Nitrifikaation mahdollisuus talviaikaisissa olosuhteissa Kallavedellä - tuloksia laboratoriokokeista

Transkriptio

1 Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6 Taina Hammar Nitrifikaation mahdollisuus talviaikaisissa olosuhteissa Kallavedellä - tuloksia laboratoriokokeista Kuopio 1997KUS POHJOIS-SAVON YMPÄRISTÖKESKUS

2 Painopaikka Pohjois-Savon ympäristökeskus Kuopio Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6

3 Sisällys Alkusanat... 5 Johdanto... 6 Aineisto ja menetelmät Lämpötilakoe Nitrifikaatiopotentiaali... 7 Tulokset ja tulosten tarkastelu Lämpötilakoe Nitrifikaatiopotentiaali Johtopäätökset Kirjallisuus...15 Liitteet Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6 3

4 4 Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6

5 Alkusanat Tämä työ lähti liikkeelle K. Matti Lappalaisen esittämästä kysymyksestä. Kiitän erityisesti Pertti Martikaista Kansanterveyslaitokselta, Helvi Heinonen-Tanskia Kuopion yliopiston ympäristötieteiden laitokselta ja Seija Salosta Suomen ympäristökeskuksesta saamistani neuvoista ja kommenteista sekä laboratoriomme väkeä ennalta suunnittelemattomien analyysien sisällyttämisestä ohjelmiin ja kokeiden käytännon toteutuksesta. Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6 5

6 1 Johdanto Kemolitotrofisella nitrifikaatiolla tarkoitetaan ammoniumin hapettumista nitriitin kautta nitraatiksi. Nitrifikaatiosta saatavan energian varassa kasvavia bakteereita on suhteellisen vähän. Eniten on tutkittu Nitrosomonas- ja Nitrobacter-sukuihin kuuluvia nitrifioivia bakteereita, joista ensinmainitut hapettavat ammoniumia nitriitiksi ja jälkimmäiset nitriittiä nitraatiksi. Molemmat ovat kemolitotrofeja eli ne pystyvät sitomaan hiilidioksidia typpiyhdisteiden hapetuksesta saamallaan energialla. On olemassa myös heterotrofisia nitrifioivia bakteereita ja sieniä, jotka voivat hapettaa ammoniumia tai orgaanisia typpiyhdisteitä, mutta eivät saa energiaa tästä hapetuksesta. (Focht & Verstraete 1977, Robertson & Kuenen 1991). Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää nitrifikaatiota talviaikaisissa olosuhteissa. Kohdealueena oli Kallavedellä Lehtoniemen jätevedenpuhdistamon edusta (Kallavesi 377), jonne tulee runsaasti ammoniumtyppikuormitusta, ja vertailupaikkana kuormitusalueen ulkopuolinen havaintopaikka (Kallavesi 405) (liite 1). Kentällä toteutettujen merkkiainekokeiden lisäksi nitrifikaatiota selvitettiin kahdentyyppisten laboratoriokokeiden avulla: 1. Nitrifikaatioaktiivisuus eri lämpötiloissa. 2. Nitrifikaatiobakteereiden lukumäärä/aktiivisuus e.m. Kallaveden havaintopaikkojen eri syvyyksissä kesällä ja talvella. Nitrifikaatiobakteereiden lukumäärän analysoinnissa yleisesti käytetyllä MPN (most probable number) -menetelmällä bakteerimäärät ovat jääneet 2-4 kertaluokkaa pienemmiksi kuin nitrifikaatioaktiivisuuden perusteella olisi todennäköistä (Knowles & Lean 1987). Tämän vuoksi nitrifikaatiobakteereiden määrää arvioitiin ns. nitrifikaatiopotentiaalimenetelmällä, jossa seurataan luonnollisen bakteeripopulaation aiheuttamaa nitraatinmuodostusta nitrifikaatiolle optimaalisissa olosuhteissa laboratoriossa. Nitrifikaatiopotentiaalimenetelmä antaa suhteellisia arvioita bakteerien määrästä ja aktiivisuudesta eri havaintopaikoilla ja -kerroilla. 6 Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6

