Heraproteiinit lääkevalmistuksen kalvomateriaalina

Heraproteiinit lääkevalmistuksen kalvomateriaalina Seminaaritiivistelmä Jussi Soininen Helsingin yliopisto Farmasian tiedekunta Farmasian teknologian osasto Maaliskuu 2007

1 1 JOHDANTO Heraproteiinit ovat meijeriteollisuuden sivutuotteita, jotka huolimatta monipuolisista ominaisuuksistaan ja ravintoarvostaan päätyvät huomattavalta osaltaan eläinten rehuksi. Viime vuosina onkin alettu etsiä heraproteiineille käyttösovelluksia, esimerkkinä VTT:n Bio- ja elintarviketekniikan ja MTT:n Elintarvikkeiden tutkimuslaitoksen Aktiiviset syötävät päällysteet- hanke (Myllärinen ym. 1997). Heraproteiinikalvojen tutkimus on tapahtunut pääasiassa elintarviketutkimuksen parissa osana ns. syötävien kalvojen tutkimusta. Syötävien kalvojen avulla on tarkoitus parantaa elintarvikkeiden laatua, pidentää käyttöaikaa sekä edistää taloudellista kannattavuutta (Kester ja Fennema 1986). Niiden avulla voidaan vähentää synteettisten pakkausmateriaalien käyttöä ja pakkausjätteiden syntymistä, samalla voidaan edistää biologisesti hajoavien pakkausmateriaalien käyttöönottoa (Krochta ja De Mulder- Johnston 1997). Proteiinirakenteisten lääkeaineiden kehitystyön edetessä lisääntyy tarve kehittää näihin yhteensopivia päällysmateriaaleja. Heraproteiinin etuihin voidaan lukea vesiliukoisuus, heraproteiinikonsentraatin hyvä saatavuus ja edullinen hinta, sekä mahdollisuus säädellä valmiin kalvon vesiliukoisuutta denaturoimalla proteiineja kuumennuksen avulla. Erikoistyön tarkoituksena oli tutkia uusien pehmitevalintojen vaikutusta heraproteiinikalvojen ominaisuuksiin valaen valmistettuja vapaita kalvoja käyttäen. Vapaat kalvot ovat hyvä tutkimuskohde, kun halutaan tutkia kalvojen ominaisuuksia itsessään (Kanig ja Goodman 1962). Vapaita kalvoja käyttäen voidaan kalvon ominaisuuksiin vaikuttavia tekijöitä vapaammin yksilöidä ja muunnella, kun ei olla tekemisissä reaalisen lääkevalmistepäällystyksen kanssa. Tutkittuja kalvoja valmistettiin sekä kuumennetusta, että kuumentamattomasta heraproteiiniliuoksesta. Kaikkien kalvokoostumusten mekaanisia ominaisuuksia tutkittiin. Lisäksi kalvojen vesihöyryn läpäisevyyttä tullaan tutkimaan eräiden

2 koostumusten osalta. Aiempaa tutkimustietoa heraproteiinikonsentraatin, ja varsinkin kuumentamattoman heraproteiinikonsentraatin käytöstä kalvojen valmistukseen on vähän. 2 MAIDON KOOSTUMUS Eri nisäkäslajien poikaset syntyvät eri kehitysvaiheissa ja erilaisiin olosuhteisiin (Fox ja McSweeney 1998). Näin ollen maidon sisältöön kohdistuvat ravitsemukselliset ja fysiologiset vaatimukset poikkeavat eri nisäkäslajien välillä toisistaan. Eri nisäkäslajien maidot eroavatkin koostumukseltaan toisistaan (taulukko 1). Erot ovat erityisen suuria maidon proteiinipitoisuudessa, joka voi vaihdella 1-24 %:n välillä. Eroja on myös eri proteiinityyppien suhteessa. Taulukko 1. Maidon koostumus eräillä nisäkäslajeilla (Fox ja McSweeney 1998, Hambling ym. 1992). Laji Kiinteitä aineita yhteensä (%) Rasvoja (%) Laktoosia (%) Proteiineja (%) Kaseiineja (%) Heraproteiineja (%) -laktoglobuliinia (mg/ml) Ihminen 12,2 3,8 7,0 1,0 0,4 0,6 0 Lehmä 12,7 3,7 4,8 3,4 2,8 0,6 1,8-5,0 Lammas 19,3 7,4 4,8 5,5 4,6 0,9 2,8 Vuohi 12,3 4,5 4,1 2,9 2,5 0,4 1,4 Sika 18,8 6,8 5,5 4,8 2,8 2,0 0,6 Hiiri 9,0 7,0 2,0 0 Kun rasva erotetaan raakamaidosta, saadaan tulokseksi rasvakomponentti sekä maitoplasma, joka sisältää veden lisäksi pääasiassa proteiineja sekä laktoosia (Walstra ja Jenness 1984). Rasvaton maito poikkeaa maitoplasmasta siten, että se sisältää vielä hieman rasvaa. Erottamalla kaseiinit maitoplasmasta saadaan maitoseerumia. Maitoseerumi ja hera ovat lähes sama asia, käytännössä hera sisältää kuitenkin vielä jonkin verran kaseiineista lohjenneita polypeptideja.

