111111111111111111 II IIII II II 11111111111111111111

111111111111111111 II IIII II II 11111111111111111111 F10008 (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSICRIFT (10) FI B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 15.04.1999 (51) Kv.lk.6 - Int.k1.6 SUOMI-FINLAND (FI) C 07K 14/315, C 12N 15/31 C 12P 21/00, C 12N 1/21 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 892408 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 18.05.1989 Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (24) Alkupäivä - Löpdag 18.05.1989 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 21.11.1989 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 20.05.1988 SE 8801894 P (73) Haltija - Innehavare 1. Alfa-Laval Agri International Aktiebolag, Box 39, 147 00 Tumba, Sverige, (SE) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Röök, Magnus, 121, Stevens Hill Circle, Birmingham, AL 35244, USA, (US) 2. Lindberg, Martin Kjell, Kornvågen 5, 752 57 Uppsala, Sverige, (SE) 3. Lindgren, Per-Eric, Linnägatan 16A, 753 32 Uppsala, Sverige, (SE) 4. Signås, Lars Christer, Hamnesplanaden 2A, 753 23 Uppsala, Sverige, (SE) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab, Jaakonkatu 3 A, 00100 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Hybridi-DNA-molekyyli, tållå molekyylillå transformoitu mikro-organismi ja menetelmä fibronektiiniå sitovan proteiinin valmistamiseksi Hybrid-DNA-molekyl, mikroorganism transformerad med denna molekyl och förfarande för framställning av ett fibronektinbindande protein (83) Mikro-organismitalletus - Deposition av mikroorganism: 4613 DSM 4614 DSM (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer FI C 84431 (A 61K 39/02), Chemical Abstracts, vol. 109, 1988, 168221r (57) Tiivistelmä - Sammandrag Esillä oleva keksintö liittyy uuteen yhdistelmä-dna-molekyyliin, joka käsittää S. dysgalactiaen nukleotidisekvenssit, jotka koodaavat ainakin yhtä proteiinia tai polypeptidiä, jolla on fibronektiinin sitomisominaisuus. Föreliggande uppfinning hänför sig tili en ny rekombinat-dna-molekyl innefattande S. dysgalactiaes nukleotidsekvenser, vilka kodar minst ett protein eller en polypeptid med bindningsegenskap för fibronektin.

Hybridi-DNA-molekyyli, tällä molekyylillä transformoitu mikro-organismi ja menetelmä fibronektiiniä sitovan proteiinin valmistamiseksi - Hybrid-DNAmolekyl, mikroorganism transformerad med denna molekyl och förfarande för framställning av ett fibronektinbindande protein 5 Esillä oleva keksintö liittyy fibronektiiniä sitoviin proteiineihin ja hybridi-dnamolekyyleihin, esim. plasmideihin tai faageihin, jotka sisältävät ainakin yhden mainittuja proteiineja koodaavan nukleotidisekvenssin. Lisäksi keksintö liittyy mikro-organismeihin, jotka sisältävät sellaisia molekyylejä, ja niiden käyttöön mainittu- 10 jen proteiinien tuottamiseksi. Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada aikaan pienimpiä mandollisia fibronektiiniä sitovia proteiineja. Lisäksi esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada aikaan mainittuja proteiineja geenitekniikan menetelmin käyttämällä esim. plasmidia, joka sisältää proteiineja 15 koodaavan nukleotidisekvenssin. WO-A1-85/05553 kuvaa bakteerin pintaproteiineja, jotka kykenevät sitomaan fibronektiiniä, fibrinogeeniä, kollageeniä ja/tai laminiinia. Siinä on osoitettu, että eri bakteereilla on kyky sitoa fibronektiiniä, fibrinogeeniä, kollageeniä ja/tai laminiinia. Edelleen on osoitettu, että Staphylococcus aureuksesta peräisin olevan fibronektiiniä 20 sitovan proteiinin molekyylipaino on 165 kd ja/tai 87 kd, mistä seuraa, että on mandollista, että pienempi proteiini on isomman osa. Fibronektiini on suuri glykoproteiini, jonka molekyylipaino on noin 450 kd ja jossa on kaksi samanlaista alayksikköä, joiden molekyylipaino voi vaihdella riippuen prekursori-mrna:n liittämistavasta. Proteiinia esiintyy peruskalvoissa ja sidekudoksis- 25 sa, mutta myös liukoisessa muodossa eri ruumiinnesteissä, kuten veriplasmassa (1). Kuuselan, 1978, tekemän alkuperäisen havainnon jälkeen, jonka mukaan S. aureus sitoutuu fibronektiiniin (2), on osoitettu että muutkin patogeeniset bakteerit, kuten eri serologista tyyppiä edustavat streptokokit (3), E. coli ja Salmonella (5) voivat sitoutua tähän proteiiniin (6). 30 Patogeenisten bakteerien kiinnittyminen pintoihin on nykyään yleisesti tunnustettu asia, kun on kysymys haavapatogeeneistä, jotka käyttävät pintareseptoreita sitoutuakseen epiteelisolupintojen, yhdistävien kudospintojen ja haavapintojen eri proteiineihin, kuten esim. fibronektiiniin, fibrinogeeniin, kollageeniin ja laminiiniin. On-

2 gelmana on, että näitä reseptoreita on suhteellisen pieni määrä bakteerin solupinnalla ja että niitä on vaikea vapauttaa. Yksi mandollinen tapa tapauksissa, joissa kyseessä olevat reseptorit koostuvat proteiineista, on kloonata kyseessä olevien reseptorien geenit, jotta olisi mandollista valmistaa niitä sellaisina määrinä, jotka mah- 5 dollistaisivat infektioiden ja infektioden etenemisen huomattavasti helpomman tutkimisen samoin kuin infektioiden profylaktisen ja terapeuttisen hoidon haavapatogeeneillä. Eri serologisia ryhmiä edustavien streptokokkien, kuten A, C ja G, seulontatutkimukset ovat Lancefieldin (3) mukaan osoittaneet, että testatut kannat voivat sitoutua 10 erilaisiin sidekudoksen proteiineihin, kuten fibronektiiniin, fibrinogeeniin, kollageeniin ja laminiiniin ja erilaisiin immunoglobuliineihin (7, 8) vaihtelevassa määrin ja eri spesifisyydellä. Streptokokkien fibronektiiniä sitovien proteiinien edelleen karakterisoimiseksi erityisesti sellaisten proteiinien Streptococcus dyslactiaesta peräisin olevat geenit on 15 kloonattu E. coliin. Näiden proteiinien fibronektiiniä sitovat alueet on myös paikallistettu ja tällaisia alueita sisältävien proteiinien ominaisuuksia ja tehtäviä käsitellään jäljempänä. Nyt on yllättäen osoitettu, että on mandollista saada aikaan hybridi-dna-molekyylejä, jotka käsittävät Streptococcus dysgalactiae'n nukleotidisekvenssin, joka koodaa 20 proteiinia tai polypeptidiä, jolla on seuraava aminohapposekvenssi: Glu Asp Thr Gln Thr Ser Gln Glu Asp Ile Val Leu Gly Gly Pro Gly Gln Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Ser Gln Pro Gly Met Ser Gly Asn Asn Ser His Thr Ile Thr..... Glu Asp Ser Lys Pro Ser Gln Glu Asp Glu Val Ile Ile Gly Gly.., %'.' 25 Gln Gly Gln Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Thr Gln Ser Gly Met Ser Gly Asp Asn Ser His Thr Asp Gly Thr Val Leu Glu Glu Asp Ser Lys Pro Ser Gln Glu Asp Glu Val Ile Ile Gly Gly Gln Gly Gln Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Thr Gln Thr Gly Met Ser Gly 30 ja/tai