7 2 Aineisto ja menetelmät 2.1 Lämpötilakoe Havaintopaikalta Kallavesi m syvyydestä otettua vettä laitettiin viiteentoista 2 l Pyrex-pulloon. Pulloihin lisättiin bakteeriympiksi hyvin nitrifioivan Lapinlahden jätevedenpuhdistamon ilmastusaltaan vettä (4 ml/2 l) ja kantaliuos B:tä (ks. kohta 2.2) (80 ml/2 l). Inkubointilämpötilat olivat 4 o C (olosuhdekaappi), 10 o C (kylmiö), 15 o C (nestehaude), 20 o C (lämpötilasäädelty huone). Kustakin lämpötilasta oli kolme rinnakkaista koeyksikköä. Näytteenoton jälkeen 15 ja 20 o C:een tarkoitetut näytteet oli säilytetty huoneenlämmössä, muut kylmiössä vajaan vuorokauden ajan. Kasvatukset tehtiin pimeässä. Pulloista otettiin alkutilannenäytteet, joista määritettiin ammonium- ja nitraattityppi, ja sen jälkeen nitraattityppinäytteitä otettiin korkeimmassa lämpötilassa inkuboiduista kasvatuksista päivittäin, muista harvemmin. Inkubointeja jatkettiin niin kauan, että nitraattipitoisuus alkoi tasaantua, lämpötilasta riippuen kahdesta kuuteen viikkoon. 2.2 Nitrifikaatiopotentiaali Nitrifikaatiopotentiaalikokeessa käytetty menetelmä on muunnos maanäytteiden nitrifikaatiota kuvaavasta menetelmästä (Torstensson 1993). Nitrifikaatiopotentiaalikokeessa bakteereille järjestetään laboratoriossa olosuhteet, joissa nitrifikaatiota rajoittavat tekijät on pyritty eliminoimaan: - inkubointilämpötila optimialueella (20 o C) - riittävä happitilanne ( inkuboinnit avoimissa astioissa ja jatkuva sekoitus) - neutraali ph - ammoniumtyppilisäys Nitraatinmuodostumisnopeus antaa kuvan bakteereiden määrästä ja aktiivisuudesta, sillä nämä muuttujat on koeasetelmassa järjestetty ainoaksi nitrifikaatiota rajoittavaksi tekijäksi. Koeolosuhteet toisaalta myös helpottavat nitrifikaation tuloksena syntyneen nitraatin säilymistä, sillä riittävä ammoniumtyppilisäys estää nitraatin joutumisen mikrobien typenlähteeksi ja riittävän hapensaannin turvaaminen estää nitraatin häviämisen denitrifikaation kautta. Esikokeen perusteella nitrifioivien bakteereiden tiheys/aktiivisuus on Kallavedessä niin pieni, että eri paikkojen ja syvyyksien välisten erojen havaitsemiseksi bakteeripopulaation annettiin lisääntyä kokeen aikana, jotta saataisiin mitattavissa olevia nitraattipitoisuuden muutoksia. Näinkin toteutettuna nitrifikaatiopotentiaalikoe antaa kuvan havaintopaikan nitrifikaatiobakteereiden lukumäärästä näytteenottohetkellä: mittarina voidaan käyttää nitraatinmuodostusta edeltävän viiveen pituutta, sillä mitä vähemmän nitrifikaatiobakteereita on, sitä kauemmin kestää populaation lisääntyminen niihin solutiheyksiin, joissa nitrifikaatio alkaa näkyä mitattavina nitraattipitoisuuksien muutoksina. Nitrifi- Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6 7

