Tuma - nucleus Solubiologian luennot 2003, kasvitiede Tuman rakenne kaksoiskalvo, joiden välissä perinukleaarinen tila huokoset (nuclear pores) ulkokalvo yhteydessä ER:ään sisäkalvossa kiinni 10 nm filamentteja = nuclear lamina Tumahuokonen nuclear pore samanlaisia kasveilla ja eläimillä toimii siivilänä ja huokosena kasvisoluissa 8-20% kaksoiskalvon pinnasta huokoskompleksissa 120 proteiinia, nukleoporiinia perifeerisistä kanavista pienet molekyylit diffundoituvat vapaasti keskuskanava toimii aktiivisena proteiinien ja RNAn kuljettimena 1
Tumahuokonen nuclear pore Tumajyvänen nukleolus ribosomitehdas Miten rakenteellisesti eroaa muista soluorganelleista? Tumassa suurin on geneettisestä informaatiosta (DNA) Proteiinit 2
Nukleiinihapot Adenine (Base) N-glycosidic bond Nucleoside Nucleotides DNA:n kaksoishelix- rakenne Francis Crick, James Watson ja Maurice Wilkins v. 1962 Nobelin lääketieteen palkinto DNA DNA on lähinnä geneettisen informaation varastomolekyyli, jonka tärkeimmät tehtävät ovat replikaatio eli geneettisen informaation siirtäminen jälkeläisille ja transkriptio eli RNA:n tuottaminen DNAn mallin mukaan. 3
Kasvien genomeja tutkitaan Valmiit kasvien geenikartat on olemassa tällä hetkellä: lituruoholta riisiltä Luentaa aloitellaan maissilla mailasella poppelilla Luenta kesken lootuksella kaalilla Paljon geenejä luettu ohra, vehnä, peruna, tomaatti, soijapapu, mänyt, kuusi, nuppusammal Organellien DNA on sirkulaarista, 2-säikeistä ja se ei muodosta laajoja supramolekyylikomplekseja proteiinien kanssa Maissin MtDNA Riisin kloroplastin DNA, 134 kb Tuma on geenitoiminnan säätelyn keskus Eksonit Intronit Geenit ovat DNA:n toiminnallisia jaksoja. RNAn välittämänä tieto siirtyy proteiinien rakenteeksi. http://www.accessexcellence.org/ 4
RNAn synteesi ja prosessointi RNAn tehtävät: informaation siirto DNA:lta ribosomeille, ribosomien rakenneosana ja aminohappojen siirrossa sytoplasmasta ribosomeille. http://www.accessexcellence.org/ab/gg/possible.html Kasvisolujen solukalvot - Solukalvojen pääasiallinen tehtävä on toimia useimpien vesiliukoisten molekyylien diffuusion esteenä. - Kaikki kalvotyypit peritään eli uusia kalvoja voi syntyä vain olemassa olevien kalvojen kasvun ja jakautumisen seurauksena. Kalvot eivät synny de novo. 5
Kasvisoluissa on laskentatavasta riippuen 17-20 erilaista kalvosysteemiä Kasvisoluista löytyvät seuraavat kalvotyypit: - solukalvo eli plasmalemma (plasma membrane), - tumakalvo (nuclear membrane), - endoplasmakalvosto = ER (endoplasmatic reticulum), - Golgin laite / diktyosomi, - endosyyttisen vesikkelin kalvo (endocytic vesicle membrane), - autofaagisten vakuolien kalvot (autophagic vacuole membranes), - tonoplasti (tonoplast), - peroksisomien kalvo (peroxisomal membr.), - glyoksisomin kalvo (glyoxysomal membr.), - kloroplastin kalvot (chloroplast membr., inner and outer), - tylakoidikalvot, - mitokondrioiden kavot (inner and outer) Kasvisolujen solukalvoilla on yleisiä rakenteellisia ja toiminnallisia ominaisuuksia Hydrofiiliset päät Kaikki solujen kalvot koostuvat polaarisista lipidi molekyyleistä ja proteiineista. Lipidikaksoiskerros toimii yleisenä läpäisevyysesteenä. Proteiinit vastaavat useimmista kalvojen muista toiminnoista ja määräävät kunkin kalvosysteemin spesifiteetin. Kalvoissa olevat proteiinit - kuljettavat molekyylejä - välittävät signaaleja - prosessoivat lipidejä - kokoavat glykoproteiineja - mekaaninen linkki soluliman ja soluseinän välillä Solukalvon neste-mosaiikki-malli Fluid-mosaic model - solukalvo on juokseva lipidien, proteiinien ja hiilihydraattien toiminnallinen mosaiikki - useita erilaisia osia, joista monet kykenevät liikkumaan - valikoivasti läpäisevä - lipidejä eniten -proteiinit säätelevät useimpia erityistehtäviä Fosfolipidit Hydrofiiliset päät Hydrofobiset hännät Useimmilla kalvolipideillä kaksoiskerros on vähiten energiaa vaativa muodostelma eli tarvitaan vähiten energiaa sen muodostamiseksi. 6
