UDC 664.002.4: 543.544 POHJOISMAINEN ELINTARVIKKEIDEN METODIIKKAKOMITEA NORDIC COMMITTEE ON FOOD ANALYSIS No 142 1992 ASPARTAAMI JA DIKETOPIPERATSIINI. MÄÄRITTÄMINEN HPLC:LLÄ ASPARTAME AND DIKETOPIPERAZIN. DE- TERMINATION BY HPLC 1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Menetelmä antaa mahdollisuuden määrittää samanaikaisesti sekä aspartaamin että diketopiperatsiinin pitoisuuden elintarvikkeista. Menetelmää voidaan käyttää juomille, marmeladeille ja makeisille. Muuttamalla hiukan näytteenvalmistusta menetelmä soveltuu myös jälkiruokavalmisteille, kuten jäätelölle, kiisselille, suklaa- ja vaniljavanukkaalle ja jogurtille (kts. kappale 5.1.3). 1. SCOPE AND FIELD OF APPLICATION The method provides an opportunity to control the content of both aspartame and diketopiperazin simultaneously in foods. The method can be used for beverages, marmalades and sweets. By slightly modifying the sample preparation, the method is also applicable to dessert products such as ice cream products, jellies, chocolate pudding, vanilla cream and yoghurt (see Section 5.1.3). 2.PERIAATE Aspartaami (APM) ja sen hajoamistuote diketopiperatsiini (5-bentsyyli-3,6-diokso-2-piperatsiinietikkahappo, DKP) määritetään isokraattisella HPLC:llä. APM ja DKP erotetaan säilöntäaineista, muista makeuttamisaineista, aromeista jne. C-18 Spherisorb ODS-2 -kolonnilla. Yhdisteet kvantitoidaan UV-detektorilla (214 nm). 2. PRINCIPLE Aspartame (APM) and its degradation product diketopiperazin (5-benzyl-3,6-dioxo-2-piperazine acetic acid, DKP) are determined by isocratic HPLC. APM and DKP are separated from preservatives, other sweeteners, flavours etc. on a C-18 Spherisorb ODS-2 column. The compounds are quantified using a UV detector (214 nm). 3. LAITTEISTO 3.1 Nestekromatografi (HPLC). 3.2 UV-detektori, joka detektoi 214 nm:lla. 3.3 Ultraäänihaude. 3.4 Tarvikkeita näyteliuoksien suodatukseen: Suodattimia, 5 µm ja 0,45 µm (Millipore) sekä näille ruiskuja ja pidikkeitä. 3. APPARATUS 3.1 Liquid chromatograph (HPLC). 3.2 UV detector for detection at 214 nm. 3.3 Ultrasonic bath. 3.4 Equipment for filtration of sample solutions: Filters, 5 µm and 0.45 µm (Millipore), and syringes and holders for the filters.
2 3.5 Tarvikkeita HPLC-liuoksien suodatukseen: Suodatin 0,45 µm yhdistettynä vakuumipumppuun tai vaihtoehtoisesti vesipumppuun jossa vesilukko. 3.6 HPLC-kolonni: C-18 Spherisorb ODS-2, 3 µm, 150 mm x 4,6 mm. 3.7 Homogenointilaite, esim. tehosekoitin 3.5 Equipment for filtration of HPLC solutions: A 0.45 µm filter combined with a vacuum pump or alternatively with a water suction pump with a water lock. 3.6 HPLC column: C-18 Spherisorb ODS-2, 3 µm, 150 mm x 4.6 mm. 3.7 Homogenizer, e. g. a kitchen blender. 4. REAGENSSIT Käytetyn veden tulee olla puhdistettu käänteisosmoosilla ja Milli-Q puhdistuksella. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää ionivaihdettua ja tislattua vettä. 4. REAGENTS All water used must be purified by reverse osmosis followed by Milli-Q purification. Alternatively, distilled ion-exchanged water may be used. Kaikkien reagenssien tulee olla vähintään pro analysi laatua. 4.1 Ortofosforihappoa (H 3 PO 4 ), 85%. 4.2 Laimeaa fosforihappoa. Sekoita 1 tilavuus 4.1:ä ja 9 tilavuutta vettä. 4.3 Kaliumdivetyfosfaattia (KH 2 PO 4 ). 4.4 Metanolia, HPLC-laatua. 4.5 Fosfaattiliuos: Liuota 4,08 g KH 2 PO 4 (4.3) n. 950 ml:an vettä. Säädä ph arvoon 3,2 laimealla fosforihapolla (4.2). Laimenna sen jälkeen 1000 ml:ksi. 4.6 0,01 mol/l kaliumdivetyfosfaatin (KH 2 PO 4 ) (4.3) vesiliuos. 4.7 HPLC-ajoliuos: Sekoita 72 tilavuutta fosfaattiliuosta (4.5) ja 28 tilavuutta metanolia (4.4). 