8 kaatiopotentiaalikoe mittaa bakteereiden lukumäärien ohella myös niiden aktiivisuutta, sillä jos koevedessä on inhiboivia tekijöitä, bakteeripopulaatio ei pysty jakaantumaan normaalisti. Koevesi otettiin ja havaintopaikoilta Kallavesi 377 (5, 20, 25 ja p-1 m) ja Kallavesi 405 (5, 20, 25 ja p-1 m). Näytteitä säilytettiin huoneenlämmössä seuraavaan päivään, jolloin koe aloitettiin. Jokaisesta näytteestä otettiin 500 ml vettä 1 l erlenmeyerpulloihin. Huhtikuussa havaintopaikan metrin syvyydestä otetusta näytteestä tehtiin lisäksi erillinen koeyksikkö, johon lisättiin 1 ml Lapinlahden jätevedenpuhdistamon ilmastusaltaalta otettua jätevettä. Heinäkuussa toteutetussa nitrifikaatiopotentiaalikokeessa ei ollut jätevesiympättyä koeyksikköä. Erlenmeyerpulloihin lisättiin 5 ml kantaliuosta A ja 20 ml kantaliuosta B (Nlisäys 4,24 mg/l). Kantaliuos A, 0,1 M: 28 ml KH 2 PO 4 (0,2 M) (kaliumfosfaattipuskuri) 72 ml K 2 HPO 4 (0,2 M) 100 ml tislattua vettä Kantaliuos B 0,5 g (NH 4 ) 2 SO 4 laimennetaan 1000 ml:ksi 0,001 M kaliumfosfaattipuskurilla Koeastiat asetettiin tasoravistelijaan (175 rpm) ja astioista otettiin alkutilannenäytteet nitraatti- ja ammoniumtyppimääritystä varten. Inkuboinnin kuluessa nitraattityppi määritettiin koeyksiköistä 1-3 vuorokauden välein kahden-kolmen viikon ajan kunnes ammoniumtyppi oli nitrifioitunut useimmissa koeyksiköissä. Heinäkuun kokeessa ammoniumtyppi määritettiin aina nitraattitypen ohella, mutta huhtikuussa ammoniumtyppimäärityksiä tehtiin harvemmin (liite 2). Koeolosuhteet olivat huhti- ja heinäkuussa hieman toisistaan poikkeavat. Huhtikuussa inkubointi tapahtui huoneenlämmössä normaaleissa laboratoriotilojen valaistusolosuhteissa ja heinäkuussa säätelyhuoneessa 20 o C:ssa hämärässä. Valolla on havaittu olevan suoraa fysiologista inhiboivaa vaikutusta nitrifikaatioon (Focht & Verstraete 1977), mutta myös välillistä positiivista vaikutusta aiheutuen fotosynteesin kautta kohentuneista happiolosuhteista (Risgaard-Petersen ym. 1994). Erilaisten koeolosuhteiden vaikutusta nitrifikaatiopotentiaaliin selvitettiin alkaneella kokeella, jossa havaintopaikalta metrin ja 20 metrin syvyydeltä otettuja vesinäytteitä inkuboitiin molemmissa koeolosuhteissa. Nitraatinmuodostusta edeltävä viive oli noin vuorokauden lyhyempi huoneenlämmössä kuin 20 o C:ssa (kuva 1). Talvella mitatut nitrifikaatiopotentiaalit saattavat näin ollen olla suhteessa hieman korkeampia verrattuna kesällä mitattuihin. 8 Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6

9 Toteutuneiden koeolosuhteiden väliset erot NO3-N (µg/l) Aika (vrk) 20 C/20m HL/20m 20 C/10m HL/10m Kuva 1. Koeolosuhteiden vaikutus nitraatinmuodostukseen nitrifikaatiopotentiaalikokeissa (avoin tunnus - inkubointi säätelyhuoneessa (20 o C), musta tunnus - inkubointi huoneenlämmössä (HL)). Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6 9