Fosfolipidit Solukalvon neste-mosaiikki-malli Fluid-mosaic model / Lipidit - Myös kasveilla lipidit koostuvat fosfolipideistä, glykolipideistä ja steroleista, mutta ne vaihtelevat suuresti solukon, lajin jne. mukaan. - Fosfolipidit voivat liikkua nopeasti kalvon tason suunnassa (yksittäiset lipidimolekyylit eivät ole kovalenttisesti sitoutuneet toisiinsa), mutta hitaasti kaksoiskerroksen läpi. Liikkeen tarkkaa mekanismia ei kuitenkaan tunneta. - Solut optimoivat kalvojensa juoksevuutta (geelimäisestä nesteeksi = faasimuutos, joka tapahtuu kullekin lipidille spesifisessä lämpötilassa) kontrolloimalla niiden lipidikoostumusta. Lipidit /rasvahapot Rasvahappoja on kahdenlaisia sekä kiinteitä että nestemäisiä riippuen lämpötilasta ja rasvahappokoostumuksesta. Tyydyttyneet = ei kaksoissidoksia. Kasvirasvat usein tyydyttymättömiä. Lipidit Rasvahapppojen synteesi tapahtuu solulimassa ja hajotus eläinsoluissa mitokondrioissa ja kasveilla peroksisomeissa ja glyoksisomeissa Kalvolipidit: Fosfolipidejä, jotka sisältävät kaksi rasvahappoa (hydrofobinen) ja yhden fosfaattimolekyylin (hydrofiilinen). Lipidien määrä kasveissa vaihtelee 0.1 % perunalla 70 % pekaanipähkinällä. Kasvit varastoivat ennenkaikkea hiilihydraatteja, mutta esim. siementen kypsyessä nämä muutetaan C-rikkaiksi triglyserideiksi. Itämisen alkaessa taas triglyseridit muutetaan hiilihydraateiksi (1g öljyä muutetaan 2.7 g hiilihydraatteja) 7
Solukalvon sterolit - Yleisimmät sterolit kasvien solukalvoissa ovat kampesterolit, sitosterolit ja stigmasterolit. Kolesteroli, joka eläimillä on pääasiallinen steroli, ei ole läheskään niin yleinen (poikkeus kaura). eläinsolu Kasvisolujen solukalvo koostuu lipideistä, proteiineista ja hiilihydraateista (40:40:20) - Solukalvo muodostaa aktiivisen pinnan solun ja sen ympäristön välillä. Se kontrolloi molekyylien kuljetusta soluun ja solusta, kuljettaa viestejä ympäristöstä soluun, osallistuu soluseinän synteesiin ja koostamiseen, yhdistää sytoskeletonia ja solun ulkopuolista matriksia. Plasmodesmit -ER:n kanssa solukalvo muodostaa plasmodesmejä =kalvotunneleita, jotka johtavat soluseinien läpi ja näin muodostavat läheisten solujen välille kommunikointikanavia. Näiden plasmodesmi-yhteyksien välityksellä lähes kaikki yksittäisen kasvin solut jakavat fysikaalisesti jatkuvan solukalvon. 8
Kasvisolujen solukalvo poikkeaa eläinsolujen solukalvosta Huom! Tämä poikkeaa siis eläimistä, joilla lähes jokaisella solulla on oma erillinen solukalvo ja solujen välinen kommunikaatio tapahtuu proteiinikanavien kautta. (Kasvisoluissa myös tavallisesti turgorpaine eli nestejännitys kun taas eläinsolut ovat iso-osmoottisia) Kylmäkaraistuminen saa aikaan spesifisiä muutoksia solukalvon lipidikoostumuksessa - Kylmäkaraistuminen saa aikaan fosfolipidien ja kaksoisisdosten määrän nousua ja glukokerebrosidien määrän laskua. -Monet kasvit elävät kuitenkin olissa, joissa päivittäinen lämpötila voi vaihdella jopa 30 C. Niinpä esim. alhaisia lämpötiloja kompensoidaan erilaisilla mekanismeilla lyhentämällä fosfolipidien häntiä, lisäämällä kaksoissidoksia jne. -Kuten kaikilla molekyyleillä myös kalvolipideillä on tietty elinkaari eli kasvisolut voivat sovittaa kalvojensa lipidikoostumuksen esim. vuodenaikaismuutosten mukaan. Solukalvon proteiinit Proteiinit liittyvät lipidikaksoiskerrokseen monin eri tavoin. Alkuperäisessä nestemosaiikkimallissa oli perifeerisiä (vesiliukoisia) ja integraalisia proteiineja. Lisäksi on rasvahappoihinliittyneitä-, prenyyliryhmiin liittyneitä-, fosfatidyyliinositoliin liittyneitä- ja (kole)steroliin liittyneitä proteiineja. Membraaniproteiinit voivat myös liikkua lateraalisesti kalvon tasossa. 9