4.8 Aspartaamistandardi: Käytä aspartaami p.a.:ta (esim. Sigma). Säilytä kuivana silikageelin päällä jääkaapissa. 4.8.1 Aspartaamin kantaliuos: Punnitse 0,1 mg:n tarkkuudella n. 150 mg aspartaamia (4.1). Liuota n. 500 ml:an 0,01 mol/l kaliumdivetyfosfaattiliuosta (4.6). Koska aspartaami on vaikealiukoinen liuosta on sekoitettava tai vaihtoehtoisesti pidettävä ultraäänihauteessa kunnes kaikki on liuennut. Laimenna tämän jälkeen 1000 ml:ksi samalla liuoksella. Liuos säilyy viikon jääkaapissa. All reagents must be of at least analytical grade. 4.1 Orthophosphoric acid (H 3 PO 4 ), 85%. 4.2 Diluted phosphoric acid. Mix 1 volume of 4.1 with 9 volumes of water. 4.3 Potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ). 4.4 Methanol, HPLC grade. 4.5 Phosphate solution: Dissolve 4.08 g KH 2 PO 4 (4.3) in about 950 ml water. Adjust the ph to 3.2 using diluted phosphoric acid (4.2). Then adjust the volume to 1000 ml. 4.6 0.01 mol/l solution of potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ) (4.3) in water. 4.7 Eluent for HPLC: Mix 72 volumes of phosphate solution 4.5 and 28 volumes of methanol 4.4. 4.8 Aspartame standard: Use aspartame p.a. (e.g. Sigma). Store dry over silica in a refrigerator. 4.8.1 Aspartame stock solution: With an accuracy of 0.1 mg weigh ca. 150 mg aspartame (4.1). Dissolve in ca. 500 ml 0.01 mol/l potassium dihydrogenphosphate solution (4.6). Since aspartame is difficult to dissolve the solution should be shaken or alternatively placed in an ultrasonic bath until complete dissolution. Then dilute to 1000 ml with the same solution (4.6). The solution will keep for one week in a refrigerator.
3 4.8.2 Aspartaamin käyttöliuos: Laimenna 20 ml aspartaamin kantaliuosta (4.8.1) 100 ml:ksi vedellä. Liuosta on valmistettava päivittäin. 4.9 DKP-standardi: Valmista kuumentamalla aspartaamia (4.8) 150 C:ssa 24 tuntia.*) 4.9.1 DKP:n kantaliuos: Punnitse 0,1 mg:n tarkkuudella n. 50 mg DKP:ta (4.9). Liuota metanoli/veteen (1+1). Pidä liuosta ultraäänihauteessa kunnes kaikki on liuennut. Laimenna 1000 ml:ksi metanoli/vedellä (1+1). 4.9.2 DKP:n käyttöliuos: Laimenna 10 ml DKP:n kantaliuosta (4.9.1) 100 ml:ksi vedellä. 4.8.2 Aspartame working solution: Dilute 20 ml of aspartame stock solution (4.8.1) to 100 ml with water. The solution must be prepared daily. 4.9 DKP standard: Prepare by heating aspartame (4.8) at 150 C for 24 hours.*) 4.9.1 DKP stock solution: With an accuracy of 0.1 mg weigh ca. 50 mg DKP (4.9). Dissolve in methanol/water (1+1). Keep the solution in an ultrasonic bath until complete dissolution. Then dilute to 1000 ml with methanol/water (1+1). 4.9.2 DKP working solution: Dilute 10 ml DKP stock solution (4.9.1) to 100 ml with water. 5. SUORITUS 5.1 Näytteenvalmistus 5.1.1 Juomat: Poista hiilidioksidi pitämällä näyte ultraäänihauteessa 10 minuuttia. Laimenna 10,0 ml näytettä, josta hiilidioksidi on poistettu, 100,0 ml:ksi vedellä ja suodata 0,45 µm suodattimella (Millipore). Tuoremehua sisältäville juomille saattaa olla helpompi käyttää kohdan 5.1.2 käsittely. 5.1.2 Marmeladit: Homogenoi näyte tehosekoittimella. Punnitse 0,01 g:n tarkkuudella n. 5 g näytettä, lisää 70 ml vettä ja aseta seos ultraäänihauteeseen 15 minuutiksi. Laimenna näyte 100 ml:ksi vedellä. Suodata näyte sekä 5 µm että 0,45 µm suodattimen läpi. Aseta suodattimet päällekkäin siten, että näyte ensin kulkee 5 µm:n suodattimen läpi. 5.1.3 Jälkiruokavalmisteille modifioitu näytteenkäsittely (kts. kohta 1) on seuraava: Laimenna homogenoitu valmiste 0,01 mol/l fosfaattiliuoksella (ph 4). Pidä ultraäänihauteessa 15 minuuttia. Laimenna määrätilavuuteen. Lisää 1 ml 0,05 mol/l CTA (heksadekyylitrimetyyliammoniumkloridi) 100 ml näyteliuosta kohti. Suodata suodatinpaperin läpi. Suodata tämän jälkeen Millipore suodattimen (0,45 µm) läpi ja injisoi HPLC-laitteeseen kuten menetelmässä on kuvattu. 