3 Glu Glu Thr Leu Pro Thr G111 Gln Gly Gin Ser Gly Ser Thr Thr Glu Val Glu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Val Ile Ile Gly Gly Gln Gly Glu Ile Val Asp Ile Glu Glu Asn Leu Pro Thr Glu Gln Gly Gln Ser Gly Ser Thr Thr 5 Glu Val Glu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Val Ile Ile Gly Gly Gln Gly Glu Val Val Asp Ile Glu Glu Ser Leu Pro Thr Glu Gln Gly Gln Ser Gly Gly Ser Thr Thr Glu Val Glu Asp yhdessä transkription ja translaation säätelysekvenssien ja selektiomarkkeria koo- 10 daavan sekvenssin kanssa. Keksinnön mukainen hybridi-dna-molekyyli käsittää yhden tai useamman seuraavista nukleotidisekvensseistä: CTA GAT ACC TCA GAA AAC AAA AAA TCT GTA ACT GAA AAA GTA ATA ACT AGC GAT GTT AAA TAT AAG ATT AAT GAT AAA GAA GTG AAA GGT 15 AAA GAA CTA GAC GAT GTC TCT TTA ACT TAC AGT AAA GAA ACC GTT CGT AAG CCA CAG GTG GAA CCA AAT GTT CCT GAT ACA CCT CAG GAA AAA CCA TTG ACA CCG CTT GCA CCG TCA GAA CCT TCA CAA CCA TCT ATT CCA GAG ACA CCA CTG ATA CCG TCA GAA CCT TCA GTT CCA GAG ACA TCA ACA CCA GAA GGT CCA ACA GAG GGA GAA AAT AAT CTT GGT 20 GGT CAG AGT GAA GAG ATA ACG ATT ACA GAA GAT TCT CAA TCA GGG ATG TCT GGT CAA AAT CCT GGT TCT GGA AAT GAA ACA GTG GTT GAA GAC ACT CAA ACA AGT CAA GAG GAT ATT GTA CTT GGT GGT CCA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT AGC CAA CCG GGT ATG TCT GGT AAT AAT AGC CAT ACT ATT ACA 25 GAA GAT TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAG GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACT CAA TCT GGT ATG TCT GGG GAT AAT AGC CAT ACA GAT GGG ACA GTG CTT GAA GAA GAC TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACC CAA ACC GGT ATG 30 TCT GGG GCT GGA CAA GTA GAG AGT CCA ACA ATC ACC GAA GAA ACC CAT AAA CCA GAA ATA ATC ATG GGC GGT CAA AGT GAC CCT ATT GAT ATG GTT

4 GAG GAC ACT CTT CCT GGT ATG TCT GGC TCT AAT GAA GCT ACT GTT GTG GAA GAA GAC ACA CGT CCT AAA CTT CAA TTC CAT TTT GAT AAT GAA GAG CCC GTT CCT GCA ACG GTT CCA ACC GTT TCT CAA ACT CCT ATT GCT CAG GTA GAA AGT AAA GTG CCT CAT GCC AAA GCA GAG AGT 5 GCG TTA CCT CAA ACT GGA GAT ACA AAT AAA CTA GAA ACG TTC TTT ACC ATT ACA GCA CTA ACT GTT ATT GGA GCG GCA GGA TTA CTA GGC AAA AAA CGT CGT AAT AAT CAA ACT GAT TAA TCA GCA GAT TTC ATC AAA CGC TAT AAA CAA GGC TAA CAT TTT AGC CTT GTT TTA TAT TGT TTC ACT GAC CTC TAA AAG TTA TGA CTG TTT TAA AGG GGG GGT AGG 10 CCA ATC CTC AAA AGT AGT TAA GTT GAG AAA CAC CAC ATC ACT TTA GTC TTA CTG CGC ATA CTA AAA GCA AAA GAT AAT TAG GAG CAC TTG CTA ACT GGA AAA AAT CAA ATG CAA AGC TAG TTG CCA AAG AAC TCT AGA ja/tai 15 CTC GAG GAA ACT TTG CCA AAC GAG GAA CAT CAA TCA GGT GAT ACC ACA ACT ATT GAA GAT ACT CGC CCG ATT GAT ACC ATG TCA GGT CTA TCA GGA GAG ACT GGG CAG TCT GGT AAT ACT ACA ATT GAG GAA GAT AGT ACG ACT CAC GTT AAA TTC TCA AAA CGT GAT ATT AAT GGT AAA GAA CTA GCA GGT GCT ATG ATT GAA CTA CGT AAT CTA TCA GGT CAA 20 ACT ATT CAA TCA TGG ATA TCA GAC GGC ACA GTT AAA GTT TTC TAC TTG ATG CCA GGG ACT TAT CAA TTT GTG GAG ACG GCA GCG CCA GAA GGT TAT GAA TTG GCA GCT CCA ATT ACC TTC ACA ATT GAT GAG AAA GGA CAA ATT TGG GTA GAC AGT ACA TTA ATT GTA GGT GAT GAC CCT ATT GTA ATG ATT GAT AAT GAC AAG CCG ATT ACT GAG GCG AGT CAA 25 TCT ATT GAT TTC GAG GAA ACT TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACG GAG GTT GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAG GGA GAG ATT GTT GAT ATC GAG GAG AAC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT 30 GAA GTA GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAA GGA GAG GTT GTT GAT ATT GAG GAG AGC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT GAA GTA GAA GAT

5 AGC AAG CCT AAA CTC TCT ATC CAC TTT GAT AAC GAG TGG CCT AAG GAA GAC AAA CCA CAA CTA CCT GCC GTT GAA AAA CCT AAG ACT AAG GAG AGC TTG CCA GCC GCA GGG GAA GCT GAA CAT GTC TTA TCT ACT ATC GTG GGA GCA ATG ATC 5 joiden avulla pienemmät toistuvat alueet (vertaa kuva 3) kussakin edellä esitetyssä geenissä koodaavat fibronektiinin sitomisaktiivisuutta omaavia peptidejä. Keksintö käsittää lisäksi plasmidin tai faagin, joka käsittää mainittua fibronektiiniä sitovia proteiineja koodaavan nukleotidisekvenssin. Keksintö käsittää lisäksi mikro-organismeja, jotka sisältävät ainakin yhden edellä 10 esitetyn kaltaisen hybridi-dna-molekyylin. Sellaiset mikro-organismit on talletettu Deutsche Sammlung von Mikroorganismen -talletuslaitokseen talletusnumerolla DSM 4614 (psdf102) ja DSM 4613 (psdf203). Keksintö liittyy lisäksi fibronektiiniä sitovien proteiinien valmistusmenetelmän, joka käsittää ainakin yhden edellä kuvatun kaltaisen hybridi-dna-molekyylin siirtämi- 15 sen mikro-organismiin, mainitun mikro-organismin kasvatuksen elatusaineessa ja tällä tavoin muodostuneen proteiinin eristämisen per se tunnetuilla menetelmillä. Keksintö kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavassa esimerkkeihin viittaamalla kuitenkaan keksintöä niihin rajaamatta. Esimerkki 1 20 Streptococcus dysgalactiaen kromosomaalisen DNA:n geenipankin konstruoiminen t Kromosomaalinen DNA Streptococcus dysgalactiaesta, kanta S2, valmistettiin perkloraattimenetelmän mukaisesti (9). DNA aukaistiin osittain käyttämällä Sau 3ALtä, fraktioitiin koon mukaan 1 % agaroosigeelissä ja kokoluokkaa 3-9 kb oleva 25 DNA-fragmentti kerättiin, elektroeluoitiin ja puhdistettiin Nensorb-kolonissa (Du Pont). Plasmidivektori puc 18 aukaistiin käyttämällä Bam HI:tä ja käsiteltiin fosfataasilla. Osittain aukaistu fraktioitu streptokokki-dna liitettiin aukaistuun puc18-vektoriin. Liittämisseos siirrettiin jäädytyksen kestävään E. coliin, kanta TG1, ja levitettiin 30 LA-maljoille, jotka sisälsivät ampillisiinia (50 mg/ml) ja IPTG:tä (0,1 mm) ja 0,004 % X-galia ja joita kutsuttiin axi-maljoiksi. Valkoiset pesäkkeet siirrettiin LAmaljoille, joissa oli ampisilliinia (50 mg/ml).