3 2.1. Heraproteiinit Lehmänmaidon proteiineista heraproteiineja on 19,3 % (Walstra ja Jenness 1984). Heraproteiinit ovat proteiineja, jotka jäävät liuenneeseen muotoon, kun maidon ph lasketaan kaseiinien isoelektriseen ph-arvoon 4,6 ja kaseiinit saostuvat (Fox ja McSweeney 1998). Hera on laimea vesiliuos, litra heraa sisältää noin 65 g kiinteitä aineita (Marshall 1982). Kiinteästä aineesta laktoosia on 70-80 % ja proteiineja noin 9 %. Heraproteiineja voidaan myös nimittää seerumiproteiineiksi tai ajatella maidon typpeä sisältäviksi ryhmiksi, kaseiini pois lukien. Lehmänmaidosta saatu hera sisältää 4-7 g/l proteiineja (Marshall 1982). Heraproteiinit ovat ryhmä globulaarisia proteiineja, joista -laktoglobuliini ja -laktalbumiini syntetisoituvat lehmän maitorauhasissa, immunoglobuliinit ja naudan seerumin albumiini taas ovat peräisin eläimen verestä (De Wit 1989). Taulukko 2 sisältää lehmänmaidon keskeiset heraproteiinit. Taulukko 2. Lehmänmaidon tärkeimmät heraproteiinit (Marshall 1982) Arvioitu osuus raakamaidon proteiineista (%) Arvioitu pitoisuus herassa (g/l) Osuus kaikesta heraproteiinista (%) Isoelektrinen piste (ph) Arvioitu molekyylipaino (Da) -laktoglobuliini 7-12 3,0 50 5,35-5,49 18 300 -laktalbumiini 2-5 0,7 12 4,2-4,5 14 000 Immunoglobuliinit 1,9-3,3 0,6 10 5,5-8,3 15 000-1 000 000 Naudan seerumin albumiini 0,7-1,3 0,3 5 5,13 69 000 Proteoosi-peptoni ym. * 2-6 1,4 23 4 100-40 800 Heraproteiinit yhteensä 15-22 6,0 100 * Sisältää proteoosi-peptoni-komponentin lisäksi jäännöksiä kaseiineista sekä joukon muita pieninä pitoisuuksina esiintyviä proteiineja.

4 Hera sisältää, veden lisäksi, vielä runsaasti laktoosia sekä mm. liuenneita suoloja (Fox ja McSweeney 1998). Keskeinen menetelmä laktoosin poistamiseksi on ultrasuodatus. Sen avulla poistuu osa laktoosista ja saadaan tuotettua heraproteiinikonsentraattia, joka sisältää 30-80 % proteiinia. Käyttämällä ioninvaihtokromatografiaa yhdessä ultrasuodatuksen kanssa saadaan poistettua laktoosia sekä mineraaleja, tuloksena on heraproteiini-isolaattia, jonka proteiinipitoisuus on noin 95 %. 2.2. -laktoglobuliini -laktoglobuliini on tärkein heraproteiini, noin 50 % heraproteiinista ja 12 % kaikesta lehmänmaidon proteiinista on -laktoglobuliinia (Fox ja McSweeney 1998). Muilla tärkeimmillä heraproteiineilla on tunnettu biologinen funktio, mutta -laktoglobuliinin biologisesta funktiosta ei ole päästy yksimielisyyteen. Palmer eristi -laktoglobuliinin lehmänmaidosta jo 1934 (Palmer 1934). -laktoglobuliini olikin ensimmäisten kiteytettyjen proteiinien joukossa, ja sen rakenne tunnetaan nykyisin hyvin (Fox ja McSweeney 1998). -laktoglobuliinimonomeerin primäärirakenne käsittää 162 aminohapon muodostaman peptidiketjun. Noin 15 % -laktoglobuliinin sekundäärirakenteesta muodostuu -heliksistä, 50 % - levystä, 15-20 % -käännöksistä ja loput järjestymättömästä osasta (Creamer ym. 1983). -laktoglobuliini on tertiäärirakenteeltaan globulaarinen, pallomainen molekyyli, jonka halkaisija on noin 3,6 nm (Fox ja McSweeney 1998). -laktoglobuliinin tertiäärirakenne on selvitetty röntgenkristallografiaa käyttäen (kuva 1), ja sen on havaittu muistuttavan retinolia sitovan proteiinin rakennetta (Papiz ym. 1986). Rakenteessa -laktoglobuliinin yhdeksästä -levyjaksosta kahdeksan muodostaa molekyylin sisäosaan hydrofobisen onkalomaisen -tynnyrin. -laktoglobuliini muodostaa neutraalissa ph:ssa dimeerejä (Creamer ym. 2004). Kuumennettaessa -laktoglobuliinia sen dimeeri jakautuu kahdeksi monomeeriksi. Kukin monomeeri sisältää viisi kysteiiniä, joista neljä muodostaa rikkisillan välityksellä kaksi kystiiniä ja yksi (Kys 121) jää vapaaksi kysteiiniksi. Kuumennus aiheuttaa sarjan muutoksia, joiden seurauksena Kys 160 jää vapaaksi, reaktiiviseksi kysteiiniksi ja