5. PROCEDURE 5.1 Sample preparation 5.1.1 Beverages: Remove carbon dioxide by keeping the sample in an ultrasonic bath for 10 minutes. Dilute 10.0 ml of the degassed sample to 100.0 ml with water and filter through a 0.45 µm filter (Millipore). For beverages containing juice it may be easier to use the procedures described under 5.1.2. 5.1.2 Marmalades: Homogenize the sample in a mixer. With an accuracy of 0.01 g, weigh ca. 5 g of the sample, add 70 ml water and place the mixture in an ultrasonic bath for 15 minutes. Then dilute the sample to 100 ml with water. Filter the sample through both a 5 µm and a 0.45 µm filter. Place the filters over one another in such a way that the solution first passes through the 5 µm filter. 5.1.3 The modified sample preparation for dessert products (see Section 1) is as follows: Dilute the homogenized product in 0.01 mol/l phosphate solution (ph 4). Keep in an ultrasonic bath for 15 minutes. Dilute to exact volume. Add 1 ml 0.05 mol/l CTA (hexadecyl trimethylammonium chloride) per 100 ml sample solution. Filter through filter paper. Then filter through Millipore filter (0.45 µm) and inject into HPLC as described in the method. *) Mazur, "Encyclopedia of Chemical Technology", 3rd Ed., John Wiley & Son Inc. New York 1983, vol 22, p. 448. *) Mazur, "Encyclopedia of Chemical Technology", 3rd Ed., John Wiley & Son Inc. New York 1983, vol 22, p. 448.
4 5.2 HPLC-määritys Aja kromatogrammeja käyttäen seuraavia HPLColosuhteita: Kolonni:Spherisorb ODS-2 -kolonni, partikkelikoko 3 µm (0,4 cm x 15 cm). Ajoliuos:Metanoli/fosfaattiliuos (28+72) (4.7). Virtaus: 0,8 ml/minuutti. Injektio: Näytetilavuus 20 µl (loop). Detektio:UV-detektio 214 nm:lla. Kuvassa 1 on esimerkki juomanäytteen kromatogrammista yhdeksän kuukauden säilytyksen jälkeen 20 C:ssa. Sakariinin, aspartyylifenyylialaniinin, DKP:n, aspartaamin ja bentsoehapon piikit kromatogrammissa on identifioitu. 6.TULOSTEN LASKEMINEN Laske näytteen aspartaami- ja DKP-pitoisuudet vertaamalla näytteen ja standardiliuoksien (4.8.2 ja vastaavasti 4.9.2) piikkien korkeudet huomioiden tehdyt laimennokset. Ilmoita tulos mg/l näytettä tai mg/kg näytettä. 5.2 HPLC determination Run chromatograms using the following HPLC conditions: Column:Spherisorb ODS-2 column with particle size 3 µm (0.4 cm x 15 cm). Eluent:Methanol/phosphate solution (28+72) (4.7). Flow: 0.8 ml/minute. Injection: Sample volume 20 µl (loop). Detection:UV detection at 214 nm. An example of a chromatogram of a soft drink after storage for nine months at 20 C is shown in Figure 1. Peaks of saccharin, aspartyl phenylalanine, DKP, aspartame and benzoic acid are identified in the chromatogram. 6. CALCULATION OF RESULTS Calculate the concentration of aspartame and DKP in the sample by comparing peak heights from sample and standard solutions (4.8.2 and 4.9.2, respectively), taking into account any dilutions. Express the result in mg/l sample or mg/kg sample. Kuva 1. Juomanäytteen kromatogrammi yhdeksän kuukauden säilytyksen jälkeen 20 C:ssa. HPLColosuhteet kuten kohdassa 5.2. Piikit: 1. Sakariini, 2. Fenyylialaniini, 3. Tuntematon, 4. Aspartyylifenyylialaniini, 5. DKP, 6. Aspartaami ja 7. Bentsoehappo. Figure 1. Chromatogram of a beverage after storage for nine months at 20 C. HPLC conditions as given under 5.2. Peaks: 1. Saccharin, 2. Phenylalanine, 3. Unknown, 4. Aspartyl phenylalanine, 5. DKP, 6. Aspartame and 7. Benzoic acid.
