POHJOISMAINEN ELINTARVIKKEIDEN METODIIKKAKOMITEA

Transkriptio

1 Nro (Finnish 2008) POHJOISAINEN ELINTARVIKKEIDEN ETODIIKKAKOITEA NORDIC COITTEE ON FOOD ANALYSIS No Aflatoksiini 1 maidossa ja maitojauheessa. äärittäminen HPLC-tekniikalla immunoaffiniteettikolonnissa tehtävän puhdistuksen jälkeen. Tämä NKL-menetelmä on validoitu kollaboratiivisissa tutkimuksissa. Aflatoxin 1 in milk and milk powder. Determination by HPLC after cleaning on an immuno affinity column. This NKL method is validated in collaborative studies. 1. TARKOITUS JA SOVELTAISALA. 1. SCOPE AND FIELD OF APPLICATION. enetelmä soveltuu aflatoksiinin 1 maidosta ja ja maitojauheesta. analysointiin The method is applicable for the determination of aflatoxin 1 in milk and milk powder. 2. PERIAATE. 2. PRINCIPLE. enetelmä perustuu aflatoksiinin 1 vasta-aineita sisältävän immunoaffiniteettikolonnin käyttöön. Näytteet puhdistuvat kun maidossa oleva aflatoksiini sitoutuu sitoutuu kolonnissa olevaan vastaaineeseen. Pylvään pesun jälkeen toksiini eluoidaan ja kvantitoidaan HPLC-tekniikalla (HPLC = suuren erotuskyvyn nestekromatografia). 3. VIITTEET Tuinstra, L. G.. Th., Roos, A. H. and Trijp, J.. P. (1993) Liquid chromatographic determination of aflatoxin 1 in milk powder using immunoaffinity columns for cleanup: Interlaboratory study. J.AOAC International 76., Dragacci, S. and Grosso, F. (2001) Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography for detection of aflatoxin 1 in liquid milk: Collaborative study. J.AOAC International 84., REAGENSSIT. Käytä pro analysi -laatua olevia reagensseja ja tislattua tai vastaavaa laatua olevaa vettä.. This method is based on the use of an immuno affinity column with antibodies against aflatoxin 1. Samples are cleaned as the aflatoxin present in the milk, is bonded to the antibodies in the column. After washing of column, the toxin is eluted and quantified with HPLC (High Performance Liquid Chromatography). 3. REFERENCES. 3.1 Tuinstra, L. G.. Th., Roos, A. H. and Trijp, J.. P. (1993) Liquid chromatographic determination of aflatoxin 1 in milk powder using immunoaffinity columns for cleanup: Interlaboratory study. J.AOAC International 76., Dragacci, S. and Grosso, F. (2001) Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography for detection of aflatoxin 1 in liquid milk: Collaborative study. J.AOAC International 84., REAGENTS. Use analytical grade reagents and distilled water or water of equivalent quality.