5 valmiiksi muodostamaan kovalenttisia rikkisiltoja muiden proteiinimolekyylien vapaiden kysteiiniryhmien kanssa. Kuva 1. Lehmänmaidon -laktoglobuliinin tertiäärirakenne (Papiz ym. 1986). Kuvaan on piirretty myös retinolimolekyyli sitoutumispaikkaansa. 3 KALVOJEN MUODOSTUMINEN Liuottimen haihtuessa ja liuoksen viskositeetin kasvaessa kalvoa muodostavat molekyylit joutuvat lähemmäksi toisiaan. Jotta kalvo muodostuisi, tarvitaan kalvonmuodostaja, jonka rakenneosien kesken vallitsee riittävän suuri koheesio (Banker 1966). Kalvonmuodostajan sisäisen vetovoiman määrä vaikuttaa keskeisesti syntyvän kalvon ominaisuuksiin. Lisäksi kalvonmuodostajamolekyylien ja molekyylikerrosten on sulauduttava diffuusion välityksellä yhtenäiseksi kalvoksi. Kalvonmuodostajan koheesioon voidaan vaikuttaa esimerkiksi muuntelemalla kalvonmuodostajaliuoksen tai dispersion pitoisuutta tai kalvon paksuutta. Kalvonmuodostumisen aikana vallitsevat olosuhteet, kuten lämpötila, paine ja kalvonmuodostumiseen käytetty aika vaikuttavat taas kalvonmuodostaja-molekyylien diffuusioon. Vapaita kalvoja voi valmistaa valamalla tai sumuttamalla (Allen ym. 1972). Sumuttamismenetelmällä valmistettu vapaa kalvo poikkeaa jossain määrin ominaisuuksiltaan valetusta kalvosta, myös menetelmien asettamat vaatimukset kalvon muodostajille poikkeavat hieman toisistaan. Sumuttaminen asettaa suuremmat vaatimukset kalvonmuodostajan koheesiolle, kun kalvo muodostuu erillisten pisaroiden

6 yhteen liittymisen seurauksena. Valettu kalvo vaatii puolestaan pitkähkön kuivumisajan. Liuottimen haihtuessa vähitellen saattaa osa aineksesta saostua, ja ainesosat voivat erottua. Seurauksena saattaa olla kalvo, jossa on toisistaan poikkeavia kerrostumia. 4 PEHMITTIMET Pehmittimiä lisätään kalvoformulaatioihin monista syistä (Banker 1966). Niillä voidaan vähentää kalvojen haurautta ja lisätä joustavuutta, sitkeyttä, vahvuutta ja iskunkestävyyttä. Pehmitteet ovat haihtumattomia ja niiden kiehumispiste on korkea. On tärkeää, että pehmite pysyy osana formulaatiota eroamatta siitä missään kalvonmuodostumisprosessin vaiheessa. Pehmittimen toimintamekanismina on kalvonmuodostajamolekyylien välisten koheesiovoimien vähentäminen. Proteiinipohjaisissa kalvoissa pehmite vähentää aminohappoketjujen välisten vetysidosten aikaan saamaa molekyylien välistä vetovoimaa (Sothornvit ja Krochta 2001). Myös kalvoon jäävä vesi toimii pehmitteenä, kun kalvoja valmistetaan vesiliuoksesta. Niinpä eräs varsinaisen pehmitteen tärkeimmistä ominaisuuksista on sen kyky sitoa vettä itseensä liuottimena toimivan veden haihtuessa. Pehmittimen lisääminen vähentää tavallisesti kalvon vetolujuutta ja alentaa lasisiirtymälämpötilaa (Banker 1966). Pehmitteen on luonnollisesti oltava kalvokoostumukseen yhteensopiva ja rakenteeltaan pysyvä. Usein tietylle kalvonmuodostajalle sopiva pehmite muistuttaa rakenteeltaan käytettyä kalvonmuodostajaa. Esimerkiksi vesiliukoisten kalvonmuodostajien kanssa sopivat yhteen hydroksyyliryhmiä sisältävät pehmitteet, kuten glyseroli. 5 SYÖTÄVÄT KALVOT Syötävien kalvojen materiaaleiksi on testattu mm. polysakkarideja, proteiineja, lipidejä sekä näiden yhdistelmiä (Kester ja Fennema 1986). Kalvoja muodostavina proteiineina on tutkittu mm. kollageenia, gelatiinia, kaseiinia, vehnän gluteenia, maissin zeinproteiinia, soijaproteiinia ja heraproteiinia (Krochta ja De Mulder-Johnston 1997). Laajamittaisessa kaupallisessa käytössä ovat näistä olleet kollageeni, gelatiini ja zein. Zein-proteiinia on käytetty myös lääketeollisuudessa kapselikuorien materiaalina.

