Rasvattoman maidon laktoosipitoisuuden määritys entsymaattisesti 1. Työn periaate Esikäsitellyn näyteliuoksen sisältämä laktoosi hajotetaan (hydrolysoidaan) entsymaattisesti D-glukoosiksi ja D-galaktoosiksi ph 6,6:ssa. D-galaktoosi hapetetaan ph 8,6:ssa NAD:n avulla edelleen entsymaattisesti D- galaktonihapoksi. Reaktiossa muodostunut NADH:n määrä on verrannollinen näytteen laktoosipitoisuuteen. NADH:n määrä mitataan spektrofotometrillä 340 nm:ssä. 2. Työturvallisuus Normaali huolellinen laboratoriotyöskentely ja suojainten käyttö. Ohjeiden huolellinen noudattaminen. 3. Reagenssit Näytteen analysoinnissa käytetään analyysipuhtaita reagensseja. Liuosten valmistamiseen käytetään 1-luokan laboratoriovettä. 3.1 Testikitti Testikitin reagenssien 1 ja 3 pitää olla 20-25 ºC ennen käyttöä. 3.1.1 Reagenssi 1: n. 600 mg lyofilisaattia, joka sisältää: sitraattipuskuria, ph n. 6,6; NAD, n. 35 mg; magnesiumsulfaattia. Sisältö on liuotettu 7 ml:aan milli-q-vettä. Liuos säilyy 3 kk 2-8 C.n lämpötilassa. Liuoksen on oltava 20-25 C ennen käyttöä. 3.1.2 Reagenssi 2: n. 1,7 ml β-galaktosidaasisuspensio, n. 100 U. Säilytys 2-8 C:n lämpötilassa. 3.1.3 Reagenssi 3: n. 34 ml kaliumdifosfaattipuskuria, ph n. 8,6. Säilytys 2-8 C:n lämpötilassa. Liuoksen on oltava 20-25 C ennen käyttöä. 3.1.4 Reagenssi 4: n. 1,7 ml galaktoosidehydrogenaasisuspensiota, n. 40 U. Säilytys 2-8 C:n lämpötilassa. 3.1.5 Reagenssi 5: Laktoosin kontrolliliuos
3.2 Trikloorietikkahappo, 3 mol/l Valmiina Vaaralausekkeet H314 H410 Voimakkaasti ihoa syövyttävää ja silmiä vaurioittavaa. Erittäin myrkyllistä vesieliöille, pitkäaikaisia haittavaikutuksia. Turvalausekkeet P273 P280 P301 + P330 + P331 P305 + P351 + P338 P308 + P310 Vältettävä päästämistä ympäristöön. Käytä suojakäsineitä/ suojavaatetusta/ silmiensuojainta/ kasvonsuojainta. JOS KEMIKAALIA ON NIELTY: Huuhdo suu. EI saa oksennuttaa. JOS KEMIKAALIA JOUTUU SILMIIN: Huuhdo huolellisesti vedellä usean minuutin ajan. Poista piilolinssit, jos sen voi tehdä helposti. Jatka huuhtomista. Altistumisen tapahduttua tai jos epäillään altistumista: Ota välittömästi yhteys MYRKYTYSTIETOKESKUKSEEN tai lääkäriin.
3.3 Natriumhydroksidiliuos, 1 mol/l Valmiina Vaaramerkit Vaaralausekkeet H290 H314 Voi syövyttää metalleja. Voimakkaasti ihoa syövyttävää ja silmiä vaurioittavaa. Turvalausekkeet P280 P301 + P330 + P331 P305 + P351 + P338 P308 + P310 Käytä suojakäsineitä/ suojavaatetusta/ silmiensuojainta/ kasvonsuojainta. JOS KEMIKAALIA ON NIELTY: Huuhdo suu. EI saa oksennuttaa. JOS KEMIKAALIA JOUTUU SILMIIN: Huuhdo huolellisesti vedellä usean minuutin ajan. Poista piilolinssit, jos sen voi tehdä helposti. Jatka huuhtomista. Altistumisen tapahduttua tai jos epäillään altistumista: Ota välittömästi yhteys MYRKYTYSTIETOKESKUKSEEN tai lääkäriin.
4. Laitteet ja välineet 4.1 Laitteet Spektrofotometri Vaaka 4.2 Välineet 1,5 ml Eppendorf-putkia, 0,2 µm ruiskusuodatin, ruiskuja, dekantterilaseja,suppilo, 100 ml:n mittapulloja ja korkkeja, mittalaseja, automaattipipettejä, pipetin kärkiä, pasteurpipettejä, muovikyvettejä, muovispaatteleita. 5. Näyte Rasvaton maito 6. Työn suoritus 6.1 Näytteen esikäsittely Näyte esikäsitellään erillisen englanninkielisen ohjeen Lactose/D-Galactose UVmethod kohdan 10 Application examples, Determination of lactose in drinking milk, condensed milk and sour milk mukaan. Tehdään kaksi rinnakkaista. Ohjeesta poiketen punnitaan maitoa tarkasti 1 ml (automaattipipetti) ja liuos neutraloidaan lisäämällä 2,8 ml natriumhydroksidiliuosta (1 M). Suodata näyte 0,2 µm ruiskusuodattimella. 6.2 Laktoosipitoisuuden määritys Näytteet analysoidaan erillisen englanninkielisen ohjeen Lactose/D-Galactose UVmethod kohdan procedure mukaan. Mittausaallonpituutena käytetään 340 nm ja kyvettinä muovikyvettiä. Absorbanssien tarkistusmittausta ei tarvitse tehdä. Näytteet eivät sisällä vapaata D-galaktoosia, joten galaktoosipitoisuutta ei tarvitse määrittää. Laktoosikitin reagensseja on vain vähän. PIPETOI SUORAAN REAGENSSIASTIASTA ÄLÄ KAADA VÄLIASTIAAN!
7. Tulokset 7.1 Tulosten laskeminen Näyteliuoksen laktoosipitoisuus lasketaan kaavalla: jossa c(laktoosi näyteliuoksessa) [ g l ] = A laktoosi M(laktoosi) V 2 ε d V 1 A laktoosi = (A 2-A 1) laktoosinäyte-(a 2-A 1) blank M (laktoosi)= 342,30 g/mol Ɛ = NADH:n molaarinen absorptiokerroin (ʎ= 340 nm)= 6,300 d = valotien pituus = 1 cm V 2 = kyvetin kokonaisliuosmäärä = 3,30 ml V 1 = kyvettiin lisätty näyteliuosmäärä = 0,100 ml l mmol cm Mikäli näytettä on laimennettu käsittelyn aikana on tulos kerrottava laimennoskertoimella. Maidon laktoosipitoisuus 100 g kohden lasketaan kaavalla: c(laktoosi maidossa)[g/100g] = c (laktoosi g näyteliuoksessa) l m (maito g näyteliuoksessa) l 100 [g/100g]
7.2 Tulosten ilmoittaminen Raportissa annetaan seuraavat tiedot a) Kaikki tarpeellinen tieto näytteen identifioimiseksi b) Rinnakkaiset tulokset g/100 g kahdella desimaalilla c) Tulos g/100 g kahdella desimaalilla d) Tuloksen tulkinta ja luotettavuuden arviointi