5 7. MENETELMÄN LUOTETTAVUUS Menetelmä kokeiltiin kollaboratiivisesti seitsemässä pohjoismaisessa laboratoriossa, joissa jokaisessa tehtiin aspartaamin ja diketopiperatsiinin yksittäismäärityksiä 20 näytteestä (kymmenen kolajuomanäytettä, neljä appelsiinijuomanäytettä ja kuusi aprikoosimarmeladinäytettä), jotka sisälsivät aspartaamia välillä 0 ja 1000 mg/kg sekä DKP:tä välillä 0 ja 160 mg/kg. Aspartaamin osittaista hajoamista DKP:ksi esiintyi näytteissä, mikä näkyi yhdisteiden saantoina näytteistä joihin oli lisätty tunnettuja määriä aspartaamia ja DKP:tä. Aspartaamin keskimääräinen saanto oli 95% ja DKP:n 105%. Laboratoriot ilmoittivat keskimäärin pitoisuudet 69,5 mg aspartaamia/kg ja 22,9 mg DKP/kg marmeladinäytteelle, johon oli lisätty 75 mg/kg aspartaamia ja 20 mg/kg DKP:ta. Toisesta marmeladinäytteestä, johon oli lisätty 1000 mg aspartaamia/kg eikä yhtään DKP:ta, laboratoriot löysivät 972 mg aspartaamia/kg ja 26 mg DKP:ta/kg. Mikään laboratorio ei havainnut aspartaamia näytteestä, johon ei ollut lisätty aspartaamia vaan pelkästään 40,2 mg/kg DKP:ta. Tästä näytteestä keskimääräinen DKP:n saanto oli 97%. Menetelmän suhteellinen standardipoikkeama uusittavuudelle aspartaamille vaihteli välillä n. 1,2-1,4%:sta (taso 270 mg/kg tai korkeampi) 7,5-10%:in (taso 50 mg/kg). Vastaavat luvut DKP:n määrittämiseksi olivat korkeammat, esim. n. 15% tasolle 100 mg/kg ja 11 sekä 19% tasolle 30 mg/kg. 7. RELIABILITY OF THE METHOD This method was collaboratively studied in seven Nordic laboratories, each of which made single determinations of aspartame and diketopiperazin in twenty samples (ten samples of cola beverage, four of orange beverage and six of apricot marmalade) containing aspartame between 0 and 1000 mg/kg and DKP between 0 and 160 mg/kg. Some degradation of aspartame to DKP occurred in the samples, which is reflected in the recovery of the compounds from samples to which known amounts of the analytes had been added. The average recovery of aspartame was 95% and that of DKP was 105%. The laboratories reported average concentrations of 69.5 mg aspartame/kg and 22.9 mg DKP/kg in a marmalade sample with 75 mg/kg aspartame and 20 mg DKP/kg added. In another marmalade sample with 1000 mg aspartame/kg and no DKP added, the laboratories found 972 mg aspartame/kg and 26 mg DKP/kg. No laboratory detected aspartame in a sample containing no aspartame but 40.2 mg/kg DKP. The average recovery of DKP from this sample was 97%. The relative standard deviation for reproducibility of the method for the determination of aspartame ranged between about 1.2-1.4% (level 270 mg/kg or higher) to 7.5-10% (level 50 mg/kg). The corresponding figures for the determination of DKP were higher, e.g. around 15% for the level 100 mg/kg and 11 and 19% for the level 30 mg/kg.