7 Proteiinipohjaisille kalvoille on ominaista suuri vesihöyryn läpäisevyys ja pieni hapen läpäisevyys (Krochta ja De Mulder-Johnston 1997). Proteiinikalvojen vesihöyryn läpäisevyyttä on yritetty vähentää lisäämällä kalvoformulaatioon lipofiilisiä aineita, kuten rasvahappoja tai vahoja. Lipofiilinen kerros voidaan vaihtoehtoisesti lisätä valmiin hydrofiilisen kalvon päälle (Kester ja Fennema 1986). Suhteellisella ilman kosteudella on suuri vaikutus sekä polysakkaridi- että proteiinikalvojen ominaisuuksiin. Lipidejä on käytetty vuosisatojen ajan elintarvikkeiden päällystämiseen (Kester ja Fennema 1986). Esimerkkejä ovat vahat, joita on käytetty hedelmien päällystämiseen, sekä suklaa, jolla on päällystetty leipomotuotteita. Muita päällystämiseen käytettyjä lipidejä ovat esimerkiksi asetyloidut monoglyseridit sekä pinta-aktiiviset aineet, kuten glyserolimonostearaatti. Lipidit ovat ei-polaarisia aineita, ja niiden pääasiallinen käyttötarkoitus on ollut valmisteiden kuivumisen estäminen, tosin vahakerros hedelmien päällä suojaa niiden pintaa myös mekaanisilta vaurioilta. 6 HERAPROTEIINIKALVOJEN OMINAISUUKSIA Proteiinirakenteisten kalvojen ominaisuudet perustuvat proteiinien väliselle vuorovaikutukselle (Perez-Gago ja Krochta 2002). -laktoglobuliinit, heraproteiinien pääkomponentit, ovat globulaarisia proteiineja, joiden tioliryhmät ja hydrofobiset alueet ovat enimmäkseen molekyylin sisäosissa. Kuumentaminen muokkaa heraproteiinien kolmiulotteista rakennetta tuoden nämä ryhmät esiin. Lisäksi kuumentaminen avaa molekyylin sisäisiä disulfidisidoksia (Shimada ja Cheftel 1989). Näin heraproteiinien kuumentaminen mahdollistaa uusien, molekyylien välisten rikkisiltojen muodostumisen ja proteiinin polymerisoitumisen. McHugh ryhmineen tutki lämmityksen, ph:n, pehmitteen sekä heraproteiini-isolaatin pitoisuuden vaikutuksia heraproteiinikalvojen vesihöyryn läpäisevyyteen (McHugh ym. 1994). Kalvon muodostuminen onnistui, kun heraproteiini-isolaatin pitoisuus vesiliuoksessa oli 8-12 % (m/m). Optimaalisiksi olosuhteiksi saatiin 10 %:n pitoisuus, neutraali ph ja kuumennus +90 C lämpötilaan 30 minuutin ajaksi. Sorbitolilla pehmitettyjen kalvojen vesihöyryn läpäisevyys oli vähäisintä.