2 NKL-menetelmä nro 175, 2003, sivu 2 (6) NKL ethod No 175, 2003, page 2 (6) 4.1 Immunoaffiniteettikolonni, jossa aflatoksiinin 1 vasta-aineita. 4.2 Asetonitriili. 4.3 Kloroformi (voidaan korvata asetonitriilillä). 4.4 Aflatoksiinin 1 standardi. Valmista kantaliuos: 0,1 µg aflatoksiinia 1 /ml kloroformia. Kloroformin voi korvata asetonitriilillä. Kts. liite). Säilytä pakastettuna tiiviissä kierreampullissa pimeässä. ääritä tarkka pitoisuus spektrofotometrisesti. olaarinen ekstinktiokerroin n. 350 nm:ssa on asetonitriilissä ja kloroformissa. 4.1 Immunoaffinity column with antibodies against aflatoxin Acetonitrile. 4.3 Chloroform (can be replaced by acetonitrile). 4.4 Aflatoxin 1 standard. Prepare a stock solution of 0.1 µg aflatoxin 1 /ml in chloroform. The chloroform can be replaced by acetonitrile. See appendix. Store in darkness in freezer in tight screw cap vials. Determine the exact concentration of the standard spectrofotometrically. The molar extinction coefficient is in acetonitrile at about 350 nm and in chloroform. 5. LAITTEET. 5.1 Säiliöitä kertakäyttöruiskuille, tilavuus 10 ja 50 ml. 5.2 Sentrifugi, jossa mahdollisuus vähintään 1000 x g arvoon käytettäessä ml:n sentrifugiputkia. 5.3 Vesihaude, joka säädettävissä lämpötiloihin ºC och 50 ºC. 5.4 HPLC-järjestelmä. HPLC-pumppu, jossa 5 µm:n käänteisfaasikolonni (C 18 ) 250 x 4,6 mm, injektori och fluoresenssi-ilmaisin, jossa eksitaatio λ 360 nm:ssa och emissio λ 435 nm:ssa. Varmistu, että HPLC-järjestelmä pystyy detektoimaan pienimmän standardipitoisuuden (kts. 6.3). Liikkuva faasi: vesi + asetonitriili (3+1). 5.5 Vakuumijärjestelmä. Käytä imupulloa tai kaupallista säädettävää vakuumijärjestelmää, joka on suunniteltu kertakäyttöisille kiinteäfaasikolonneille. 5. APPARATUS. 5.1 Barrels, for disposable syringes with the capacity of 10 and 50 ml. 5.2 Centrifuge, capable of generating at least 1000 x g for tubes with a volume of ml. 5.3 Water-bath, adjustable for temperatures of ºC and 50 ºC. 5.4 HPLC system. HPLC pump equipped with a 5 µm reversed phase column (C 18 ) 250 x 4.6 mm, injector and a fluorescence detector with exitation at λ 360 nm and emission at λ 435 nm. Check that the HPLC system is able to detect the lowest given standard concentration in 6.3. obile phase: water + acetonitrile (3 +1). 5.5 Vacuum system. Use a suction flask or a commercial adjustable vacuum chamber intended for work with solid phase columns (once-use columns). 6. SUORITUS. 6.1 Uuttaminen Nestemäiden maidon uuttaminen. Lämmitä maito C:een. Joko suodata kylliksi maitoa Whatman nro 4 suodatinpaperin läpi tai sentrifugoi vähintään 1000 x g (jopa 4000 x g) 15 minuuttia. Ota talteen vähint. 50 ml suodosta tai supernatanttia ja jatka kohdasta PROCEDURE. 6.1 Extraction Extraction of liquid milk. Warm the milk to C, and either filter enough milk through Whatman no 4 filter, or centrifuge for 15 min at not less than 1000 x g (up to 4000 x g). Collect at least 50 ml of filtrate or supernatant, and proceed to 6.2.

3 NKL-menetelmä nro 175, 2003, sivu 3 (6) NKL ethod No 175, 2003, page 3 (6) aitojauheen uuttaminen. Punnitse 10 ± 0,1 g maitojauhetta 250 ml:n dekanterilasiin. Lisää pienin erin maitojauheeseen 50 ml lämmintä (50 ºC) vettä samalla jatkuvasti lasisauvalla sekoittaen tavoitteena homogeeninen seos. Anna seoksen jäähtyä 20 ºC:een ja siirrä se kvantitatiivisesti 100 ml:n mittapulloon. Huuhdo dekanterilasi pienin erin vettä ja lisää erät mittapulloon. Lisää liuokseen vettä 100 ml:n merkkiin ja sekoita ylösalaisin käännellen kunnes seos on homogeeninen. Suodata tai sentrifugoi seos kohdan mukaan ja jatka kohtaan Extraction of milk powder. Weigh 10 ± 0.1 g milk powder into a 250 ml beaker. Add in small portions, 50 ml of warm (50 ºC) water to the milk powder while continuously stirring with a glass rod to get a homogeneous mixture. Let the mixture cool to 20 ºC, and transfer it quantitatively into a 100 ml volumetric flask. Use small volumes of water to rinse the beaker, and add to the volumetric flask. Add water to the milk powder solution up to the 100 ml mark, and mix by turning the flask upside down until the solution is homogenous. Filter or centrifuge the milk powder sample as described in step and proceed to Puhdistaminen immunokolonnissa. Liitä 50 ml:n kertakäyttöruiskun säiliö immunoaffiniteettinkolonin päähän ja yhdistä vakuumijärjestelmään. Pipetoi 50 ml kohdasta 6.1 saatua näytettä immunoaffiniteettikolonnin ruiskusäiliöön. Anna näytteen kulkeutua kolonnin läpi tasaisella virtausnopeudella 2-3 ml/min. Vaihda 50 ml:n säiliö puhtaaseen 10 ml:n säiliöön. Pese 10 ml:lla vettä em. virtausnopeudella. Kuivaa kolonni hyvin käyttäen vakuumia. Poista 10 ml:n säiliö. Eluoi aflatoksiini 1 hitaasti pieneen putkeen käyttäen 4 ml asetonitriiliä. Anna asetonitriilin pysyä kontaktissa kolonnin kanssa vähintään 2 minuuttia. Haihduta varovasti kuivaksi typpivirrassa käyttäen vesihaudetta ºC:ssa. Liuota näyte 1000 µl:aan liikkuvaa faasia. 6.3 Kromatografointi. Säädä liikkuvan faasin virtausnopeukseksi 1,0 ml/min. Aseta fluoresenssi-ilmaisimen aallonpituus eksitaatiolle λ 360 nm:iin ja emissiolle λ 435 nm:iin. Laadi standardikuvaaja injisoimalla 25 µl ainakin neljää eri standardipitoisuutta alueelta 0,25-25 ng aflatoksiinia 1 /ml liikkuvaa faasia, mikä vastaa ng/l maitoa. Laadi kuvaaja piikkialojen tai piikkikorkeuksien suhteesta standardipitoisuuksiin. Huom! Jos on tarpeen, niin säädä asetonitriilin ja veden määräsuhdetta taataksesi aflatoksiinin 1 parhaan erottumisen häiritsevistä komponenteista. Analysoi näyteuutteet injisoimalla 25 µl näytettä samoissa olosuhteissa kuin standardit. Vertaa näytteen aflatoksiinipitoisuutta standardikuvaajaan. 6.2 Cleaning up on immuno column. Attach the barrel of a 50 ml disposable syringe to the top of an immuno affinity column, and connect to the vacuum system. Pipette 50 ml of sample from 6.1 into the syringe barrel on the immuno affinity column. Let the sample pass through the column at a slow steady flow rate of 2-3 ml/min. Replace the 50 ml barrel with a clean one of 10 ml. Wash with 10 ml water at the same flow rate as above. Dry the column completely with the suction apparatus. Disconnect the 10 ml barrel, and elute the aflatoxin 1 slowly into a small tube with 4 ml of acetonitril. Let the acetonitrile stay in contact with the column for at least 2 minutes. Evaporate gently to dryness under nitrogen and o C water-bath. Dissolve the sample in 1000 µl of mobile phase. 6.3 Chromatography. Adjust the flow rate of the mobile phase to 1.0 ml /min, and set the wavelengths on the fluorescence detector to λ 360 nm for excitation and λ 435 nm for emission. Prepare a standard curve by injecting 25 µl of at least four standard concentrations in the range of ng aflatoxin 1 /ml in mobile phase, corresponding to ng/l milk. Plot the peak area or peak height versus the standard concentrations. Note: If necessary, adjust the acetonitril to water ratio to ensure optimal separation of aflatoxin 1 from interfering components. Analyse sample extracts by injecting 25 µl of sample under the same conditions as for the standards. Compare the content of aflatoxin in the sample to the standard curve.

