Biosensoreiden uudet sovellusalueet teollisuuden mittauksissa

Biosensoreiden uudet sovellusalueet teollisuuden mittauksissa Vesa Virtanen Biotekniikan laboratorio Kajaanin yliopistokeskus

Miksi kiinnostus biosensoreihin? Biosensorit ovat: Tärkeitä työkaluja kliinisessä ja ympäristö diagnostiiikassa, lääkemonitoroinnissa, ruoan turvallisuuden tarkkailussa ja sodankäynnin varoitussysteemeissä (turvallisuus) Tärkeitä laitteita tarjoten yksinkertaisuutta sekä analyyttisessä laboratoriossa että kentällä. Selektiivinen, nopea ja herkkä instrumentti kemiallisten ja biokemiallisten kohdeyhdisteiden määrittämiseen

Biosensoreiden markkinaosuus $7.3 miljardia 2003 10.2 miljardia2007 Kasvuvauhti noin 10.4%

MIKÄ ON BIOSENSORI? Klassinen Määritelmä Bio tunnistava elementti Muunnin Signaalin ulostulo Entsyymit Sähkökemiallinen Vasta-aineet Optinen Vastaanottajat Magneettinen Kokonainen solu......

BIOSENSORIT- Historia 1956: Oxygen electrode (Clark) 1962: Enzyme electrode 1972: Commercial glucose sensor (YSI) 1975: Microbe-based biosensor 1983: Surface plasmon resonanse (Biacore) 1987: Screen printed enzyme electrode (MediSens)

Biosensori sovelluksia Terveydenhoito ja diagnostiikka Ruoan laadun määrittäminen Ympäristön saastuttajien määrittäminen Teollisuuden prosessikontrollit

Tavoite Kehittää biosensoreita ja menetelmiä, joilla voidaan spesifisesti määrittää haluttuja biomolekyylejä ja metalleja liittyen ihmisfysiologisiin ja vesi- sekä ympäristömittauksiin useita eri tekniikoita hyväksi käyttäen. Kehittää mittalaite, jossa hyödynnetään yo. menetelmiä Analytiikkapäivät, Kokkola

Pintaplasmoni resonanssi biotunnistus (SPR) Erittäin herkkä menetelmä Voi olla pieni ja kannettava Reaali aikainen analyysi, ei leimaamistarvetta TYPICAL REAL TIME SPR SENSORGRAM 1.0 Reflection coefficie Baseline Association Dissociation Regeneration Refractive Units Sensor surface Ir R= Ii R Time

Sähkökemiallinen Biotunnistus Screen printed electrode Kannettava Potentiostat Analytiikkapäivät, Kokkola

SPR:n ja sähkökemiallisten tekniikoiden yhdistäminen samaan Portable Potentiometer Spreeta flow-cell and housing Screen Printed Electrode Spreeta sensor

Kannettavan laitteen kehitys +Potentiometer Useita määritysalueita Näytekammio ja näytteen käsittely Näytteen jakaminen useampaan linjaan Näytteen siirto määritysalueille Yhteistyö muiden toimijoiden kanssa

ENTSYYMI BIOSENSORi Pesticides

Magneettisten kuulien hyödyntäminen Magnetic bead

Magneettisten kuulien tuottamat edut Ei riipu diffuusio asteesta Esikonsentrointi ja näytteen puhdistus Sensori voidaan uudelleenkäyttää Voidaan käyttää useanlaisten reseptoreiden kanssa (esim. DNA probes, polymeeri reseptorit jne.)

Immunosensori: suora analyytin detektointi

Flow rate (µl/min) Integroidun nestevirtauspiirin yhdistäminen Reservoir filled with NaSO 4 Sample chambers filled 100 80 R 2 =0.9714 60 Electrode connectors for electrochemical pump 40 20 Double sided Adhesive gasket tape 80mm 0 0 2 4 6 8 Direct current (ma) Gold sensing surface 25mm 6mm

Ihmisfysiologiset muutokset ja biomarkkerit Pitkäaikaisessa fyysisessä rasituksessa tapahtuu fysiologisia muutoksia ihmiskehon biologisessa kemiassa (esim. Kortisoli, Laktaatti, a-amylaasi, vasta-aineet, Proteiinit, Elektrolyytit) Näiden yhdisteiden pitoisuus voi antaa hyvän yleiskuvan yksilön terveydestä, kunnosta ja suorituskyvystä Useat yhdisteet relevantteja sekä liikuntateknologisiin että terveydenhuollollisiin määrityksiin Nämä yhdisteet voidaan mitata verestä, seerumista ja virtsasta. Analytiikkapäivät, Kokkola