6 Geenipankin seulominen fibronektiiniä sitovan proteiinin (FNBP) suhteen Valkoiset pesäkkeet kerättiin axi-maljoilta käyttämällä hammastikkuja ja siirrettiin LA-maljoille, joissa oli ampisilliinia, 52 pesäkettä maljaa kohti. Kaikkiaan kerättiin 728 transformanttia. Nämä seulottiin fibronektiiniä sitovan aktiivisuuden suhteen 5 käyttämällä suodatusmenetelmää jäljempänä olevan mukaisesti. Transformantit kerätään axi-maljoilta ampisilliinia sisältäville LA-maljoille ja maljoja inkuboidaan yön yli. Näiltä maljoilta pesäkkeet replikoidaan uusille LA-maljoille ja niitä inkuboidaan 37 C:ssa yön yli. Nitroselluloosasuodatin asetetaan jokaiselle agarmaljalle, jossa on riittävästi kasvaneita pesäkkeitä. Kun suodattimet 10 ovat täysin kostuneet, pesäkkeet kiinnitetään niihin imun avulla ja sen jälkeen suodattimet poistetaan varovasti. Suodattimet asetetaan kloroformihöyryyn 5 minuutiksi ja pestään sen jälkeen 3 x 10 min 37 C:ssa puskuriliuoksessa, joka sisältää 100 nim Tris-HC1, ph 7,5, 0,05 % Tween-40 ja 150 mm NaCl. Suodattimien annetaan kuivaa huoneen lämmössä noin 30 min. Suodattimia esi-inkuboidaan 150 mm:ssa 15 NaCl:a, 10 mm:ssa Tris-HC1:a, ph 7,5, ja 1,4 %:a rasvattomassa maitojauheessa 2 tuntia 37 C:ssa tai huoneen lämmössä yön yli. Maitojauhepuskurin täytyy olla juuri valmistettua. 125I:11a leimattu fibronektiini lisätään (n. 30 000 cpm suodatinta kohti), ja suodattimia inkuboidaan huoneen lämmössä yön yli. Suodattimet pestään 3 x 10 min. 37 C:ssa liuoksessa, jossa on 0,05 % Tween-40:tä ja 150 mm NaC1, minkä 20 jälkeen suodattimet kuivataan. Valottamaton filmi asetetaan niiden päälle ja annetaan sen valottua 3-5 päivää. Filmi kehitetään ja kloonit, jotka ovat sitoutuneet 125 1- fibronektiiniin identifioidaan ja eristetään. Suodatinseulonta-analyysissä paljastui 3 positiivista kloonia, jotka kaikki edelleen analysoitiin. Fibronektiinin sitomiskyky määritettiin edelleen kilpailuanalyysissä 25 (10). E. coli -kloonien lysaatti valmistettiin hajottamalla bakteerit lysotsyymillä (1 mg/ml) puskuriliuoksessa, joka sisälsi 100 mm Tris-HC1, ph 7,5, 150 mm NaC1 ja 1 mm EDTA:a. Fibronektiinin sitomisaktiivisuus analysoitiin määrittämällä lysaattien kyky kilpailla S. aureuksen, kanta Cowan I (vaihtoehtoisesti kanta 8325-4), ja S. dysgalactiaen, kanta S2, kanssa mainitussa järjestyksessä, suhteessa niiden kykyyn 30 sitoutua 125 1-leimattuun 29 kd:n fibronektiinifragmenttiin. Testi osoitti, että on mandollista estää fibronektiinin sitoutuminen kahteen stafylokokkikantaan samoin kuin S. dysgalactiaen S2-kantaan, kun käytetään streptokokki-dna:ta sisältäviä E. coli -kloonien lysaatteja. Kääntäen voidaan 29 kd:n fibronektiinifragmentin sitoutuminen S. dysgalactiaeen estää lisäämällä E. coli -kloonin lysaattia, joka sisältää S. 35 aureuksen fibronektiiniä sitovan proteiinin geenin.

7 Restriktiokartoitus ja subkloonaus Suodatinanalyysin kolmen positiivisen subkloonin, joita nimitetään psdf100:ksi, psdf200:ksi ja psdf300:ksi, plasmidi-dna preparoitiin LiCl-menetelmällä (11) ja ne määritettiin 4,9 kb:n, 6,9 kb:n ja 6,5 kb:n painoisiksi, mainitussa järjestyksessä, 5 käyttämällä restriktioentsyymikatkaisua ja agaroosigeelianalyysiä. Kaikki kolme kloonia katkaistiin noin 20 yleisimmällä restriktioentsyymillä, jotka tunnistavat 6 nukleotidin sekvenssin, ja katkaisumalli lähtökohtana luonnosteltiin restriktiokartat. Klooneista kaksi, psdf100 ja psdf300, olivat osittain päällekkäisiä niin, että niillä oli 3,9 kb:n yhteinen sekvenssi, ja näin ollen vain yksi valittiin jatkotutkimuksiin. 10 Koska psdf100:11a oli suurempi fibronektiinin sitomisaktiivisuus kuin psdf300:11a, ensin mainittu valittiin. psdf 100 ja psdf200 subkloonattiin fibronektiinin sitomisaktiivisuutta koodaavien alueiden identifioimiseksi tarkemmin. psdf100 katkaistiin Bam HI:llä, minkä jälkeen plasmidi suljettiin uudelleen. Klooni, josta Bam HI - Bam HI -fragmentti oli 15 poistettu, nimitettiin psdf101:ksi ja se oli positiivinen. psdf 101 katkaistiin edelleen Xbaillä, minkä tuloksena syntyi 3 fragmenttia, joista yksi käsitti pääasiassa puc18-vektorin. Kaksi muuta XbaI-XbaI-fragmenttia puhdistettiin ja liitettiin puc18-vektoriin. Yksi näistä fragmenteista koodaa fibronektiinin sitomisaktiivisuutta. Tämä klooni nimitettiin psdf200:ksi. Vastaavalla tavalla konstruoitiin subkloo- 20 nit myös psdf200:sta. ClaI-SacI-fragmentin poistaminen psdf200:sta antoi tuloksena psdf201:ksi nimitetyn kloonin ja edelleen BgIII-EcoRl-fragmentin poistaminen psdf201:sta antaa tuloksena psdf202:n. Lopuksi psdf202:sta on poistettu XhoI-EcoRl-fragmentti. Tällä tavalla saatu uusi klooni nimitettiin psdf203:ksi. Kaikki nämä uudet subldoonit ovat positiivisia, ts. ne ilmentävät fibronektiinin si- 25 tomisaktiivisuutta, vertaa kuviin la ja lb. Jatkosubkloonaus ExDIII-digestiolla Dideoksimenetelmällä tehtävän nukleotidisekvensoinnin helpottamiseksi tarvitaan pienempiä subklooneja, jotka vaihtelevat pituudeltaan 150-200 emäsparin verran, jotta saataisiin aikaan päällekkäin menevä DNA-sekvenssi. Eksonukleaasi III diges- 30 toi yhden DNA-juosteen 5'-vapaasta päästä tai tylpästä päästä, mutta jättää 3'- vapaan pään. Yksijuosteinen DNA-digestoitiin sen jälkeen S 1-nuldeaasilla. Tätä tekniikkaa käytetään "Erase-a-Base" System Kitissä (Promega, Madison, USA) ja se mandollistaa sellaisen subkloonisarjan valmistamisen, joka eroaa kooltaan muutamalla sadalla

8 nukleotidilla. Kiinnostuksen kohteena olevissa tapauksissa testattiin fibronektiinin sitomisaktiivisuus, vertaa taulukkoon 1 alla. Taulukko 1 Inhibitioanalyysi putkissa 5 Analyysiseos: 100 ul E. coli -kloonien lysaattia, joka sisälsi streptokokin DNAklooneja (bakteereita kasvatettiin LB:lla + 50 mg ampisilliinia + 1 mm IPTG, pestiin ja konsentroitiin pitoisuuteen 0D540 = 5,0) 100 ml Cowan I -soluja, kuumatapettuja, OD540 = 5,0 10 100 ml 1251-leimattua fibronektiiniä, 8865 cpm 200 ml PBS + 0,1 % BSA Pesu: Kandesti PBS:ssa + 0,1 % BSA + 0,05 % Tween 0.

9 Subklooniu lysaatti Lysaatin laimennos cpm:n lukema Sitoutuminen % suhteessa kontrolliin ilman lysaattia 5 Kontrolli Ilman lysaattia 4430 100 Inkubaatio: 2 tuntia, huoneenlämpö psdf102c10 laimentamaton 550 12,4 10-2 3870 87,4 psdf102c13 laimentamaton 200 4,5 10 10-2 1440 32,5 psdf102c9 laimentamaton 610 13,8 10-2 3170 71,6 psdf102c11 laimentamaton 1400 31,6 10-2 3490 78,8 15 psdf102c14 laimentamaton 630 14,2 10-2 3220 72,7 psdf102c18 laimentamaton 4030 91,0 10-2 4300 97,1 psdf203c3 laimentamaton 640 14,4 20 10-2 2780 62,8 psdf203c6 laimentamaton 2710 61,2 10-2 4790 108 psdf203c8 laimentamaton 3180 71,8 10-2 3660 82,6 25 psdf203 cll laimentamaton 3540 79,9 10-2 3970 89,6 psdf203c15 laimentamaton 3860 87,1 10-2 4300 97,1 psdf203c9 laimentamaton 4020 90,7 30 10-2 4730 107 psdf102 laimentamaton 200 4,5 10-2 1050 23,7 psdf203 laimentamaton 180 4,1 10-2 950 21,4 35 TG1 laimentamaton 3690 83,3