4 NKL-menetelmä nro 175, 2003, sivu 4 (6) NKL ethod No 175, 2003, page 4 (6) 7. LASKUTOIITUKSET. 7.1 Nestemäinen maito Laske aflatoksiinin 1 pitoisuus nestemäisessä maidossa seuraavasti: a = ng/l aflatoksiinia 1 7. CALCULATIONS. 7.1 Liquid milk. Calculate the aflatoxin 1 content using this formula: a = ng/l aflatoxin aitojauhe. Laske aflatoksiinin 1 pitoisuus maitojauheessa seuraavasti: jolloin a a = ng/kg aflatoksiinia 1 = Aflatoksiinin 1 pitoisuus näytteessä (ng/ml) standardikuvaajalta. V ext = Näytteen tilavuus (1,0 ml). = Nestemäisen maidon tilavuus (0,050 l) tai maitojauheen määrä (0,005 kg), joka ajettu kolonnin läpi. 7.2 ilk powder. Calculate the aflatoxin 1 content using this formula: Where a a = ng/kg aflatoxin 1 = Concentration of aflatoxin 1 in the sample (in ng/ml) from the standard curve. V ext = The sample volume (1.0 ml). = Volume of liquid milk (0.050 l) or mass of milk powder (0.005 kg) which has passed through the column. 8. TURVAOHJEITA. Kuvatussa menetelmässä käytetään aflatoksiinin 1 liuoksia ja kloroformia. Aflatoksiini 1 on ihmisille syöpää aiheuttava ja kloroformin epäillään olevan syöpää aiheuttava liuotin. Analyysilaboratorio suojataan riittävästi suoralta auringonvalolta. Pidä aflatoksiinin 1 standardiliuokset valolta suojassa. Hapolla pesemättömät lasiastiat aflatoksiiniliuosten säilytykseen saattavat aiheuttaa aflatoksiinin häviämistä. Uudet lasitavarat, jotka tulevat kosketukseen aflatoksiinin kanssa liotetaan laimeassa hapossa useita tunteja, jonka jälkeen astiat huuhdotaan tislatulla vedellä vapaaksi haposta. Tee laboratoriojäte myrkyttömäksi esim. pitämällä sitä 5% natriumhypokloriittiliuoksessa (NaOCl) useita tunteja. Pese sitten laimealla hapolla ja huuhdo lopuksi vedellä vapaaksi haposta. 8. SAFETY PRECAUTIONS. The method described requires the use of aflatoxin 1 solutions and chloroform. Aflatoxin 1 is carcinogenic to human subjects, and chloroform is suspected to be a carcinogenic solvent. Adequately protect from direct daylight the laboratory where the analyses are performed, and keep the aflatoxin 1 standard solutions protected from light. The use of non-acid-washed glassware for aflatoxin solutions may cause loss of aflatoxins. oreover, brand new laboratory glassware coming into contact with solutions of aflatoxin, should be soaked in diluted acid for several hours, then rinsed well with distilled water to remove all traces of acid. Decontaminate laboratory waste by for example soaking in 5% sodium hypochlorite (NaOCl) for several hours, then washing with diluted acid, and finally rinsing well with water to remove all traces of acid.