Ihmisfysiologiset mittaukset; Miksi sylki? Helppo, ei-invasiivinen näytteenotto aiheuttamatta stressiä ja epämiellyttävyyttä yksilölle (esim. Pienet lapset ja vanhukset, verisuonten vaikea löytäminen) Hyvä korrelaatio veri- ja seeruminäytteisiin. Kiinnostavat yhdisteet Vasta-aine IgA, IgG a-amylaasi C-Reaktiivinen proteiini (CRP) Kortisoli Laktaatti Insuliini Indikoi tulehduksia ja immunologisia muutoksia liittyy anaerobiseen kynnykseen ja stressistä palautumiseen Tulehduksen biomarkkeri Stressistä palautuminen ja ylirasitus Anaerobinen ja aerobinen kynnys Ravinnollinen glykeminen indeksivaste ja resistanssi Analytiikkapäivät, Kokkola

Biosensorikehitys, ihmisfysiologia Optinen Suface Plasmon Resonace Sylki IgA CRP Lääkeaineet IgG Sähkökemiallinen (Screen Printed Electrodes) Kortisoli α-amylaasi Laktaatti Insuliini

%Incremental change of Refractive Index (RI) SPR Samanaikainen C-reaktiivisen proteiinin (CRP) ja Kortisolin määrittäminen 120 100 80 60 40 20 Cortisol CRP Fitted curve for cortisol(5) Fitted crve for CRP 0 1E-6 1E-5 1E-4 1E-3 0.01 0.1 1 [µg/l] Spreeta SPR laitteella

Intensity of Current(uA) Syljen L-Laktaatin määrittäminen LOX LAKTAATTI + O 2 + H 2 O -------> PURYVIINIHAPPO + H 2 O 2 O O- -O O µa 1) HO + o 2 O + H 2 O 2 0.0 2) PB (rid) CH 3 CH 3 + + H 2 O 2 OH - PB (ox) -0.5 e - -1.0-1.5 Graphite modified with Prussian blue 0 50 100 150 200 time(s) Kalibrointi sensorigrammi käyrät PalmSens laitteelta saatuna s

Intensity of current(ua) Intensity of current(ua) Laktaatin määrittäminen 1.2 1 y = 3,2249x + 0,01 R 2 = 0,9986 1.2 1 y = 3.369x + 0.0532 R 2 = 0.9989 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 LOD: 0.01mM [Lactate](mM) Inter electrode repeatability n=5 Working range: 0.01 0.30mM 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 [Lactate](mM) Intra electrode repeatability, n=3 Reaalinäytteen tyypillinen pitoisuus 0.1-3.0mM

Printattu elektrodi modifioituna nano-komposiitti materiaalilla Sol-Gel Matrix Si LDH MB + Si CNT CNT O O O O O Si LDH Si Si MB + O O O O MB+ + O CNT Si Si MB + CNT LDH MB O + MB O + O LDH O MB + Si LDH = Laktaatti dehydrogenaasi MB = Meldola Blue Electrode Configuration CNT + Mediator + LDH Sol-gel matrix Screen-printed electrode

I (na) I (na) Sol-Gel modifioituna hiilinanoputkilla (CNT) 1200 1000 800 CNT1 = jauheessa CNT2 = suspendoituna DMF:ään 600 400 200 0 MB/SolGel MB+CNT1/SolGel MB+CNT2/SolGel 600 500 400 MB+CNT2/SolGel MB+CNT1/SolGel 0 1 2 3 4 5 6 NADH (mm) 300 200 MB/SolGel 100 0 Arvinte, A., Sesay, A. M., Virtanen, V., and Bala, C. ELECTROANALYSIS 20 (2008) 2355-2362 Herkkyyden parantuminen

Sol-Gel modifioituna hiilinanoputkilla (CNT) CNT1 = jauheessa CNT2 = suspendoituna DMF:ään :(a) MB-SWNT-SG/SPE, (b) MB-SG/SPE ja (c) SWNT-SG/SPE; E=-50 mv;. Herkkyyden parantuminen Arvinte, A., Sesay, A. M., Virtanen, V., and Bala, C. ELECTROANALYSIS 20 (2008) 2355-2362

Prussian Blue GOD Mutarotase α-gd α-amylaasin määrittäminen PB (red) O 2 OH - β-d-glucose α-d-glucose Maltotriose (G3) + Maltose (G2) α-amylase Maltopentose e - PB (ox) H2O2 Gluconic Acid β-d-glucose α-d-glucose + β-d-glucose Maltose (G2) + Maltotriose (G3) Reaktioketju Micheli,L., Caprio, F., Mahosenaho, M., Sesay, A., Palleschi, G., and Virtanen, V. (2010) A disposable biosensor for the determination of alpha-amylase in human saliva Microchimica Acta, in press

Current (na) Tuloksia α-amylaasille 800 700 y = 3,0705x R 2 = 0,9799 600 500 400 300 U/ml Amylase Lineare (U/ml Amylase) 200 100 0 0 50 100 150 200 250 U/ml Amylase Saman elektrodin toistettavuus, n=4

