Vakioitu toimintaohje KeBPr-5205 ja 5206 Pellicon Maxi -suodatuslaite

Transkriptio

1 Bioprosessitekniikan laboratorio 1/7 Vakioitu toimintaohje KeBPr-505 ja 506 Pellicon Maxi -suodatuslaite Dokumenttinro.: 1048 Versio: pvm: Laatijat: Tarkastaja: Tarkastaja: Tero Eerikäinen, Heidi Salo, Anssi Törmä 1 Käyttötarkoitus Mikrobisolumassan konsentrointi (ts. solujen erotus). Laite koostuu rungosta (Hydrios Biotechnology Oy:n) ja suodatinkasetista. Kokonaisuuteen sopiva pumppu on Hydrioksen Sine pumppu. Soluerotukseen TKK:n runko ei sovellu, koska ei ole yhteisiin sopivaa pumppua. Sen sijaan ultrasuodatukseen runko soveltuu hyvin, jolloin pumppuna voidaan käyttää Hydrioksen Watson-Marlow letkupumppua. Liitteessä 1 on esitetty hieman mikrosuodatuksen teoriaa ja perusmalleja. Vastuuhenkilö Ultrasuodatuslaitteiden KeBPr-505 ja 506 sekä Hydrios-laitteiden laitevastaava on Tero Eerikäinen. 3 Käyttöohjeet Laitteeessa on käytössä seuraavat suodattimet: 1 kpl Biomax 1000 kda ( m ) ja kpl Biomax 1000 kda (0,5 m ) membraaneja. 3.1 Laitteen kokoaminen 1) Huuhtele suodatinkasetti ja tiivistemuovikalvot vedellä ennen kokoamista. ) Aseta ensin tiivistemuovikalvo laitteeseen, sitten suodatinkasetti ja kasetin päälle tiivistemuovikalvo. Jos käytät useampia suodatinkasetteja, tulee myös kasettien väliin tiivistemuovikalvo. Tarkista, että reiät ovat kohdallaan. 3) Laita yläosa niin, että sen ja alaosan sivussa olevat kolmiot tulevat samalle sivulle (vain Hydrioksen runko). Kiinnitä mutterit kiristämällä momenttiavaimella vuorotellen ristikkäisiä muttereita vähän kerrallaan. Kiristä mutterit

2 Bioprosessitekniikan laboratorio /7 ensin momenttiin 4,3 kgm, odota 5-10 min ja kiristä uudelleen samaan momenttiin. Lopuksi kiristä mutterit momenttiin 6,3 kgm. 4) Kiinnitä T-kappaleet syöttö- ja retentaattilinjaan (väliin tiiviste ja kiristys hygieenisellä kiristimellä (sanitary clamp)). Kiinnitä samalla tavalla painemittarit T-kappaleiden sivuputkiin ja retentaattilinjaan lisäksi kuristusventtiili. Kiinnitä ensimmäiseen permeaattilinjaan venttiili ja toiseen painemittari (Hydrioksen rungossa kutistuvan T-kappaleen avulla), venttiili ja pätkä letkua. 5) Liitä suodattimen syöttölinja letkun avulla Hydrioksen Sine pumppuun. Lisää pumppuun vettä. Liitä pumpun imupuolen letku ja suodattimeen retentaattiletku. 3. Toimintakunnon tarkastaminen 1) Varaa vettä ainakin 100 l (5 C). ) Laita laitteesta lähtevät permeaatti- ja retentaattiletkut menemään viemäriin. 3) Avaa retentaatti- ja permeaattilinjat täysin auki. Käynnistä pumppu ja aseta syöttönopeudeksi noin 30% Sine pumpussa. Huuhtele kunnes noin 5 l/m on mennyt läpi. 4) Ohjaa retentaattiletku välisammioon. Kurista varovasti retentaattiventtiiliä, kunnes syöttöpaine on noin 0,35 bar (viallisessa mittarissa nro. 1 = 0,75 bar). Huuhtele noin 5 l/m. 5) Ohjaa permeaattiletku välisammioon. Mittaa NWP, kun arvot ovat stabiloituneet. Merkitse NWP-mittauksen seurantalistaan permeaattivuo vedelle (l/min), P F, P R ja veden lämpötila. Laske NWP kaavalla: NWP J H O F PF PR A P P, missä J = permeaattivuo vedelle (l/min) H O F = lämpötilan korjauskerroin (5 C F = 1,000, Taulukko1) P F = syöttöpaine (bar; 1 bar = n. 14,5 psi) P R = retentaattipaine (bar) P p = permeaattipaine (bar) (yleensä nolla) A = suodattimen kokonaispinta-ala (m ) 6) Aja laite tyhjäksi vedestä.