Kasvisolun solukalvon reseptorit Kasvisolun solukalvossa runsaasti resptoreita (esim. hormoni-, oligosakkaridi-, peptidi-, jne), mutta näiden proteiinireseptoreiden eristäminen solukalvoista (lähinnä alhaisen pitoisuuden vuoksi) on osoittautunut vaikeaksi. Niinpä on käytetty geneettistä lähestymistapaa ja identifioitu / karakterisoitu reseptori-proteiini geenejä. Usein näillä reseptoreilla proteiinikinaasi aktiivisuutta. Etyleenireseptori RNAn synteesi ja prosessointi RNAn tehtävät: informaation siirto DNA:lta ribosomeille, ribosomien rakenneosana ja aminohappojen siirrossa sytoplasmasta ribosomeille. http://www.accessexcellence.org/ab/gg/possible.html Geneettinen koodi on lähes universaali kaikissa eliöissä ja se sisältyy DNA:n nukleotidijärjestykseen Non-canonical codes: http://www.accessexcellence.org/ab/gg/possible.html 10
Aminohaposta proteiiniksi - biologisissa systeemeissä 20 eri aminohappo - entsyymiproteiinit toimivat solutason säätelijöinä Kaikilla aminohapoilla on sama perusrakenne Peptidisidos Heksokinaasi-proteiinin primaari rakenne Proteiinien sekundaarirakenteet - kaksi mallia α-helix malli Sekundaarirakenne tarkoittaa polypeptidiketjun paikallisia laskoksia ja kiertymiä Aminohapoista koostuva polypeptidiketju muodostaa keskusrakenteen, josta sivuketjut (R) suuntautuvat ulospäin. Aminohapon CO-ryhmä muodostaa vetysidoksen kauempana olevan amonohapon NH-yhmän kanssa. β-laskostettu malli Proteiinien tertiääri- ja kvaternaari-rakenteet Tertiääri-rakenne on 3-dimensionaalinen polypeptidiketjun malli, sisältäen prim. ja sek. rakenteet, mutta myös mahdolliset rakennetta vakauttavat kovalenttiset sidokset ja erilaisia vuorovaiktuksia etäämpänä toisistaan olevien alueiden kanssa Kvaternaari-rakenne ilmenee vain jos proteiini koostuu useammasata kuin yhdestä polypeptidiketjusta. Esim. hemoglobiini, joka koostuu neljästä polypeptidistä. 11
Kalvokuljetus Solukalvon selektiivinen läpäisevyys Kalvokuljetuksen merkitys kasvisolussa Turgorpaine Ravinteiden otto Aineenvaihdunnan jätteet pois solulimasta (H + ) metaboliittien kuljetus metaboliittien sijoittelu eri soluorganelleihin vapaan energian muuttaminen biologisesti hyödylliseen muotoon signaalin välitys (Ca 2+ ) Passiivinen kuljetus Passiivisessa kuljetuksessa ei tarvita energiaa. Diffuusio (ei polaariset molekyylit ja mahdollisesti pienet polaariset molekyylit) Proteiinikanavat ja proteiinikantajat 12
Aktiivinen kuljetus Kasvisolun kalvopumput Protonipumpuissa ATP:n hydrolyysi saa aikaan protonikuljetuksen kalvon läpi. Protonipumppaus saa aikaan: 1. solulima muuttuu emäksisemmäksi ja soluseinät happamoituvat > vaikutus solun kasvuun ja laajenemiseen 2. elektrokemiallinen gradientti muodostuu solukalvon poikki. Sähköpotentiaali (tässä tapauksessa negatiivinen sisäpuolella) ja konsentraatio gradientti (tässä tapauksessa ph-gradientti, joka ulkopuolella hapan). Näitä gradientteja voidaan käyttää sekundäärisenä aktiivisena kuljetussysteeminä, jotka saavat aikaan ionien ym. yhdisteiden kuljetuksen kalvon läpi (konsentraatio gradienttiaan vastaan) Hiivan V-tyypin H + -ATPaasi 13
