ENTSYYMIKATA- LYYSIN PERUSTEET (dos. Tuomas Haltia) Elämän edellytykset: Solun täytyy pystyä (a) replikoitumaan (B) katalysoimaan tarvitsemiaan reaktioita tehokkaasti ja selektiivisesti eli sillä on oltava entsyymejä (c) solulla täytyy olla energian lähde MIHIN ENTSYYMIEN TEHOKKUUS PERUSTUU?
Tässä luennossa: Entsyymit = Proteiineja, jotka katalysoivat kemiallisia reaktioita Eivät itse kulu reaktiossa Nopeuttavat reaktioita ratkaisevasti Eivät voi muuttaa reaktion termodynamiikkaa eli sitä, onko reaktio energeettisesti suotuisa vai ei Vain energeettisesti suotuisa (= alamäkeen oleva ) reaktio voi tapahtua (muttei välttämättä tapahdu!)
Solun aineenvaihdunta: kaikki riippuu entsyymeistä!
Entsyymit määräävät, mitä solussa tapahtuu
Aineenvaihdunta (metabolia) riippuu siitä, mitkä entsyymit ovat aktiivisia
Entsymaattinen nopeusfaktori Solussa ei tapahtuisi paljon mitään ilman entsyymejä.
Entsyymit keskeisiä Geneettisissä taudeissa (tietty entsyymi inaktivoitunut mutaation seurauksena) Häiriötiloissa joissa syynä on liiallinen entsyymiaktiivisuus (esim. tupakoitsijan keuhkolaajentuma; elastaasin inhibiittorin inaktivoituminen)) Lääkkeiden kohdemolekyyleinä (aspiriini, protonipumpun estäjät ) Diagnostiikassa ( mm. kudosspesifit isoentsyymit), esim. sydäninfarktin jälkeen
E+S ES EP E+P Reagoivat molekyylit eli substraatit (S) sitoutuvat entsyymin aktiiviseen keskukseen Sitoutumisenergia ( katalyysi!) Syntyy ES-kompleksi Aktiivisessa keskuksessa substraatti muuttuu tuotteeksi P Aktiivinen keskus on spesifinen osa entsyymin 3-ulotteista rakennetta
Entsyymi alentaa reaktion aktivaatioenergiaa reaktio nopeutuu dramaattisesti
AKTIIVINEN KESKUS JA SATURAATIOKINETIIKKA Induced fit (substraatti vaikuttaa aktiiviseen keskukseen ja päinvastoin) V max Nopeus kun entsyymi on saturoitunut substraatilla K M = substraattikonsentraatio jossa v = ½ V max Michaelis-Mentenin yhtälö: v = V max [S] / K M + [S]
ENTSYYMI ja SUBSTRAATTI Entsyymin aktiivinen keskus spesifinen substraatille, substraatti sitoutuu spontaanisti
ES-kompleksi perustuu (lukuisiin) heikkoihin vuorovaikutuksiin SITOUTUMISENERGIA!
Miten entsyymin toimintaa tutkitaan: entsyymikinetiikka = mitataan reaktionopeuksia eri substraatti- ja inhibiittorikonsentraatioissa Monet lääkkeet ovat entsyymiinhibiittoreita Jos entsyymin rakenne tiedossa, inhibiittori(lääke) voi olla mahdollista suunnitella in silico Reversiibelit ja irreversiibelit estäjät, itsemurhainhibiittorit Rationaalinen lääkesuunnittelu
Lineweaver-Burk - Saadaan Michaelis- Mentenin yhtälöstä kuvaaja 1/V 0 = (K M /V max ) 1/[S] + 1/V max Michaelis-Mentenin yhtälö: V o = V max [S] / K M + [S]
Kilpaileva inhibitio Inhibiittori tyypillisesti muistuttaa substraattia
Lineweaver-Burk kompetitiivisen inhibiittorin läsnäollessa Kulmakerroin muuttuu, leikkauspiste ei vain K M muuttuu
Ei-kilpaileva (uncompetitive) inhibiittori sitoutuu vain ESkompleksiin Mitä etua verrattuna kilpailevaan inhibiittoriin, jos I on lääkeaine? Leikkauspisteet akseleilla muuttuvat K m ja V max muuttuvat saman verran
Sekainhibitio Inhibiittori voi sitoutua sekä vapaaseen entsyymiin että ESkompleksiin Sekä K m että V max muuttuvat eri faktorilla
Ei-katalysoitu reaktio on hidas, koska Lähtöainetta ja tuotetta erottaa toisistaan korkea energiavalli Alhaisessa lämpötilassa vain pienellä osalla lähtöainemolekyyleistä on riittävästi energiaa energiavallin ylittämiseen Energiavalli = Aktivaatioenergia; jos sitä pystytään alentamaan reaktio nopeutuu!