10 Nukleotidisekvensointi ExoIII-digestion jälkeen saadut subkloonit ja muut subkloonit sekvensoitiin dideoksi-menetelmällä Gem Seq R dsdna Sequencing Systemin mukaan (Promega Biotech., Madison, USA). 5 psdf102:n nuldeotidisekvensointi tuotti seuraavan sekvenssin: CTA GAT ACC TCA GAA AAC AAA AAA TCT GTA ACT GAA AAA GTA ATA ACT AGC GAT GTT AAA TAT AAG ATT AAT GAT AAA GAA GTG AAA GGT AAA GAA CTA GAC GAT GTC TCT TTA ACT TAC AGT AAA GAA ACC GTT CGT AAG CCA CAG GTG GAA CCA AAT GTT CCT GAT ACA CCT CAG GAA 10 AAA CCA TTG ACA CCG CTT GCA CCG TCA GAA CCT TCA CAA CCA TCT ATT CCA GAG ACA CCA CTG ATA CCG TCA GAA CCT TCA GTT CCA GAG ACA TCA ACA CCA GAA GGT CCA ACA GAG GGA GAA AAT AAT CTT GGT GGT CAG AGT GAA GAG ATA ACG ATT ACA GAA GAT TCT CAA TCA GGG ATG TCT GGT CAA AAT CCT GGT TCT GGA AAT GAA ACA GTG GTT 15 GAA GAC ACT CAA ACA AGT CAA GAG GAT ATT GTA CTT GGT GGT CCA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT AGC CAA CCG GGT ATG TCT GGT AAT AAT AGC CAT ACT ATT ACA GAA GAT TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAG GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACT CAA TCT GGT ATG 20 TCT GGG GAT AAT AGC CAT ACA GAT GGG ACA GTG CTT GAA GAA GAC TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACC CAA ACC GGT ATG TCT GGG GCT GGA CAA GTA GAG AGT CCA ACA ATC ACC GAA GAA ACC CAT AAA 25 CCA GAA ATA ATC ATG GGC GGT CAA AGT GAC CCT ATT GAT ATG GTT GAG GAC ACT CTT CCT GGT ATG TCT GGC TCT AAT GAA GCT ACT GTT GTG GAA GAA GAC ACA CGT CCT AAA CTT CAA TTC CAT TTT GAT AAT GAA GAG CCC GTT CCT GCA ACG GTT CCA ACC GTT TCT CAA ACT CCT ATT GCT CAG GTA GAA AGT AAA GTG CCT CAT GCC AAA GCA GAG AGT 30 GCG TTA CCT CAA ACT GGA GAT ACA AAT AAA CTA GAA ACG TTC TTT ACC ATT ACA GCA CTA ACT GTT ATT GGA GCG GCA GGA TTA CTA GGC AAA AAA CGT CGT AAT AAT CAA ACT GAT TAA TCA GCA GAT TTC ATC AAA CGC TAT AAA CAA GGC TAA CAT TTT AGC CTT GTT TTA TAT TGT

11 TTC ACT GAC CTC TAA AAG TTA TGA CTG TTT TAA AGG GGG GGT AGG CCA ATC CTC AAA AGT AGT TAA GTT GAG AAA CAC CAC ATC ACT TTA GTC TTA CTG CGC ATA CTA AAA GCA AAA GAT AAT TAG GAG CAC TTG CTA ACT GGA AAA AAT CAA ATG CAA AGC TAG TTG CCA AAG AAC TCT 5 AGA jossa sekvenssin toistuvat alueet GAA GAC ACT CAA ACA AGT CAA GAG GAT ATT GTA CTT GGT GGT CCA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT AGC CAA CCG GGT ATG TCT GGT AAT AAT AGC CAT ACT ATT ACA 10 GAA GAT TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAG GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACT CAA TCT GGT ATG TCT GGG GAT AAT AGC CAT ACA GAT GGG ACA GTG CTT GAA GAA GAC TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACC CAA ACC GGT ATG 15 TCT GGG koodaavat fibronektiinin sitomisaktiivisuutta omaavaa peptidiä. psdf203:n nukleotidisekvensointi tuotti seuraavan sekvenssin: CTC GAG GAA ACT TTG CCA AAC GAG GAA CAT CAA TCA GGT GAT ACC ACA ACT ATT GAA GAT ACT CGC CCG ATT GAT ACC ATG TCA GGT CTA 20 TCA GGA GAG ACT GGG CAG TCT GGT AAT ACT ACA ATT GAG GAA GAT AGT ACG ACT CAC GTT AAA TTC TCA AAA CGT GAT ATT AAT GGT AAA GAA CTA GCA GGT GCT ATG ATT GAA CTA CGT AAT CTA TCA GGT CAA ACT ATT CAA TCA TGG ATA TCA GAC GGC ACA GTT AAA GTT TTC TAC TTG ATG CCA GGG ACT TAT CAA TTT GTG GAG ACG GCA GCG CCA GAA 25 GGT TAT GAA TTG GCA GCT CCA ATT ACC TTC ACA ATT GAT GAG AAA GGA CAA ATT TGG GTA GAC AGT ACA ATT ACT GAG GCG AGT CAA TCT ATT GAT TTC GAG GAA ACT TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACG GAG GTT GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAG 30 GGA GAG ATT GTT GAT ATC

12 GAG GAG AAC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT GAA GTA GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAA GGA GAG GTT GTT GAT ATT GAG GAG AGC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT 5 GAA GTA GAA GAT AGC AAG CCT AAA CTC TCT ATC CAC TTT GAT AAC GAG TGG CCT AAG GAA GAC AAA CCA CAA CTA CCT GCC GTT GAA AAA CCT AAG ACT AAG GAG AGC TTG CCA GCC GCA GGG GAA GCT GAA CAT GTC TTA TCT ACT ATC GTG GGA GCA ATG ATC 10 jossa sekvenssin toistuvat alueet GAG GAA ACT TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACG GAG GTT GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAG GGA GAG ATT GTT GAT ATC GAG GAG AAC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT 15 GAA GTA GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAA GGA GAG GTT GTT GAT ATT GAG GAG AGC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT GAA GTA GAA GAT koodaavat fibronektiinin sitomisaktiivisuutta omaavaa peptidiä. 20 Southern blot -hybridisaatiossa ei ole havaittavissa mitään samankaltaisuutta DNAtasolla S. aureuksen fibronektiiniä sitovan proteiinin geenien ja S. dysgalactiaen vastaavien geenien välillä. Vastaavien lajien proteiinien välinen kilpailuun perustuva inhibitio johtuu todennäköisimmin siitä seikasta, että niiden sitoutumiskohdat fibronektiinin NH2-pään 29 kd:n fragmentissa ovat lähellä toisiaan ja siten steerisesti 25 estävät sitoutumisen. Kanden tutkitun fibronektiiniä sitovan E. coli -kloonin lysaatin Western blot -analyysi osoittaa käytettäessä 125I-leimattua fibronektiiniä ja autoradiografiaa, että subklooni psdf203 koodaa proteiinia, jonka molekyylipaino on 70 kd ja subklooni psdf 102 vastaavaa proteiinia, jonka molekyylipaino on 110 kd. 30 Edellä kuvattujen nukleotidisekvenssien koodaamien proteiinien tai polypeptidien johdetut aminohapposekvenssit ovat seuraavat:

13 Glu Asp Thr Gln Thr Ser Gln Glu Asp Ile Val Leu Gly Gly Pro Gly Gln Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Ser Gln Pro Gly Met Ser Gly Asn Asn Ser His Thr Ile Thr Glu Asp Ser Lys Pro Ser Gln Glu Asp Glu Val Ile Ile Gly Gly 5 Gln Gly Gln Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Thr Gln Ser Gly Met Ser Gly Asp Asn Ser His Thr Asp Gly Thr Val Leu Glu Glu Asp Ser Lys Pro Ser Gln Glu Asp Glu Val Ile Ile Gly Gly Gln Gly Gln Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Thr Gln Thr Gly Met Ser Gly 10 ja Glu Glu Thr Leu Pro Thr Glu Gin Gly Gln Ser Gly Ser Thr Thr Glu Val Glu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Val Ile Ile Gly Gly Gin Gly Glu Ile Val Asp Ile Glu Glu Asn Leu Pro Thr Glu Gln Gly Gln Ser Gly Ser Thr Thr 15 Glu Val Glu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Val Ile Ile Gly Gly Gln Gly Glu Val Val Asp Ile Glu Glu Ser Leu Pro Thr Glu Gln Gly Gln Ser Gly Gly Ser Thr Thr Glu Val Glu Asp mainitussa järjestyksessä. 20 Kyseisiä fibronektiiniä sitovia proteiineja voidaan käyttää immunisaatiossa, jolloin proteiinit, mieluiten yhdessä fuusioproteiinin kanssa, jotta reaktiokohteeksi saataisiin suurempi antigeeni, injektoidaan niin suurina annoksina, että isäntänisäkkäässä syntyy immunologinen reaktio. Näin fibronektiiniä sitovia proteiineja voidaan käyttää märehtijöiden rokottamiseen streptokokki-infektioiden aiheuttamaa utaretuleh- 25 dusta vastaan. Lisäksi fibronektiiniä sitovia proteiineja voidaan käyttää estämään infektiot avoimissa ihovammoissa. Haavoja voidaan hoitaa käyttämällä suspensiota, joka sisältää fibronektiiniä sitovaa proteiinia. Näin ollen fibronektiiniä sitovia proteiineja voidaan käyttää haavojen hoidossa, esim. tukkimalla bakteerin sitoutumiskohdat fibronek- 30 tiinissä, tai immunisaatiossa (rokotus). Viimeksi mainitussa tapauksessa isäntä tuottaa spesifisiä vasta-aineita, jotka voivat suojata bakteerikantojen kiinnittymiseltä ja

