydän- ja verenkiertoelimistön sairauksien alkuvaiheet Erikoistarpeita OY:ssa erilaiset näytemateriaalit, kasvi, eläin, mikrobi, humaani, solulinja, DNA, RNA, koko genomi, valitut geenialueet GS Junior (Roche) 454 sekvenssointilaitteet Ion Torrent Illumina