10 3 Tulokset ja tulosten tarkastelu 3.1 Lämpötilakoe Inkubointilämpötila vaikutti selkeästi nitrifikaationopeuteen (kuva 2). Nitraattia muodostui 20 o C:ssa 310 µg/l, 15 o C:ssa 120 µg/l, 10 o C:ssa 45 µg/l ja 4 o C:ssa 31 µg/l vuorokautta kohti. Nitrifikaationopeus on suoraan verrannollinen nitrifikaatiobakteereiden kasvunopeuteen, joten sen perusteella voidaan laskea myös bakteereiden generaatioaika (taulukko 1). Generaatioaika oli 4 o C:een lämpötilassa noin 40 vrk, 10 o C:een lämpötilassa noin 33 vrk, 15 o C:een lämpötilassa 12 vrk ja 20 o C:een lämpötilassa noin 7 vrk. Q 10 -arvo, joka mittaa prosessinopeuden kasvua lämpötilan noustessa 10 o C, oli 3,07. Mitattu Q 10 -arvo oli jokseenkin samaa luokkaa kuin esimerkiksi eräissä entsyymireaktioissa (Atlas 1984) NO3-N (µg/l) Aika (vrk) 4 C 10 C 15 C 20 C Kuva 2. Nitraattitypen muodostuminen eri lämpötiloissa. 10 Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6

11 Taulukko 1. Nitrifikaatiobakteereiden reaktionopeusvakio ja generaatioaika eri lämpötiloissa (suluissa keskihajonnat, n = 3) Lämpötila reaktionopeusvakio (vrk -1 ) generaatioaika (vrk) 4 o C 1, (9, ) 40,49 (2,33) 10 o C 2, (1, ) 33,02 (2,04) 15 o C 5, (8, ) 11,64 (0,16) 20 o C 9, (6, ) 7,38 (0,46) Lämpötilakokeissa oli erikoisena piirteenä, että vain alle puolet käytettävissä olleesta ammoniumtyppimäärästä pystyi hapettumaan nitraatiksi kokeen aikana. Hapenpuutteesta ei ollut kysymys. Ammoniumtyppeä ei mitattu alkutilanteen jälkeen eikä kokonaistyppipitoisuuksia ollenkaan, joten ei voida sanoa, hävisikö nitraattityppeä denitrifikaation kautta, pelkistyikö sitä ammoniumtypeksi fermentoivien bakteereiden toiminnan tuloksena vai inhiboiko jokin tekijä nitrifikaatioprosessia. Denitrifikaatio oli todennäköisesti hyvin vähäistä, koska veden orgaanisen aineen määrä oli niukka (BOD 7 alle 2 mg/l) heterotrofisille denitrifikaatiobakteereille ja koska olosuhteet eivät olleet hapettomat. Samoista syistä myös fermentoivien bakteerien toiminta on epätodennäköistä. Koevesien ph:ta ei mitattu kokeen aikana, mutta on ilmeistä, että nitrifikaation seurauksena ph laski reaktion kannalta liian alhaiseksi. Lämpötilakokeessa koeliuoksia ei puskuroitu. 3.2 Nitrifikaatiopotentiaali Ammoniumtyppipitoisuudet pienenivät nitrifikaatiopotentiaalikokeessa µg/l:sta yleensä selvästi alle 100 µg/l:aan (liite 2). Poikkeuksena olivat havaintopaikan 405 päällysveden ja kesätilanteessa myös pohjanläheisen vesikerroksen näytteet, joissa nitrifikaatio oli niin hidasta, ettei kaikki ammoniumtyppi ehtinyt kahden-kolmen viikon koejakson aikana hapettua. Epäorgaanisen typen kokonaismäärä pysyi kokeiden aikana jokseenkin samalla tasolla, monissa tapauksissa lievästi nousi (liite 3). Nitrifikaatiopotentiaalikokeessa mitattavissa olevaa nitraatinmuodostusta edeltävän viiveen pituutta voidaan käyttää kunkin havaintopaikan nitrifioivien bakteereiden lukumäärän/aktiivisuuden suhteellisena mittana (taulukko 2, kuvat 3 ja 4). Viive oli odotetusti pienin siinä koeyksikössä, johon oli lisätty jätevedenpuhdistamolta ymppiä. Havaintopaikkojen 377 ja 405 väliset erot olivat suuret: nitrifikaatiopotentiaali oli Lehtoniemen edustan yli 20 metrin vesisyvyyksissä noin kaksinkertainen havaintopaikkaan 405 verrattuna. Sen sijaan 5 metrin syvyydeltä otetuissa näytteissä viiveet olivat talvella samaa tasoa, Lehtoniemen edustallakin vertailupaikan luokkaa. Vuodenaikaiset erot eivät olleet kovin selvät, joskin kesällä bakteereiden lukumäärä/aktiivisuus oli yleisesti ottaen jonkin verran suurempi kuin talvella ja potentiaalin vertikaalisessa jakautumisessa on eroa, niin että pisteellä 405 potentiaalihuippu on talvella pohjan läheisessä vesikerroksessa, kesällä metrin syvyydessä. Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6 11