14 jotka koostuvat sellaisista fibronektiiniä sitovista proteiineista. Tällä tavoin vastaaineet estävät bakteerikantojen kiinnittymisen vahingoittuneeseen kudokseen. Esimerkkejä kudosvaurion käsittelystä ovat: a) sellaisten iho- ja sidekudoshaavojen käsittely, jotka mekaaninen tai kemialli- 5 nen vamma ja/tai lämpö ovat aiheuttaneet; b) limakalvon kuten ruoansulatuskanavan tai maitorauhasten, kohdun tai emättimen haavojen käsittely; c) sidekudosproteiinien, jotka ovat olleet alttiina minimaalisten kudosvaurioiden (mikrohaavojen) kautta epiteelin tai endoteelin kanssa (utaretulehdus, sydänläppätu- 10 lehdus, lonkkanivelkirurgia). Kun käytetään kyseessä olevia fibronektiiniä sitovia proteiineja, jotka on valmistettu hybridi-dna-tekniikalla tai synteettisesti, nisäkkäiden inununisaatioon (rokotus) ihminen mukaan lukien, proteiinit tai polypeptidit sekoitetaan steriiliin isotoniseen saliiniliuokseen, mieluiten farmaseuttisesti käyttökelpoisen siroteaineen kanssa. Li- 15 säksi voidaan käyttää erilaisia adjuvantteja pitkittätnään vapautumista kudoksessa ja saada täten proteiini pidemmäksi ajaksi ruumiin immunopuolustussysteemin käyttöön. Immunisaation saavuttamiseksi sopiva annos on 0,5-5 mg fibronektiiniä sitovaa proteiinia ruumiin painokiloa ja immunisaation injektointikertaa kohti. Kestävän 20 immunisaation aikaansaamiseksi rokotukset pitäisi suorittaa peräkkäin 1-3 viikon välein, mieluiten kolme kertaa. Normaalisti adjuvantteja ei lisätä immunisaatiokäsittelyä uusittaessa. Kun kyseisiä fibronektiiniä sitovia proteiineja tai polypeptideja käytetään paikalliseen pinnalliseen hoitoon, proteiini sekoitetaan isotoniseen saliiniliuokseen pitoisuu- 25 tena 25-250 mg/ml. Haavoja käsitellään sitten vain sellaisella määrällä, joka on riittävä haavapinnan kunnolliseen kasteluun. Keskimääräiseen haavaan käytettävä määrä on tällä tavoin vain muutama millilitra liuosta. Proteiiniliuoksella suoritetun hoidon jälkeen haavat pestään sopivasti isotonisella saliiniliuoksella tai jollakin muulla sopivalla haavan käsittelyliuoksella. 30 Lisäksi tämän keksinnön mukaista fibronektiiniä sitovaa proteiinia tai syntetoitua polypeptidiä voidaan käyttää S. dysgalactiae -kantojen aiheuttamien bakteeri-infektioiden diagnosointiin, jolloin tämän keksinnön mukainen fibronektiiniä sitova proteiini immobiloidaan kiinteään kantajaan kuten pieniin lateksi- tai Sepharose R-helmiin, jolloin vasta-aineita sisältävien seerumien annetaan kulkea tällä tavoin immo-

15 biloidun fibronektiiniä sitovan proteiinin läpi ja reagoida sen kanssa. Agglutinaatio mitataan sen jälkeen per se tunnetuilla menetelmillä. Edelleen fibronektiiniä sitovaa proteiinia tai polypeptidiä voidaan käyttää ELISAtestissä (Enzymelinked Immunosorbent Assay; E. Engvall, Med. Biol. 55, 193 5 (1977)). Siinä polystyreenimikrotitrauslevyn kuopat peitetään fibronektiiniä sitovalla proteiinilla ja inkuboidaan yön yli 4 C:ssa. Levyt pestään sen jälkeen perusteellisesti PBS:a sisältävällä 0,05 % Tween 20:11ä ja kuivataan. Potilaan seerumista PBS- Tweeniin tehdyt laimennussarjat lisätään kuoppiin ja inkuboidaan 30 C:ssa 1,5 tuntia. Huuhtelun jälkeen anti-ihmis-igg, joka on konjugoitu entsyymiin tai pipar- 10 juuren peroksidaasi tai alkalinen fosfataasi lisätään kuoppiin ja inkuboidaan edelleen 30 C:ssa 1,5 tuntia. Näiden inkubointien aikana potilaan seerumin IgG ja lisätty anti-ihmis-igg-entsyymikonjugaatti, tässä järjestyksessä, on sitoutunut niihin. Huuhtelun jälkeen lisätään entsyymisubstraatti. p-nitrofosfaatti alkalisen fosfataasin tapauksessa tai ortofenyleenidiamiinisubstraatti (OPD) siinä tapauksessa, että on 15 käytetty peroksidaasia, mainitussa järjestyksessä. Levyn kuopat huuhdellaan sitten sitraattipuskurilla, joka sisältää 0,055 % OPD ja 0,005 % H 202 ja inkuboidaan 30 C:ssa 10 min. Entsyymireaktio lopetetaan lisäämällä H 2SO4 :n 4 N liuosta jokaiseen kuoppaan. Värin kehittyminen mitataan spektrofotometrillä. Riippuen käytetystä entsyymisubstraattityypistä voidaan yhtä hyvin käyttää fluore- 20 senssimittausta. Toinen S. dysgalactiae -infektioiden diagnosointimenetelmä on DNA-geenikoettimen käyttö, joka perustuu fibronektiiniä sitovan proteiinin nukleotidisekvenssiin tai sen osaan. Siinä tapauksessa luonnon tai synteettinen DNA-sekvenssi kiinnitetään kiinteään kantajaan kuten nitroselluloosasuodattimelle, nailonsuodattimelle tai 25 edellä mainitulle polystyreenilevylle, esim. utaretulehdusta diagnosoitaessa lisäämällä maitoa, pinnalle. DNA-geenikoetin, mieluiten entsymaattisesti leimattu tai sitten radioaktiivisella isotoopilla leimattu, lisätään sen jälkeen kiinteäpintaiselle levylle, jolle DNA-sekvenssi on kiinnittynyt, jolloin DNA-geenikoetin kiinnittyy membraaniin kiinnittyneeseen sekvenssiin niissä kohdissa, joissa kiinnittynyttä 30 DNA:ta on. Entsyymi tai radioaktiivinen isotooppi voidaan helposti määrittää tunnetuilla menetelmillä. Edellä termi fibronektiiniä sitova proteiini käsittää myös kaikki polypeptidisekvenssit, jotka muodostavat kokonaisen proteiinin minimaalisen fibronektiiniä sitovan kohdan.

16 Kuva 1 Restriktiokartta Kuva la. puc18-vektorin yhdessä sisältämänsä S. dysgalactiaen 5 kb:n insertin kanssa muodostaman psdf 100:n restriktiokartta ja subkloonit. 5 Kuva lb. puc18-vektorin yhdessä sisältämänsä S. dysgalactiaen 6,9 kb:n insertin kanssa muodostaman psdf200:n restriktiokartta ja subkloonit. A. Kloonin restriktiokartta. B. Erilaisia subklooneja, jotka on konstruoitu fibronektiinin sitomisaktiivisuutta koodaavan geenialueen määrittämiseksi. Eri geenituotteiden sitomisaktiivisuus on 10 osoitettu. C. Subkloonit, jotka on saatu psdf102:n ja psdf203:n, mainitussa järjestyksessä, ExoIII-digestiolla. Mittakaava: 1 cm = 100 emäsparia. M on se osa DNA-sekvenssiä, joka koodaa proteiinin membraaniin sitoutunutta osaa (= COOH-pää). Subklooni p102c10 sisältää geenin 3'-pään (kuva la). Al, A2 tai A3 ja B1, B2 ja B3, tässä 15 järjestyksessä, tarkoittavat sekvenssien toistuvia alueita (vertaa kuva 3). Kuva 2 Inhibitioanalyysit putkissa ' 25I-leimatun fibronektiinin sitoutuminen S. dysgalactiaen S2- ja S. aureuksen Cowan I -soluihin, mainitussa järjestyksessä, lisättäessä E. coli -kloonien lysaatit. An- 20 netut prosenttiarvot ovat suhteessa ' 251-leimatun fibronektiinin sitoutumiseen soluihin ilman lysaattia. Negatiivisena kontrollina käytettiin E. colin TG1-lysaattia, joka sisälsi puc18-vektorin, mutta ei inserttiä, millä ei ollut vaikutusta solujen sitoutumiseen fibronektiiniin. E. coli -klooni 015 sisältää S. aureuksesta geenin, joka koodaa fibronektiinin sitomisaktiivisuutta. 25 Kuva 3 Esittää psdf102:n ja psdf203:n repetitiiviset sekvenssit. Kuva 4 Esittää psdf102:n nukleotidisekvenssit ja johdetut aminohapposekvenssit. Kuva 5 30 Esittää psdf203:n nukleotidisekvenssit ja johdetut aminohapposekvenssit.