3 Bioprosessitekniikan laboratorio 3/7 Taulukko 1. Lämpötilan korjauskerroin F lämpötilan funktiona Lämpötilan noustessa viskositeetti μ ja korjauskerroin F pienenevät. 3.3 Aloitus ja suodatus 1) Aloita suodatus. Laita retentaatti- ja syöttöletku väkevöintiastiaan. ) Käynnistä pumppu. Sopiva syöttönopeus on noin l/min/m (Sine pumpussa 30-40%). Syöttöpaine on noin 0,8 1,5 bar (maks. 7 bar/30c) ja retentaattipaine on noin 0,...0,5 bar. V-screenillä voi ajaa jopa 33 L/min/m, mutta kestävätkö solut tämän? Jos paine-ero tuntuu liian isolta, on laiteeseen asennettava permeaattipumppu tai -venttiili. Näin toimiessa sulje aluksi permeaattiventtiili. Käynnistä kierto ja avaa varovasti permeaattiventtiiliä. Sopiva vastapaine on noin 0,1 0, bar (1,5 3,0 psi). 3) Ota ylös suodatusdataa omalle seurantalomakkeelleen. 3.4 Lopetus 1) Avaa kaikki venttiilit ja sulje pumppu hitaasti (kun pumppu on pysähtynyt venttiilit voi taas sulkea). ) Sulje permeaattiventtiili, avaa retentaattiventtiili ja huuhtele ensin lämpimällä (maks. 50 C) vedellä 10 l/min/m (Sine 0%). Ohjaa retentaatti viemäriin. Avaa permeaattiventtiili ja jatka huuhtelua. 3) Jatkaa pesua 0,1-0,5 M NaOH-liuoksella (maks. 50 C). Kierrätä noin 30 minuuttia pienellä retentaattivastapaineella. Jätä yön yli liukenemaan. 4) Sulje permeaattiventtiili ja aja NaOH-liuos laitteesta viemäriin. Valmista 10 litraa pesuliuosta, joka sisältää 00 ml Na-hypokloriittia (10% aktiivikloorin määrä, esim. Kloriitti Forte) ja 0,1 M NaOH:ia. Kierrätä liuosta suodattimessa

4 Bioprosessitekniikan laboratorio 4/7 nopeudella 0% ja pienellä retentaattivastapaineella minuuttia. Huuhtele lopuksi vedellä. 5) Mittaa NWP kuten kohdassa 3.. Jos arvo on laskenut merkittävästi edellisestä mittauksesta, pesua pitää jatkaa/tehostaa. 6) Säilytä kasetit ja välikalvot 0,1 M NaOH:ssa. ÄLÄ KOSKAAN SULJE PUMPPUA ÄKILLISESTI, JOS PERMEAATTI- VENTTIILI ON KIINNI. TÄMÄ JOHTAA SIIHEN, ETTÄ PERMEAATTI- PUOLELLA OLEVA PAINE PURKAUTUU TAKAISIN KALVOJEN LÄPI JA KALVOT HAJOAVAT! HUOMAA MYÖS ESIMERKIKSI FERMENTORIIN MENEVÄ SYÖTTÖPUTKI, TARKISTA ETTÄ SYÖTTÖPUTKEN PALLOVENTTIILI ON AUKI (KAHVA POISTETTU ETTEI JÄÄ VAHINGOSSA KIINNI, MUTTA ETTEI OLE KÄÄNTYNYT KIINNI JOSTAIN SYYSTÄ).