12 Taulukko 2. Viiveen pituus (vrk) nitrifikaatiopotentiaalikokeessa. Viive on laskettu nitraatinmuodostuksen eksponentiaalisen vaiheen mukaisen suoran yhtälöstä m 20 m 25 m 32 m ymppi 5 m 20 m 25 m 43 m Talvi 12,4 5,6 6,6 5,0 4,7 12,4 11,5 12,0 8,4 Kesä 9,3 4,5 6,1 4,7 13,4 9, 10,4 12,0 Koetilanteen optimaalisissa olosuhteissa nitrifikaationopeus oli suurin havaintopaikan 377 talvella 20 metrin syvyydestä otetussa näytteessä (taulukko 3). Saman paikan 25 ja 32 metrin syvyyksissä ja havaintopaikan 405 pohjanläheisessä vesikerroksessa talvisen bakteeripopulaation nitrifikaationopeus oli noin 30 % alhaisempi, muissa näytteissä vähintään 50 % alhaisempi. Kesätilanteessa havaintopaikan 377 näytteissä nitrifikaationopeus oli varsin tasainen 20 metrin syvyydestä pohjaan, havaintopaikalla 405 oli huippu metrin syvyydessä. Nitrifikaationopeuden suuruusluokassa ei ollut olennaista vuodenaikaista eroa NO3-N, µg/l m 20m 25m 43m 5m 20m 25m 32m vrk Kuva 3. Nitraatinmuodostus nitrifikaatiopotentiaalikokeissa talvella (yhtenäinen viiva - Kallavesi 377, pisteviiva - Kallavesi 405, katkoviiva - ymppi Lapinlahden jätevedenpuhdistamolta). 12 Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6

13 Taulukko 3. Nitraattitypen muodostumisnopeus (µg/l/vrk) nitrifikaatiopotentiaalikokeissa (laskettu kokeen alkutilanteesta eksponentiaalisen vaiheen loppuun) m 20 m 25 m 32 m ymppi 5 m 20 m 25 m 43 m Talvi Kesä Varsinkin kesällä toteutetuissa nitrifikaatiopotentiaalikokeissa levät olisivat periaatteessa voineet kilpailla nitrifikaatiobakteereiden kanssa ammoniumtypestä. Epäorgaanisen typen kokonaismäärässä ei kuitenkaan tapahtunut olennaista muutosta (liite 3), joten koeyksiköiden levätuotannon voi arvioida olleen lähes olematonta, ja nitrifikaatiobakteereiden aiheuttamat muutokset olivat koeasetelmassa ilmeisen ainoita typenkierron prosesseja. Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6 13