17 Kirjallisuusviitteet 1. Hymes, R. 0. (1985) Annu. Rev. Cell Biol. 1, 67-90. 2. Kuusela, P. (1978) Nature 276, 718-720. 3. Switalski, L. ym. (1982) Eur. J. Clin. Microbiol. 1, 381-387. 5 4. Fröman, G. ym. (1984) J. Biol. Chem. 259, 14899-14905. 5. Baloda, S. B. ym. (1985) FEMS Microbiol. Lett. 28, 1-5. 6. Wadström, T. ym. (1985) teoksessa Jackson, G. J. (toim), Pathogenesis of Infection, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokio, s. 193-207. 7. Lopes, J. D. ym. (1985) Science 229, 275-277. 10 8. Langone, I. I. (1982) Adv. Immunol. 32, 157-252. 9. Marmur, J. (1961) J. Mol. Biol. 3, 208-218. 10. Flock, J.-I. ym. (1987) The EMBO Journal 6, 2351-2357. 11. Monstein, H.-J. ym. (1986) Biochem. Int. 12, 889-896.

18 Patenttivaatimukset 1. Hybridi-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se käsittää Streptococcus dysgalactiae'n nukleotidisekvenssin, joka koodaa proteiinia tai polypeptidiä, jolla on seuraava aminohapposekvenssi: 5 Glu Asp Thr Gln Thr Ser Gln Glu Asp Ile Val Leu Gly Gly Pro Gly Gln Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Ser Gln Pro Gly Met Ser Gly Asn Asn Ser His Thr Ile Thr Glu Asp Ser Lys Pro Ser Gln Glu Asp Glu Val Ile Ile Gly Gly Gln Gly Gin Vai Ile Asp Phe Thr Glu Asp Thr Gln Ser Gly Met 10 Ser Gly Asp Asn Ser His Thr Asp Gly Thr Val Leu Glu Glu Asp Ser Lys Pro Ser Gln Glu Asp Glu Val Ile Ile Gly Gly Gln Gly Gln Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Thr Gln Thr Gly Met Ser Gly ja/tai 15 Glu Glu Thr Leu Pro Thr Glu Gln Gly Gln Ser Gly Ser Thr Thr Glu Val Glu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Val Ile Ile Gly Gly Gin Gly Glu Ile Val Asp Ile Glu Glu Asn Leu Pro Thr Glu Gln Gly Gln Ser Gly Ser Thr Thr Glu Val Glu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Val Ile Ile Gly Gly Gin 20 Gly Glu Val Val Asp Ile Glu Glu Ser Leu Pro Thr Glu Gln Gly Gln Ser Gly Gly Ser Thr Thr Glu Val Glu Asp yhdessä transkription ja translaation säätelysekvenssien ja selektiomarkkeria koodaavan sekvenssin kanssa. 25 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hybridi-dna-molekyyli, tunnettu siitä, että mainittu S. dysgalactiae'n nuldeotidisekvenssi on sisällytetty puc18-ekspressiovektoriin. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen hybridi-dna-molekyyli, tunnettu siitä, että se on plasmidi psdf 102 (DSM 4614).

19 4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen hybridi-dna-molekyyli, tunnettu siitä, että se on plasmidi psdf 203 (DSM 4613). 5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen hybridi-dna-molekyyli, tunnettu siitä, että se käsittää yhden tai useamman seuraavista nukleotidisekvensseistä: 5 CTA GAT ACC TCA GAA AAC AAA AAA TCT GTA ACT GAA AAA GTA ATA ACT AGC GAT GTT AAA TAT AAG ATT AAT GAT AAA GAA GTG AAA GGT AAA GAA CTA GAC GAT GTC TCT TTA ACT TAC AGT AAA GAA ACC GTT CGT AAG CCA CAG GTG GAA CCA AAT GTT CCT GAT ACA CCT CAG GAA AAA CCA TTG ACA CCG CTT GCA CCG TCA GAA CCT TCA CAA CCA TCT 10 ATT CCA GAG ACA CCA CTG ATA CCG TCA GAA CCT TCA GTT CCA GAG ACA TCA ACA CCA GAA GGT CCA ACA GAG GGA GAA AAT AAT CTT GGT GGT CAG AGT GAA GAG ATA ACG ATT ACA GAA GAT TCT CAA TCA GGG ATG TCT GGT CAA AAT CCT GGT TCT GGA AAT GAA ACA GTG GTT GAA GAC ACT CAA ACA AGT CAA GAG GAT ATT GTA CTT GGT GGT CCA 15 GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT AGC CAA CCG GGT ATG TCT GGT AAT AAT AGC CAT ACT ATT ACA GAA GAT TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAG GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACT CAA TCT GGT ATG TCT GGG GAT AAT AGC CAT ACA GAT GGG ACA GTG CTT GAA 20 GAA GAC TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACC CAA ACC GGT ATG TCT GGG GCT GGA CAA GTA GAG AGT CCA ACA ATC ACC GAA GAA ACC CAT AAA CCA GAA ATA ATC ATG GGC GGT CAA AGT GAC CCT ATT GAT ATG GTT 25 GAG GAC ACT CTT CCT GGT ATG TCT GGC TCT AAT GAA GCT ACT GTT GTG GAA GAA GAC ACA CGT CCT AAA CTT CAA TTC CAT TTT GAT AAT GAA GAG CCC GTT CCT GCA ACG GTT CCA ACC GTT TCT CAA ACT CCT ATT GCT CAG GTA GAA AGT AAA GTG CCT CAT GCC AAA GCA GAG AGT GCG TTA CCT CAA ACT GGA GAT ACA AAT AAA CTA GAA ACG TTC TTT 30 ACC ATT ACA GCA CTA ACT GTT ATT GGA GCG GCA GGA TTA CTA GGC AAA AAA CGT CGT AAT AAT CAA ACT GAT TAA TCA GCA GAT TTC ATC AAA CGC TAT AAA CAA GGC TAA CAT TTT AGC CTT GTT TTA TAT TGT TTC ACT GAC CTC TAA AAG TTA TGA CTG TTT TAA AGG GGG GGT AGG CCA ATC CTC AAA AGT AGT TAA GTT GAG AAA CAC CAC ATC ACT TTA

20 GTC TTA CTG CGC ATA CTA AAA GCA AAA GAT AAT TAG GAG CAC TTG CTA ACT GGA AAA AAT CAA ATG CAA AGC TAG TTG CCA AAG AAC TCT AGA mieluiten 5 GAA GAC ACT CAA ACA AGT CAA GAG GAT ATT GTA CTT GGT GGT CCA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT AGC CAA CCG GGT ATG TCT GGT AAT AAT AGC CAT ACT ATT ACA GAA GAT TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAG GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACT CAA TCT GGT ATG 10 TCT GGG GAT AAT AGC CAT ACA GAT GGG ACA GTG CTT GAA GAA GAC TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACC CAA ACC GGT ATG TCT GGG ja/tai 15 CTC GAG CAA ACT TTG CCA AAC GAG GAA CAT CAA TCA GGT GAT ACC ACA ACT ATT GAA GAT ACT CGC CCG ATT GAT ACC ATG TCA GGT CTA TCA GGA GAG ACT GGG CAG TCT GGT AAT ACT ACA ATT GAG GAA GAT AGT ACG ACT CAC GTT AAA TTC TCA AAA CGT GAT ATT AAT GGT AAA GAA CTA GCA GGT GCT ATG ATT GAA CTA CGT AAT CTA TCA GGT CAA 20 ACT ATT CAA TCA TGG ATA TCA GAC GGC ACA GTT AAA GTT TTC TAC TTG ATG CCA GGG ACT TAT CAA TTT GTG GAG ACG GCA GCG CCA GAA GGT TAT GAA TTG GCA GCT CCA ATT ACC TTC ACA ATT GAT GAG AAA GGA CAA ATT TGG GTA GAC AGT ACA ATT ACT GAG GCG AGT CAA TCT ATT GAT TTC 25 GAG GAA ACT TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACG GAG GTT GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAG GGA GAG ATT GTT GAT ATC GAG GAG AAC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT GAA GTA GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAA 30 GGA GAG GTT GTT GAT ATT GAG GAG AGC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT GAA GTA GAA GAT

21 AGC AAG CCT AAA CTC TCT ATC CAC TTT GAT AAC GAG TGG CCT AAG GAA GAC AAA CCA CAA CTA CCT GCC GTT GAA AAA CCT AAG ACT AAG GAG AGC TTG CCA GCC GCA GGG GAA GCT GAA CAT GTC TTA TCT ACT ATC GTG GGA GCA ATG ATC 5 mieluiten GAG GAA ACT TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACG GAG GTT GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAG GGA GAG ATT GTT GAT ATC GAG GAG AAC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT 10 GAA GTA GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAA GGA GAG GTT GTT GAT ATT GAG GAG AGC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT GAA GTA GAA GAT. 6. Mikro-organismi, tunnettu siitä, että se on transformoitu jonkin patenttivaati- 15 muksista 1-5 mukaisella hybridi-dna-molekyylillä ja ilmentää mainittua hybridi- DNA-molekyyli ä. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen mikro-organismi, tunnettu siitä, että se on E. coli -kanta, edullisesti E. coli -kanta TG1, jonka talletusnumero on DSM 4613 tai DSM 4614. 20 8. Menetelmä fibronektiiniä sitovan proteiinin tai polypeptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) vähintään yksi patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen hybridi-dna-molekyyli viedään mikro-organismiin, b) mainittua mikro-organismia viljellään kasvua edistävässä väliaineessa, ja 25 c) täten muodostunut proteiini eristetään sinänsä tunnetulla tavalla.,, 1. I