5 Mikrosuodatuksen teoriaa Liite 1 Mikrosuodatuksessa ehkä tärkein tekijä on permeaattivuo J. Sen yksikkönä käytetään L m - s -1 tai m s -1 (L m - s -1 = 10-3 m s -1 ). Yhdessä prosessissa tarvittavan suodatuskapasiteetin (L h -1 ) kanssa se määrää suodatuslaiteen koon. Permeaattivuota ajava voima on membraanin yli vallitseva paine-ero eli transmembraanipaine P TM. Se määritellään: PF PR PTM PP, (1) missä P F, P R ja P P ovat syötön, retentaatin ja permeaatin mittaripaineet. Tyypillisesti P P = 0. Permeaattivuon ja transmembraanipaineen välistä yhteyttä kuvaa yhtälö: P J, () R TM tot missä on viskositeetti ja R tot on kokonaisvirtausvastus. Yhtälö pätee sekä dead-end että TFF-suodatukselle (Tangential flow filtration). TFF-suodatuksessa virtausvastus koostuu membraanin vastuksesta R m, polarisaatiokerroksen vastuksesta R p, geelikerroksen vastuksesta R g sekä kiinteiden aineiden muodostaman suodatinkakun vastuksesta R c : R tot R R R R. (3) m p g c Aivan suodatuksen alussa vuo laskee nopeasti ns. polarisaatiokerroksen muodostuessa, mutta saavuttaa pian vakiotilan. Vakiotilassa polarisaatiokerroksen paksuus on sama kuin hydrodynaamisen kerroksen. Tässä kerroksessa tangentiaalinen lineaarivirtausnopeus kasvaa nollasta seinämän kohdalla bulkkivirtauksen vakioarvoon u (kuva 1a). Kuva 1. a) Konsentraatiopolarisaatio ja b) geelikerros makromolekyylien TFFsuodatuksessa (Datar ja Rosén, 1993). J = permeaattivuo (m/s), u tangentiaalivirtausnopeus (m/s), hydrodynaamisen (polarisaatio)kerroksen paksuus (m), C b = liuenneen aineen bulkkikonsentraatio (g/l), C w = liuenneen aineen konsentraatio membraanin pinnalla, C g = konsentraatio, jossa makromolekyylit geeliytyvät.

6 Mikrosuodatuksen teoriaa Liite 1 Transmembraanipainetta nostettaessa permeaattivuo ja kaavan 5 mukaan myös C w kasvavat. Kun C w = C g, permeaattivuo ei enää kasva, koska paine vain tiivistää geelikerrosta ja sen aiheuttama virtausvastus kasvaa entisestään. Sen sijaan tangentiaalivirtausnopeuden nostaminen kasvattaa aineensiirtokerrointa, mikä taas mahdollistaa suuremman maksimaalisen permeaattivuon, kun C g /C b on vakio. Kokeellisesti on havaittu että permeaattivuota J voidaan mallintaa solukonsentraation ja virtauskanavan paineen funktiona seuraavasti: J C k P 1/ 3 k k (4) 1 ln 3 CF J on permeaattivuo, L m - min -1 C on solukonsentraatio retentaattipuolella, g L -1 P CF on painehäviö virtauskanavassa (=P F -P R ), bar ovat tapauskohtaiset kerroinparametrit k i Solukonsentraatio voidaan laskea suodatuksenalkukonsentraattion ja retentaatin tilavuuden muutoksen perusteella. Kerää mittausdataa mallia varten: SUODATUSDATA Kalvo: Pvm/tekijä: t (min) V perm (L) V tot (L) P F ( ) P R ( ) PumpSpeed

7 Mikrosuodatuksen teoriaa Liite 1