Kasvisolun kalvopumput Solukalvon P-tyypin H + -ATPaasi Useissa solun kalvoissa P-tyypin Ca 2+ -ATPaasi Tonoplastissa V-tyypin H + -ATPaasi ja H + -PPaasi (pyrofosfataasi) Mitokondrioiden sisäkalvossa ja kloroplastien tylakoideissa F-tyypin H + -ATPaasi ABC-tyypin pumput (sekundäärimetaboliittien kuljetukseen) Enstyymiproteiinit ovat solutason säätelijöitä Entsyymit katalysoivat (kiihdyttävät) useita eri reaktiotyyppejä. (esim. hydrolaasit katalysoivat hydrolyyttisiä hajoamisreaktioita, syntaasit synteesireaktioita, oksidoreduktaasit, lyaasit, ligaasit jne). Entsyymin katalyyttinen toiminta perustuu sen aktiivisenkohdan muodostamaan yhdistymään substraatin (= molekyyli, johon entsyymin toiminta kohdistuu) kanssa. Yhdistymä muodostuu heikkojen sidosten kuten vety- ja ionisidosten kanssa. Jotta substraatti voi muodostaa reaktiotuotteen sen on ensin saatava ns. aktivaatioenergiaa saavuttaakseen ns. siirtymätilan. Entsyymi muodostaakin maksimaalisen määrän heikkoja sidoksia substraatin kanssa vasta kun se on siirtymätilassa. Heikkojen sidosten muodostuessa vapautuu tietty määrä energiaa ja lisäenergiaa vapautuu sidoksista, jotka syntyvät substraatin muuntuessa kohti siirtymätilaa. Lisäksi entsyymin aktiivinen kohta voi myös tarjota substraatille katalyysiin osallistuvia atomiryhmiä. Näin ollen entsyymi vähentää aktivaatioenergiaa ja nopeuttaa reaktiota. Katalyyttistä aktiivisuutta myös RNA-molekyyleillä (ribotsyymit). Kumpi oli evoluutiossa ensin RNA vai DNA? Kantajaproteiinit noudattavat Michaelis-Menten kinetiikkaa eli konformaatio muuttuu kuljetuksen aikana Entsyymimolekyylissä ei kuitenkaan useinkaan ole katalyysiin tarvittavia atomiryhmiä. Näissä tapauksissa entsyymi ottaa avuksi kofaktorin = orgaanisen molekyylin tai metalli-ionin. Orgaaninen kofaktori = koentsyymi, lisää suuresti entsyymin katalyysi mahdollisuuksia. koentsyymi voi kiinnittyä löysästi entsyymiin katalyysin ajaksi, ovat usein vitamiinien johdannaisia kiinnittyä pysyvästi entsyymiin = prosteettinen ryhmä Michaelis-Mentenin yhtälö V= reaktionopeus S = substraatin pitoisuus Vmax = on nopeus silloin kun entsyymi (E) on siotutunut substraattiin (ES). Eli ES muuttminen EP:ksi. Km on vakio joka kuvaa entsyymin sitoutumista substraattiin. 14
Kantajat Kantajat kuljettavat spesifisesti suurta joukkoa epäorgaanisia ioneja ja pieniä orgaanisia yhdisteitä. Oleellista kantajaproteiinien konformaation muutos ja substraattispesifisyys. Kantajat Useat kantajat toimivat H + -symporttereina tai antiporttereina. H + -symportterit; kuljetus samaan suuntaan kuin H + tai Na + eli solulimaan H + -antiportterit; kuljetus eri suuntaan kuin H + tai Na + eli solulimasta pois 15
Ioni kanavat yleisiä kasvisolujen kalvoissa 1 µm 2 kalvoa voi sisältää satoja tai tuhansia pumppuproteiineja niin tyypillisesti samalla alalla on 1-10 ionikanavaproteiinia. Kalsium-kanavat, anionikanavat, vakuolin malaattikanavat Kalsium Signaalit saavat aikaan joko muutoksia sytosolisen kalsiumin määrässä tai kalsiumin kulkeutumisessa kalvojen läpi > fysiologinen vaste Signaalit, jotka välittyvät kasvisoluissa sytosolisen kalsiumin [Ca 2+ ] i avulla ovat: tuuli kosketus lämpötila sienet haavoitus oksidatiivinen stressi punainen ja sininen valo ABA hapettomuus osmoottiset stressit ravinnetila Transientti [Ca 2+ ] i voi olla hyvin korkea (eläinsoluissa 10-100µM) Kanavat ovat auki noin 2 millisekunttia ja yksi kanava voi johtaa 10 6 ionia / s. 16
Punainen valo >muutokset sytosolisessa kalsiumissa vehnän protoplastissa Akvaporiinit ovat vesikanavia / rakenne Miksi tarvitaan kun vesi kulkee myös kalvon läpi? 17