5 NKL-menetelmä nro 175, 2003, sivu 5 (6) NKL ethod No 175, 2003, page 5 (6) 9. ENETELÄN LUOTETTAVUUS. enetelmä on kollaboratiivisesti tutkittu maitojauheella pitoisuusalueella ng aflatoksiinia 1 /kg. Tutkimuksen teki International Dairy Federation (IDF) (Tuinstra et al.) (kts. 3.1). Tutkitulla pitoisuusalueella RSD R vaihteli välillä 11 ja 23 %. enetelmä on kollaboratiivisesti tutkittu myös nestemäiselle maidolle pitoisuusalueella ng/l. Tutkimus tehtiin European S&T -projektissa (Dragacci et al.) (kts. 3.2). Tutkitulla pitoisuusalueella RSD R vaihteli välillä 21-31%. Kun näytteisiin lisättiin aflatoksiinia 1 tasolla 50 ng/l todettiin, että RSD r vaihteli välillä 8-18% keskimääräisen saannon ollessa 74%. 9. RELIABILITY OF THE ETHOD. This method has been collaborative tested on milk powder in the range of ng aflatoxin 1 /kg by the International Dairy Federation (IDF) (Tuinstra et al.) (see 3.1). RSD R was found to vary between 11-23% in the tested range. The method has also been collaborative tested on liquid milk in the range of ng/l in a European S&T project (Dragacci et al.) (see 3.2). RSD R varied between 21-31% in the tested range. In spiked samples at the 50 ng/l level, the RSD r values ranged from 8 to 18%, and the average recovery was 74%. 10. ENETELÄN REFERENTTI. Tord öller, Statens Livsmedelsverk, Uppsala, Ruotsi, on laatinut tämän NKL-menetelmän. 10. REFEREE OF THE ETHOD. Tord öller at the National Food Administration of Sweden has elaborated this NKL method. NKL - Nordic Committee on Food Analysis

6 Liite NKL-menetelmään nro 175, 2003 Appendix NKL ethod No 175, 2003 Vertailu: Aflatoksiinin 1 kantaliuokset kloroformissa ja asetonitriilissä. Comparison of aflatoxin 1 stock solutions in chloroform and acetonitrile. Lambert K. Sørensen and Helga Hansen, Steins Laboratorium, Denmark. Steins Laboratorium AS on tutkinut asetonitriilin käyttöä kloroformin sijasta, koska kloroformi on otsonia hajottava aine. Valmistettiin ko. liuottimista kantaliuokset sisältäen 0,1 μg/ml aflatoksiinia 1 ja niitä säilytettiin 4-6 ºC:ssa. olemmista kantaliuoksista valmistettiin standardiliuokset 10% asetonitriiliin pitoisuudessa 0,005 μg/ml. Ne analysoitiin HPLCtekniikalla käyttäen fluoresenssi-ilmaisinta (ex 365 nm, em 435 nm). Kolonni: NovaPak C 18, 3,9 x 150 mm. Liikkuva faasi: 25% asetonitriili. Analyysitulokset kantaliuoksista valmistetuista uusista standardiliuoksista, joita varastoitiin 26 viikkoa esitetään seuraavassa taulukossa. Kantaliuosten laimennostekijät (v/v) olivat koeaikana vakioiset. As chloroform is considered as ozone depleting, Steins Laboratorium AS examined the possibilities for substituting this agent with acetonitrile. Stock solutions containing 0.1 μg/ml Aflatoxin 1 were prepared and stored at 4-6 ºC μg/ml standard solutions in 10% acetonitrile were prepared from both of the stock solutions. These were analysed by HPLC with fluorescence detection (ex 365 nm, em 435 nm). Column: NovaPak C 18, 3.9 x 150 mm. obile phase: 25% acetonitrile. The results obtained on new prepared standard solutions from the stock solutions, stored for up to 26 weeks, are listed in the following table. The v/v dilution factors of stock solutions were constant during the test period. Week Peak area of standard solution in Relative difference in Acetonitrile Chloroform Peak area (%) ean SD RSD (%)