8 Myös kuumentamattomasta proteiinista valmistettujen heraproteiini-isolaattikalvojen ominaisuuksia on tutkittu (Perez-Gago ym.). Kuumentamattomasta proteiiniliuoksesta valmistettujen kalvojen vetolujuus ja venyvyys olivat pienempiä kuin kuumennetusta liuoksesta valmistettujen kalvojen, vesihöyryn läpäisevyydessä sen sijaan ei ollut eroa. Kuumennetusta liuoksesta valmistetut kalvot olivat veteen liukenemattomia, kuumentamattomat liukenivat veteen täysin. Liuoksen ph:lla ei ollut merkitystä tutkittujen kalvojen liukoisuuteen, mekaaniseen lujuuteen tai vesihöyryn läpäisevyyteen. Liuosten pitoisuudeksi valittiin vain 5 % (m/m), koska suurempina pitoisuuksina heraproteiiniliuos geeliytyy helposti, kun haluttiin tutkia kalvon muodostumista myös alhaisessa (4-5) ph:ssa. Kovalenttiset rikkisidokset ja hydrofobiset vuorovaikutukset selittävät kuumennettujen kalvojen suuremman lujuuden, kuumentamattomien kalvojen koheesiosta vastaavat pääasiassa vetysidokset. Tutkittaessa kalvon muodostumista heraproteiinikonsentraatilla huomattiin, että proteiinin vesiliuoksen ph:ta oli säädettävä ennen liuoksen kuumentamista, jottei proteiinin saostumista kuumennuksen aikana tapahtuisi (Banerjee ja Chen 1995). Proteiiniliuoksen ph:n säätö arvoon 6,6 ja kuumennus +75 C lämpötilaan 30 minuutin ajaksi varmisti yhtenäisen kalvorakenteen muodostumisen. Liuoksen proteiinipitoisuus oli 10 %, pehmitteenä käytettiin glyserolia, jota oli 50 % proteiinin määrästä. Heraproteiinikonsentraatista valmistettujen kalvojen vesihöyrynläpäisevyys oli vähäisempää kuin heraproteiini-isolaatista valmistettujen kalvojen, vetolujuusarvot olivat korkeampia isolaattikalvoilla. Käytetyn heraproteiinikonsentraatin proteiinipitoisuus oli 76,6 %, mukana ollut rasva (6,8 %) lienee tehnyt kalvoista hydrofobisempia ja parempia esteitä vesihöyrylle. 7 PEHMITTIMEN VALINTA JA ESIKOKEET Glyseroli valittiin ensimmäiseksi testattavaksi pehmitteeksi, koska se on paljon käytetty ja hyväksi havaittu pehmite heraproteiinikalvoja valmistettaessa (Sothornvit ja Krochta 2001). Esikokeiden perusteella myös hunajaa voitiin käyttää heraproteiinikalvojen pehmitteenä. Akaasiahunaja on juoksevaa hunajaa, ja väriltään vaaleaa. Se sisältää monosakkarideja noin 73 %, disakkarideja noin 10 %, trisakkarideja noin 3 % ja vettä

9 noin 16 % (Krauze ja Zalewski 1991). Sen monosakkaridit ovat fruktoosi ja glukoosi, joita on suhteessa 1,67/1 (Cotte ym. 2003). Poikkeuksellisen suuri fruktoosin osuus antaa akaasiahunajalle sen juoksevan ominaisuuden..kolmanneksi pehmitteeksi valittiinkin fruktoosin ja glukoosin yhdistelmä, ja näiden suhde säilytettiin samana kuin se on akaasiahunajassa. Tästä pehmitevaihtoehdosta käytetään tässä nimeä monosakkaridit. Tavoitteena oli verrata monimutkaisen luonnonaineen ja puhdasaineyhdistelmän pehmitevaikutusta. Sakkaroosin on havaittu olevan melko hyvä pehmite -laktoglobuliinikalvoille (Sothornvit ja Krochta 2001). Sakkaroosihan koostuu juuri glukoosi- ja fruktoosiyksiköstä. Käytetyt pehmitemäärät valittiin esikokeiden perusteella. Kuumentamattomat kalvot sisälsivät 60, 80 ja 100 % (m/m) pehmitettä suhteessa proteiinin määrään. Kuumennetut kalvot sisälsivät 60, 80, 100 ja 120 % (m/m) pehmitettä. Tätä pienemmillä pehmitemäärillä kalvot olivat liian hauraita, ja suuremmilla pehmitemäärillä liian pehmeitä tutkittaviksi. 8 KÄYTETYT MATERIAALIT JA MENETELMÄT 8.1 Käytetyt materiaalit Tutkittuna heraproteiinina käytettiin ultrasuodatettua Heracles heraproteiinikonsentraattia (Juusto Kaira, Kuusamo). Konsentraatti sisälsi 77 % heraproteiinia. Tutkittuja pehmitteitä olivat glyseroli (Ph. Eur.), akaasiahunaja (Hunajainen SAM Oy, Söderkulla), fruktoosi (Ph. Eur.) ja glukoosi (Ph. Eur.). Liuottimena käytettiin puhdistettua vettä. 8.2 Kalvojen paksuuden mittaaminen Kalvojen kuivuttua niistä leikattiin tutkittavat näytepalat ja näytteiden paksuudet mitattiin mikrometrillä (Sony Digital Indicator U30-F, Japani). Kalvon paksuus määritettiin viiden mittauksen keskiarvona, mittauspisteenä oli viisi satunnaista pistettä siltä kalvon alueelta, jolta tutkimus suoritettaisiin. 8.3 Kalvojen mekaanisen kestävyyden tutkimus Kalvojen mekaanisen kestävyyden tutkimista varten kalvoista leikattiin 15 x 100 mm näytteet. Aiemmin määritettyä kalvon paksuuden keskiarvoa käytettiin kalvon