22 Patentkrav 1. Hybrid DNA-molekyl, kännetecknad av att den omfattar en nukleotidsekvens av Streptococcus dysgalactiae som kodar för ett protein eller en polypeptid med följande aminosyrasekvens: 5 Glu Asp Thr Gln Thr Ser Gln Glu Asp Ile Val Leu Gly Gly Pro Gly Gln Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Ser Gln Pro Gly Met Ser Gly Asn Asn Ser His Thr Ile Thr Glu Asp Ser Lys Pro Ser Gln Glu Asp Glu Val Ile Ile Gly Gly Gln Gly Gln Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Thr Gln Ser Gly Met 10 Ser Gly Asp Asn Ser His Thr Asp Gly Thr Val Leu Glu Glu Asp Ser Lys Pro Ser Gin Glu Asp Glu Val Ile Ile Gly Gly Gln Gly Gln Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Thr Gln Thr Gly Met Ser Gly och/eller 15 Glu Glu Thr Leu Pro Thr Glu Gln Gly Gln Ser Gly Ser Thr Thr Glu Val Glu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Val Ile Ile Gly Gly Gln Gly Glu Ile Val Asp Ile Glu Glu Asn Leu Pro Thr Glu Gln Gly Gln Ser Gly Ser Thr Thr Glu Val Glu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Val Ile Ile Gly Gly Gln 20 Gly Glu Val Val Asp Ile Glu Glu Ser Leu Pro Thr Glu Gln Gly Gln Ser Gly Gly Ser Thr Thr Glu Val Glu Asp i kombination med transkriptions- och translationsregulerande sekvenser och en sekvens som kodar för en selektionsmarkör. 25 2. Hybrid-DNA-molekyl enligt patentkrav 1, kännetecknad av att nämnda nukleotidsekvens av S. dysgalactiae är innehållen i en puc18-ekspressionvektor. 3. Hybrid-DNA-molekyl enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknad av att den är plasmid psdf 102 (DSM 4614). 4. Hybrid-DNA-molekyl enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknad av att den är 30 plasmid psdf 203 (DSM 4613).

23 5. Hybrid-DNA-molekyl enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknad av att den omfattar en eller flera av följande nukleotidsekvenser: CTA GAT ACC TCA GAA AAC AAA AAA TCT GTA ACT GAA AAA GTA ATA ACT AGC GAT GTT AAA TAT AAG ATT AAT GAT AAA GAA GTG AAA GGT 5 AAA GAA CTA GAC GAT GTC TCT TTA ACT TAC AGT AAA GAA ACC GTT CGT AAG CCA CAG GTG GAA CCA AAT GTT CCT GAT ACA CCT CAG GAA AAA CCA TTG ACA CCG CTT GCA CCG TCA GAA CCT TCA CAA CCA TCT ATT CCA GAG ACA CCA CTG ATA CCG TCA GAA CCT TCA GTT CCA GAG ACA TCA ACA CCA GAA GGT CCA ACA GAG GGA GAA AAT AAT CTT GGT 10 GGT CAG AGT GAA GAG ATA ACG ATT ACA GAA GAT TCT CAA TCA GGG ATG TCT GGT CAA AAT CCT GGT TCT GGA AAT GAA ACA GTG GTT GAA GAC ACT CAA ACA AGT CAA GAG GAT ATT GTA CTT GGT GGT CCA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT AGC CAA CCG GGT ATG TCT GGT AAT AAT AGC CAT ACT ATT ACA 15 GAA GAT TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAG GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACT CAA TCT GGT ATG TCT GGG GAT AAT AGC CAT ACA GAT GGG ACA GTG CTT GAA GAA GAC TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACC CAA ACC GGT ATG 20 TCT GGG GCT GGA CAA GTA GAG AGT CCA ACA ATC ACC GAA GAA ACC CAT AAA CCA GAA ATA ATC ATG GGC GGT CAA AGT GAC CCT ATT GAT ATG GTT GAG GAC ACT CTT CCT GGT ATG TCT GGC TCT AAT GAA GCT ACT GTT GTG GAA GAA GAC ACA CGT CCT AAA CTT CAA TTC CAT TTT GAT AAT 25 GAA GAG CCC GTT CCT GCA ACG GTT CCA ACC GTT TCT CAA ACT CCT ATT GCT CAG GTA GAA AGT AAA GTG CCT CAT GCC AAA GCA GAG AGT GCG TTA CCT CAA ACT GGA GAT ACA AAT AAA CTA GAA ACG TTC TTT ACC ATT ACA GCA CTA ACT GTT ATT GGA GCG GCA GGA TTA CTA GGC AAA AAA CGT CGT AAT AAT CAA ACT GAT TAA TCA GCA GAT TTC ATC 30 AAA CGC TAT AAA CAA GGC TAA CAT TTT AGC CTT GTT TTA TAT TGT TTC ACT GAC CTC TAA AAG TTA TGA CTG TTT TAA AGG GGG GGT AGG CCA ATC CTC AAA AGT AGT TAA GTT GAG AAA CAC CAC ATC ACT TTA GTC TTA CTG CGC ATA CTA AAA GCA AAA GAT AAT TAG GAG CAC TTG

24 CTA ACT GGA AAA AAT CAA ATG CAA AGC TAG TTG CCA AAG AAC TCT AGA företrädesvis GAA GAC ACT CAA ACA AGT CAA GAG GAT ATT GTA CTT GGT GGT CCA 5 GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT AGC CAA CCG GGT ATG TCT GGT AAT AAT AGC CAT ACT ATT ACA GAA GAT TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAG GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACT CAA TCT GGT ATG TCT GGG GAT AAT AGC CAT ACA GAT GGG ACA GTG CTT GAA 10 GAA GAC TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACC CAA ACC GGT ATG TCT GGG och/eller CTC GAG CAA ACT TTG CCA AAC GAG GAA CAT CAA TCA GGT GAT ACC 15 ACA ACT ATT GAA GAT ACT CGC CCG ATT GAT ACC ATG TCA GGT CTA TCA GGA GAG ACT GGG CAG TCT GGT AAT ACT ACA ATT GAG GAA GAT AGT ACG ACT CAC GTT AAA TTC TCA AAA CGT GAT ATT AAT GGT AAA GAA CTA GCA GGT GCT ATG ATT GAA CTA CGT AAT CTA TCA GGT CAA ACT ATT CAA TCA TGG ATA TCA GAC GGC ACA GTT AAA GTT TTC TAC 20 TTG ATG CCA GGG ACT TAT CAA TTT GTG GAG ACG GCA GCG CCA GAA GGT TAT GAA TTG GCA GCT CCA ATT ACC TTC ACA ATT GAT GAG AAA GGA CAA ATT TGG GTA GAC AGT ACA ATT ACT GAG GCG AGT CAA TCT ATT GAT TTC GAG GAA ACT TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACG 25 GAG GTT GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAG GGA GAG ATT GTT GAT ATC GAG GAG AAC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT GAA GTA GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAA GGA GAG GTT GTT GAT ATT 30 GAG GAG AGC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT GAA GTA GAA GAT

25 AGC AAG CCT AAA CTC TCT ATC CAC TTT GAT AAC GAG TGG CCT AAG GAA GAC AAA CCA CAA CTA CCT GCC GTT GAA AAA CCT AAG ACT AAG GAG AGC TTG CCA GCC GCA GGG GAA GCT GAA CAT GTC TTA TCT ACT ATC GTG GGA GCA ATG ATC 5 företrädesvis GAG GAA ACT TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACG GAG GTT GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAG GGA GAG ATT GTT GAT ATC GAG GAG AAC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT 10 GAA GTA GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAA GGA GAG GTT GTT GAT ATT GAG GAG AGC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT GAA GTA GAA GAT. 6. Mikroorganism, kännetecknad av att den är transformerad med en hybrid- 15 DNA-molekyl enligt något av patentkraven 1-5 och uttrycker nämnda hybrid-dnamolekyl. 7. Mikroorganism enligt patentkrav 6, kännetecknad av att den är en E. coli -stam, företrädesvis E. coli -stammen TG1 med deponeringsnumret DSM 4613 eller DSM 4614. 20 8. Förfarande för framställning av ett fibronektinbindande protein eller polypeptid, kännetecknat av att a) minst en hybrid-dna-molekyl enligt patentkrav 1 eller 2 introduceras i en mikroorganism, b) nämnda mikroorganism odlas i ett tillväxtbefrämjande medium, och 25 c) det sålunda bildade proteinet isoleras på i och för sig känt sätt.