14 4 Johtopäätökset Tämän tutkimuksen perusteella ei pystytä sanomaan, paljonko Lehtoniemen edustalla ja vertailupaikalla tapahtuu nitrifikaatiota. Sen sijaan tulokset antavat kuvan nitrifikaatioaktiivisuuden lämpötilariippuvuudesta ja suhteellisen arvion bakteeripopulaation mahdollisuudesta nitrifikaatioon talvella ja kesällä tutkittujen havaintopaikkojen eri syvyyksillä. Nitrifikaatiopotentiaalikokeiden perusteella Lehtoniemen jätevedenpuhdistamolta tuleva ammoniumtyppikuormitus on lisännyt lähialueen nitrifioivien bakteereiden määriä ja/tai aktiivisuutta vertailualueeseen verrattuna. Bakteerit ovat myös voineet tulla jäteveden mukana. Nitrifikaatiopotentiaalin vuodenaikaisvaihtelut eivät olleet kovin suuret: talvella nitrifikaatiopotentiaali on Lehtoniemen edustalla jokseenkin yhtä suuri kuin kesällä. Talvella nitrifikaatiobakteerit säilyvät paremmin, koska predaatiopaine on pienempi kuin kesällä. Jäänalaiset lämpöolosuhteet rajoittavat nitrifikaatiota niin, että nitraatinmuodostuksen ja sen aiheuttaman hapenkulutuksen voidaan tehtyjen lämpötilakokeiden perusteella arvioida olevan korkeintaan viidesosan siitä, mitä olisi 20 o C:een lämpötiloissa. Toisaalta kesälämpötilatkin ovat jäteveden kulkeutumissyvyydessä korkeintaan o C. Näin ollen syvissä vesikerroksissa nitrifikaationopeuden voidaan arvioida olevan kesällä alle puolet 20 o C:ssa esiintyvästä ja toisaalta 2-3 kertaa suurempi kuin talvitilanteessa. Järven olosuhteissa nitrifikaatiota voi alhaisen lämpötilan ohella rajoittaa huono happitilanne. Havaintopaikalla Kallavesi 377 happipitoisuus on pohjan lähellä ollut viime vuosina huonoimmillaankin noin 1 mg/l ja metrin syvyydessä noin 3 mg/l. Martikaisen ja Nurmiaho-Lassilan (1985) tutkimuksen kohteena olleet maaperän nitrifikaatiobakteerit pystyivät jakaantumaan lähes normaalisti, vaikka hapen määrä kaasufaasissa pieneni neljäsosaan, ja hapen määrän väheneminen 1:20-osaan pidensi generaatioaikaa vain kolmanneksella. Näin ollen happitilanteen puolesta Kallavedessä on nitrifikaatiolle varsin tasaiset olosuhteet ympäri vuoden. 14 Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6

15 Kirjallisuus Atlas, R.M Microbiology. Fundamentals and applications. New York. Focht, D.D. & Verstraete, W Biochemical ecology of nitrification and denitrification. Adv. Microb. Ecol. 1: Knowles, R. & Lean, D.R.S Nitrification: A significant cause for oxygen depletion under winter ice. Can. J. Fish. Aquat. Sci. Vol. 44: Martikainen, P.J. & Nurmiaho-Lassila, E-L Nitrospira, an important ammonium-oxidizing bacterium in fertilized coniferous forest soil. Canadian Journal of Microbiology 31(3): Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Nielsen, L.P. & Revsbech, N.P Diurnal variation of denitrification and nitrification in sediment colonized by benthic microphytes. Limnol. Oceanogr. 39 (3): Robertson, L.A. & Kuenen, J.G Physiology of nitrifying and denitrifying bacteria. Julkaisussa: Microbial production and consumption of greenhouse gases: methane, nitrogeooxides and halomethanes (Roger, J.E. & Whitman, W.P., eds.) s Torstensson, L Ammonium oxidation, a rapid method to estimate potential nitrification in soils. Julkaisussa: L. Torstensson (ed.). Soil biological variables in environmental hazard assessment. Guidelines. Uppsala. ss Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6 15

16 LIITE 1 Liite 1. Havaintopaikat 16 Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6

17 Liite 2. Ammoniumtyppipitoisuudet nitrifikaatiopotentiaalikokeissa. LIITE 2 huhtikuu aika (vrk) ymppi ,1 0, heinäkuu aika (vrk) ,92 1,19 1, , , , Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6 17

18 LIITE 3 Liite 3. Epäorgaanisen typen pitoisuudet nitrifikaatiopotentiaalikokeissa. huhtikuu aika (vrk) ymppi ,1 0, heinäkuu aika (vrk) ,92 1,19 1, , , , Pohjois-Savon ympäristökeskuksen moniste 6