10 poikkipinta-alaa laskettaessa ja edelleen kalvon vetolujuuden määrityksessä. Rinnakkaisia kokeita tehtiin 5 6. Kalvot tutkittiin Lloyd LRX materiaalinkoestus-laitteella (Lloyd Instruments Ltd, Englanti). Kalvojen testialue oli 15 x 40 mm ja venytysnopeus 10 mm/mm. Kennona käytettiin 100 N:n kennoa. Kalvoja venytettiin, kunnes ne katkesivat. Tutkituista kalvoista määritettiin kalvojen vetolujuus sekä venyvyys. 9 KALVOJEN VALMISTUS Kaikki tutkitut kalvot valmistettiin proteiinikonsentraatin 10 % (m/m) vesiliuoksesta. Kuumentamattomat kalvot valmistettiin lisäämällä proteiinin joukkoon huoneenlämpöinen vesi pienissä erissä hyvin sekoittaen. Tähän proteiinin vesiliuokseen lisättiin pehmite. Sekoituksen jälkeen kalvot valettiin pipetoimalla 10,0 g liuosta kutakin kalvoa varten teflonmuottiin. Valmistettaessa kuumennettuja kalvoja liuotettiin aluksi proteiini veteen kuten edellä. Sitten liuoksen ph säädettiin 2 M NaOH:n avulla 6,6:een ennen kuumennusta. Kuumennus suoritettiin kattilassa vesihauteessa. Liuoksen lämpötilaa tarkkailtiin, ja sen tuli pysyä +80 C:ssa 20 minuutin ajan. Liuokset jäähdytettiin huoneenlämmössä, välillä sekoittaen. Pehmite lisättiin jäähtyneeseen liuokseen ja kalvot valettiin samaan tapaan kuin kuumentamattomat. Kalvot saivat kuivua 2 vuorokautta huoneenlämmössä. Poikkeuksen muodostivat akaasiahunajalla pehmitetyt kalvot, jotka vaativat 3 vuorokauden kuivumisajan. 10 TULOKSET JA YHTEENVETO TULOKSISTA 10.1 Kuumentamattomasta proteiinista valmistetut kalvot Kuvasta 2 nähdään, kuinka heraproteiinikalvojen vetolujuus laskee, kun pehmitemäärä kasvaa. Erityisesti glyserolilla pehmitetyillä kalvoilla ero 60 % ja 80 % pehmitettä sisältävien kalvojen välillä on jyrkkä. Ero monosakkarideilla ja akaasiahunajalla pehmitettyjen kalvojen välillä on merkittävä (P<0,05) ainoastaan, kun pehmitteitä on käytetty 100 % proteiinikonsentraatin määrästä. Vastaavasti kalvojen venyvyys lisääntyy pehmitemäärän myötä (kuva 3). Monosakkarideilla pehmitetyt kalvot ovat merkittävästi venyvämpiä, kuin glyserolilla tai akaasiahunajalla pehmitetyt kalvot, kun pehmitettä käytetään 80 % proteiinikonsentraatin määrästä. Kun pehmitettä käytetään

11 3,5 3 Vetolujuus (MPa) 2,5 2 1,5 1 Glyseroli Akaasiahunaja Monosakkaridit 0,5 0 60 % 80 % 100 % Pehmitteen määrä suhteessa heraproteiinikonsentraatin määrään Kuva 2. Kuumentamattomasta proteiinista valmistettujen heraproteiinikalvojen vetolujuudet eri pehmitteillä ja pehmitemäärillä, n=5-6. 120,0 100,0 Venyvyys (%) 80,0 60,0 40,0 Glyseroli Akaasiahunaja Monosakkaridit 20,0 0,0 60 % 80 % 100 % Pehmitteen määrä suhteessa heraproteiinikonsentraatin määrään Kuva 3. Kuumentamattomasta proteiinista valmistettujen heraproteiinikalvojen venyvyydet eri pehmitteillä ja pehmitemäärillä, n=5-6.