C-,eenin suunta A. EcoRI BamHI XbaI BamHI HindIII KpnI XbaI BstXI XbaI psdf100---1 1 1 1 1 4 1 I 1 2 3 4 5 kb B. I lmentyminen psdf101 psdf102 C. p 102c10 4 XbaI A 1 A 2 I A 3 1 \ \I Ilmentyminen XbaI p 102c13 p 102c9 p 102c11 I p 102c14 1 p 102c18 FIG. la

Geenin suunta A. psdf200 HindIII XhoI aci Bg II C a sti B tii HindIII XhoI 1 1 1 1 2 3 4 5 6 7 kb B. psdf201 Ilmentvminen psdf202 psdf203 C....--ECoRV EcoRV..- 1 p203 1,--- 1 t, 4 1 + B B 2 3 p203c3 1 p203c6 1, 1 (+) p203c8 1 1 (+) p203c11 p203c9 p203c15 FIG. 1b

10 E. coli-tg1:n lysaatti a. (ouc18) b. 015 c. psdf100 d. psdf101 e. psdf102 f. psdf200 g. psdf201 h. psdf202 S. dysgalactiae S2 1-1 1 1 1 1 1 1 S. aureus Cowan I Laimen- 10 tamaton 10-2 Lysaattilaimennos FIG. 2

100 5 E. coli-tg1:n lysaatti a. (puc18) b. 015 c. psdf100 d. psdf101 e. psdf102 f. psdf200 g. psdf201 h. psdf202 S. dysgalactiae S2 S. aureus Cowan I Laimen- 10-1 1 0-2 tamaton 10-3 10-4 Lysaattilaimennos FIG. 2

psdf102 Al EDTQT5QEDI V - LGGPGQVI DFTED!E;QPGM E:CHTT 11 1111 11 1111 88888 8 11 81 1111 11 4411 1 18 1411 88888 8 II 41 1411 A2 EDKPSQEDE VIIGGGQVI DFTEDTQGM TVLE A3 EDSKPSQEDE VIIGGQGWI OFTED7QTGAI.56AGWESP 1 111 1 1 111 11 81 1 4 111 4 1 141 11 11 8 TITEETHK E IIMSGQEDFI D VEDTLEGM SGSWEAEDT psdf203 Al EETL TEQGQ 51;GTTEVEDT KG EVIIGGQ GElvDI A2 EENLPTEQ6( :E GSTTEVEDT KGPEvIIGSQ GEVvDI EU:LPTEQGQ ;GSTTE, EDS KPKLE:IHFDN El,!PKED FIG. 3

FIG. 4 1 48 CTAGATACCTCA GAAAACAAAAAA TCTGTAACTGAA AAAGTAATAACT LeuAspihrSer GluAsnLysLys SerValThrGlu LysValIleThr 49 -+ + + + + 95 AGCGATGTTAAA TATAAGATTAAT GATAAAGAAGTG AAAGGTAAAGAA SerAspValLys TyrLysIleAsn AS"pLysGluVal LysGlyLysGlu 97 + + + + + 144 CTAGACGATGTC TCTTTAACTTAC AGTAAAGAAACC GTTCGTAAGCCA LeuAspAspVal SerLeuThrTyr SerLysGiuThr ValArqLysPro 145 +. + + + 192 CAGGTGGAACCA AATGTTCCTGAT ACACCTeAGGAA AAACCATTGACA GlnYalGluPro As..riValPrciAp ThrProG1nGlu LysProLeuThr 193 + + + + + 240 CCGrTTGr:ACCG TrAGAACCTTCA CAACCATCTATT CCAGAGACACCA ProLeuAli,Pro 8,.ērGluProSer GlnPrciSerIle ProGluThrPro 241 + + + + 288 CTGATACCGTCA GAACCTTCAGTT CCAGAGACATCA ACACCAGAAGGT LeuIleProSer GluProSerVal ProGluThrSer ThrProGluGly 2R%71 + + + + + 236 CCAACAGAGGGA GAAAATAATCTT Gr;TrGTCAGAGT GAAGAGATAAC:G ProThrGluGly G1uA nasnleu GlyGlyGlnSer GluGluIleThr *.37. 4- + + 2:84 ATTACAGAAGAT TCTOAATCAGGG ATGTCTGGTCAA AATCCTGGTTCT IleThrGluAsp SerG1nSerG1y MetSerGlyGin AsnProGlySer + 1- + + + 432 GGAAATGAAACA GT2GTTGAAGAC ACTCAAACAAGT CAAGAGGATATT GlyA.TIGIuThr (,).=.1...,1 G1uA=.p ThrGInThrSer GInGluAspIle.433 + + + + + 480 GTACTTGGTGT CrAGGTCAAGTG ATTGArTTTACA GAAGATAGCCAA ~LeuGlyGly ProGlyGlriVal IleA=.pPheThr GluAspSerGIn 481 + + + + 528 CCGGGTATGTCT GGTAATAATAGC CATACTATTACA GAAGATTCTAAA ProGlyMetSer GlyAsnAsnSer HisThrIleThr GluAspSerLys.*:..52=7, -+ + + + + CCAAGTCAAGAG GATGAGGTGATA ATC:GGCGGTCAA GGTCAGGTGATT 9 ProSerGlnGlu A.=.pGluValIl I1GlyGlyGln GlyGInlIle Va,. % %.577 r r ---+ + + + + GACTTTACAGAA GATACTC:AATCT GGTATGTCTGGG GATAATAGCCAT AspPheThrGlu AspihrG1nSer GlyMetSerGly AspAsnSerHis ACAGATGGGACA GTGCTTGAAGAA GACTCTAAACCA AGTCAAGAGGAT ThrAs.pGlyThr alleugluglu Asp:SerLPro SerGlnGluAsp 576 624 672 G73 + + + + + 720 GAGGTGATAATC GGCGGTCAAGGT CAAGTGATTGAC TTTACAGAAGAT GluVall1Ile G1yG1yG1nG15) GlriVallleAs.p PheThrGluA,!. p

721 768 ACCCAAACCGGT ATGTCTGGGGCT GGACAAGTAGAG AGTCC:AACAATC ThrG1nThrGly MetSerGlyAla GlyGInValGlu SerProThrile 769 --4- + + + + 316 ACrGAAGAAACC CATAAACCAGAA ATAATCATGGGC GGTCAAAGTGAC ThrGluGluThr HisLysProGlu IleIleMetGly GlyGlnSerAsp 817 + + + + CCTATTGATATG GTTGAGGACACT CTTCCTGGTATG TCTGGCTCTAAT 264. ProIleAsoMet V1G1uA.E..pThr LeuProGlyMet SerGlySerAn + + + + + GAAGCTACTGTT GTGGAAGAAGAC ACACGTCCTAAA CTTCAATTCCAT GluAlaThrVal Va1GluG1uA.2.p ThrArqProLys LuGinPheHis 913 + + + + + 950 TTTGATAATGAA GAGCCCGTTCCT GCAACGGTTCCA ACCGTTTCTI -AA PheA,E.pAsnGlu GluProValPro AlaThrValPro ThrValS,=rGin 961 + + +. ACTCCTATTGCT CAGGTAGAAAGT AAAGTGCCTCAT GCCAAAGCAGAG ThrProIleAla GinVIGIuS.=.r LyValProHic. AlaLy..Allu 1002 '100 9 105g AGTGCGTTACC.T CAAACTGGAGAT Ar.AAATAAACTA GAAACGTTCTTT SerAlLeuPro GinThrGlyAsp ThrA.E.nLy.ELeu GluThrPhePhe :1057 + + + 1104 ACCATTACAGCA CTAAOTGTTATT GGAGCGGCAGGA TTACTAGG:AAA TFrr I lethra1= LeuThrValIle GlyAlaAlaGly LeuluGlyLys... : 110.5 + + + + + 1152 AAACGTCGTAAT AATCAAACTGAT TAATCAGCAGAT TTCATCAAACGC LysArgArc,A.z..n AsnG1nThrA,Ep EndSerAlaAso PheileLy2.Arq 1153 + + + + TATAAACAAGGC TAACATTTTAGC CTTGTTTTATAT TGTTTCACTGAC TyrLys.G.InGly End 1201 CTCTAAAAGTTA TGACTGTTTTAA AGGGGGGGTAGG CCAATCCTCAAA :.: 1249 -+ + + + + AGTAGTTAAGTT GAGAAACACCAC ATCACTTTAGTC TTACTGCGCATA 1297 + + + + + CTAAAAGCAAAA GATAATTAGGAG CACTTGCTAACT ggaaaaaatcaa 1200 1248 1296 1344 1345 + + + 1374 ATGCAAAGCTAG TTGOCAAAGAAC TCTAGA FIG. 4