ENTSYYMIKATA- LYYSI PERUSTUU AKTIVAATIOENERGIAN ALENTAMISEEN Entsyymit EIVÄT vaikuta reaktion tasapainoon eli entsyymit nopeuttavat vain reaktioita joiden energetiikka on suotuisa (reaktiot alamäkeen ) MITEN aktivaatioenergiaa alennetaan?
Aktivaatioenergia johtuu lähtöainetta ja tuotetta erottavasta korkeaenergisestä siirtymätilasta. Aktivaatioenergian alentaminen = siirtymätilan stabilointi. Entsyymin aktiivinen keskus on komplementaarinen siirtymätilalle Siirtymätila = reaktiopolun energiaprofiilin korkeimmassa kohdassa esiintyvä hyvin lyhytikäinen molekyylirakenne
Siirtymätila ja siirtymätila-analogi: peptidisidos ja sen hydrolyysi Figure 3-47 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Entsyymi (A)Orientoi (B) Muuttaa varausten paikkaa (C) Vääntää substraatteja kohti siirtymätilaa Figure 3-52 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Entsyymit alentavat aktivaatioenergiaa Sitomalla substraatin spesifisesti kuitenkin siten, että kaikkein tiukimmin sitoutuu siirtymätila Käyttämällä sitoutumisenergiaa substraatin vääntämiseen reaktiolle otollisempaan konformaatioon Orientoimalla substraatin ja katalyyttiset ryhmät optimaalisesti Pitämällä veden poissa reagoivilta pinnoilta Keskeisin tekijä on sitoutumisenergia!
STIKKAASI! Pelkkä substraatin sitominen ei johda katalyysiin, vaan päinvastoin substraatin stabiloitumiseen!
ENTSYYMIT Katalyyttejä joissa Aktiivinen keskus joihin Substraatit sitoutuvat Tämä johtaa Siirtymätilan stabiloitumiseen ja edelleen Aktivaatioenergian alenemiseen Tuloksena on reaktionopeuden kasvu Huom. entsyymi ei vaikuta reaktion tasapainotilaan eli lähtöaineen ja tuotteen määrään tasapainotilassa! (Mutta nopeuttaa tasapainon saavuttamista.)
Erään entsyymin mekanismi Katso: http://bcs.whfreeman.com/lehninger5e/default.asp Mechanism Animations : Fig 6.21: Chymotrypsin Mechanism Kymotrypsiini: rakenne, aktiivinen keskus, sitoutumisenergian käyttö, siirtymätila, kovalenttisesti sitoutunut välituote
Kymotrypsiinin spesifisyys (proteaasi joka katkaisee peptidisidoksen ison hydrofobisen ah:n karboksipuolelta)
Tasomainen peptidisidos on inertti (vaikka sen hydrolyysireaktio on vesiliuoksessa termodynaamisesti alamäkeen)
Kymotrypsiinin sekvenssi
KYMOTRYPSIINI ja sen AKTIIVINEN KOHTA Punainen = aktiivinen keskus Vihreä = substraatin sivuketjun sitoutumiskohta
KATALYYTTINEN TRIADI Vetysidos vahvistuu substraatin sitoutuessa Ser-195 muuttuu reaktiivisemmaksi!
KYMOTRYPSIININ MEKANISMI Reaktiossa esiintyy kovalenttinen välituote (asyyli-intermediaatti); katalyysin toinen puoli koostuu intermediaatin hydrolyysistä.
KYMOTRYPSIININ MEKANISMI Katso: http://bcs.whfreeman.com/lehninger/ Mechanism Animations : Fig 6.21: Chymotrypsin Mechanism
Sitoutumisenergia 1. Oksianionin sitoutumispaikka (=siirtymätilan stabilointi)
Sitoutumisenergia 2. Tasku hydrofobiselle sivuketjulle (= spesifisyys)
Kymotrypsiinin katalyysin keskeiset piirteet Katkaisee proteiinin hydrofobisen sivuketjun C-puolelta (tasku sivuketjulle = sitoutumisenergian käyttö) Akt. keskuksessa seriini-195-oh, joka tehdään reaktiiviseksi vetysidosketjulla katalyyttisen triadin muihin jäseniin (His-57, Asp- 102) Reaktiivinen Ser-195 nukleofiilinä peptidikarbonyyliin kovalenttisesti entsyymiin sitoutunut välituote Tetraedrinen oksianioni-siirtymätila, joka stabiloidaan vetysidoksin; sitoutumisenergian käyttö!