12 60 %, on glyserolilla pehmitettyjen kalvojen venyvyys merkittävästi pienempää kuin kahta muuta pehmitintä käytettäessä. Kuva 4 kertoo pehmitteen määrän vaikutuksesta kalvon vetolujuuteen ja venyvyyteen. Pehmitteen määrän lisäys kasvattaa kalvon venyvyyttä, mutta pienentää vetolujuutta. 4 100,0 3,5 3 Vetolujuus Venyvyys 90,0 80,0 70,0 Vetolujuus (MPa) 2,5 2 1,5 1 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 Venyvyys (%) 0,5 10,0 0 60 % 80 % 100 % Pehmitteen määrä suhteessa heraproteiinikonsentraatin määrään 0,0 Kuva 4. Kuumentamattomasta proteiinista valmistettujen, monosakkarideilla pehmitettyjen heraproteiinikalvojen vetolujuus ja venyvyys, n=5-6. 10.2 Kuumennetusta proteiinista valmistetut kalvot Kuva 5 kertoo kuumennuksen vaikutuksesta monosakkarideilla pehmitettyjen haraproteiinikalvojen vetolujuuteen. Vetolujuudet ovat merkittävästi suurempia kuumennetusta proteiinista valmistetuilla kalvoilla kaikilla tutkituilla monosakkaridipehmitteen määrillä. Paras vetolujuus tutkituista koostumuksista saavutettiin, kun käytettiin monosakkarideja pehmitteenä, ja pehmitteen määrä oli 60 % proteiinikonsentraatin määrästä (kuva 6). Akaasiahunajan käyttö pehmitteenä onnistui, kun hunajaa oli 80 % proteiinikonsentraatista. Nämä kalvot olivat jo kuitenkin hyvin hauraita, mikä myös näkyy kuvasta 6. Yleisesti voidaan todeta, että kuumennettua proteiinia käytettäessä täytyi pehmitettä käyttää hieman enemmän kuin kuumentamattoman proteiinin kanssa. Kalvojen venyvyydet kasvavat myös kuumennettua proteiinia

13 6 5 Vetolujuus (MPa) 4 3 2 Monosakkaridit, kuumentamaton Monosakkaridit, kuumennettu 1 0 60 % 80 % 100 % 120 % Pehmitteen määrä suhteessa proteiinin määrään Kuva 5. Proteiinin kuumennuksen vaikutus heraproteiinikalvojen vetolujuuteen, pehmitteenä monosakkaridit, n=4-6. 6,00 5,00 Vetolujuus (MPa) 4,00 3,00 2,00 Glyseroli Akaasiahunaja Monosakkaridit 1,00 0,00 60 % 80 % 100 % 120 % Pehmitteen määrä suhteessa heraproteiinikonsentraatin määrään Kuva 6. Kuumennetusta proteiinista valmistettujen heraproteiinikalvojen vetolujuudet eri pehmitteillä ja pehmitemäärillä, n=4-6.

14 käytettäessä pehmitemäärän kasvaessa (kuva 7), jääden kuitenkin pienemmiksi, kuin ilman kuumennusta (kuva 3). 70,00 60,00 50,00 Venyvyys (%) 40,00 30,00 20,00 Glyseroli Akaasiahunaja Monosakkaridit 10,00 0,00 * 60 % 80 % 100 % 120 % Pehmitteen määrä suhteessa heraproteiinikonsentraatinin määrään Kuva 7. Kuumennetusta proteiinista valmistettujen heraproteiinikalvojen venyvyydet eri pehmitteillä ja pehmitemäärillä, n=4-6. * = kyseistä koostumusta ei voitu tutkia sen haurauden vuoksi. 10.3 Yhteenveto tuloksista Heraproteiinikalvoja on mahdollista valmistaa sekä kuumennetusta, että kuumentamattomasta heraproteiinikonsentraatista. Kalvojen vetolujuudet ovat suurimmillaan, kun käytetään kuumennettua proteiinia, jolloin muodostuu kovalenttisia rikkisiltoja -laktoglobuliinimolekyylien välille. Pieni pehmitemäärä lisää kalvon vetolujuutta, joskin kalvon venyvyys tällöin vähenee. Käytettäessä pehmitteenä monosakkarideja tai akaasiahunajaa saavutetaan paremmat vetolujuusarvot kuin glyserolia käytettäessä, joskin tutkittujen kalvojen vetolujuudet jäävät kaikilla koostumuksella melko alhaisiksi. Käyttösovelluksesta riippuu, onko heraproteiinikalvojen mekaaninen lujuus riittävää.