α-amylaasi biosensori parametrit LOD mm 0,01mM Working range (mm) 0,O1-0,30 Average RSD% INTRA ELECTRODE 7% Average RSD% INTER ELECTRODE 10% Sensitivity A*cm- 2 /mm* 26 Lineaarisuus (R 2 ) Alue 0.05 1mM Glukoosi Maltoosi Maltotrioosi α-amylaasi 0.998 0.993 0.998 0.998 1-100mM 10-100mM 10-230 U/ml LOD 0,05mM 1mM 20 mm 15 U/ml Aikuisnäytteen keskiarvo 92.4 U/ml Micheli,L., Caprio, F., Mahosenaho, M., Sesay, A., Palleschi, G., and Virtanen, V. (2010) A disposable biosensor for the determination of alpha-amylase in human saliva Microchimica Acta, in press

Sähkökemiallinen sensori vs kaupallinen kit vertailukuvaaja sähkökemiallisen sensorin ja kaupallisen kitin antamista tuloksista verrattuna laskettuihin arvoihin

Vesi ja Ympäristömittaukset elektrokemiallisilla menetelmillä Raskasmetallien (Pb, Cd, Zn, Cu, Ni, Co, Mn jne) elektrokemiallisen määrityksen edut verrattuna muihin tekniikoihin (AAS, ICP): -Nopeus -Herkkyys -Selektiivisyys -Yksinkertaisuus -Edullisuus -Online-mittaus -Soveltuvuus kenttäkäyttöön Copyright PalmSens

Kiinnostavat yhdisteet Raskasmetalli ionit (Pb, Cu, Ni, jne...) bakteerit Teollisuuden prosessivedet Ympäristösovellukset Teollisuuden prosessivedet Ympäristösovellukset

Differential pulse anodic stripping voltammetry (DPASV) Perustuu metalli-ionin pelkistämiseen elohopea(hg)- päällysteiselle elektrodille sopivalla potentiaalilla E red, jolloin muodostuu amalgaami-yhdiste: M x+ + x e - M 0 (Hg) M = esim. Pb, Cd, Zn, Cu, Mn Skannattaessa potentiaalialue anodisesti metallit hapettuvat kullekin ominaisessa potentiaalissa E ox Yhdellä mittauskerralla jopa 4-6 analyytin määritys Samaa elektrodia voidaan käyttää useita kertoja Kaupalliset analysaattorit yleensä yhdelle metallille!

dt/de, s/v Cu, Pb: Square wave anodic stripping voltammetry (SWASV) 24 Kuparin ja lyijyn määrittäminen samasta 50 ppb 20 100 ppb näytteestä 16 0 ppb 200 ppb 500 ppb 12 I. Tothill et all 8 4 0 0-0,2-0,4-0,6-0,8 Potential, V

Kuparin elektrokemiallinen määrittäminen vesinäytteestä. Menetelmä: Square wave voltammetry Elektrodi: Mercury+Methocel -coated SPE

Peak area VuA Kuparin lineaarisuus Copper content vs. peak area 2,5 2 1,5 1 0,5 0-0,5 R 2 = 0,9996 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Copper content ppm

Ni, Co: Differential Pulse Adsorptive stripping voltammetry (DPAdSV) Menetelmä käytössä tietyille metalleille (esim. Ni ja Co), jotka eivät muodosta amalgaamia elohopean kanssa tarvitaan lisäksi kompleksinmuodostaja (dimetyyliglyoksimi, DMG): Ni 2+ + 2 DMGH2 + 2 e - Ni(DMG) 2 muodostunut kompleksi adsorboituu elektrodille Kehittämistarpeet: - Elektrodeissa käytetty elohopea korvaaminen vähemmän myrkyllisellä yhdisteellä, esim. vismutilla (Bi) hapenpoistoa ei tarvita -kompleksinmuodostajaksi nioksimi

Entsyymin inhibitioon perustuva nikkelin (Ni 2+ ) määritys Sarkosiini oksidaasi -entsyymi pilkkoo sarkosiinin tuottaen samalla vetyperoksidia Vetyperoksidi mitataan Prussian Blue modifioidulla elektrodilla Nikkeli inhiboi entsyymiä, jolloin vetyperoksidia muodostuu vähemmän sarcosine + H 2 O + O 2 Ni 2+ glysiini + formaldehydi + H 2 O 2 Entsyymi

Vesi- ja Ympäristö sovellutukset; Tulevaa Sensoreiden kehitys kaivosten poístovesien metallipitoisuuksien monitorointiin Myös muut vedet Myös eloperäiset määritykset vesistä Bakteerien määrittäminen On-line määrittäminen

Tulevaisuuden biosensorisovellukset Henkilökohtaiset point-of-care laitteet Dynaamiset non-invasiiviset ja invasiiviset sensorit Henkilökohtaiset terveys ja fitness monitorit Interaktiiviset ympäristösensorit ja aktiiviset suojauslaitteet Teollisten prosessien tarkkailu ja säätö Uudet sovellusalueet

Ympäristösensorit / Minewater Sähkökemiallisten ja biosensorien kehitys kaivos- ja ympäristövesien metallipitoisuuksien määrittämiseen Minewater/TEKES Vesi-ohjelma 2009-2011 Yhteishanke Moniwaterin kanssa (VTT vetoinen) Partnerit: Mila, TTY,SYKE, MIKES, Outotech, Agnico-eagle, Pyhäsalmi Mine, Labtium, EHPtekniikka