15 11 KIRJALLISUUS Allen DJ, DeMarco JD, Kwan KC: Free Films I: Apparatus and Preliminary Evaluation. J Pharm Sci 61: 106-109, 1972 Banerjee R, Chen H: Functional Properties of Edible Films Using Whey Protein Concentrate. J Dairy Sci 78: 1673-1683, 1995 Banker GS: Film Coating Theory and Practice. J Pharm Sci 55: 81-89, 1966 Cotte JF, Casabianca H, Chardon S, Lheritier J, Grenier-Loustalot MF: Application of carbohydrate analysis to verify honey authenticity. J Chromatogr A 1021: 145-155, 2003 Creamer LK, Parry DA, Malcolm GN: Secondary structure of bovine -lactoblobulin B. Arch Biochem Biophys 227: 98-105, 1983 Creamer LK, Bienvenue A, Nilsson H, Paulsson M, Van Wanroij M, Lowe EK, Anema SG, Boland MJ, Jimenez-Flores R: Heat-Induced Redistribution of Disulfide Bonds in Milk Proteins. 1. Bovine -lactoglobulin. J Agric Food Chem 52: 7660-7668, 2004 De Wit JN: Functional properties of whey proteins. Kirjassa Developments in Dairy Chemistry -4, ss. 285-321. Toim. Fox PF, Elsevier Science Publishers Ltd, Barking 1989 Fox PF ja McSweeney PL: Dairy Chemistry and Biochemistry. Kluwer Academic Publishers Group, Dordrecht 1998 Hambling SG, McAlpine AS, Sawyer L: -lactoblobulin. Kirjassa: Advanced Dairy Chemistry-1: Proteins, ss. 141-190. Toim. Fox PF, Elsevier Science Publishers Ltd., Barking 1992 Kanig JL, Goodman H: Evaluative Procedures for Film-Forming Materials Used in Pharmaceutical Applications. J Pharm Sci 51: 77-83, 1962 Kester JJ, Fennema OR: Edible Films and Coatings: A Review. Food Technol 40: 47-59, 1986 Krauze A, Zalewski RI: Classification of honeys by principal component analysis on the basis of chemical and physical parameters. Lebensm Unters Forsch 192: 19-23, 1991 Krochta JM, De Mulder-Johnston C: Edible and Biodegradable Films: Challenges and Opportunities. Food Technol 51: 60-74, 1997 Marshall KR: Industrial isolation of milk proteins: whey proteins. Kirjassa Developments in Dairy Chemistry -1, ss. 339-373. Toim. Fox PF, Applied Science Publishers Ltd, Barking 1982

16 McHugh TH, Aujard JF, Krochta JM: Plasticized Whey Protein Edible Films: Water Vapor Permeability Properties. J Food Sci 59: 416-423, 1994 Myllärinen P, Rantamäki P, Latva-Koivisto J, Ahvenainen R: Elintarvikepakkausten minimointi aktiivisilla syötävillä päällysteillä. Mahdollisuudet ja haasteet. Valtion teknillinen tutkimuskeskus, VTT Tiedotteita, Espoo 1997 Palmer AH: The preparation of a crystalline globulin from the albumin fraction of cow s milk. J Biol Chem 104: 359-372, 1934 Papiz MZ, Sawyer L, Eliopoulos EE, North AC, Findlay JB, Sivaprasadarao R, Jones TA, Newcomer ME, Kraulis PJ. The structure of -lactoglobulin and its similarity to plasma retinol-binding protein. Nature 324: 383 385, 1986 Perez-Gago MB, Nadaud P, Krochta JM: Water Vapour Permeability, Solubility, and Tensile Properties of Heat-denatured versus Native Whey Protein Films. J Food Sci 64: 1034-1037, 1999 Perez-Gago MB, Krochta JM: Formation and Properties of Whey Protein Films and Coatings. Kirjassa Protein-Based Films and Coatings. Toim. Gennadios A, CRC Press, Boca Raton, 2002 Shimada K, Cheftel JC: Sulfhydryl Group/Disulfide Bond Interchange Reactions during Heat-Induced Gelation of Whey Protein Isolate. J Agric Food Chem 37: 161-168, 1989 Sothornvit R, Krochta JM: Plasticizer effect on mechanical properties of -lactoglobulin films. J Food Eng 50: 149-155, 2001 Swaisgood HE: Chemistry of milk protein. Kirjassa Developments in Dairy Chemistry- 1, ss. 1-59. Toim. Fox PF, Applied Science Publishers Ltd, Barking 1982 Walstra P ja Jenness R: Dairy Chemistry and Physics. John Wiley & Sons, New York 1984